基于碳氮稳定同位素比值和UPLC-Q-Orbitrap代谢组学技术的有机奶和普通奶的成分差异研究

聂雪梅; 谢昀; 许博舟; 许秀丽

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120095

基于碳氮稳定同位素比值和UPLC-Q-Orbitrap代谢组学技术的有机奶和普通奶的成分差异研究

聂雪梅^{1, 2,},
谢昀^{1, 2},
许博舟^{1, 2},
许秀丽^{1, 2, ,}

1.
中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京 100176
2.
国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100176

基金项目: 中国检科院基本科研业务费项目（2020JK008）。

详细信息

作者简介:
聂雪梅（1978−），女，硕士，副研究员，研究方向：食品安全，E-mail：niexuemei_00@163.com

通讯作者:
许秀丽（1983−），女，博士，研究员，研究方向：食品安全，E-mail：xuxiuli_78@163.com。

中图分类号: TS207.7
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出版历程
- 收稿日期: 2022-12-12
- 网络出版日期: 2023-10-03
- 刊出日期: 2023-11-24

Differentiated Study of Constituents between Organic Milk and Ordinary Milk by Stable Isotope Ratio and UPLC-Q-Orbitrap

NIE Xuemei^{1, 2,},
XIE Yun^{1, 2},
XU Bozhou^{1, 2},
XU Xiuli^{1, 2, ,}

1.
Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection & Quarantine, Beijing 100176, China
2.
Key Laboratory of Food Quality and Safety for State Market Regulation, Beijing 100176, China

摘要

摘要: 目的：为了防止受利益驱动的一些不法商家随意标注“有机”字样来对食品采取假冒、伪造、以次充好等方式欺诈消费者。方法：本研究提出采用碳氮稳定同位素比值和UPLC-Q-Orbitrap 代谢组学技术两种方式对有机奶和普通奶进行差异成分的研究，同时对不同泌乳期的有机奶进行分析。结果：由于碳和氮同位素比值单因素方差分析P<0.01，因此有机奶和普通奶具有显著性差异，可通过碳和氮同位素比值对有机奶进行判别；同时基于液相色谱-高分辨质谱的差异物质的代谢组学数据，采用OPLS-DA方法筛选出差异代谢物，共筛选包括组氨酸等5种差异较大的代谢物，且不同泌乳期的有机奶中组氨酸等化合物含量差异性较大。结论：该研究虽然样本有限，但有机奶和普通奶存在显著的差异代谢物，通过C和N同位素比值，以及5种筛查的差异代谢物可初步判定有机奶，该研究对有机奶和普通奶的差异化研究提供一定的科学依据。
- 有机奶 /
- 碳氮同位素比值 /
- UPLC-Q-Orbitrap /
- 成分差异
Abstract: Objective: To prevent some illegal companies driven by interests from arbitrarily labeling "organic" to deceive consumers using ways such as counterfeiting, forgery, and shoddy food. Methods: This study investigated differential components between organic and regular milk by stable isotope ratio and UPLC-Q-Orbitrap-based metabolomics. Organic milk with different lactation stages was also analyzed. Results: There was a significant difference between organic and ordinary milk for single factor ANOVA P<0.01. The carbon stable isotope and nitrogen stable isotope ratios could be used to distinguish organic and ordinary milk. Based on the data from UPLC-Q-Orbitrap, differential metabolites were screened by the OPLS-DA method, five different constituents were obtained, and there was a big difference between different lactation stages of organic milk such as histidine etc. Conclusion: Although the data of this study was obtained from limited samples, the different constituents between organic and ordinary milk were confirmed. Organic milk could be preliminarily determined by the data of carbon isotope ratio, nitrogen isotope ratio, and five different constituents screened by the UPLC-Q-Orbitrap method. This study could provide a scientific basis for the identification of organic and ordinary milk.
- organic milk /
- carbon isotope ratio and nitrogen isotope ratio /
- UPLC-Q-Orbitrap /
- different constituents

HTML全文

乳业是健康中国、强壮民族不可或缺的产业^[1]，随着消费者收入水平的提高，人们对牛奶品质的要求越来越高，纯天然、无污染、安全健康的有机奶得到了消费者的青睐，因此有较高的安全性和经济价值，但受利益驱动，一些不法商家随意标注“有机”字样来对食品采取假冒、伪造、以次充好等方式欺诈消费者，因此对有机奶和非有机奶中差异性成分的研究非常重要。有机乳制品甄别目前主要集中在产地的认证和安全指标的检测，但仅依靠产地有机认证的信息不能完全保证有机奶的真实性，目前尚无有效的检测方法对有机奶和非有机奶进行精准鉴别。

