Process Optimization and Quality Evaluation of Pomegranate Juice Yogurt Fermented with Streptococcus thermophilus FUA329
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摘要: 微生物发酵转化鞣花酸生成具有多种生物活性的尿石素A，显著提高富含鞣花酸食品的营养价值。本研究通过单因素与响应面试验优化获得菌株FUA329发酵石榴汁酸奶的最佳工艺，以嗜热链球菌CGMCC1.8748为对照，对石榴汁酸奶的菌种活力、流变特性及抗氧化活性进行分析，并利用高效液相色谱法测定菌株FUA329发酵石榴汁酸奶中的尿石素A含量。结果表明：嗜热链球菌FUA329发酵制备石榴汁酸奶的最佳工艺为石榴汁添加量为15.79%，蔗糖添加量为7.08%，发酵剂接种量为3.04%，发酵时间7 h，发酵温度37 ℃，综合感官评分79.4分；在最佳工艺条件下，菌株FUA329发酵石榴汁酸奶的酸度（82.5±1.3）°T，乳清析出量9.6%±0.97%，色差68.17±2.75，菌种活力2.01±0.31（OD600）。抗氧化活性方面，菌株FUA329发酵石榴汁酸奶的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率分别为82.87%±1.48%、88.20%±2.10%和76.92%±1.02%，明显优于菌株FUA329原味酸奶以及嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵石榴汁酸奶。此外，菌株FUA329发酵石榴汁酸奶7 h，尿石素A含量达到3.31 μmol/L。研究为利用嗜热链球菌FUA329发酵制备功能性石榴汁酸奶奠定理论基础。
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关键词:
- 石榴汁 /
- 嗜热链球菌FUA329 /
- 尿石素A /
- 酸奶 /
- 工艺优化
Abstract: Metabolizing ellagic acid (EA) to urolithin A with numerous bioactivities significantly improve the nutritional value of food rich in EA. In the present study, Streptococcus thermophilus FUA329 was applied to prepare pomegranate juice yogurt. The best process formula was investigated through single-factor experiments and response surface methodology. With S. thermophilus CGMCC1.8748 as control, the viability of strain, rheological properties and antioxidant activity of pomegranate juice yogurt fermented with strain FUA329 were evaluated. The content of urolithin A in pomegranate juice yogurt fermented with strain FUA329 were analyzed by high-performance liquid chromatography. The results showed that the optimal fermentation conditions for preparing pomegranate juice yogurt by S. thermophilus FUA329 were 15.79% pomegranate juice content, 7.08% sucrose content and 3.04% starter inoculum size, fermentation at 37 ℃ for 7 h and comprehensive sensory score was 79.4 points. Under the optimal conditions, the results of basic indicators showed that yogurt acidity was (82.5±1.3)°T, whey precipitation was 9.6%±0.97%, color difference was 68.17±2.75, bacterial activity