• EI
  • Scopus
  • 中国科技期刊卓越行动计划项目资助期刊
  • 北大核心期刊
  • DOAJ
  • EBSCO
  • 中国核心学术期刊RCCSE A+
  • 中国精品科技期刊
  • JST China
  • FSTA
  • 中国农林核心期刊
  • 中国科技核心期刊CSTPCD
  • CA
  • WJCI
  • 食品科学与工程领域高质量科技期刊分级目录第一方阵T1
中国精品科技期刊2020

一种新型绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽结构鉴定及分子结合机制分析

汤海霞, 王爽爽, 郝果, 宋宇轩, 张磊, 葛武鹏

汤海霞,王爽爽,郝果,等. 一种新型绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽结构鉴定及分子结合机制分析[J]. 食品工业科技,2022,43(1):110−118. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021040014.
引用本文: 汤海霞,王爽爽,郝果,等. 一种新型绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽结构鉴定及分子结合机制分析[J]. 食品工业科技,2022,43(1):110−118. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021040014.
TANG Haixia, WANG Shuangshuang, HAO Guo, et al. Identification of a Novel ACE-inhibitory Peptide from Sheep Casein and Evaluation of the Molecular Binding Mechanism[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(1): 110−118. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021040014.
Citation: TANG Haixia, WANG Shuangshuang, HAO Guo, et al. Identification of a Novel ACE-inhibitory Peptide from Sheep Casein and Evaluation of the Molecular Binding Mechanism[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(1): 110−118. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021040014.

一种新型绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽结构鉴定及分子结合机制分析

基金项目: 西北农林科技大学金昌奶绵羊试验示范基地建设(A289021806)
详细信息
    作者简介:

    汤海霞(1994−),女,硕士研究生,研究方向:食品功能化加工工程技术,E-mail: 1457813461@qq.com

    通讯作者:

    葛武鹏(1965−),男,博士,教授,研究方向:乳及乳制品科学,E-mail:josephge@nwafu.edu.cn

  • 中图分类号: TS252

Identification of a Novel ACE-inhibitory Peptide from Sheep Casein and Evaluation of the Molecular Binding Mechanism

  • 摘要: 本研究旨在利用蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白,制备新型血管紧张素转化酶(Angiotensin-I-Converting Enzyme,ACE)抑制肽并对其分子抑制机制进行分析,为功能性绵羊乳多肽乳制品开发提供技术支持。试验以绵羊乳酪蛋白为原料,以水解度、ACE抑制率和分子量分布为评价指标,从四种蛋白酶中筛选最适蛋白酶,选择<3 kDa的组分通过LTQ Orbitrap Velos质谱仪进行肽鉴定,筛选潜在的ACE抑制肽进行人工合成并测定其半抑制浓度(IC50),采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接进一步解释肽段的抑制机制。结果表明:碱性蛋白酶为最佳水解蛋白酶;从κ-酪蛋白中筛选出一种新的ACE抑制肽KYIPIQY,半抑制浓度(IC50)为5.73 μmol/L;Linewaver-Burk图表明该肽对ACE为混合型抑制模式;分子对接显示,KYIPIQY通过与ACE的S1和S2活性口袋形成氢键和疏水作用力发生紧密结合并且可以扭曲ACE的Zn2+四面体,抑制ACE催化活性的失活而发挥高效的ACE抑制活性。
    Abstract: The purpose of this study was to prepare a novel Angiotensin-I-Converting Enzyme(ACE) inhibitory peptide by hydrolyzing sheep casein with protease and analyze its molecular inhibitory mechanism, so as to provide technical support for the development of functional sheep milk polypeptide dairy products. In this experiment, sheep casein was used as raw material, with hydrolysis degree, ACE inhibition rate and molecular weight distribution as indexes, the most suitable protease was selected from four proteases, and the components with less than <3 kDa was identified by LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer. the potential ACE inhibitory peptides were selected for artificial synthesis and it half inhibitory concentration (IC50) was measured. The inhibition kinetics of enzyme was determined by Linewaver-Burk mapping, and the inhibition mechanism of peptide segment was further explained by molecular docking. The results showed that alkaline protease was the best hydrolytic protease. A new ACE inhibitory peptide KYIPIQY was screened from κ -casein and its IC50 was 5.73 μmol/L. Linewaver-Burk diagram showed that the peptide showed a mixed inhibition mode on ACE. Molecular docking showed that KYIPIQY can form hydrogen bonds with S1 and S2 active pockets of ACE, and closely combine with hydrophobic force. KYIPIQY can distort the Zn2+ tetrahedron of ACE, and inhibit the deactivation of ACE catalytic activity, thus exerting high-efficiency ACE inhibitory activity.
  • 高血压以体循环动脉血压(收缩压或舒张压)升高为主要特征(收缩压≥140 mmHg,舒张压≥90 mmHg)。高血压病人会出现清晨头痛、流鼻血和耳朵嗡嗡作响等症状,如果不及时治疗,会导致持续的胸痛(也称为心绞痛)、心脏病发作、心力衰竭和心律不齐,从而导致猝死[1]。血管紧张素转换酶(Angiotensin-I-Converting Enzyme,ACE)是血管紧张素系统中的一种关键酶,可以催化血管紧张素Ⅰ转化为具有强大的血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ,并且使具有降血压作用的缓激肽失活[2]。因此,可以通过抑制ACE活性来治疗高血压。血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-I-converting enzyme inhibitors,ACEI)已被广泛研究用于预防和控制高血压。但人工合成的ACEI具有不良副作用,例如持续性干咳、皮疹和味觉障碍等[3]。为了解决上述问题,越来越多的学者开始聚焦于天然来源的ACE抑制肽研究,目前人们已经从乳[4]、豌豆[5]、鸡蛋[6]、刺参[7]和红松仁[8]等天然食物中分离得到ACE抑制肽。

