Optimization of Extraction Process of Isaria cicadae Miquel Spore Oil and Effect on Inflammation and Oxidative Damage of Intestinal Epithelial Cells
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摘要: 本研究利用溶剂提取法对人工蝉花孢子粉中的脂类成分连续回流提取，基于单因素实验结果设计响应面试验优化提取工艺，以最大限度地提高蝉花孢子油的得油率，分析其组成并通过实验探究其体外抗炎活性及其对肠上皮细胞氧化损伤修复的影响。结果显示，在液固比为12:1、55 ℃的条件下连续回流提取3 h后，蝉花孢子油得油率最高，为2.626%±0.04%。气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测分析共得到25种成分，其中包含18种脂肪酸成分，占比为87.86%。体外实验结果表明，蝉花孢子油浓度在20~200 μg/mL时能够明显提高RAW264.7细胞存活率，显著促进LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌至正常生理值（P<0.001）；蝉花孢子油浓度在60~200 μg/mL时，能够显著促进H2O2诱导的Caco-2细胞的增殖（P<0.01）；蝉花孢子油浓度在40~100 μg/mL时，能够显著增强Caco-2细胞的迁移能力（P<0.05）。因此，蝉花孢子油具有潜在的促进肠上皮细胞的氧化损伤的修复作用。作为由新食品原料提取得到的成分，在开发针对炎性肠病肠黏膜损伤的特殊医学用途配方食品方面具有应用前景。Abstract: This study utilized solvent extraction to continuously reflux extract the lipid components of cultural Isaria cicadae Miquel spore powder, optimized the extraction process to maximize the yield of Isaria cicadae Miquel spores oil based on the single-factor experiments, and response surface analysis, explored its composition, anti-inflammatory activity in vitro and potential effects on repairing oxidative damage of intestinal epithelial cells. Results indicated that under the conditions of a liquid-solid ratio of 12:1 and a temperature of 55 ℃, the highest yield of Isaria cicadae Miquel spore oil was obtained after continuous countercurrent extraction for 3 hours, reaching 2.626%±0.04%. Additionally, 25 compounds were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis, including 18 fatty acids, accounting for 87.86%. In vitro experiments demonstrated that Isaria cicadae Miquel spore oil at concentrations of 20~200 μg/mL, significantly increased RAW264.7 cell survival rate and significantly promoted cellular NO secretion to normal physiological levels under LPS-induced conditions (P<0.001). Moreover, at concentrations of 60~200 μg/mL, Isaria cicadae Miquel spore oil significantly promoted the proliferation of H2O2-induced Caco-2 cells (P<0.01), while concentrations of 40~100 μg/mL significantly enhanced the migration ability of Caco-2 cells (P<0.05). Thus, Isaria cicadae Miquel spore oil has the potential to promote the repair of oxidative damage to intestinal epithelial cells. As a component extracted from novel food materials, it holds promise for the development of foods for special medical purposes, targeting inflammatory bowel disease and intestinal mucosal injury.