was 2.01±0.31 (OD600). In terms of antioxidant activity, DPPH radical, ABTS+ radical and superoxide anion radical scavenging rates of fermented pomegranate juice yogurt by strain FUA329 were 82.87%±1.48%, 88.20%±2.10% and 76.92%±1.02%, respectively, which was significantly better than plain yogurt fermented by strain FUA329 and pomegranate juice yogurt fermented by S. thermophilus CGMCC1.8748. In addition, urolithin A content was 3.31 μmol/L in fermented pomegranate juice yogurt by strain FUA329 after 7 h. The results of this study would provide a theoretical basis for fermenting a functional pomegranate juice yogurt, and lay a foundation for the development and utilization of S. thermophilus FUA329.-
Keywords:
- pomegranate juice /
- Streptococcus thermophilus FUA329 /
- urolithin A /
- yogurt /
- process optimization
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肌肉衰退引起的机体功能障碍增加老年人衰弱、跌倒、骨折与失能风险，严重损害老年人的健康和生活质量[1]。随着我国老龄化的逐年加剧，这一问题给家庭和社会造成了越来越沉重的负担。目前，积极应对人口老龄化已上升为国家战略。国家卫生健康委等15个部门联合印发《“十四五”健康老龄化规划》，明确指出要针对老年人肌肉衰退实施积极预防和干预。但是，目前缺乏缓解肌肉衰退的有效方法。因此，探索显著有效地延缓老年人肌肉衰退的方法刻不容缓。
鞣花酸具有抗氧化、减少胆固醇和油脂累积等生物学活性[2]。由于溶解度低，难以被直接吸收利用，经肠道菌代谢后生成不同种类的尿石素[3]。其中，尿石素A（Uro-A）是目前唯一临床显示可通过线粒体自噬改善肌肉功能的化合物，还具有抗癌、抗炎、改善认知障碍、减缓动脉粥样硬化等生物学活性，且对人类健康无风险[4−6]。但是，30岁以上人群中，约50%的人不能产生尿石素A [7]。因此，2018年，美国食品药品监督管理局批准尿石素A为营养补充剂。2021年，Amazentis公司将化工合成的Uro-A开发为抵抗肌肉衰退的营养补充剂，受到消费者青睐。目前，Uro-A的工业制备只有化工合成法[8]。如果制备富含Uro-A的食品，则可以让人们在享受美食的同时，补充Uro-A，抵抗肌肉衰退，增强健康水平。
酸奶中的蛋白质和钙等营养素更容易被老年人吸收利用，增强全身免疫力，并具有调节肠道菌群、降低胆固醇、抗肿瘤、增强免疫力和延缓衰老等功效[9]。石榴中富含鞣花单宁，含量达到0.35~0.75 mg/g[10]。利用可以转化鞣花酸生成尿石素A的安全菌株发酵制备石榴汁酸奶，将水解石榴中鞣花单宁生成的鞣花酸转化为尿石素A，提升酸奶的营养价值。本研究室分离报道了一株具有转化鞣花酸生成尿石素A的嗜热链球菌FUA329，菌种保藏号为CGMCC NO.24963，研究表明该菌株具有良好的安全性和益生性[11−13]。本研究利用嗜热链球菌FUA329发酵制备含有尿石素A的石榴汁酸奶，对发酵条件进行优化，为开发具有营养保健功效的功能性酸奶提供实验支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
嗜热链球菌FUA329 由本实验室保藏；脱脂乳粉 上海光明乳业股份有限公司；蔗糖 东莞市金仙峰实业有限公司；嗜热链球菌CGMCC1.8748 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；石榴 采摘于江苏海洋大学苍梧校区；BHI培养基 广东环凯微生物科技有限公司；DPPH自由基清除率试剂盒、超氧阴离子自由基清除率试剂盒 南京建成生物工程研究所；ABTS+自由基清除能力检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；甲酸、乙腈 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
