Comparative Analysis Between Scarfskin and Scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle by HPLC Fingerprints and Multi-components Content Determination
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摘要: 目的：选取16批次佛手的外皮和果肉作为研究对象，研究二者的差异性。方法：采用HPLC分别建立了佛手外皮和果肉指纹图谱，并进行了多成分的含量测定。结果：果肉中标定了8个共有峰，外皮中标定了18个共有峰，指认了6种成分，分别是东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行相似度评价分析，乐山市内佛手外皮和果肉与各自的对照图谱相似度较好，均大于0.90；而同一批次佛手外皮和果肉的相似度非常低只有0.10～0.35。在此基础上，对6种指认的成分进行了含量测定，佛手外皮中，检出6种指认的成分，其中5,7-二甲氧基香豆素、香叶木苷含量较高；而果肉中橙皮苷、香叶木苷含量较高，其余4种成分未检出。结论：通过HPLC指纹图谱及多成分定量分析，发现佛手外皮和果肉的成分及含量存在显著性的差异，利用这些特点，可以将佛手外皮和果肉分别应用于不同的领域，以达到资源利用最大化的目的；同时所建立的方法可用于佛手质量的控制，并为佛手资源的合理高效的开发利用提供了技术支撑。Abstract: Objective: The scarfskin and scarcocarp of 16 batches of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle were collected as the research objects to find out the differences between scarfskin and scarcocarp. Methods: The fingerprints of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle were established by HPLC, and the content of multicomponents was determined respectively. Result: Eight common peaks were picked up in scarcocarp, 18 in scarfskin, and six constituents were identified as scopoletin, scoparone, hesperidin, diosimin, 5,7-dimethoxy coumarin and bergapten. The similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine was employed for similarity analysis. The scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle in Leshan City had good similarity with their respective reference fingerprints, both greater than 0.90. The similarity between the scarfskin and scarcocarp of the same batch of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle was very low, only 0.10 to 0.35. On this basis, the contents of six identified components were determined. In the scarfskin of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle six components were detected, and the contents of 5,7-dimethoxy coumarin and diosimin were higher. But the contents of hesperidin and diosimin in the scarcocarp were higher, and the other four components were not detected. Conclusion: Through HPLC fingerprint and quantitative analysis of multiple components, it was found that there were significant differences in composition and content between scarfskin and scarcocarp. With these characteristics, the scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle could be used in different fields to maximize the use of resources. At the same time, the established method could be used for quality control of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle, and would provide technical support for rational and efficient development and utilization of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle resources.