    很多研究已经从不同乳源来源的酪蛋白中分离得到ACE抑制肽,例如,CHEN等[9]使用复合蛋白酶水解牛乳,鉴定得到2条新的ACE抑制肽VLPVPQ和VAPFPE;ESPEJO-CARPIO等[10]利用枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶水解羊乳酪蛋白,结果发现1条新ACE抑制肽WY。UGWU等[11]将胃蛋白酶和胰蛋白酶混合分别水解驼乳和马乳来源的酪蛋白,得到的酪蛋白水解液有显著的ACE抑制率。我国绵羊乳产量位居世界第二位,绵羊乳中酪蛋白平均含量为4.5%,乳清蛋白仅占1%左右[12],目前关于绵羊乳酪蛋白的研究较少。酶解法因其设备要求简单,条件温和易于控制并且可以根据蛋白酶的酶切位点得到特定的肽类等特点,常用于活性肽的制备[13]

    因此,本文首次以绵羊乳酪蛋白为原料制备ACE抑制肽,为开发绵羊乳降血压功能性食品提供了理论依据及技术参考。本文选择碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K水解绵羊乳酪蛋白,筛选ACE抑制率最高的酪蛋白水解物进行氨基酸结构鉴定,最后采用Linewaver-Burk作图和分子对接模拟对肽段抑制机理进行研究。

    绵羊乳 采自甘肃省金昌奶绵羊试验示范基地;胰蛋白酶(2500 U/mg) 上海源叶公司;蛋白酶K(40 mAnsom U/mg) 德国默克公司;碱性蛋白酶(2.4LFG) 诺维信公司;胃蛋白酶(≥250 U/mg)、邻苯二甲醛(OPA)、L-丝氨酸 北京索莱宝有限公司;马尿酸-组氨酸-亮氨酸(HHL) 上海麦克林公司;血管紧张素转换酶(ACE≥2.0 U/mg)、乙腈 色谱级,美国Sigma公司。

    ÄKTA蛋白纯化系统 美国GE公司;5417R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;LGJ-25C真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司;LTQ Orbitrap Velos 赛默飞世尔科技;1100型高效液相色谱 美国Agilent公司;UV-1900紫外分光光度计 日本岛津。

    绵羊乳离心脱脂(5000 r/min,15 min,4 ℃)重复两次,用2 mol/L的HCl调节pH至4.2,室温静置30~60 min后离心(4700 r/min,10 min,4 ℃)弃上清液,得到的沉淀即为酪蛋白粗品,依次用酸性水(pH4.2)清洗3次,用蒸馏水清洗3次[14],然后进行真空冷冻干燥。

    将绵羊乳酪蛋白粉末配成底物浓度为5%的溶液,调节溶液到每种酶的最适酶解条件(蛋白酶K,pH7.5,37 ℃;碱性蛋白酶,pH7.0,55 ℃;胃蛋白酶,pH3.0,37 ℃;胰蛋白酶,pH8.0,37 ℃),试验前期查阅文献[15],综合考虑选择酶添加量为3%,用1 mol/L NaOH维持酶解体系的pH不变,反应1 h取一次样品,在95 ℃下灭活15 min,冷却至室温调pH到7.0,离心(10000 r/min,15 min,4 ℃)取上清液,测定样品的水解度和ACE抑制率。

    水解度(Degree of hydrolysis,DH)的测定采用OPA法[16]。向1 mL的OPA试剂(40 mg OPA溶解在1 mL的甲醇中,加入0.95 g的四硼酸钠,0.5 g的SDS,100 μL的β-疏基乙醇,去离子水定容到50 mL)中加入100 μL的丝氨酸标准液(浓度为0.9516 meqv/L)、样品和去离子水涡旋5 s,室温避光条件下精确反应2 min后在340 nm下测吸光度(OD)。DH的计算方程如式(1)~式(3):

    Serine-NH2=(OD样品OD空白OD标准OD空白)×0.9516meqv/L×V×NX×P
    (1)

    式中:Serine-NH2:每克蛋白中Serine-NH2的量;V:样品的总体积;N:样品的稀释倍数;X:样品的质量;P(%):样品中蛋白质的含量。

    h=(Serine-NH2β)/αmeqv/g
    (2)

    式中:h:样品水解过程中每克酪蛋白被断裂的肽键数;αβ:是常数分别为1.039、0.383。

    DH(%)=h/htot××100
    (3)

    式中:htot:每克酪蛋白所含的总肽键数为8.2。

    ACE抑制率的测定在CUSHMAN等[15]的方法上稍作修改。向离心管中加入10 μL样品和30 μL 2.5mmol/L HHL,37 ℃培养5 min,加入20 μL的50 mU/mL ACE,37 ℃振荡培养60 min,加入60 μL的1 mol/L HCl终止反应。HHL释放的马尿酸(HA)浓度通过HPLC测定。通过公式4计算

    ACE抑制率(%)=ΔAControlΔAsampleΔAControl×100
    (4)

    式中:ΔAControl和ΔAsample分别代表空白(缓冲液)和样品中HA的峰面积。

    HPLC检测条件:分析柱:C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:25 ℃;流速:0.5 mL/min;上样量:10 μL;流动相A:含有0.05% TFA的超纯水;流动相B:乙腈;洗脱条件:78%流动相A和22%流动相B等度洗脱30 min;检测器波长:228 nm。

    将冷冻干燥后的多肽样品配成浓度为20 mg/mL的溶液,过0.22 μm的滤膜,试验采用ÄKTA pure 100蛋白纯化系统,分离凝胶柱为:SuperdexPeptide10/300GL柱(300 mm×10 mm,GE公司)。洗脱条件:流动相:乙腈:水:三氟乙酸=30:70:0.1 (v/v),上样量:500 μL,流速0.5 mL/min,检测波长为220 nm。同时,选择牛乳白蛋白 (6800 Da)、α-乳白蛋白 (14186 Da)、维生素B12(1355 Da)、氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)、甘氨酸(75 Da)为标准品测定标准曲线,标准曲线方程为:y=−0.1192x+7.2412(R2=0.9963)。

    使用10 kDa和3 kDa的超滤管在4 ℃对酪蛋白水解液进行初步分离,获得>10 kDa、10~3 kDa、<3 kDa 3个组分,冷冻干燥后测各组分ACE抑制活性的IC50