UV-1000型紫外分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；PB-10 pH计 上海仪电科仪公司； WSC-S 色差仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；XW-80A漩涡混合器 上海青浦泸西仪器厂；MCR 102模块化智能型高级流变仪 上海恪瑞仪器科技有限公司；Agilent1200高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 酸奶制作
石榴汁的制备[14]：取新鲜石榴洗净切块，破壁机打碎，石榴汁在4 ℃、5000×g 离心10 min，取上清液，用500 mL真空式过滤器过滤除菌。
石榴汁酸奶的制备[15]：脱脂牛奶中加入蔗糖和15%的石榴汁，85 ℃，杀菌10 min，室温冷却至40 ℃；无菌状态下分别接种嗜热链球菌FUA329和嗜热链球菌CGMCC1.8748，菌液浓度OD600为2.7（3%，V/V），搅拌均匀，罐装在玻璃瓶中于37 ℃发酵7 h；凝固后放4 ℃冰箱冷藏。以不加石榴汁的酸奶为对照。
1.2.2 单因素实验
首先进行预实验，初步确立利用嗜热链球菌FUA329发酵石榴汁酸奶配方工艺参数。预实验中以脱脂牛奶的添加量为标准，石榴汁添加量20%、蔗糖添加量8%、发酵时间6 h、发酵剂接种量3%制作出的酸奶，经感官评定产品酸甜较为合理，口感较为细腻，石榴汁酸奶也具有一定的黏稠感。基于预实验结果，进行石榴汁酸奶的单因素优化实验。
1.2.2.1 发酵时间对酸奶感官评分的影响
以脱脂牛奶的添加量为标准，在石榴汁的添加量为20%、蔗糖添加量为8%、发酵剂接种量3%的情况下，探究发酵时间为5、6、7、8、9 h对酸奶感官评分的影响。实验中每个单因素变量确定最佳条件后，接下来就按照最优条件进行下一因素的确定。
1.2.2.2 石榴汁的添加量对酸奶感官评分的影响
以脱脂牛奶的添加量为标准，在蔗糖添加量为8%、发酵时间7 h、发酵剂接种量3%的情况下，探究石榴汁添加量为5%、10%、15%、20%、25%对酸奶感官评分的影响。
1.2.2.3 蔗糖的添加量对酸奶感官评分的影响
以脱脂牛奶的添加量为标准，在石榴汁的添加量为15%、发酵时间7 h、发酵剂接种量3%的情况下，探究蔗糖添加量为5%、6%、7%、8%、9%对酸奶感官评分的影响。
1.2.2.4 发酵剂接种量对酸奶感官评分的影响
以脱脂牛奶的添加量为标准，在石榴汁的添加量为15%、蔗糖添加量为7%、发酵时间7 h的情况下，探究发酵剂接种量1%、2%、3%、4%、5%对酸奶感官评分的影响。
1.2.3 响应面优化试验
在发酵时间为7 h的基础上选取对发酵效果影响较显著的石榴汁添加量（A）、蔗糖添加量（B）和发酵剂接种量（C）三因素，根据Box-Benhnken设计试验，以产品综合感官评分（Y）为响应值，采用响应面法对发酵条件进行优化，试验设计水平见表1。
表 1 响应面试验因素和水平Table 1. Factors and levels of response surface test水平 因素 A石榴汁添加量（%） B蔗糖添加量（%） C发酵剂接种量（%） −1 10 6 2 0 15 7 3 1 20 8 4 1.2.4 嗜热链球菌FUA329和嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵制备石榴汁酸奶的基础指标测定
1.2.4.1 感官评价
选取10名具有食品评价经验的人组成感官评定组，其中7~10岁男女各1名，每增加10岁，男女各增加1名，对发酵后成品酸奶的外观颜色、气味、口感、状态、酸甜度进行评价，满分为100分，每项分值为20分，最终结果为总分的平均值[16]。石榴汁酸奶感官评价标准见表2。
表 2 酸奶样品感官评分标准Table 2. Sensory scoring criteria for yogurt samples评价指标 评分标准 分值
外观颜色呈乳白色或稍带黄色，色泽均匀一致 14~20 呈微黄色或稍带红色，色泽不均匀 7~13 颜色异常，出现灰暗或红色等其他颜色 0~6
气味奶香味浓郁，有乳酸菌发酵后的香气 14~20 奶香气味微弱，稍有奶腥味或稍带异味 7~13 有鱼腥味，酒精发酵气味或其他不良气味 0~6
口感口感细腻，爽口 14~20 口感略粗糙，不爽口 7~13 口感非常粗糙，有颗粒状物且不爽口 0~6
状态均匀，无气泡，几乎无乳清析出， 黏稠度适宜，
状态稳定14~20 不均匀，有微量气泡，有明显乳清析出， 黏度稀，
且不太稳定7~13 凝乳不良，有气泡，乳清严重析出， 黏度很稀，
非常不稳定0~6
酸甜度酸甜适口 14~20 酸味重或者不适口 7~13 有苦味，涩味或其他不良滋味 0~6 1.2.4.2 酸度的测定