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佛手为芸香科植物佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）的干燥果实，佛手中含多种化学成分，含黄酮类、香豆素类、糖类、挥发油、柠檬苦素及氨基酸类物质等，主要成分为黄酮类、香豆素类和挥发油[1]，具有疏肝理气、和胃止痛等功效，主治胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等症状，收载于《中国药典》2020年版一部[2]。据文献报道，以四川和广东的佛手种植面积最大，产量最高[3]。四川佛手因为产量大、质量好，在国内外市场畅销，形成了川佛手道地品牌，作为四川道地中药材和药食同源的品种，具有较大的经济价值[4]。
近年来对佛手的研究主要集中于挥发油[5-6]、浸出物[7]、多成分的定量分析[8-9]、佛手指纹图谱的建立[10-13]等。指纹图谱在中药质量评价中被广泛地应用，可充分地体现中药中各成分分布的状况，目前采用指纹图谱的方法评价佛手的成分及含量的文献较多[14-18]。
本文参照佛手质量标准（2020年版《中国药典》一部）进行橙皮苷含量测定时，发现同批次不同果之间、及同一果之间（因外皮与果肉的占比不同）的含量差异较大。因此本研究拟以果实不同部位的角度入手，通过建立指纹图谱，以评价佛手外皮与果肉、及不同产区的异同，同时探究外皮和果肉的化学成分及含量的差异性，为佛手资源的充分开发利用提供技术支撑，为完善佛手的质量评价提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
佛手 来源信息详见表1；甲醇、乙醇 分析纯，成都科龙化工试剂厂；蒸馏水 实验室制备；东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯对照品 含量大于98%，成都普思生物科技科技股份有限公司。
表 1 佛手样品信息Table 1. Informations of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle样品号 采收日期 果色（成熟度） 产地 S1 2021年7月28日 黄果 乐山夹江县 S2 2021年7月28日 青果 乐山夹江县 S3 2021年8月12日 青果夹带少许黄色 乐山五通桥 S4 2021年8月12日 青果 乐山五通桥 S5 2021年8月26日 黄果 乐山犍为县 S6 2021年8月26日 黄果 乐山犍为县 S7 2021年9月6日 黄果 乐山沐川县 S8 2021年9月6日 青果 乐山沐川县 S9 2021年9月15日 青果 乐山沙弯县 S10 2021年9月15日 青果 乐山沙弯县 S11 2021年9月20日 黄果 广东肇庆 S12 2021年9月20日 青果 广东肇庆 S13 2021年9月26日 黄果 云南昆明 S14 2021年9月26日 黄果 云南昆明 S15 2021年9月26日 黄果 福建泉州 S16 2021年9月26日 青果 福建泉州 Altus10 液相色谱仪 珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司；Kromasil液相色谱柱（100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）） 瑞典阿克苏诺贝尔（Akzo Nobel）公司；XS205DU型电子分析天平 梅特勒托利多仪器上海有限公司；ULUP-11-10超纯水机 成都超纯水科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 液相色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1 mol/L 乙酸铵（B），梯度洗脱（0～60 min，5% A→90% A；60～62 min，90% A→5% A；62～68 min，5% A）；流速：1 mL·min−1；柱温30 ℃；进样量：10 μL。
1.2.2 溶液的制备
1.2.2.1 混合对照品储备液的制备
精密称定各对照品，分别加甲醇制成含东莨菪内酯0.4649 mg/mL、滨蒿内酯对照品0.4190 mg/mL、橙皮苷对照品0.5218 mg/mL、香叶木苷对照品0.5057 mg/mL、5,7-二甲氧基香豆素对照品0.4677 mg/mL、佛手苷内酯对照品0.1706 mg/mL；依次精密吸取上述贮备液0.8、0.8、8.0、8.0、8.0、1.0 mL，置同一25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得混合对照品储备液（含东莨菪内酯14.8768 μg/mL、滨蒿内酯对照品13.4096 μg/mL、橙皮苷对照品166.976 μg/mL、香叶木苷对照品161.8176 μg/mL、5,7-二甲氧基香豆素对照品149.6496 μg/mL、佛手苷内酯对照品6.8241 μg/mL）。
1.2.2.2 供试品的制备
取鲜佛手并将其外皮和果肉分离，于烘箱中60 ℃烘至水分低于10.0%，分别取外皮和果肉各0.5 g，打粉（过三号筛），精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，回流1 h，放冷，用甲醇补足减少的重量，摇匀，过滤，即得。按照同样方法制备不含供试品的阴性对照溶液。
1.2.3 系统适用性与专属性试验