    将小于3 kDa组分的多肽粉末重新溶解在0.1%三氟乙酸中,用Thermo-DionexUltimate3000高效液相色谱和LTQOrbitrapVelos质谱仪分析多肽结构。分析柱是石英毛细管柱(15 mm×75 μm);流动相A为含有0.1%甲酸的水,流动相B含有0.1%甲酸和80%乙腈的水;梯度洗脱程序为0~2 min,8%~18%B;2~32 min,18%~35%B;32~34 min,35%~100%B;34~42 min,100%B;进样量:6 μL;流速:0.3 µL/min,全扫描质谱(350~1500 m/z,60000分辨率)。

    筛选和预测的潜在的ACE抑制肽在上海生工生物工程股份有限公司采用固相合成法进行合成,经高效液相色谱法验证,该肽的纯度≥98%。将合成的肽配成浓度为2、5、10、15、25 μmol/L的溶液,按照1.2.4的方法测定肽的ACE抑制率。

    使用1/V和1/HHL的Linewaver-Burk做图分析KYIPIQY对血管紧张素转换酶抑制模式,方法在SUTOPO等[17]基础上稍有修改。将KYIPIQY(0、3、8 μmol/L)和不同浓度的HHL(0.5、2、2.5、3.5 mmol/L)与ACE按1.2.4方法混合培养,测定马尿酸的含量,根据主图的Y轴和X轴截距计算Vmax和Km。

    由DiscoveryStudio2019clien软件生成,用CHARMm力场对配体进行能量最小化;从RCSB蛋白质数据库下载ACE晶体结构(代码:1O8A,PDB),用软件中的CleanProtein模块对ACE进行加氢、去水处理,定义活性坐标为(X: 38.977,Y: 38.645,Z: 50.183),对接半径为 10Å,选择程序CDOCKER进行半柔性分子对接[18],根据对接结果中“-CDOCKEREnergy”和“-CDOCKERInteractionEnergy”的值确定肽与ACE结合最佳方式,然后分析肽与ACE的相互作用位点和相互作用力类型评估分子对接的结果。

    所有数据重复三次并采用Origin 2018进行数据分析并作图。

    在一定范围内,水解度的大小与蛋白质水解释放的肽段含量成正比,蛋白质的水解程度影响着水解产物的功能和生物活性,因此测定酶解过程中水解物的水解度具有重要意义。图1a显示,四种蛋白酶在水解60、120、180 min后酪蛋白水解液的水解度都随着酶解时间的延长而增大,水解度在2.02%和16.69%之间。其中碱性蛋白酶的绵羊乳酪蛋白水解液的水解度最大,胰蛋白酶和蛋白酶K没有显著差异(P>0.05),胃蛋白酶的酪蛋白水解液的水解度最小。四种蛋白酶的酪蛋白水解液的水解度的显著差异(P<0.05)可能与酶促反应的速率或酶和底物亲和力的特定作用有关[19]

    图  1  不同蛋白酶水解对酪蛋白水解度(a)、ACE抑制率(b)和分子量分布(c)的影响
    注:CP、 W、J、K、Y分别代表酪蛋白、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶;1、2、3分别代表水解时间,单位小时(h)。
    Figure  1.  Effects of different proteases on degree of hydrolysis (a),ACE inhibition rate (b) and molecular weight distribution(c) of casein hydrolysate

    4种蛋白酶在不同水解时间获得的水解产物的ACE抑制率为78.3%至94.3%(图1b)。除蛋白酶K的酪蛋白水解液ACE抑制率最大值在60 min为92.6%,其余3种蛋白酶的酪蛋白水解液的ACE抑制率都随着酶解时间的延长呈现出先增大后减小的趋势,这些结果表明,酶处理的程度影响水解物的ACE抑制率,与舒国伟等[20]使用蛋白酶水解山羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽结果类似,可能是肽段的分子量在酪蛋白水解液降血压中发挥重要作用。碱性蛋白酶120 min的ACE抑制率最大为94.3%。因此,试验测定了四种酪蛋白水解物在不同水解时间的分子量分布,结果如图1c所示,虽然所有水解产物中仍含有>10 kDa的蛋白,但与未水解的酪蛋白对比,蛋白质分解明显,并且随着酪蛋白水解液水解度的增大小分子肽逐渐分解,将具有ACE抑制活性的肽逐渐水解为不具有ACE活性的肽段,导致酪蛋白水解液的抑制活性降低。

    使用超滤管对J120 绵羊乳酪蛋白水解液进行截留,得到组分I(>10 kDa)、组分II(3~10 kDa)和组分III(<3 kDa),冷冻干燥后配成浓度800 μg/mL的溶液测ACE抑制率。结果如图2所示,各组分均有ACE抑制活性,但随着组分分子量减小,ACE抑制率增高,其中组分III的ACE抑制率为84.5%。马莹等[21]用超滤管对乳清蛋白水解液进行超滤分离,显示<3 kDa组分的ACE抑制活性最高。本研究结果与YU等[22]的研究结果相一致,相比于大分子量的多肽,小分子量的多肽显示出更高的ACE抑制活性。因此选择<3 kDa的组分进行下一阶段实验。

    图  2  不同分子质量多肽组分对ACE抑制率的影响
    注:不同大写字母表示超滤得到的三组分ACE 抑制率差异显著,P<0.05。
    Figure  2.  Effect of casein peptides with different molecular weights on ACE inhibition rate

    使用LTQOrbitrapVelos质谱仪对小于3 kDa的组分进行肽鉴定,共鉴定出411条肽段,其中源自αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白分别为84、116、137和74,表1列出了分子量小于1300 Da的肽,经过在BIOPEP和SwePep数据库搜索比对,发现已经验证ACE抑制活性的肽段有19条,是酪蛋白水解液具有高ACE抑制率的主要原因。