按照GB 5009.239-2016进行测定。
1.2.4.3 乳清析出量的测定
取10 g发酵后的酸奶置于120目的漏斗中自然放置2 h，收集滤液后称量[17]。
乳清析出率(%)=析出后质量酸奶样品质量×100 1.2.4.4 色度的测定
取发酵后的酸奶搅拌均匀，室温放置30 min。称取30.0 g酸奶样品置于培养皿，轻微晃动使酸奶均匀铺在培养皿底部，用色度计进行检测[18]。
1.2.4.5 菌种活力的测定
样品在4 ℃、3500×g 的条件下离心10 min，向离心后的沉淀中加入5 mL灭菌生理盐水，与MTT染色液混匀，37 ℃培养条件下染色 30 min，4 ℃、12000×g 离心10 min，DMSO悬浮沉淀物，用酶标仪测定600 nm下OD值[19−20]。
1.2.4.6 抗氧化能力检测
DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率均采用试剂盒进行测定。
1.2.4.7 流变学分析
酸奶样品在室温下放置15 min，采用MCR 102流变仪测定表观黏度，转子型号P60/Ti02150138。实验参数设定为：流动-斜坡模式，温度4 ℃，平衡时间5 min，剪切速率 0.01~100 s−1[21]，取50个点进行测试。
1.2.4.8 高效液相色谱测定鞣花酸和尿石素A
色谱柱为ZORBAX SB-C18（250×4.6 mm，5.0 µm）（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）。以1%甲醇（A）和乙腈（B）为流动相。流速1.0 mL/min，进样量5 µL，紫外检测器（UA）305 nm，柱温30 ℃。洗脱条件：梯度洗脱，洗脱梯度曲线：0~15 min，0~20% B；15~20 min，20%~70% B；20~21 min，70%~95% B；21~24 min，95%~100% B；24~25 min，100%~20% B[22]。
1.3 数据处理
每组实验均为三个平行，通过Excel 2010对数据进行整理，利用SPSS 23.0软件对数据进行显著性分析，采用Origin软件进行图的绘制，响应面优化试验数据采用 Design-ExpertV8.0.6进行分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 发酵时间对菌株FUA329发酵酸奶感官评分的影响
在制作酸奶过程中发酵时间对酸奶感官品质影响较大，发酵时间短则酸奶黏稠度低影响口感，若发酵时间过长则发酵菌株可能会失活。由图1可以看出，在发酵时间在5~9 h之间，产品感官评分呈现先增加后下降的趋势，当发酵时间为7 h时，产品状态均一，色泽光亮，感官评分达79.2。当发酵时间达到9 h时，产品出现轻微的乳清分离，影响品质。这可能是在发酵过程中，随着发酵时间的延长酸奶的酸度不断下降，从而造成酸奶中酪蛋白等其他蛋白质分子稳定性下降，进而出现蛋白质絮集、乳清分离的现象[23]，因此后续选择发酵时间7 h进行下一步实验。
2.1.2 石榴汁添加量对菌株FUA329发酵酸奶感官评分的影响
石榴汁含有大量单宁物质，添加量过大则口感酸涩，添加量过少则鞣花酸等多酚类物质含量较少。随着石榴汁添加量的不断提升，感官评分呈现先增高后下降的趋势。当石榴汁添加量为15%时，发酵后的酸奶风味达到最佳，口味适宜（图2），因此选择石榴汁15%添加量进行下一步实验。
2.1.3 蔗糖添加量对菌株FUA329发酵酸奶感官评分的影响
蔗糖添加量在5%~9%之间，酸奶的感官评分先上升后下降，当蔗糖添加量为7%时，产品口感酸甜适中（图3）。蔗糖的加入会丰富酸奶的口感，增加酸奶的黏稠度，但是蔗糖添加过量可能会逐渐掩盖酸奶的酸味，使酸奶尝起来口味偏甜，同时蔗糖添加量过多，还会影响产品菌株的发酵能力，造成产品品质下降，失去酸奶中的特有风味。
2.1.4 发酵剂接种量对菌株FUA329发酵酸奶感官评分的影响
产品发酵剂的接种量的多少主要取决于发酵剂的种类，不同类型的发酵剂接种量有所不同。酸奶的感官评分随发酵剂接种量的增加呈现先增高后下降的趋势，当发酵剂接种量在3%时，发酵出的酸奶质地柔顺，酸甜适中；当发酵剂接种量增大到5%时，发酵出的酸奶口感较酸，适口度差，感官评分低（图4）。在酸奶发酵过程中大量的发酵剂在发酵初期就使产品达到较高的酸度，同时随着发酵时间的延长菌株还在不断增长，后酸化现象严重，因此造成产品的适口度较差，感官品质下降[24]。
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图 4 发酵剂接种量对感官评分影响Figure 4. Effect of inoculating amount of fermentation agents on sensory scores2.2 响应面试验