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蝉花（Isaria cicadae Miquel，IcM）是一种具有重要药用价值的可食用真菌，并且通过安全性评估获批为新食品原料[1]。研究显示，蝉花具有抑制基质金属蛋白酶和基质蛋白合成的能力，可以减少胶原纤维的沉积和组织纤维化[2]。蝉花中的活性成分能够抑制炎症介质的释放，减轻肠道炎症反应，从而减缓纤维化的发展[3]。除此之外，实验室的前期研究中还证实了蝉花具有抗炎、抗氧化、修复5-氟尿嘧啶损伤的肠粘膜、对抗三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的肠道纤维化等作用[2−5]。目前90%以上炎性肠病患者都伴随着营养缺乏的症状，药物治疗与生物制剂治疗都有严重的副作用，肠内营养制剂辅助正成为控制疾病进展的重要方法。国外的肠内营养制剂属于特医食品，但国内属于药品，随着《食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则》的发布[6]，作为肠内营养补充的首选的特殊医学用途配方食品（FSMP），改变了其原先的药物属性，确定为食品。对于蝉花成分研究主要偏重于水溶性成分核苷类及多糖类[7]，而对油脂类成分的开发研究相对较少。灵芝孢子油开发以及市场应用的巨大成功[8−11]，为蝉花孢子油的研究与开发提供了重要的参考价值。
野生条件下的蝉花药效成分受自然环境以及采摘条件的制约，蝉花孢子粉很难得以保留，限制了其商业价值的开发。而人工蝉花在人工环境下采用固定的配方进行繁育，保证了蝉花孢子粉的完整和药效成分的稳定[12]。常见的油脂类提取方法主要有索氏提取法、超临界CO2萃取法、微波提取法、超声提取法[13−15]等，其中索氏提取法可以高效地提取样品中的油脂类成分，包括脂肪酸、甘油三酯等，从而获得较高纯度的油脂样品[16]。该方法操作简单，且提取的油脂样品质量稳定可靠，能够有效地保持脂肪酸的活性，有利于实验数据的准确性和可重复性。
因此本实验采用索氏提取法，对专利菌种Y.R.L-3栽培所得蝉花孢子粉中的油脂类成分进行提取优化。为了更好地开发蝉花孢子油的应用价值，本实验设计响应面试验优化提取工艺，通过气相色谱质谱联用技术（GC-MS）鉴定其成分组成。同时通过体外实验构建炎症和肠上皮细胞氧化损伤模型，对蝉花孢子油治疗肠道炎症性疾病进行初步探索，为人工蝉花的高效利用提供新的方向。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
RAW264.7细胞、Caco-2细胞 南京中医药大学药理实验室提供；蝉花孢子粉 本实验室人工栽培收集得到；石油醚（30~60 ℃沸程） 国药集团；正己烷（色谱级） 永华化学股份有限公司；氢氧化钠（分析纯） 泰坦科技有限公司；磷酸盐缓冲液（Phosphate belanced solution，PBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素与链霉素溶液 南京森贝伽生物科技有限公司；胎牛血清 诺维赞生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT） 广州赛国生物科技有限公司；二甲基亚砜DMSO、脂多糖LPS 南京建成生物科技有限公司；NO含量检测试剂盒 上海碧云天生物科技有限公司；无水乙醇 分析纯，无锡亚盛化工有限公司。
Q-500B型高速多功能粉碎机 上海冰都电器有限公司；TQ8050型气相色谱质谱联用仪 日本岛津；SW-CJ-2G型超净工作台 苏州净化实验设备有限公司；YCP-50型CO2培养箱 长沙华曦电子科技有限公司；XD-202型倒置显微镜 江南永新光学有限公司；Spectra Max 190型酶标仪 美谷分子仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 人工蝉花孢子油的制备
将人工蝉花孢子粉经高速多功能粉碎机破壁，称取m0 g破壁孢子粉，以30~60 ℃沸程的石油醚作为溶剂，利用索氏提取装置以不同料液比，提取温度，提取时间进行回流提取，提取结束后将滤纸筒取出回收溶剂，待溶剂回收完毕，取下提取瓶，收集孢子油，称重记录为m1 g，并计算得油率[17]。
蝉花孢子油得油率(%)=m1m0×100 式中：m0表示所用破壁孢子粉质量；m1表示提取得到的孢子油的质量。
1.2.2 单因素实验
根据孙贺春等[18]提取灵芝孢子油的方法，结合课题组对蝉花成分分析的初步研究，设置单因素实验，以提取温度为55 ℃，提取时间为3 h，液固比为12:1为基础条件，分别探究液固比（8:1、10:1、12:1、14:1、16:1）、提取温度（40、45、50、55、60 ℃）、提取时间（1、2、3、4、5 h）对孢子油得油率的影响。
1.2.3 响应面优化提取条件
根据单因素实验结果，取合适的条件区间：液固比区间为10:1~14:1；提取温度区间为50~60 ℃；提取时间区间为2~4 h。以孢子油得油率为响应值，通过Design-Expert 10.1.1设计三因素三水平Box-Behnken试验（表1）。