    表  1  酪蛋白水解物肽谱的质谱鉴定
    Table  1.  Identification of peptide spectrum of casein hydrolysate by mass spectrometry
    序号AA序列来源分子量长度ACE活性
    1RPKHPIαs1-casein747.46293826IC50 40.3 µmol/L
    2KHPIKHαs1-casein759.46318246
    3VVAPFPEαs1-casein758.40800667IC50 100.0±0.1 µmol/L
    4NENLLRαs1-casein758.41612426
    5RPKHPIKαs1-casein875.55851937
    6LFRQFYαs1-casein873.46281617IC50 7.9 ±1.7 μmol/L
    7KYNVPQLαs1-casein861.48210337
    8QLFRQFαs1-casein838.45665166
    9NENLLRFαs1-casein905.48472787ACEI
    10FYPQLFRαs1-casein970.51500127
    11LFRQFYQαs1-casein1001.5210447
    12FRQFYQLαs1-casein1001.5187857
    13RPKHPIKHαs1-casein1012.6163378IC50 892.83 ± 0.11 µmol/L
    14FYPQLFRQαs1-casein1098.5735348
    15RPKHPIKHQαs1-casein1140.6750969IC50 13 µmol/L
    16KFPQYLαs2-casein795.4399896
    17KFAWPQαs2-casein776.40904426IC50 177.1 ± 14.9 µmol/L
    18RLNFLKαs2-casein790.49345586
    19NRLNFLαs2-casein776.44127076
    20YQKFPQαs2-casein810.41447636
    21PYVRYLαs2-casein810.45103646IC50 2.4 ± 0.2 µmol/L
    22KNHLNFLαs2-casein885.49473757
    23KFPQYLQαs2-casein923.49821657
    24KNRLNFLαs2-casein904.53581427
    25QKFPQYLαs2-casein923.49839967
    26YQKFPQYLαs2-casein1086.5619378
    27KNRLNFLKαs2-casein1032.6315178
    28KNHLNFLKαs2-casein1013.5889158
    29FLPYPYκ-casein799.40196416
    30YIPIQYκ-casein796.42375366IC50 10.0 µmol/L
    31ARHPHPκ-casein714.37956426ACEI
    32ARHPHPHκ-casein851.43937867
    33IAKYIPIκ-casein817.5181147
    34RFFDDKκ-casein827.40483276
    35HPHPHLSκ-casein824.41624637
    36FLPYPYYκ-casein962.46550177ACEI
    37KYIPIQYκ-casein924.51866337
    38HPHPHLSFκ-casein971.48393438ACEI
    39FFDDKIAKκ-casein983.51927378
    40KIAKYIPIκ-casein945.61259648
    41NQFLPYPYκ-casein1041.5041989
    42LHLPLPβ-casein689.43461796IC50 2.9 μmol/L
    43HLPLPLβ-casein689.43455696
    44RGPFPILβ-casein799.48094367
    45NLHLPLPβ-casein803.47728157IC50 51 μmol/L
    46LHLPLPLβ-casein802.51848027IC50 425 μmol/L
    47RGPFPILVβ-casein898.55082888
    48RDMPIQAFβ-casein977.48558238IC50 209 mkM/L
    49PVRGPFPILVβ-casein1094.67204510
    50GPVRGPFPILβ-casein1052.62553610
    51EKLHLPLPLβ-casein1059.65419
    52VENLHLPLPLβ-casein1144.6912110
    53LTQTPVVVPPFβ-casein1197.68803611ACEI
    54YQEPVLGPVRGβ-casein1214.65628411IC50 412 μmol/L
    55GVPKVKETMVPKβ-casein1312.76677112IC50 376.1 ± 36.9 µmol/L
    注:肽段的IC50是从BIOPEP和SwePep数据库中查找得知的;ACEI表示肽段其有ACE活性,但数据库并未列出IC50
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    通过阅读文献发现,当一条肽段含有ACE抑制活性肽的片段,那么这条肽段也可能具有ACE抑制活性。例如,KAI等[23]证明了来自牦牛κ-酪蛋白的肽KYIPIQ具有ACE抑制活性,其IC50为7.8 μmol/L;同样GÓMEZ-RUIZ等[24]用蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白得到κ-酪蛋白肽YIPIQY也显示了抗高血压的功能,ACEI的IC50为10.0 μmol/L。新鉴定的7肽KYIPIQY来源于目前的酪蛋白水解物,包含具有ACEI活性的片段,即KYIPIQ和YIPIQY。因此,7肽-KYIPIQY极有可能具有ACE抑制活性,为了验证此肽段是否具有ACEI活性,试验选择KYIPIQY进行人工合成肽。图3为其二级结构。

    图  3  KYIPIQY的二级质谱图
    Figure  3.  Secondary mass spectra of KYIPIQY

    采用高效液相色谱法测定了7-KYIPIQY的ACEI活性和IC50值。不同浓度肽的ACEI活性如图4所示。IC50值由回归方程确定:Y =(−0.08811)X2+4.04501X+29.69037(R2=0.999)。结果表明,KYIPIQY是一种新颖高效的ACE抑制肽,其IC50值为5.73 μmol/L,活性明显高于从酪蛋白中鉴定的ACEI肽LLYQEPVLGPVR(IC50=274.0±5.0 μmol/L)[25]和MVPYPQR(IC50=30 μmol/L)[26]

    图  4  KYIPIQY的ACE抑制活性
    Figure  4.  ACE inhibitory activity of KYIPIQY

    通过Linewaver-Burk图分析7肽KYIPIQY对血管紧张素转换酶的抑制模式。如表2所示,Vmax值随着肽浓度的增加而降低,说明ACEI肽可能阻断了底物与ACE活性位点的结合。随着ACEI浓度的增加,Km值升高,这表明更高浓度肽段有利于ACE催化反应。图5显示ACEI肽表现出混合类型的酶抑制模式,表明7-KYIPIQY可以与血管紧张素转换酶的活性和非活性位点的位置结合,降低了血管紧张素转换酶的催化活性,达到降血压的作用。类似的,从南瓜子中分离鉴定的肽段RFPLL也为混合抑制模式[27]

    表  2  KYIPIQY在不同浓度下的Vmax和Km
    Table  2.  2Vmax and Km of KYIPIQY at different concentrations
    参数0 μmol/L3 μmol/L8 μmol/L
    Vmax(μmol/L/min)4.634.363.65
    Km(mmol/L)5.097.459.47
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  5  KYIPIQY对ACE的Lineweaver-Burk图
    Figure  5.  Lineweaver−Burk plot of ACE inhibition by the peptide LFRQFY