精密吸取混合对照品溶液（“1.2.2.1”项）、供试品溶液和阴性对照溶液（“1.2.2.2”项）各10 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，所得实验数据应符合相关要求。
2. 结果与分析
2.1 指纹图谱研究方法学考察
2.1.1 参照峰的选择
2020年版《中国药典》以橙皮苷作为单指标性成分用以评价佛手的质量[1]，橙皮苷在色图谱中分离度好，峰面积较高，稳定性好，因此将其作为色谱参照峰（S），计算获取各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。
2.1.2 精密度试验
取供试品（编号S1）制备溶液，按“1.2.1”项下色谱条件重复进样6次，分别记录6次进样的色谱图，计算各个共有峰面积和相对保留时间的RSD，发现供试品中的各个共有峰相对峰面积RSD为0.52%～1.75%；相对保留时间RSD为0.35%～1.88%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。
2.1.3 重复性试验
取供试品（编号S1）粉末6份，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.1”项下色谱条件对6份样品分别进样测定，计算各个共有峰面积和相对保留时间的RSD，发现供试品中的各个共有峰相对峰面积RSD为1.36%～3.75%；相对保留时间RSD为0.78%～3.12%，均小于4.0%，表明本实验方法重复性良好。
2.1.4 稳定性试验
取供试品（编号S1）溶液，于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h时按“1.2.1”项下色谱条件对以上6份样品进样测定（分别平行测定3次）。分别计算6次测定中6种成分的峰面积和相对保留时间的RSD，发现供试品中的各个共有峰相对峰面积RSD为0.41%～2.68%；相对保留时间RSD为0.053%～0.47%，均小于3.0%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。
2.2 指纹图谱的构建
2.2.1 16批次佛手外皮和果肉的指纹图谱构建
取16批次佛手外皮和果肉，分别按“1.2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录供试品色谱图，导出HPLC数据图谱，并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版）》软件，分别选择供试品（编号S1）佛手的外皮和果肉作为参照图谱，时间窗宽度0.3，选取多个特征峰进行多点校正，自动峰匹配，佛手外皮的指纹图谱标定了18个共有峰，佛手果肉的指纹图谱标定了8个共有峰，分别生成佛手果皮和果肉的对照指纹图谱，见图1。佛手外皮中同时指认了6个峰，其中峰8、11、13、14、15、16分别为东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯；佛手果肉中同时指认了8个共有峰，其中峰6、7分别为橙皮苷、香叶木苷。而将同一批次的佛手的外皮和果肉进行指纹图谱相似度评价，发现共有峰有4个，分别是外皮色谱图中的峰1、5、13、14。由于各成分在外皮和果肉中含量值相差较大，导致二者的相似度非常低。通过直观比较对照图谱可知，橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素是区别佛手的外皮与果肉的差异性物质。
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图 1 16批次佛手外皮和果肉的HPLC指纹图谱共有模式注：a. 16批次佛手外皮HPLC指纹图谱共有模式；b. 16批次佛手果肉HPLC指纹图谱共有模式；c. 佛手外皮HPLC指纹图谱；d. 佛手果肉HPLC指纹图谱。Figure 1. Common pattern of HPLC fingerprints of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle2.2.2 指纹图谱相似度分析
利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版）》软件计算佛手的外皮与果肉与各自的对照指纹图谱相似度结果，以及同一批次佛手的外皮与果肉的相似度结果。分别将佛手的外皮指纹图谱及果肉指纹图谱进行叠加（见图1），指纹图谱的相似度结果见表2。结果表明，佛手外皮中成分多含量丰富，5,7-二甲氧基香豆素的含量最高；10批次乐山市内佛手的外皮的对照指纹图谱的相似度结果在0.90以上，6批次外省佛手中云南地区的外皮的对照指纹图谱的相似度偏低，其余在0.90以上；而佛手果肉中成分较少，橙皮苷含量最高，东莨菪内酯、滨蒿内酯、5,7-二甲氧基香豆素及佛手苷内酯成分在果肉中缺失；10批次乐山市内佛手的果肉对照指纹图谱的相似度在0.90以上，6批次外省佛手中肇庆地区的果肉的对照指纹图谱的相似度偏低，其余在0.9以上；而同一批次佛手的外皮与果肉的相似度计算结果非常低，只有0.10～0.35，原因是佛手外皮与果肉的成分及含量存在显著差异，导致相似度计算结果偏低。
表 2 16批次佛手的外皮与果肉相似度评价Table 2. Similarity evaluation of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle from 16 batches外皮供试品 相似度 果肉供试品 相似度 R（S1） 1 R（S1） 1 S2 0.971 S2 0.971 S3 0.942 S3 0.924 S4 0.927 S4 0.968 S5 0.923 S5 0.955 S6 0.924 S6 0.967 S7 0.953 S7 0.973 S8 0.971 S8 0.982 S9 0.936 S9 0.918 S10 0.904 S10 0.965 S11 0.926 S11 0.848 S12 0.913 S12 0.815 S13 0.753 S13 0.965 S14 0.748 S14 0.979 S15 0.948 S15 0.949 S16 0.962 S16 0.936 外皮对照图谱1.000 果肉对照图谱1.000 2.3 佛手的外皮与果肉中各成分的含量测定