2.2.1 FUA329发酵石榴汁酸奶响应面试验结果分析
基于单因素实验结果，菌株FUA329发酵石榴汁酸奶在7 h时产品状态达到最佳，感官评分最高，因此，控制发酵时间7 h，发酵温度37 ℃，以石榴汁添加量、蔗糖添加量、发酵剂接种量进行响应面优化试验，结果如表3所示；运用Design-Expert软件对响应值进行回归拟合，得到回归方程为：Y=79.5+0.30A+0.21B+0.11C−0.075AB−0.23AC−0.05BC−0.90A2−1.23B2−1.12C2，并对所得的回归方程进行方差分析，结果如表4所示。
表 3 响应面试验设计及结果Table 3. Experimental design and results of response surface methodology试验号 A石榴汁添加量 B蔗糖添加量 C发酵剂接种量 Y感官评分 1 0 0 0 79.5 2 1 −1 0 77.4 3 0 0 0 79.6 4 −1 0 −1 76.6 5 1 1 0 77.7 6 0 0 0 79.4 7 0 1 −1 77.3 8 0 −1 −1 77.0 9 1 0 1 77.9 10 0 0 0 79.3 11 0 0 0 79.7 12 −1 0 1 77.5 13 −1 −1 0 76.9 14 1 0 −1 77.9 15 −1 1 0 77.5 16 0 1 1 77.4 17 0 −1 1 76.9 表 4 回归模型方差分析Table 4. Variance analysis of regression model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 18.21 9 2.02 43.24 <0.0001 ** A 0.72 1 0.72 15.39 <0.0057 ** B 0.36 1 0.36 7.72 0.0273 * C 0.10 1 0.10 2.16 0.1847 AB 0.023 1 0.023 0.48 0.5104 AC 0.020 1 0.020 4.33 0.0760 BC 0.001 1 0.001 0.21 0.6579 A2 3.41 1 3.41 72.90 <0.0001 ** B2 6.32 1 6.32 1325.05 <0.0001 ** C2 5.33 1 45.33 113.90 <0.0001 ** 残差 0.33 7 0.047 失拟项 0.23 3 0.076 3.03 0.1559 不显著 纯误差 0.10 4 0.025 总和 18.54 16 R2=0.9813 R2Adj=0.9572 注：“*”表示差异显著（0.01<P<0.05），“**”表示差异极显著（P<0.01）。 由表4可知，本试验回归模型F值为43.24，P<0.01，极其显著；失拟项（P=0.1559），不显著；说明本试验的回归模型显著性和稳定性较好。其中该模型中A极显著，对产品感官评分影响较大，B显著，同样对产品感官评分具有影响；二次项A2、B2、C2极显著；交互项AB、BC、AC不显著。因此三个因素对酸奶感官评分的影响顺序为A（石榴汁添加量）>B（蔗糖添加量）>C（发酵剂接种量）。
发酵酸奶响应面等高线图如图5所示，对响应面结果分析得出石榴汁酸奶的最佳工艺条件为石榴汁添加量15.79%、蔗糖添加量7.08%、发酵剂接种量3.04%。
2.3 验证实验
为检验模型的可靠性，在发酵工艺条件为石榴汁添加量为15.79%，蔗糖添加量为7.08%，发酵剂接种量为3.04%下，进行三次平行实验。所测得的产品感官评分为79.4±1.7，与模型理论值79.5接近，因此基于响应面优化的石榴汁酸奶工艺参数优化较准确可靠。
2.4 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶基础指标测定结果
酸度、乳清析出量、色差、菌种活力是衡量酸奶品质的重要指标。由表5可知嗜热链球菌FUA329发酵酸奶的感官评分、滴定酸度与嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵酸奶的差异不显著，两株菌的产酸能力和风味物质产生水平差异不显著（P>0.05）。嗜热链球菌FUA329发酵石榴汁酸奶乳清析出量显著低于热链球菌CGMCC1.8748发酵酸奶以及未添加石榴汁的原味酸奶（P<0.05）。这可能是由于石榴汁中含有大量酚类物质，多酚和蛋白质之间相互作用可形成稳定的配合物，增加了酪蛋白网络稳定性和持水能力[25]。粉色的石榴汁造成石榴汁酸奶的色差值显著低于原味酸奶（P<0.05）。嗜热链球菌FUA329发酵石榴汁酸奶的菌种活力显著高于原味酸奶（P<0.05），初步表明石榴汁可以促进嗜热链球菌FUA329活力。