    分子对接是通过计算相互作用能和分子间作用力来预测配体与受体活性位点的低能结合模式的有效方法[28]。为了进一步解释KYIPIQY的ACEI机制,通过DiscoveryStudio2019 软件对抑制肽和ACE进行了分子对接,形成的ACE-KYIPIQY复合体的三维结构、局部图、2D图如图6所示。分子对接结果中-CDOCKER_Energy表示肽和ACE之间紧密结合强度,表3所示,KYIPIQY的-CDOCKER_Energy大于KYIPIQ和YIPIQ,显示出更高的亲和力,这表明KYIPIQY可能比其他两肽发挥更高的ACE抑制作用,它们的ACE抑制的IC50值证明了推测。ACE的三个主要的活性位点口袋,分别是S1(Ala354、Glu384和Tyr523残基)、S2 (Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520残基)和S1’(Glu162)[29]。此外,Zn2+ 也是ACE活性位点,与ACE残基His383、His387和Glu411形成四面配位体,在ACE和抑制剂之间的结合亲和力中起重要作用[30]。在表4中,KYIPIQY与ACE残基共形成10个氢键,10个疏水作用力和两个静电力,研究表明氢键是维持 ACE 与抑制肽结合的主要作用力,疏水作用力和静电力也有助于ACE-结合肽的稳定[31],KYIPIQY 与ACE的S1和S2活性口袋中的Ala354和His353形成2个氢键和3个疏水作用力,表明KYIPIQY能与 S1和S2口袋形成紧密的结合,与 ACE 残基 His383、His387 和 Glu411之间形成3个氢键和一个疏水作用力可能会导致四面体配位的 Zn2+的扭曲,造成 ACE 催化活性的失活[32]而发挥高效的ACE抑制活性。

    表  3  KYIPIQY、KYIPIQ和YIPIQY与ACE分子对接评分
    Table  3.  “-CDOCKER ENERGY” of KYIPIQY、KYIPIQ and YIPIQ
    KYIPIQYKYIPIQYIPIQY
    CDOCKER ENERGY(kcal/mol)114.704101.50194.8488
    -CDOCKER Interaction Energy(kcal/mol)118.525101.11091.6473
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    表  4  ACE-KYIPIQY复合物在最佳构象中观察到的氢键以及静电和疏水相互作用
    Table  4.  Hydrogen bonds and electrostatic and hydrophobic interactions observed in the best peptide poses based on the ACE−KYIPIQY complex
    作用基团键长(Å)类型
    KYIPIQY:H126 - A: GLU376:OE22.81002HydrogenBond;Electrostatic
    A: ARG124:NH2–KYIPIQY: O582.95510Electrostatic
    A: ARG522:HH11–KYIPIQY: O372.12882HydrogenBond
    A: ARG522:HH22–KYIPIQY: O542.56810HydrogenBond
    KYIPIQY:H133 - KYIPIQY: O582.41456HydrogenBond
    A: HIS383:HD2 - KYIPIQY: O152.90523HydrogenBond
    A: PRO519:HD1 - KYIPIQY: O542.69951HydrogenBond
    KYIPIQY:H76 - A: HIS353:NE22.69449HydrogenBond
    KYIPIQY:H83 - A: ALA354:O3.00979HydrogenBond
    KYIPIQY:H97 - A: GLU411:OE22.43009HydrogenBond
    A: ARG124:NH2 - KYIPIQY4.18158Electrostatic
    KYIPIQY:H124 - A: HIS3833.04660HydrogenBond
    A: HIS353 - KYIPIQY4.53912Hydrophobic
    A: ALA356 - KYIPIQY4.20697Hydrophobic
    KYIPIQY:C29 - A: VAL5183.83256Hydrophobic
    A: HIS353 - KYIPIQY:C274.57682Hydrophobic
    A: HIS387 - KYIPIQY3.78408Hydrophobic
    A: PHE512 - KYIPIQY:C274.65133Hydrophobic
    KYIPIQY - A: ALA3544.42391Hydrophobic
    KYIPIQY - A: VAL3804.27771Hydrophobic
    KYIPIQY - A: ILE885.26322Hydrophobic
    KYIPIQY - A: ARG1245.13500Hydrophobic
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  6  KYIPIQY与ACE的分子对接结果
    注:a、b和c分别为ACE-KYIPIQY复合体的三维结构、局部图、2D图。
    Figure  6.  Molecular docking results of KYIPIQY and ACE

    试验通过碱性蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白得到的水解液的ACE抑制率为94.3%±0.86%,在体外展现出极高的ACE抑制活性。然后通过LTQ Orbitrap Velos质谱仪从酪蛋白水解液中鉴定出一种新的ACEI肽,KYIPIQY(源自κ-酪蛋白)显示出强有力的ACEI活性,IC50值为5.73 μmol/L,并对ACE具有混合型抑制作用。此外,分子对接模拟表明KYIPIQY与ACE的S1、S2的活性口袋氨基酸残基形成强结合力,并与Zn2+的四面配位体ACE残基形成3个氢键导致四面体配位的 Zn2+的扭曲,进而造成 ACE 催化活性的失活,而展现出显著的体外降血压活性。本研究表明绵羊乳酪蛋白是制备食源性降血压肽的极佳原料,可为绵羊乳新型功能食品的开发和抗高血压保健品提供理论依据和指导。

  • 图  1   不同蛋白酶水解对酪蛋白水解度(a)、ACE抑制率(b)和分子量分布(c)的影响

    注:CP、 W、J、K、Y分别代表酪蛋白、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶;1、2、3分别代表水解时间,单位小时(h)。

    Figure  1.   Effects of different proteases on degree of hydrolysis (a),ACE inhibition rate (b) and molecular weight distribution(c) of casein hydrolysate

    图  2   不同分子质量多肽组分对ACE抑制率的影响

    注:不同大写字母表示超滤得到的三组分ACE 抑制率差异显著,P<0.05。

    Figure  2.   Effect of casein peptides with different molecular weights on ACE inhibition rate