表 1 响应面试验的因素水平Table 1. Factors and levels of response surface experiment水平 因素 A液固比 B提取时间（h） C提取温度（℃） −1 10:1 2 50 0 12:1 3 55 1 14:1 4 60 1.2.4 验证实验
根据Box-Behnken实验结果，对比响应面模拟的最优提取条件，通过对比其工艺优化后得油率与预测得油率来验证其工艺优化的可靠性。将最优条件下提取得到的蝉花孢子油放入−20 ℃冰箱保存，用于后续实验使用。
1.2.5 孢子油成分分析
参照凡军民等[19]的方法稍作修改。取上述制备的蝉花孢子油100 mg，加入 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL摇匀，40 ℃水浴15~20 min，取出冷却，加入10 mL正己烷溶解，静置10 min，取上清液过0.22 μm滤膜。色谱条件：色谱柱：DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm；柱温：60 ℃保持3 min，以15 ℃/min速率升至160 ℃，以8 ℃/min速率升至210 ℃，以3.15 ℃/min速率升至230 ℃，保持20 min，以20 ℃/min速率升至280 ℃，保持2 min。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，进样口温度270 ℃，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，溶剂延迟5 min，全扫描模式，质谱扫描范围：40~400 amu。实验数据采用AMDIS软件进行分析，共检出145个色谱峰，导入NIST14数据库进行质谱图比对，分析得到其化学组成以及相对峰面积，按峰面积归一法计算各成分在孢子油中的相对含量。
1.2.6 细胞培养
RAW264.7细胞和Caco-2细胞的完全培养液由89%高糖DMEM、10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素溶液组成。细胞复苏后于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。当细胞培养瓶里的细胞密度达到80%~90%时，进行传代培养。
1.2.7 人工蝉花孢子油体外抗炎活性的研究
1.2.7.1 MTT法检测RAW264.7细胞活力
RAW264.7细胞常被用于炎症反应的实验研究[20−21]。将呈对数生长期的RAW264.7细胞以每孔1×104的个数，180 μL的体积接种于96孔板中，每组设置6个平行，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。每孔分别加入20 μL不同浓度的DMSO溶液（0.1%、0.5%、1%、2%）和蝉花孢子油溶液（20、80、200 μg/mL），放回细胞培养箱继续培养24 h后，每孔加入20 μL浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，放入恒温箱避光孵育4 h，吸去孔板中溶液，加150 μL DMSO溶液，避光摇床振荡10 min，使用酶标仪检测490 nm 波长处的OD值，并计算其存活率。
1.2.7.2 蝉花孢子油对LPS刺激RAW264.7细胞分泌NO量的影响
将呈对数生长期的RAW264.7细胞以1×104/孔，160 μL/孔接种于96孔板中，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。每组设置6个复孔，分为对照组、LPS组、实验组。除对照组外，其余每组每孔分别加入20 μL的LPS溶液（1 μg/mL），诱导4 h后，实验组每孔分别加入不同浓度的蝉花孢子油溶液（20、80、200 μg/mL），对照组加入等体积的完全培养基作为空白对照，继续孵育24 h后，收集细胞上清液，使用NO试剂盒测定不同条件下RAW264.7细胞NO的释放量。
1.2.8 人工蝉花孢子油对肠上皮细胞氧化损伤的修复作用研究
1.2.8.1 H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的建立
将呈对数生长的Caco-2细胞消化后，稀释至1×104个/孔，180 μL/孔接种于96孔板，每组均设6个复孔，37 ℃，5% CO2条件下培养一段时间，待细胞贴壁后，每孔分别加入20 μL H2O2溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.8 mmol/L），放回CO2培养箱继续孵育24 h后，每孔加入20 μL浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，放入恒温箱避光孵育4 h，吸去孔板中溶液，加150 μL DMSO溶液，避光摇床振荡10 min，使用酶标仪检测490 nm 波长处的OD值，并计算其存活率[22−23]。
1.2.8.2 蝉花孢子油对H2O2刺激后Caco-2细胞活力的影响