在有机产品真实性鉴别方面，稳定同位素质谱技术可用于鉴别不同种类和来源的食品，是国际上目前用于鉴别食品成分和掺假的一种有效工具，并在有机乳^[2−3]、葡萄酒^[4]、蜂蜜^[5−6]、果汁^[7−8]等食品的鉴别方面有所应用。葡萄酒、蜂蜜和果汁中掺假的问题，由于添加物与天然糖中¹³C/¹²C、¹⁵N/¹⁴N比值的不同，因此通过稳定同位素比值质谱技术可以比较明显地区分出来。但有机乳与普通乳的区别在于有机牧场和普通牧场饲养方式不同，影响¹³C/¹²C、¹⁵N/¹⁴N比值的因素较多。除不同牧场饲料差别外^[3]，同一牧场奶牛冬天食用玉米，夏天食用草或豆科植物，稳定同位素C和N比值也会随着饮食的季节不同而有变化^[9]。此外，采样时间和地理位置也会影响稳定同位素C和N的比值^[10]，因此仅通过一种检测手段很难满足精准分析。

代谢组学近年来在动植物疾病诊断、生物标志物筛选、物质毒性毒理研究、中医药等多个领域得到了广泛应用^[11]，对食品中代谢小分子也可以进行定性和定量的分析，从而动态呈现出机体内代谢物的变化，代谢组学常用的研究方法主要包括气相色谱-质谱联用法^[12-14]、质子核磁共振法^[15-16]和超高效液相色谱-串联四极杆质谱法^[17-19]等。已有相关报道代谢组学用于不同泌乳期乳制品的代谢物差异物分析^[20−21]，其中超高效液相串联-四极杆静电场轨道阱质谱更具有高灵敏度、选择性强、重现性好等优点，目前被广泛应用于代谢物测定、中药组分分析鉴定研究，康佳欣等^[22]采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱非靶向代谢组学方法对萨能奶中山羊初乳和常乳进行了代谢组学分析，发现有118种代谢物与常乳存在差异，主要是脂质类、氨基酸类、核苷类等。也有文献表明通过稳定同位素氮和高分辨质谱结合的方式可对有机番茄进行鉴别^[23]，因此本论文也将首次尝试将稳定同位素比值、超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Orbitrap）及化学计量学相结合的分析技术对有机奶进行研究，旨在揭示有机奶和普通奶之间的差异性，为有机牛奶的真实性筛选提供一定的科学依据。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

泌乳早期有机牛奶（30~90 d）、泌乳晚期有机牛奶（210~270 d）、普通牛奶　内蒙古的有机奶饲养基地和普通奶饲养基地，每批次牛奶从挤奶场随机取样，经分析剔除掉不符合牛奶（经代谢组学分析个体差异较大为不符合牛奶），共有63个样品，其中有机奶包括17个泌乳早期奶，22个泌乳晚期奶，普通奶包括24个，所取的牛奶混合均匀，具有代表性；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、锡杯（9 mm×5 mm）、CN反应管　美国Thermo Fisher Scientific公司；甲酸　质谱级，J&K 科学有限公司；实验室用水　实验室自制；IAEA600咖啡因（δ13C=−27.271‰，δ15N=1‰）　国际原子能机构。

Delta V同位素比质谱仪、Flash EA2000元素分析仪　美国Thermo-Fisher公司；Q-exactive 高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨率质谱仪　美国Thermo Fisher Scientific； Milli-R04纯水仪　德国Millipore公司；ML104/02分析天平　梅特勒-托利多上海有限公司；HSC-12B 针式氮吹仪　天津恒奥科技有限公司；旋涡混合仪　德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 同位素质谱测定方法

1.2.1.1 同位素质谱样品的制备

将鲜牛奶混匀后，冷冻干燥成粉末，过20目筛放于−80 ℃备用。

1.2.1.2 样品中碳氮同位素比值分析

冻干成粉末的样品，分别称量约150~180 μg，并用锡杯密封包裹成球，每份样品重复3次，测定稳定碳同位素比值。冻干成粉末的样品，分别称量约3000~3200 μg，并用锡杯密封包裹成球，每份样品重复3次，测定稳定氮同位素比值。