    图  3   KYIPIQY的二级质谱图

    Figure  3.   Secondary mass spectra of KYIPIQY

    图  4   KYIPIQY的ACE抑制活性

    Figure  4.   ACE inhibitory activity of KYIPIQY

    图  5   KYIPIQY对ACE的Lineweaver-Burk图

    Figure  5.   Lineweaver−Burk plot of ACE inhibition by the peptide LFRQFY

    图  6   KYIPIQY与ACE的分子对接结果

    注:a、b和c分别为ACE-KYIPIQY复合体的三维结构、局部图、2D图。

    Figure  6.   Molecular docking results of KYIPIQY and ACE

    表  1   酪蛋白水解物肽谱的质谱鉴定

    Table  1   Identification of peptide spectrum of casein hydrolysate by mass spectrometry

    序号AA序列来源分子量长度ACE活性
    1RPKHPIαs1-casein747.46293826IC50 40.3 µmol/L
    2KHPIKHαs1-casein759.46318246
    3VVAPFPEαs1-casein758.40800667IC50 100.0±0.1 µmol/L
    4NENLLRαs1-casein758.41612426
    5RPKHPIKαs1-casein875.55851937
    6LFRQFYαs1-casein873.46281617IC50 7.9 ±1.7 μmol/L
    7KYNVPQLαs1-casein861.48210337
    8QLFRQFαs1-casein838.45665166
    9NENLLRFαs1-casein905.48472787ACEI
    10FYPQLFRαs1-casein970.51500127
    11LFRQFYQαs1-casein1001.5210447
    12FRQFYQLαs1-casein1001.5187857
    13RPKHPIKHαs1-casein1012.6163378IC50 892.83 ± 0.11 µmol/L
    14FYPQLFRQαs1-casein1098.5735348
    15RPKHPIKHQαs1-casein1140.6750969IC50 13 µmol/L
    16KFPQYLαs2-casein795.4399896
    17KFAWPQαs2-casein776.40904426IC50 177.1 ± 14.9 µmol/L
    18RLNFLKαs2-casein790.49345586
    19NRLNFLαs2-casein776.44127076
    20YQKFPQαs2-casein810.41447636
    21PYVRYLαs2-casein810.45103646IC50 2.4 ± 0.2 µmol/L
    22KNHLNFLαs2-casein885.49473757
    23KFPQYLQαs2-casein923.49821657
    24KNRLNFLαs2-casein904.53581427
    25QKFPQYLαs2-casein923.49839967
    26YQKFPQYLαs2-casein1086.5619378
    27KNRLNFLKαs2-casein1032.6315178
    28KNHLNFLKαs2-casein1013.5889158
    29FLPYPYκ-casein799.40196416
    30YIPIQYκ-casein796.42375366IC50 10.0 µmol/L
    31ARHPHPκ-casein714.37956426ACEI
    32ARHPHPHκ-casein851.43937867
    33IAKYIPIκ-casein817.5181147
    34RFFDDKκ-casein827.40483276
    35HPHPHLSκ-casein824.41624637
    36FLPYPYYκ-casein962.46550177ACEI
    37KYIPIQYκ-casein924.51866337
    38HPHPHLSFκ-casein971.48393438ACEI
    39FFDDKIAKκ-casein983.51927378
    40KIAKYIPIκ-casein945.61259648
    41NQFLPYPYκ-casein1041.5041989
    42LHLPLPβ-casein689.43461796IC50 2.9 μmol/L
    43HLPLPLβ-casein689.43455696
    44RGPFPILβ-casein799.48094367
    45NLHLPLPβ-casein803.47728157IC50 51 μmol/L
    46LHLPLPLβ-casein802.51848027IC50 425 μmol/L
    47RGPFPILVβ-casein898.55082888
    48RDMPIQAFβ-casein977.48558238IC50 209 mkM/L
    49PVRGPFPILVβ-casein1094.67204510
    50GPVRGPFPILβ-casein1052.62553610
    51EKLHLPLPLβ-casein1059.65419
    52VENLHLPLPLβ-casein1144.6912110
    53LTQTPVVVPPFβ-casein1197.68803611ACEI
    54YQEPVLGPVRGβ-casein1214.65628411IC50 412 μmol/L
    55GVPKVKETMVPKβ-casein1312.76677112IC50 376.1 ± 36.9 µmol/L
    注:肽段的IC50是从BIOPEP和SwePep数据库中查找得知的;ACEI表示肽段其有ACE活性,但数据库并未列出IC50
    下载: 导出CSV

    表  2   KYIPIQY在不同浓度下的Vmax和Km

    Table  2   2Vmax and Km of KYIPIQY at different concentrations

    参数0 μmol/L3 μmol/L8 μmol/L
    Vmax(μmol/L/min)4.634.363.65
    Km(mmol/L)5.097.459.47
    下载: 导出CSV

    表  3   KYIPIQY、KYIPIQ和YIPIQY与ACE分子对接评分

    Table  3   “-CDOCKER ENERGY” of KYIPIQY、KYIPIQ and YIPIQ

    KYIPIQYKYIPIQYIPIQY
    CDOCKER ENERGY(kcal/mol)114.704101.50194.8488
    -CDOCKER Interaction Energy(kcal/mol)118.525101.11091.6473
    下载: 导出CSV

    表  4   ACE-KYIPIQY复合物在最佳构象中观察到的氢键以及静电和疏水相互作用

    Table  4   Hydrogen bonds and electrostatic and hydrophobic interactions observed in the best peptide poses based on the ACE−KYIPIQY complex