表 5 酸奶样品基础指标对比Table 5. Comparison of basic indicators of yogurt samples酸奶种类 感官评分 滴定酸度（°T） 乳清析出量（%） 色差 菌种活力OD600 嗜热链球菌FUA329原味酸奶 75.7±1.9b 76.3±1.2b 12.25±0.85b 91.97±2.97a 1.78±0.03c 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶 79.5±1.7a 82.5±1.3a 9.6±0.97d 68.17±2.75b 2.01±0.03a 嗜热链球菌CGMCC1.8748原味酸奶 76.1±1.5b 75.7±1.3b 13.56±0.82a 92.97±2.14a 1.87±0.02b 嗜热链球菌CGMCC1.8748石榴汁酸奶 78.9±1.6a 80.8±1.4a 10.7±0.72c 68.22±1.95b 1.96±0.01a 注：同列不同小写字母表示存在显著性差异（P<0.05）；表6同。 2.5 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶抗氧化能力检测结果
嗜热链球菌FUA329发酵的两种酸奶与嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵的两种酸奶的DPPH自由基清除率、ABTS＋自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率结果如表6所示。嗜热链球菌FUA329菌株发酵石榴汁酸奶的DPPH、ABTS＋、超氧阴离子自由基清除率显著高于嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵石榴汁酸奶（P<0.05）；石榴汁酸奶抗氧化活性显著高于原味酸奶（P<0.05），可能是石榴汁中含有的具有抗氧化活性的多酚、蛋白质所致[26−27]。
表 6 酸奶样品抗氧化能力对比Table 6. Comparison of antioxidant capacity of yogurt samplesDPPH自由基清除率（%） ABTS+自由基清除率（%） 超氧阴离子自由基清除率（%） 嗜热链球菌FUA329原味酸奶 66.32±1.36 c 66.70±1.90 c 54.13±0.81c 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶 82.87±1.48a 88.20±2.10a 76.92±1.02 a 嗜热链球菌CGMCC1.8748原味酸奶 63.99±1.46 c 60.90±1.21c 52.27±1.17c 嗜热链球菌CGMCC1.8748石榴汁酸奶 73.50±1.39 b 83.80±1.73b 68.64±1.23b 2.6 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶流变学检测结果
表观黏度可从侧面反映样品的结构及稳定性，是感官评价的重要组成部分[28]。两种菌发酵酸奶的表观黏度都随剪切速率的增长而下降。石榴汁酸奶的黏度随剪切速率的变化曲线如图6所示。嗜热链球菌FUA329和 CGMCC1.8748发酵后的石榴汁酸奶黏度在受外界干扰方面差异不显著。两种酸奶剪切应力变化均呈现剪切变稀的曲线特征，剪切应力都随剪切速率的增大而增大，但是当剪切速率达到一定值时，剪切应力增长速率变得缓慢，表明二者流变特性相近。
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图 6 石榴汁酸奶剪切应力（A）及黏度曲线（B）Figure 6. Shear stress (A) and viscosity curve (B) of pomegranate juice yogurt2.7 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶发酵前后尿石素A检测结果
尿石素A比鞣花酸具有更高的生物利用度，且具有缓解肌肉衰退等多种生物学活性，因此，转化食品中的鞣花酸生成尿石素A可显著提高食品的保健功效[29]。采用高效液相色谱法测定嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶中的鞣花酸代谢产生尿石素A的含量，检测结果如图7所示。嗜热链球菌FUA329发酵7 h后石榴汁酸奶中的尿石素A含量为3.31 μmol/L，鞣花酸转化为尿石素A的转化率为35.7%。嗜热链球菌FUA329转化石榴汁中鞣花酸生成尿石素A的最佳时间为48 h[30]。本研究酸奶最佳发酵时间为7 h，因此，鞣花酸转化生成尿石素A的转化率偏低。