将呈对数生长期的Caco-2细胞以1×104/孔，160 μL/孔接种于96孔板中，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。分为对照组、H2O2模型组、实验组，每组设置6个复孔。除对照组外，其余每孔均加入20 μL H2O2溶液并孵育4 h。实验组每孔分别加入20 μL不同浓度的蝉花孢子油溶液（20、40、60、80、100、150、200 μg/mL），对照组加入等体积的完全培养基作为空白对照，放入CO2培养箱继续培养24 h，每孔加入20 μL浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，放入恒温箱避光孵育4 h，吸去孔板中溶液，加150 μL DMSO溶液，避光摇床振荡10 min，使用酶标仪检测490 nm 波长处的OD值，并计算其存活率。
1.2.8.3 蝉花孢子油对Caco-2细胞迁移能力的影响
采用划痕实验评估蝉花孢子油对Caco-2细胞迁移能力的影响。Caco-2细胞按5×105个/孔的细胞数接种于6孔板，每孔体积为2 mL。在37 ℃，5% CO2条件下贴壁生长至90%以上，用200 μL无菌枪头垂直均匀划痕，用PBS缓慢洗去脱落细胞，清洗三次。分别加入含不同浓度的蝉花孢子油的完全培养基2 mL（40、60、80、100 μg/mL）（含1%胎牛血清）干预24 h后，倒置显微镜下观察并拍照记录0、12和24 h的划痕情况，计算细胞迁移率[24−25]。计算公式如下：
细胞迁移率(%)=S0−S迁移S0×100 式中：S0表示细胞在0时的划痕面积；S迁移表示细胞在某一时刻的划痕面积。
1.3 数据处理
进行三次重复，取三次实验平均值，数值结果均以平均值±标准差的形式呈现。采用GraphPad Prism Ver. 8.0.2和Design Expert.10软件进行数据分析及图片绘制，统计学差异比较采用普通单向方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 提取条件对得油率的影响
实验结果表明（图1a），随着液固比的增大，人工蝉花孢子粉的得油率呈现先增大后减小的趋势，当液固比为12:1时，得油率达到最大，继续增大提取溶剂的体积，孢子油得油率反而降低，这说明孢子粉所含油量与提取溶剂达到饱和后，一部分孢子油会随着过量溶剂的挥发而相应损耗。因此选取12:1为最佳液固比。
由图1b可知，孢子油的得油率随着温度升高而升高，在55 ℃时达到峰值，随后呈现下降趋势，分析其原因是所用提取溶剂石油醚的沸程在30~60 ℃，当温度达到60 ℃时，会产生剧烈沸腾，从而溶剂的挥发速度也随之加快，因此导致孢子油的损失加重。因此选取55 ℃为最佳提取温度。
适当延长提取时间能有效提高孢子油的得油率，然而实验结果显示（图1c），当提取时间超过3 h以后，溶剂的萃取效果趋于饱和，得油率增加不再明显，考虑节约时间成本，选取3 h为最佳提取时间。
2.2 响应面试验结果
采用响应面软件Design-Expert.10对试验结果（表2）进行处理，建立二次回归模型，得回归方程为：Y=2.49+0.14A+0.17B+0.037C−0.13AB−0.019AC−0.077BC−0.27A2−0.29B2−0.32C2，R2=0.9989，R2Adj=0.9975，表明模型拟合程度好。由表3可知：模型P<0.0001极为显著，具有统计学意义，因素A、B、C对试验结果均为极显著影响（P<0.001），失拟项不显著，说明试验误差小、可信度高，蝉花孢子油的提取效果能用该模型进分析。根据F值可以看出，各因素的影响大小为：B（提取时间）>A（液固比）>C（提取温度），且AB与BC间交互作用极显著（P<0.001）。
表 2 响应面试验结果Table 2. Results of response surface experiments试验号 因素 A：液固比 B：提取时间（h） C：提取温度（℃） 得油率（%） 1 12:1 3 55 2.506 2 14:1 2 55 2.026 3 12:1 4 60 2.016 4 10:1 2 55 1.504 5 12:1 4 50 2.088 6 12:1 2 60 1.824 7 10:1 3 60 1.812 8 14:1 3 50 2.032 9 10:1 3 50 1.708 10 12:1 3 55 2.478 11 10:1 4 55 2.112 12 14:1 3 60 2.062 13 14:1 4 55 2.098 14 12:1 3 55 2.508 15 12:1 3 55 2.468 16 12:1 2 50 1.590 17 12:1 3 55 2.492 表 3 二次响应面回归模拟方差分析Table 3. Secondary response surface regression analysis of variance table类型 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.70 9 0.19 708.54 <0.0001 *** A-液固比 0.15 1 0.15 548.91 <0.0001 *** B-提取时间 0.23 1 0.23 880.02 <0.0001 *** C-提取温度 0.011 1 0.011 41.08 0.0004 *** AB 0.072 1 0.072 269.41 <0.0001 *** AC 0.001369 1 0.001369 5.14 0.0578 BC 0.023 1 0.023 87.81 <0.0001 *** A2 0.30 1 0.30 1114.96 <0.0001 *** B2 0.35 1 0.35 1325.48 <0.0001 *** C2 0.43 1 0.43 1629.40 <0.0001 *** 残差 0.001866 7 0.002666 失拟项 0.006550 3 0.002183 0.72 0.5896 不显著 纯误差 0.001211 4 0.003028 总变异 1.70 16 R2=0.9989，R2Adj=0.9975 注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异较显著（P<0.01）；***表示差异极显著（P<0.001）。 