    作用基团键长(Å)类型
    KYIPIQY:H126 - A: GLU376:OE22.81002HydrogenBond;Electrostatic
    A: ARG124:NH2–KYIPIQY: O582.95510Electrostatic
    A: ARG522:HH11–KYIPIQY: O372.12882HydrogenBond
    A: ARG522:HH22–KYIPIQY: O542.56810HydrogenBond
    KYIPIQY:H133 - KYIPIQY: O582.41456HydrogenBond
    A: HIS383:HD2 - KYIPIQY: O152.90523HydrogenBond
    A: PRO519:HD1 - KYIPIQY: O542.69951HydrogenBond
    KYIPIQY:H76 - A: HIS353:NE22.69449HydrogenBond
    KYIPIQY:H83 - A: ALA354:O3.00979HydrogenBond
    KYIPIQY:H97 - A: GLU411:OE22.43009HydrogenBond
    A: ARG124:NH2 - KYIPIQY4.18158Electrostatic
    KYIPIQY:H124 - A: HIS3833.04660HydrogenBond
    A: HIS353 - KYIPIQY4.53912Hydrophobic
    A: ALA356 - KYIPIQY4.20697Hydrophobic
    KYIPIQY:C29 - A: VAL5183.83256Hydrophobic
    A: HIS353 - KYIPIQY:C274.57682Hydrophobic
    A: HIS387 - KYIPIQY3.78408Hydrophobic
    A: PHE512 - KYIPIQY:C274.65133Hydrophobic
    KYIPIQY - A: ALA3544.42391Hydrophobic
    KYIPIQY - A: VAL3804.27771Hydrophobic
    KYIPIQY - A: ILE885.26322Hydrophobic
    KYIPIQY - A: ARG1245.13500Hydrophobic
    下载: 导出CSV
  • [1]

    WANG M, HAN W Z, ZHANG M, et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats [J]. American Journal of Translational Research, 2018, 10(12): ‏ 4042−4053.

    [2] 陈秋銮, 陈雪芹, 马倩, 等. 酶解法制备牡丹籽ACE抑制肽及其稳定性[J]. 食品工业科技,2020,41(19):149−156. [CHENG Q L, CHENG X Q, MA Q, et al. Preparation and stability of ACE inhibitory peptidesfrom peony seed meal by enzymatic hydrolysis[J]. Science and Technology of Food Industry,2020,41(19):149−156.
    [3] 叶贤江, 苏志琛, 林晓娟, 等. 基于生物信息学与分子对接技术对坛紫菜降血压肽的筛选及活性研究 [J/OL]. 食品科学, 2021, 1−14[2021-03-17]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210108.1905.030.

    YE X J, SU Z C, LIN X J, et al. Screening and activities study of antihypertensive peptides from porphyra haitanensisby bioinformatics and molecular docking [J/OL]. Food Science, 2021, 1−14[2021-03-17]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210108.1905.030.

    [4]

    GEERLINGS A, VILLAR I C, ZARCO F H. Identification and characterization of novel angiotensin-converting enzyme inhibitors obtained from goat milk[J]. Journal of Dairy Science,2006,89(9):3326−3335. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(06)72369-4

    [5] 陈炫宏, 嵇威, 董雷超, 等. 豌豆寡肽对饮食诱导的高血压大鼠ACE活性及肠道菌群调节效果评价 [J/OL]. 食品科学, 2020, 1-14[2021-03-17]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20201229.0901.004.html.

    CHEN X H, JI W, DONG L C, et al. Regulate effects of pea oligopeptides on ACE activity and intestinal flora regulation in diet-induced hypertensive rats [J/OL]. Food Science, 2020, 1-14[2021-03-17]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20201229.0901.004.html.

    [6]

    FAN H, WANG J, LIAO W, et al. Identification and characterization of gastrointestinal-resistant angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from egg white proteins[J]. J Agric Food Chem,2019,67(25):7147−7156. doi: 10.1021/acs.jafc.9b01071

    [7] 华鑫, 孙乐常, 万楚君, 等. 刺参ACE抑制肽制备及降压功效分析[J]. 食品科学,2018(10):125−130. [HUA X, SUN L C, WAN C J, et al. Preparation and antihypertensive activity of angiotensin i-converting enzyme(ACE) inhibitory peptidesderived from sea cucumber(Stichopus japonicas)[J]. Food Science,2018(10):125−130. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201814019
    [8] 苗欣宇, 王祖浩, 王鹏, 等. 红松仁清蛋白ACE抑制肽的分离纯化与结构鉴定[J]. 食品科学,2017(5):139−143. [MIAO X Y, WANG Z H, WANG P, et al. Isolation, purification and structural analysis of ace inhibitory peptides derived from red pine (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. ) nuts albumin[J]. Food Science,2017(5):139−143.
    [9]

    CHEN L, SHANGGUAN W, BAO C, et al. Collaborative optimization and molecular docking exploration of novel ACE-inhibitory peptides from bovine milk by complex proteases hydrolysis[J]. Artificial Cells,2020,48(1):180−187.

    [10]

    ESPEJO-CARPIO F J, GOBBA C D, GUADIX A, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of goat milk protein fractions[J]. International Dairy Journal,2013,32(2):175−183. doi: 10.1016/j.idairyj.2013.04.002

    [11]

    UGWU C P, ABARSHI M M, MADA S B, et al. Camel and horse milk casein hydrolysates exhibit angiotensin converting enzyme inhibitory and antioxidative effects in vitro and in silico[J]. International Journal of Peptide Research & Therapeutics,2019,25(4):1595−1604.

    [12] 宋宇轩, 安小鹏, 张磊, 等. 奶绵羊产业概况及中国奶绵羊产业的前景分析[J]. 中国乳业,2019(8):16−21. [SONG Y X, AN X P, ZHANG L, et al. General situation of dairy sheep industry and prospect analysis of dairy sheep industry in China[J]. China Dairy,2019(8):16−21.
    [13] 王佳佳, 胡志和. 乳源ACE抑制肽的制备及应用[J]. 食品科学,2012(3):286−291. [WANG J J, HU Z H. Preparation and application of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptidesderived from milk: A review[J]. Food Science,2012(3):286−291. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201703060
    [14]

    SALAMI M, MOOSAVI-MOVAHEDI A A, MOOSAVI-MOVAHEDI F, et al. Biological activity of camel milk casein following enzymatic digestion[J]. J Dairy Res,2011,78(4):471−478. doi: 10.1017/S0022029911000628

    [15]

    CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology,1971,20(7):1637−1648. doi: 10.1016/0006-2952(71)90292-9

    [16]

    NIELSEN P M, PETERSEN D, DAMBMANN C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J]. Journal of Food Science,2010,66(5):642−646.

    [17]

    SUTOPO C C Y, SUTRISNO A, WANG L F, et al. Identification of a potent angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptide from black cumin seed hydrolysate using orthogonal bioassay-guided fractionations coupled with in silico screening [J]. Process Biochemistry, 2020, 95:204-213.