采用HPLC法建立了佛手的外皮与果肉的指纹图谱，外皮中指认了6个指标性成分，果肉中指认了2个指标性成分，为了进一步明确佛手的外皮与果肉中各指标性成分的含量及差异性，本研究建立了同时测定外皮与果肉中各指标性成分含量测定的方法。据文献报道，佛手中成分比较高的是三类物质，分别是黄酮类、香豆素类及挥发油[1,19]。通过用文献中报道的含量较高的部分指标性成分的对照品进行匹配，发现只有6种成分，最终确定对佛手中外皮与果肉中的6种成分（东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯）进行同时测定，见图2。
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图 2 佛手外皮和果肉的HPLC色谱图注：1. 东莨菪内酯；2. 滨蒿内酯；3. 橙皮苷；4. 香叶木苷；5. 5,7-二甲氧基香豆素；6. 佛手苷内酯。A.混合对照品溶液； B.夹江地区佛手外皮供试品溶液；C.夹江地区佛手果肉供试品溶液； D.阴性供试品。Figure 2. HPLC chromatogram of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle2.3.1 含量测定方法学考察
2.3.1.1 线性关系考察
精密量取“1.2.2.1”项下对照品贮备液，加甲醇稀释成5个浓度，各精密吸取10 μL，在“1.2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表3，表明各成分在各自范围内线性关系良好。
表 3 线性回归方程Table 3. Linear regression equation成分名称 回归方程 r 线性范围（μg/mL） 东莨菪内酯 Y=16549X+2763.8 1.0000 0.1860～14.8768 滨蒿内酯 Y=13096X+744.2 0.9999 0.1676～13.4096 橙皮苷 Y=20915X−36296 1.0000 2.0872～166.976 香叶木苷 Y=8908X+7089 1.0000 2.02272～161.8176 5,7-二甲氧基香豆素 Y=18707X+29157 0.9998 1.8706～149.6496 佛手苷内酯 Y=15288X+397 0.9998 0.0853～6.8241 2.3.1.2 精密度试验
精密吸取“1.2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“1.2.1”项下色谱条件重复进样6次。结果，东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯峰面积的RSD分别为0.85%、1.02%、0.46%、0.58%、0.52%、1.36%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.1.3 稳定性试验
取同一批次供试品（编号S1）溶液，于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h时按“1.2.1”项下色谱条件进样测定。结果，东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯峰面积的RSD分别为1.04%、0.97%、0.48%、0.64%、0.42%、1.25%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。
2.3.1.4 重复性试验
取同一批次供试品（编号S1）适量，共6份，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.2.2”项下色谱条件进样测定，测得东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯含量的RSD分别为1.58%、1.41%、0.95%、0.99%、1.08%、1.43%，表明本方法重复性良好。
2.3.1.5 加样回收率试验
取已知含量的同一批次供试品（编号S1）0.5 g，精密称定，共6份，精密加入混合对照品储备液（含东莨菪内酯14.8768 μg/mL、滨蒿内酯对照品13.4096 μg/mL、橙皮苷对照品166.976 μg/mL、香叶木苷对照品161.8176 μg/mL、5,7-二甲氧基香豆素对照品149.6496 μg/mL、佛手苷内酯对照品6.8241 μg/mL）10 mL，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表4。
表 4 加样回收率试验结果Table 4. Test results of sample addition recovery成分 取样量（g） 样品含量（μg/g） 加入量（μg/g） 测得量（μg/g） 回收率（%） 平均回
收率（%）RSD
（%）东莨菪内酯 0.5001 40.01 148.77 191.23 101.65 100.45 1.06 0.4981 39.85 148.77 188.75 100.09 0.4998 39.98 148.77 188.19 99.62 滨蒿内酯 0.5012 129.31 134.10 128.25 95.64 94.36 1.20 0.5033 129.85 134.10 126.03 93.98 0.4986 128.64 134.10 125.33 93.46 橙皮苷 0.5004 140.11 1669.76 1712.19 94.15 92.25 1.79 0.5106 142.97 1669.76 1667.11 91.45 0.4978 139.38 1669.76 1662.10 91.15 香叶木苷 0.5047 868.08 1618.18 2494.35 100.50 99.74 1.17 0.4956 852.43 1618.18 2460.21 98.39 0.4967 854.32 1618.18 2491.44 100.32 5,7-二甲氧