图2为各因素的响应面3D曲面图及等高线图，响应面曲面的坡度直接反映各因素发生变化时孢子油得油率的响应灵敏程度[26]。图中AB的坡度较AC和BC更加陡峭，BC的坡度较AC更加陡峭。同时响应面的3D曲面图可以映射出不同因素之间交互作用对蝉花孢子油得油率的影响，等高线越接近椭圆，证明两个因素之间的交互作用越明显[27−28]。图中AB的等高线图最接近椭圆，其次是BC的等高线，AC的等高线椭圆特征不明显。综合来看，液固比与提取时间的交互作用最为明显，其次是提取温度与提取时间的交互作用，最后是液固比与提取温度的交互作用。
2.3 验证实验结果
通过拟合方程及响应面分析得出的最佳提取条件为：液固比为12.383:1，提取时间为3.249 h，提取温度为55.113 ℃，得油率为2.525%。在此条件基础上，考虑实际操作，修正提取条件为液固比12:1、提取时间3 h、提取温度55 ℃，并重复三次验证实验，得油率为2.626%±0.04%，与预测值无显著差异。
2.4 孢子油成分分析结果
通过GC-MS检测得到蝉花孢子油总离子流图（图3），利用总离子流图各峰对应的质谱图，通过NIST14谱库按照80%的匹配度进行筛选，共鉴定出25种化合物，如表4所示。其中含18种脂肪酸，占孢子油成分总含量的87.86%，这与先前的实验研究相符[29]。其中包括亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、花生酸、反式维生素A酸、山嵛酸等，这与灵芝孢子油中的脂肪酸成分具有高度的相似性[30]。按照相对含量来看，蝉花孢子油中含量最高的成分依次为亚油酸、油酸、棕榈酸、反式维生素A酸和棕榈油酸，这些成分占孢子油成分总含量的83.71%，且都为不饱和脂肪酸，它们在抗氧化以及消除机体炎症方面具有很好的效果，如亚油酸、硬脂酸等，它们被证实可以减少极化的RAW264.7细胞中NO的释放[9]。除此之外，还包含少量的三萜类成分角鲨烯以及芳香烃类成分。
表 4 GC-MS成分分析结果Table 4. GC-MS composition analysis results序号 保留时间（min） 名称 分子式 相对含量（%） 1 7.194 壬醛 C9H18O 0.53 2 10.645 壬醛酸甲酯 C10H18O3 0.24 3 12.55 肉豆蔻醛 C14H28O 0.38 4 13.51 正十七烷 C17H36 0.23 5 13.702 十五醛 C15H30O 0.27 6 13.78 肉豆蔻酸甲酯 C15H30O2 0.55 7 14.065 正二十一烷 C21H44 0.09 8 14.62 顺-7-十六碳烯醛 C16H30O 0.21 9 14.94 十五烷酸甲酯 C16H32O2 0.33 10 15.865 棕榈油酸甲酯 C17H32O2 3.32 11 16.125 棕榈酸甲酯 C17H34O2 17.70 12 16.5 邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4 0.21 13 16.94 棕榈酸乙酯 C18H36O2 0.17 14 17.375 14-甲基十六烷酸甲酯 C18H36O2 0.31 15 18.325 亚油酸甲酯 C19H34O2 27.09 16 18.45 油酸甲酯 C19H36O2 22.45 17 18.51 反式维生素A酸甲酯 C19H36O2 13.15 18 18.81 硬脂酸甲酯 C19H38O2 0.69 19 20.17 二氢甾醇甲酯 C20H38O2 0.31 20 21.67 顺-11-二十烯酸甲酯 C21H40O2 0.55 21 22.155 花生酸甲酯 C21H42O2 0.61 22 26.868 山嵛酸甲酯 C23H46O2 0.04 23 30.37 二十三酸甲酯 C24H48O2 0.08 24 35.03 木焦油酸甲酯 C25H50O2 0.06 25 39.495 角鲨烯 C30H50 0.51 2.5 体外抗炎活性实验结果
2.5.1 DMSO溶剂对RAW264.7细胞存活率的影响
蝉花孢子油是一种天然活性油脂，不易溶于细胞培养基，因此在开展细胞实验之前需要先使用DMSO溶解，再配制成不同浓度的含药培养基。通常认为DMSO浓度小于0.1%对细胞几乎无影响，但事实上不同细胞对DMSO的耐受力是不同的[31−32]。如图4所示，DMSO的浓度在0.1%~0.5%时对细胞毒性无影响，当浓度达到1%后，对细胞存活率出现极显著影响（P<0.001）。说明当DMSO浓度达到1%时会对RAW264.7细胞产生细胞毒性，因此后续实验为了排除溶剂对结果的影响，选用0.1%的DMSO作为该实验所用孢子油的溶剂。