    [18]

    FU Y, ALASHI A M, YOUNG J F, et al. Enzyme inhibition kinetics and molecular interactions of patatin peptides with angiotensin I-converting enzyme and renin[J]. Int J Biol Macromol,2017,101:207−213. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.03.054

    [19]

    DRYÁKOVÁ A, PIHLANTO A, MARNILA P, et al. Antioxidant properties of whey protein hydrolysates as measured by three methods[J]. European Food Research & Technology,2010,230(6):865−874.

    [20] 舒国伟. 羊乳源ACE抑制肽制备, 分离纯化及鉴定 [D]. 西安: 陕西科技大学, 2016.

    SHU G W. Preparation, purification and identification of ACE inhibitory peptides derived from goat milk[D]. Xi’an: Shaanxi University of Science and Technology, 2016.

    [21] 马莹, 薛璐, 胡志和, 等. 双酶水解乳清蛋白ACE抑制肽的制备工艺优化[J]. 食品工业,2019,6:153−158. [MA Y, XUE L, HU Z H, et al. Optimization of preparation process of double enzyme hydrolyzedwhey protein ACE inhibitory peptide[J]. The Food Industry,2019,6:153−158.
    [22]

    YU Z, WU S, ZHAO W, et al. Identification of novel angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptide from collagen hydrolysates and its molecular inhibitory mechanism[J]. International Journal of Food Science & Technology,2020,55(9):3145−3152.

    [23]

    KAI L, LANWEI Z, XUE H, et al. Quantitative structure-activity relationship modeling coupled with molecular docking analysis in screening of angiotensin i-converting enzyme inhibitory peptides from Qula casein hydrolysates obtained by two-enzyme combination hydrolysis[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2018,66(12):3221−3228.

    [24]

    GÓMEZ-RUIZ J Á, RAMOS M, RECIO I. Identification of novel angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides from ovine milk proteins by CE-MS and chromatographic techniques[J]. Electrophoresis,2010,28(22):4202−4211.

    [25]

    LIU P, LAN X, YASEEN M, et al. Immobilized metal affinity chromatography matrix modified by poly (ethylene glycol) methyl ether for purification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from casein hydrolysate [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2020, 1143(122042).

    [26]

    SOLEYMANZADEH N, MIRDAMADI S, MIRZAEI M, et al. Novel β-casein derived antioxidant and ACE-inhibitory active peptide from camel milk fermented by Leuconostoc lactis PTCC1899: Identification and molecular docking[J]. International Dairy Journal,2019,97:201−208. doi: 10.1016/j.idairyj.2019.05.012

    [27] 何海艳, 刘梦婷, 杨爱萍, 等. 南瓜籽蛋白源ACE抑制肽的制备及其降血压活性 [J/OL]. 食品科学, 1−14. https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210309.0909.002.html.

    HE H Y, LIU M T, YANG A P, et al. Preparation of pumpkin seed protein ACE inhibitory peptide and its antihypertensive activity[J/OL]. Food Science, 1−14. https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210309.0909.002.html.

    [28]

    TU M, WANG C, CHEN C, et al. Identification of a novel ACE-inhibitory peptide from casein and evaluation of the inhibitory mechanisms[J]. Food Chemisrry,2018,256:98−104. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.02.107

    [29] 陈佳丽, 杨胜涛, 萧振邦, 等. 罗非鱼鱼皮肽的体外ACE抑制活性、消化性及分子对接对比[J]. 广东海洋大学学报,2019,39(5):107−114. [CHEN J L, YANG S T, XIAO Z B, et al. Study on in vitro ACE inhibitory activity, digestibility and molecular docking comparison of tilapia fish skin peptide[J]. Journal of Zhanjiang Ocean University,2019,39(5):107−114.
    [30]

    ROHIT A C, SATHISHA K, APARNA H S. A variant peptide of buffalo colostrum β-lactoglobulin inhibits angiotensin I-converting enzyme activity[J]. European Journal of Medicinal Chemistry,2012,53:211−219. doi: 10.1016/j.ejmech.2012.03.057

    [31] 侯成杰, 聂彩清, 王彦茜, 等. α-乳白蛋白源 ACE 抑制肽快速筛选及验证[J/OL]. 食品科学, 2020. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.ts.20201229.0930.028.html.

    HOU C J, NIE C Q, WANG Y Q, et al. Accurate screening and verification of α-lactalbumin-derived ACE inhibitory peptides[J/OL] Food Science, 2020. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.ts.20201229.0930.028.html.

    [32]

    WU Q, JIA J, YAN H, et al. A novel angiotensin- converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from gastrointestinal protease hydrolysate of silkworm pupa (Bombyx mori) protein: Biochemical characterization and molecular docking study[J]. Peptides,2015,68:17−24. doi: 10.1016/j.peptides.2014.07.026

  • 期刊类型引用(4)

    1. 卢蔼纯,苏嘉毅,杨迅,冉佳鑫,郭俊斌,唐德剑,祁蒙,夏曾润,梁兴唐,尹艳镇,曹庸,苗建银. 富硒核桃粕蛋白降血压肽的酶解制备及硒含量分析. 现代食品科技. 2023(02): 161-169 . 百度学术
    2. 杨志操. 牛乳中血管紧张素转换酶抑制肽的潜在价值与研究进展. 中国乳业. 2023(05): 82-86 . 百度学术
    3. 马凤,叶灏铎,夏珍,徐燕,孙世利,曹庸,苗建银. 英红九号茶蛋白ACE抑制肽的制备、氨基酸组成及不同超滤组分的活性评价. 现代食品科技. 2023(07): 237-245 . 百度学术
    4. 邓应朝,高燕. 乳中酪蛋白生物活性多肽的潜在应用价值. 中国乳业. 2023(08): 99-104 . 百度学术

    其他类型引用(3)

图(6)  /  表(4)
计量
  • 文章访问数:  297
  • HTML全文浏览量:  86
  • PDF下载量:  17
  • 被引次数: 7
出版历程
  • 收稿日期:  2021-04-01
  • 网络出版日期:  2021-11-07
  • 刊出日期:  2021-12-31

目录

/

返回文章
返回
x 关闭 永久关闭