基香豆素0.4928 737.23 1496.50 1395.49 93.25 93.25 1.18 0.4893 731.99 1496.50 1378.96 92.15 0.4896 732.44 1496.50 1412.02 94.35 佛手苷内酯 0.5013 14.04 68.24 63.50 93.05 93.05 1.61 0.5008 14.02 68.24 64.52 94.55 0.4975 13.93 68.24 62.48 91.56 2.3.2 16批次佛手外皮与果肉的含量测定
分别取16批次佛手供试品，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.1”项下色谱条件进样测定，按外标法计算各组分的含量，结果见表5。
表 5 各地佛手外皮与果肉各成分含量测定结果（%，n=3）Table 5. Determination of contents in scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle from different provenances (%, n=3)编号 含量（%，RSD<2.0%） 东莨菪
内酯滨蒿
内酯橙皮苷 香叶
木苷5,7-二甲氧基
香豆素佛手苷
内酯外皮 S1 0.004 0.0129 0.014 0.086 0.748 0.0014 S2 0.0039 0.0114 0.015 0.081 0.624 0.0011 S3 0.0011 0.0011 0.003 0.053 0.660 0.0009 S4 0.0008 0.0007 0.005 0.049 0.616 0.0007 S5 0.0012 0.0094 0.007 0.057 0.458 0.0013 S6 0.0040 0.0104 0.008 0.052 0.402 0.0011 S7 0.0015 0.0062 0.006 0.062 0.673 0.0007 S8 0.0021 0.0055 0.007 0.071 0.582 0.0006 S9 0.0010 0.0007 0.010 0.037 0.321 0.0009 S10 0.0011 0.0011 0.008 0.037 0.329 0.0011 S11 0.0035 0.0044 0.013 0.130 0.729 0.0011 S12 0.0043 0.0035 0.008 0.104 0.656 0.0013 S13 0.0055 0.0309 0.002 0.023 0.222 0.0008 S14 0.0048 0.0314 0.002 0.032 0.257 0.0007 S15 0.0044 0.0176 0.062 0.095 0.728 0.0015 S16 0.0045 0.0153 0.075 0.087 0.682 0.0017 果肉 S1 / / 0.118 0.051 / / S2 / / 0.103 0.046 / / S3 / / 0.097 0.075 / / S4 / / 0.087 0.085 / / S5 / / 0.064 0.025 / / S6 / / 0.060 0.030 / / S7 / / 0.087 0.075 / / S8 / / 0.113 0.025 / / S9 / / 0.133 0.072 / / S10 / / 0.125 0.063 / / S11 / / 0.151 0.443 / / S12 / / 0.168 0.518 / / S13 / / 0.058 0.205 / / S14 / / 0.055 0.162 / / S15 / / 0.0420 0.037 / / S16 / / 0.0430 0.043 / / 2.3.3 含量测定结果与分析
从表5可以看出，佛手外皮中5,7-二甲氧基香豆素、香叶木苷含量较高，其余成分含量较少；而果肉中橙皮苷、香叶木苷含量较高，其余4种成分未检出。
从佛手外皮与果肉指纹图谱的建立，到多成分的含量测定，可以发现佛手的外皮与果肉的成分及含量存在显著的差异，而成分的不同必然会导致生物效应的差异，利用佛手外皮与果肉的差异，可以将其应用于不同的领域，以达到资源利用最大化的目的。
2.3.4 波长的选择
采用紫外可见分光光度计，分别对东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯6种标准物质溶液进行扫描（190～400 nm），结果显示：橙皮苷在284 nm有最大吸收；5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯在320 nm吸收值最大；东莨菪内酯、滨蒿内酯、香叶木苷在350 nm有最大吸收。将6种标准物质的混合溶液于3 个不同波长（284、320、350 nm）下扫描，结果显示在320 nm条件下，色谱峰较多，各峰吸收值良好，故选择 320 nm作为指纹图谱的检测波长。多成分含量测定要求检测波长为最大吸收波长，故含量测定中选择284 nm作为橙皮苷的检测波长；320 nm作为5,7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯的检测波长；350 nm作为东莨菪内酯、滨蒿内酯、香叶木苷的检测波长。
3. 讨论与结论
3.1 指纹图谱分析