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图 4 DMSO对RAW264.7细胞存活率的影响注：与Control组相比，***P<0.001。Figure 4. Effect of DMSO on survival rate of RAW264.7 cells2.5.2 不同浓度蝉花孢子油对RAW264.7细胞存活率的影响
如图5所示，蝉花孢子油浓度在20 μg/mL时对RAW264.7细胞无显著影响，随着浓度增加，细胞存活率也逐渐增加，当孢子油浓度达到80 μg/mL之后，蝉花孢子油开始呈现对RAW264.7细胞的促增殖作用，并且当浓度达到200 μg/mL时，促增殖作用最为显著，与Control组相比出现极显著差异（P<0.001），整体上看对细胞的促增殖作用呈现浓度相关性。根据MTT实验结果可以看出，蝉花孢子油在20~200 μg/mL之间不会对RAW264.7细胞产生细胞毒性，并且对细胞有促增殖的作用。
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图 5 蝉花孢子油对RAW264.7细胞存活率的影响注：与Control组相比，*P<0.05，***P<0.001。Figure 5. Effect of IcM spore oil on survival rate of RAW264.7 cells2.5.3 蝉花孢子油对RAW264.7细胞NO分泌量的影响
基于图6所示结果，与对照组相比，LPS刺激后，RAW264.7细胞NO的释放量明显增加，与Control相比差异极显著（P<0.001），在不同浓度的蝉花孢子油（20~200 μg/mL）的处理下，实验组细胞NO释放量降低，与LPS组相比差异极显著（P<0.001）。通过探究蝉花孢子油对LPS刺激的RAW264.7细胞一氧化氮（NO）分泌量的影响，来评估药物的抗炎活性[33]。NO是一种重要的炎症介质，在炎症过程中起着调节炎症反应、杀伤微生物和促进组织修复等作用[34]。蝉花孢子油对LPS刺激的RAW264.7细胞NO分泌量的影响，可能是通过抑制iNOS的表达或活性来实现的。通过多种机制作用于细胞内，例如抑制炎症信号通路、调节转录因子活性、减少氧化应激等，最终减少iNOS的表达和NO的合成。实验结果说明，细胞炎症模型建立成功，且蝉花孢子油能够降低NO的分泌量，抑制LPS引起的炎症反应，表明其具备一定的抗炎活性。
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图 6 蝉花孢子油对LPS诱导后RAW264.7细胞分泌NO含量的影响注：与Control组比较，###P<0.001；与LPS组比较， ***P<0.001。Figure 6. Effect of IcM spore oil on NO content secreted by RAW264.7 cells after LPS induction2.6 氧化损伤的保护作用
2.6.1 H2O2刺激的Caco-2细胞氧化损伤模型建立
Caco-2细胞作为一种人克隆结肠癌细胞，结构和功能类似小肠上皮细胞，常被用作构建肠上皮模型[35−36]。通过测定不同浓度H2O2处理后Caco-2细胞的存活率，判断H2O2对Caco-2细胞氧化损伤的程度，从而选取最佳造模浓度。如图7所示，随着H2O2浓度的增加Caco-2细胞存活率逐渐降低。当H2O2浓度为1.2 mmol/L时，Caco-2细胞存活率约为57.58%，此时细胞浓度最接近半数抑制浓度（IC50），且与对照组相比具有极显著性差异（P<0.001），因此，选取1.2 mmol/L H2O2作为后续实验的造模浓度。
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图 7 不同浓度H2O2对Caco-2细胞存活率的影响注：与Control组相比，**P<0.01，***P<0.001。Figure 7. Effect of different H2O2 concentrations on survival rate of Caco-2 cells2.6.2 蝉花孢子油对H2O2刺激后Caco-2细胞存活率的影响
图8呈现了蝉花孢子油对H2O2诱导后Caco-2细胞存活率的影响。如图8所示，随着蝉花孢子油浓度的升高，细胞存活率逐渐上升，当达到60 μg/mL时开始呈现显著性差异（P<0.01），当浓度在80~200 μg/mL时与H2O2模型组相比差异极显著（P<0.001），表明蝉花孢子油能够有效提高H2O2诱导的Caco-2细胞的存活率。当细胞暴露于过氧化氢后，细胞内的氧化损伤会增加，导致细胞的损伤和死亡，细胞的存活率显著降低。然而，蝉花孢子油的介入显著提升了氧化损伤后Caco-2细胞的存活率，且呈现浓度依赖性。说明蝉花孢子油可以通过减轻氧化应激的程度，促进细胞内抗氧化防御系统的活性，修复氧化损伤，从而提高细胞的存活率，证实了蝉花孢子油具有一定的抗氧化和细胞修复的作用。
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图 8 蝉花孢子油对H2O2刺激后Caco-2细胞存活率的影响注：与Control组相比，###P<0.001；与H2O2组相比，**P<0.01，***P<0.001。Figure 8. Effect of IcM spore oil on survival rate of H2O2-induced Caco-2 cells2.6.3 蝉花孢子油对Caco-2细胞迁移能力的影响