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图 7 高效液相色谱测定嗜热链球菌FUA329、嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵石榴汁酸奶对鞣花酸和尿石素A含量的影响注：A. 鞣花酸和尿石素A标准品；B. 菌株FUA329未发酵石榴汁酸奶；C. 菌株FUA329发酵7 h的石榴汁酸奶；D. 菌株CGMCC1.8748未发酵石榴汁酸奶；E. 菌株CGMCC1.8748发酵7 h的石榴汁酸奶。Figure 7. Effect of pomegranate juice yogurt fermented by S. thermophilus FUA329 and S. thermophilus CGMCC1.8748 on the content of ellagic acid and urolithin A determined by high performance liquid chromatography3. 结论
通过单因素结合响应面试验优化获得了嗜热链球菌FUA329发酵制备石榴汁酸奶的发酵工艺。嗜热链球菌FUA329与嗜热链球菌CGMCC1.8748 发酵添加和不添加石榴汁酸奶在风味和品质上差异不显著。菌株FUA329发酵石榴汁酸奶的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率显著高于菌株FUA329发酵原味酸奶以及嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵石榴汁酸奶（P<0.05）。嗜热链球菌FUA329发酵石榴汁酸奶7 h，尿石素A含量达到3.31 μmol/L，鞣花酸转化为尿石素A的转化率为35.7%。本研究为利用嗜热链球菌FUA329制备功能性石榴汁酸奶提供了一定的参考数据。
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图 4 发酵剂接种量对感官评分影响
Figure 4. Effect of inoculating amount of fermentation agents on sensory scores
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图 6 石榴汁酸奶剪切应力（A）及黏度曲线（B）
Figure 6. Shear stress (A) and viscosity curve (B) of pomegranate juice yogurt
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图 7 高效液相色谱测定嗜热链球菌FUA329、嗜热链球菌CGMCC1.8748发酵石榴汁酸奶对鞣花酸和尿石素A含量的影响
注：A. 鞣花酸和尿石素A标准品；B. 菌株FUA329未发酵石榴汁酸奶；C. 菌株FUA329发酵7 h的石榴汁酸奶；D. 菌株CGMCC1.8748未发酵石榴汁酸奶；E. 菌株CGMCC1.8748发酵7 h的石榴汁酸奶。
Figure 7. Effect of pomegranate juice yogurt fermented by S. thermophilus FUA329 and S. thermophilus CGMCC1.8748 on the content of ellagic acid and urolithin A determined by high performance liquid chromatography
表 1 响应面试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 因素 A石榴汁添加量（%） B蔗糖添加量（%） C发酵剂接种量（%） −1 10 6 2 0 15 7 3 1 20 8 4 
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表 2 酸奶样品感官评分标准
Table 2 Sensory scoring criteria for yogurt samples
评价指标 评分标准 分值
外观颜色呈乳白色或稍带黄色，色泽均匀一致 14~20 呈微黄色或稍带红色，色泽不均匀 7~13 颜色异常，出现灰暗或红色等其他颜色 0~6
气味奶香味浓郁，有乳酸菌发酵后的香气 14~20 奶香气味微弱，稍有奶腥味或稍带异味 7~13 有鱼腥味，酒精发酵气味或其他不良气味 0~6
口感口感细腻，爽口 14~20 口感略粗糙，不爽口 7~13 口感非常粗糙，有颗粒状物且不爽口 0~6
状态均匀，无气泡，几乎无乳清析出， 黏稠度适宜，
状态稳定14~20 不均匀，有微量气泡，有明显乳清析出， 黏度稀，
且不太稳定7~13 凝乳不良，有气泡，乳清严重析出， 黏度很稀，
非常不稳定0~6
酸甜度酸甜适口 14~20 酸味重或者不适口 7~13 有苦味，涩味或其他不良滋味 0~6