从相似度计算的结果显示乐山市内的佛手的外皮与果肉与各自对照图谱的相似度均大于0.90，表明乐山本地区不同批次间相似度较好，而外省佛手的外皮对照图谱相似度除云南地区的偏低外，福建与肇庆的都在0.90以上；外省佛手的果肉对照图谱相似度除肇庆地区的偏低外，福建与云南的都在0.90以上。从佛手的外皮与果肉的对照指纹图谱可知，佛手的外皮的图谱标定的色谱峰数目较多，包含果肉中标定的4个峰，更直观表明外皮与果肉所含化学成分种类及含量的不一致。
3.2 多成分定量分析
为进一步比较佛手的外皮与果肉化学成分含量的变化，本研究在建立的指纹图谱基础上对16批次佛手的外皮与果肉中的6个指标性成分进行含量测定，结果发现橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量在佛手的外皮与果肉中存在显著差异；橙皮苷含量在果肉中较高，而5,7-二甲氧基香豆素的含量在外皮中较高；测定结果还发现，同一产地的黄果外皮中5,7-二甲氧基香豆素的含量明显高于青果的（约3～5倍）；而青果果肉中橙皮苷的含量明显高于黄果的（约0.5～3倍）。
3.3 推广应用
橙皮苷为二氢黄酮苷类化合物[20]，已经被证明具有多种药理活性如抗氧化、抗炎镇痛、免疫调节、抗肿瘤等[21]，为了提高佛手在这方面的治疗作用，可以选取佛手的果肉，且宜选用青果；5,7-二甲氧基香豆素属于香豆素类化合物，具有抗感染、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗血栓生成、抗菌等药理活性，香豆素类化合物抗肿瘤作用已成为一个研究热点，具有很高的药用价值[22]。另外，香豆素类化合物具有芳香气味，可作为香料、增香剂等，也应用于食品、塑料制品等产品中[23]，那么要让佛手在这些领域能发挥很好的价值，就可以选取佛手的外皮，且宜选用黄果。
通过HPLC指纹图谱及多成分进行定量分析，发现佛手外皮和果肉的成分及含量存在显著性的差异，利用这些特点，可以将佛手外皮和果肉分别应用于不同的领域，以达到资源利用最大化的目的。本研究所建立的HPLC指纹图谱和多成分进行同时定量分析的方法，可用于佛手的质量控制，并为合理充分利用佛手的药用价值提供了数据支撑。
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图 1 16批次佛手外皮和果肉的HPLC指纹图谱共有模式
注：a. 16批次佛手外皮HPLC指纹图谱共有模式；b. 16批次佛手果肉HPLC指纹图谱共有模式；c. 佛手外皮HPLC指纹图谱；d. 佛手果肉HPLC指纹图谱。
Figure 1. Common pattern of HPLC fingerprints of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle
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图 2 佛手外皮和果肉的HPLC色谱图
注：1. 东莨菪内酯；2. 滨蒿内酯；3. 橙皮苷；4. 香叶木苷；5. 5,7-二甲氧基香豆素；6. 佛手苷内酯。A.混合对照品溶液； B.夹江地区佛手外皮供试品溶液；C.夹江地区佛手果肉供试品溶液； D.阴性供试品。
Figure 2. HPLC chromatogram of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle
表 1 佛手样品信息
Table 1 Informations of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle
样品号 采收日期 果色（成熟度） 产地 S1 2021年7月28日 黄果 乐山夹江县 S2 2021年7月28日 青果 乐山夹江县 S3 2021年8月12日 青果夹带少许黄色 乐山五通桥 S4 2021年8月12日 青果 乐山五通桥 S5 2021年8月26日 黄果 乐山犍为县 S6 2021年8月26日 黄果 乐山犍为县 S7 2021年9月6日 黄果 乐山沐川县 S8 2021年9月6日 青果 乐山沐川县 S9 2021年9月15日 青果 乐山沙弯县 S10 2021年9月15日 青果 乐山沙弯县 S11 2021年9月20日 黄果 广东肇庆 S12 2021年9月20日 青果 广东肇庆 S13 2021年9月26日 黄果 云南昆明 S14 2021年9月26日 黄果 云南昆明 S15 2021年9月26日 黄果 福建泉州 S16 2021年9月26日 青果 福建泉州 
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表 2 16批次佛手的外皮与果肉相似度评价
Table 2 Similarity evaluation of scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle from 16 batches
外皮供试品 相似度 果肉供试品 相似度 R（S1） 1 R（S1） 1 S2 0.971 S2 0.971 S3 0.942 S3 0.924 S4 0.927 S4 0.968 S5 0.923 S5 0.955 S6 0.924 S6 0.967 S7 0.953 S7 0.973 S8 0.971 S8 0.982 S9 0.936 S9 0.918 S10 0.904 S10 0.965 S11 0.926 S11 0.848 S12 0.913 S12 0.815 S13 0.753 S13 0.965 S14 0.748 S14 0.979 S15 0.948 S15 0.949 S16 0.962 S16 0.936 外皮对照图谱1.000 果肉对照图谱1.000
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表 3 线性回归方程
Table 3 Linear regression equation