通过划痕实验，利用不同浓度的蝉花孢子油处理Caco-2细胞，通过观察细胞的迁移情况，来判断其对肠道损伤的修复能力。根据实验结果（图9a），观察不同时间点记录的图片可以发现Caco-2在不经任何处理的情况下也会发生迁移，蝉花孢子油干预后，迁移率有所增加。如图9b所示，对细胞划痕后24 h的细胞迁移率进行量化，当蝉花孢子油浓度在40~60 μg/mL时，Caco-2细胞的迁移率显著增加（P<0.05）；浓度在80~100 μg/mL时，细胞迁移率增加更加显著（P<0.01）。总体来看，蝉花孢子油可以通过提高Caco-2细胞迁移率来促进细胞修复，具有修复受损肠道的潜力，其修复效果可能和其含有的丰富不饱和脂肪酸有关，但仍有待实验进一步验证。
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图 9 蝉花孢子油对Caco-2细胞迁移率的影响注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 9. Effect of IcM spore oil on the migration rate of Caco-2 cells3. 结论
本研究利用索氏提取装置对实验室人工培育的蝉花孢子粉中的油脂进行回流提取，制备了蝉花孢子油，并且通过单因素实验和响应面试验优化了最佳提取条件：液固比12:1、提取温度55 ℃、提取时间3 h。通过气相色谱质谱联用技术检测出蝉花孢子油中含有25种化合物，其中含18种脂肪酸，占比高达87.86%。其中包含了亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、花生酸、反式维生素A酸、山嵛酸等成分。证明了在该工艺条件下提取的蝉花孢子油成分稳定，脂肪酸较全面。
体外活性研究表明，蝉花孢子油能够极显著降低炎症介质一氧化氮的释放（P<0.001），这一作用结果可能和其含有的多种不饱和脂肪酸有关。除此之外，结果还表明蝉花孢子油还可以减轻 H2O2刺激后Caco-2细胞产生的氧化损伤，并且能够促进肠上皮细胞的迁移能力，说明该工艺下提取的蝉花孢子油有效保留了活性成分，具备一定的抗炎和修复肠上皮细胞氧化损伤的作用。
本研究首次对人工蝉花孢子粉中的孢子油成分进行提取并优化了提取方法，虽然相较于灵芝孢子油的提取工艺还不够成熟，存在得油率低，石油醚萃取风险较高的问题，但对于人工蝉花开发利用具有重要启发意义。同时本研究还证实了蝉花孢子油在炎症性肠炎治疗方面的潜在价值，为开发肠道特殊医疗配方食品提供了重要理论依据。在具体应用方面，后续还需要进一步改进提取方法，来提高得油率与品质，同时还需要更多活性指标来验证其对肠道炎症的治疗效果。
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图 4 DMSO对RAW264.7细胞存活率的影响
注：与Control组相比，***P<0.001。
Figure 4. Effect of DMSO on survival rate of RAW264.7 cells
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图 5 蝉花孢子油对RAW264.7细胞存活率的影响
注：与Control组相比，*P<0.05，***P<0.001。
Figure 5. Effect of IcM spore oil on survival rate of RAW264.7 cells
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图 6 蝉花孢子油对LPS诱导后RAW264.7细胞分泌NO含量的影响
注：与Control组比较，###P<0.001；与LPS组比较， ***P<0.001。
Figure 6. Effect of IcM spore oil on NO content secreted by RAW264.7 cells after LPS induction
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图 7 不同浓度H2O2对Caco-2细胞存活率的影响
注：与Control组相比，**P<0.01，***P<0.001。
Figure 7. Effect of different H2O2 concentrations on survival rate of Caco-2 cells
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图 8 蝉花孢子油对H2O2刺激后Caco-2细胞存活率的影响
注：与Control组相比，###P<0.001；与H2O2组相比，**P<0.01，***P<0.001。
Figure 8. Effect of IcM spore oil on survival rate of H2O2-induced Caco-2 cells
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图 9 蝉花孢子油对Caco-2细胞迁移率的影响
注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 9. Effect of IcM spore oil on the migration rate of Caco-2 cells