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表 3 响应面试验设计及结果
Table 3 Experimental design and results of response surface methodology
试验号 A石榴汁添加量 B蔗糖添加量 C发酵剂接种量 Y感官评分 1 0 0 0 79.5 2 1 −1 0 77.4 3 0 0 0 79.6 4 −1 0 −1 76.6 5 1 1 0 77.7 6 0 0 0 79.4 7 0 1 −1 77.3 8 0 −1 −1 77.0 9 1 0 1 77.9 10 0 0 0 79.3 11 0 0 0 79.7 12 −1 0 1 77.5 13 −1 −1 0 76.9 14 1 0 −1 77.9 15 −1 1 0 77.5 16 0 1 1 77.4 17 0 −1 1 76.9
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表 4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 18.21 9 2.02 43.24 <0.0001 ** A 0.72 1 0.72 15.39 <0.0057 ** B 0.36 1 0.36 7.72 0.0273 * C 0.10 1 0.10 2.16 0.1847 AB 0.023 1 0.023 0.48 0.5104 AC 0.020 1 0.020 4.33 0.0760 BC 0.001 1 0.001 0.21 0.6579 A2 3.41 1 3.41 72.90 <0.0001 ** B2 6.32 1 6.32 1325.05 <0.0001 ** C2 5.33 1 45.33 113.90 <0.0001 ** 残差 0.33 7 0.047 失拟项 0.23 3 0.076 3.03 0.1559 不显著 纯误差 0.10 4 0.025 总和 18.54 16 R2=0.9813 R2Adj=0.9572 注：“*”表示差异显著（0.01<P<0.05），“**”表示差异极显著（P<0.01）。
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表 5 酸奶样品基础指标对比
Table 5 Comparison of basic indicators of yogurt samples
酸奶种类 感官评分 滴定酸度（°T） 乳清析出量（%） 色差 菌种活力OD600 嗜热链球菌FUA329原味酸奶 75.7±1.9b 76.3±1.2b 12.25±0.85b 91.97±2.97a 1.78±0.03c 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶 79.5±1.7a 82.5±1.3a 9.6±0.97d 68.17±2.75b 2.01±0.03a 嗜热链球菌CGMCC1.8748原味酸奶 76.1±1.5b 75.7±1.3b 13.56±0.82a 92.97±2.14a 1.87±0.02b 嗜热链球菌CGMCC1.8748石榴汁酸奶 78.9±1.6a 80.8±1.4a 10.7±0.72c 68.22±1.95b 1.96±0.01a 注：同列不同小写字母表示存在显著性差异（P<0.05）；表6同。
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表 6 酸奶样品抗氧化能力对比
Table 6 Comparison of antioxidant capacity of yogurt samples
DPPH自由基清除率（%） ABTS+自由基清除率（%） 超氧阴离子自由基清除率（%） 嗜热链球菌FUA329原味酸奶 66.32±1.36 c 66.70±1.90 c 54.13±0.81c 嗜热链球菌FUA329石榴汁酸奶 82.87±1.48a 88.20±2.10a 76.92±1.02 a 嗜热链球菌CGMCC1.8748原味酸奶 63.99±1.46 c 60.90±1.21c 52.27±1.17c 嗜热链球菌CGMCC1.8748石榴汁酸奶 73.50±1.39 b 83.80±1.73b 68.64±1.23b
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1. 李兴阳，王贝琦，郭超，操慧，于瑞莲，王琴. 蝉花孢子油的提取工艺优化及对炎症和肠上皮细胞氧化损伤的影响. 食品工业科技. 2025(05): 187-195 . 
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