成分名称 回归方程 r 线性范围（μg/mL） 东莨菪内酯 Y=16549X+2763.8 1.0000 0.1860～14.8768 滨蒿内酯 Y=13096X+744.2 0.9999 0.1676～13.4096 橙皮苷 Y=20915X−36296 1.0000 2.0872～166.976 香叶木苷 Y=8908X+7089 1.0000 2.02272～161.8176 5,7-二甲氧基香豆素 Y=18707X+29157 0.9998 1.8706～149.6496 佛手苷内酯 Y=15288X+397 0.9998 0.0853～6.8241
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表 4 加样回收率试验结果
Table 4 Test results of sample addition recovery
成分 取样量（g） 样品含量（μg/g） 加入量（μg/g） 测得量（μg/g） 回收率（%） 平均回
收率（%）RSD
（%）东莨菪内酯 0.5001 40.01 148.77 191.23 101.65 100.45 1.06 0.4981 39.85 148.77 188.75 100.09 0.4998 39.98 148.77 188.19 99.62 滨蒿内酯 0.5012 129.31 134.10 128.25 95.64 94.36 1.20 0.5033 129.85 134.10 126.03 93.98 0.4986 128.64 134.10 125.33 93.46 橙皮苷 0.5004 140.11 1669.76 1712.19 94.15 92.25 1.79 0.5106 142.97 1669.76 1667.11 91.45 0.4978 139.38 1669.76 1662.10 91.15 香叶木苷 0.5047 868.08 1618.18 2494.35 100.50 99.74 1.17 0.4956 852.43 1618.18 2460.21 98.39 0.4967 854.32 1618.18 2491.44 100.32 5,7-二甲氧
基香豆素0.4928 737.23 1496.50 1395.49 93.25 93.25 1.18 0.4893 731.99 1496.50 1378.96 92.15 0.4896 732.44 1496.50 1412.02 94.35 佛手苷内酯 0.5013 14.04 68.24 63.50 93.05 93.05 1.61 0.5008 14.02 68.24 64.52 94.55 0.4975 13.93 68.24 62.48 91.56
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表 5 各地佛手外皮与果肉各成分含量测定结果（%，n=3）
Table 5 Determination of contents in scarfskin and scarcocarp of Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle from different provenances (%, n=3)
编号 含量（%，RSD<2.0%） 东莨菪
内酯滨蒿
内酯橙皮苷 香叶
木苷5,7-二甲氧基
香豆素佛手苷
内酯外皮 S1 0.004 0.0129 0.014 0.086 0.748 0.0014 S2 0.0039 0.0114 0.015 0.081 0.624 0.0011 S3 0.0011 0.0011 0.003 0.053 0.660 0.0009 S4 0.0008 0.0007 0.005 0.049 0.616 0.0007 S5 0.0012 0.0094 0.007 0.057 0.458 0.0013 S6 0.0040 0.0104 0.008 0.052 0.402 0.0011 S7 0.0015 0.0062 0.006 0.062 0.673 0.0007 S8 0.0021 0.0055 0.007 0.071 0.582 0.0006 S9 0.0010 0.0007 0.010 0.037 0.321 0.0009 S10 0.0011 0.0011 0.008 0.037 0.329 0.0011 S11 0.0035 0.0044 0.013 0.130 0.729 0.0011 S12 0.0043 0.0035 0.008 0.104 0.656 0.0013 S13 0.0055 0.0309 0.002 0.023 0.222 0.0008 S14 0.0048 0.0314 0.002 0.032 0.257 0.0007 S15 0.0044 0.0176 0.062 0.095 0.728 0.0015 S16 0.0045 0.0153 0.075 0.087 0.682 0.0017 果肉 S1 / / 0.118 0.051 / / S2 / / 0.103 0.046 / / S3 / / 0.097 0.075 / / S4 / / 0.087 0.085 / / S5 / / 0.064 0.025 / / S6 / / 0.060 0.030 / / S7 / / 0.087 0.075 / / S8 / / 0.113 0.025 / / S9 / / 0.133 0.072 / / S10 / / 0.125 0.063 / / S11 / / 0.151 0.443 / / S12 / / 0.168 0.518 / / S13 / / 0.058 0.205 / / S14 / / 0.055 0.162 / / S15 / / 0.0420 0.037 / / S16 / / 0.0430 0.043 / /
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