表 1 响应面试验的因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平 因素 A液固比 B提取时间（h） C提取温度（℃） −1 10:1 2 50 0 12:1 3 55 1 14:1 4 60 
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表 2 响应面试验结果
Table 2 Results of response surface experiments
试验号 因素 A：液固比 B：提取时间（h） C：提取温度（℃） 得油率（%） 1 12:1 3 55 2.506 2 14:1 2 55 2.026 3 12:1 4 60 2.016 4 10:1 2 55 1.504 5 12:1 4 50 2.088 6 12:1 2 60 1.824 7 10:1 3 60 1.812 8 14:1 3 50 2.032 9 10:1 3 50 1.708 10 12:1 3 55 2.478 11 10:1 4 55 2.112 12 14:1 3 60 2.062 13 14:1 4 55 2.098 14 12:1 3 55 2.508 15 12:1 3 55 2.468 16 12:1 2 50 1.590 17 12:1 3 55 2.492
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表 3 二次响应面回归模拟方差分析
Table 3 Secondary response surface regression analysis of variance table
类型 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.70 9 0.19 708.54 <0.0001 *** A-液固比 0.15 1 0.15 548.91 <0.0001 *** B-提取时间 0.23 1 0.23 880.02 <0.0001 *** C-提取温度 0.011 1 0.011 41.08 0.0004 *** AB 0.072 1 0.072 269.41 <0.0001 *** AC 0.001369 1 0.001369 5.14 0.0578 BC 0.023 1 0.023 87.81 <0.0001 *** A2 0.30 1 0.30 1114.96 <0.0001 *** B2 0.35 1 0.35 1325.48 <0.0001 *** C2 0.43 1 0.43 1629.40 <0.0001 *** 残差 0.001866 7 0.002666 失拟项 0.006550 3 0.002183 0.72 0.5896 不显著 纯误差 0.001211 4 0.003028 总变异 1.70 16 R2=0.9989，R2Adj=0.9975 注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异较显著（P<0.01）；***表示差异极显著（P<0.001）。
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表 4 GC-MS成分分析结果
Table 4 GC-MS composition analysis results
序号 保留时间（min） 名称 分子式 相对含量（%） 1 7.194 壬醛 C9H18O 0.53 2 10.645 壬醛酸甲酯 C10H18O3 0.24 3 12.55 肉豆蔻醛 C14H28O 0.38 4 13.51 正十七烷 C17H36 0.23 5 13.702 十五醛 C15H30O 0.27 6 13.78 肉豆蔻酸甲酯 C15H30O2 0.55 7 14.065 正二十一烷 C21H44 0.09 8 14.62 顺-7-十六碳烯醛 C16H30O 0.21 9 14.94 十五烷酸甲酯 C16H32O2 0.33 10 15.865 棕榈油酸甲酯 C17H32O2 3.32 11 16.125 棕榈酸甲酯 C17H34O2 17.70 12 16.5 邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4 0.21 13 16.94 棕榈酸乙酯 C18H36O2 0.17 14 17.375 14-甲基十六烷酸甲酯 C18H36O2 0.31 15 18.325 亚油酸甲酯 C19H34O2 27.09 16 18.45 油酸甲酯 C19H36O2 22.45 17 18.51 反式维生素A酸甲酯 C19H36O2 13.15 18 18.81 硬脂酸甲酯 C19H38O2 0.69 19 20.17 二氢甾醇甲酯 C20H38O2 0.31 20 21.67 顺-11-二十烯酸甲酯 C21H40O2 0.55 21 22.155 花生酸甲酯 C21H42O2 0.61 22 26.868 山嵛酸甲酯 C23H46O2 0.04 23 30.37 二十三酸甲酯 C24H48O2 0.08 24 35.03 木焦油酸甲酯 C25H50O2 0.06 25 39.495 角鲨烯 C30H50 0.51
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