1.2.1.3 同位素比质谱仪参数

离子化方式：EI离子源，离子源电压：3.06 kV，真空度：1.5×10⁻⁶ mbar。氦气压力：4 bar，氧气压力：4 bar，二氧化碳压力：4 bar，氮气压力：4 bar，空气压力：8 bar。

1.2.1.4 元素分析仪参数

元素分析仪氧化炉最高温度为980 ℃，载气氦流量为100 mL/min，氧气流速为175 mL/min；氦气吹扫气为180 mL/min，柱温为50 ℃。

1.2.1.5 碳氮同位素比值测定

元素分析-同位素比质谱（EA-IRMS）分析结果以δ表示，它反应了样品和国际标准物质之间同位素丰度比的相对差异：

δ = \frac{R_{S P L} - R_{S T D}}{R_{S T D}} \times 10^{3}

$\delta=\frac{{\rm{R}}_{{\rm{SPL}}}-{\rm{R}}_{{\rm{STD}}}}{{\rm{R}}_{{\rm{STD}}}} \times 10^{3}$

其中，R代表¹³C/¹²C或¹⁵N/¹⁴N的同位素含量比，SPL与STD分别代表样品和标准物质；δ 值用千分数表示（‰）。

1.2.2 高分辨质谱测定方法

1.2.2.1 高分辨质谱样品前处理

前处理方法参考相关文献[24−25]，将鲜牛奶称量约2 g，加入 10 mL乙腈，超声提取30 min后，加入3 g NaCl，在4 ℃下10000 r/min离心10 min，取5 mL上层提取液，在40 ℃下氮气下吹至近干。残渣加乙腈1 mL进行复溶，过0.22 μm滤膜，放置于2 mL液相进样瓶中，待测。

1.2.2.2 高分辨质谱仪器参数

液相色谱条件^[26]：色谱柱Accucore aQ（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）；流动相为A为有机相乙腈，流动相B为水溶液（0.1%甲酸，v/v）；流速0.3 mL/min；进样体积为5 μL，柱温40 ℃；流动相梯度洗脱程序：0～0.5 min，5% A；0.5～5 min，5%～30% A；5～10 min，30%～100% A；10～12 min，100% A；12～15 min，5% A。

质谱条件：离子源为加热电喷雾离子源；喷雾电压为3.5 kV；离子传输管温度为320 ℃；全扫描-数据依赖二级扫描模式，一级分辨率70000，二级分辨率17500，实验中所用的气体均为高纯氮气，质量扫描范围（m/z）为100～1500，监测模式：正离子监测模式。

1.3 数据处理

通过Xcalibur软件进行原始数据采集，将原始数据导入Compound Discover^TM 3.0软件，对总离子流图中的色谱峰提取、峰对齐、匹配分析等，质荷比范围为m/z 100～1500；峰相应强度最小值1×10^－6。同时将数据矩阵提取出来的数据信息利用SIMCA-13.0软件进行标准化归一化处理，并进行正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA），根据VIP（VIP>1）和组间变化的显著性（P<0.01）进行有机奶和普通奶的差异性代谢物的筛选。

2. 结果与分析

2.1 有机牛奶和普通牛奶稳定碳氮同位素比值的分析

利用元素分析仪共测定39个有机奶和24个普通奶，表1为有机奶和普通奶的δ¹³C和δ¹⁵N值对比。

表 1 有机奶和普通奶样品δ¹³C和δ¹⁵N值对比

Table 1. δ¹³C and δ¹⁵N in organic milk and ordinary milk

样品	δ¹³C范围（‰）	δ¹³C中位值（‰）	δ¹⁵N范围（‰）	δ¹⁵N中位值（‰）
有机奶（n=39）	−30.60~−23.06	−27.46	3.02~3.82	3.40
普通奶（n=24）	−31.39~−22.16	−27.36	2.43~3.25	2.81

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2.1.1 有机与普通牛奶稳定碳同位素比值的分析

通过碳同位素元素分析仪测定63个有机奶和普通奶，对比分析了有机奶和普通奶的δ¹³C值，39个有机奶样品的中位值δ¹³C为−27.46‰；24个普通奶的δ¹³C中位值为−27.36‰，有机奶和普通奶δ¹³C值有部分交叉，但有机奶和普通奶的单因素方差分析P<0.01，从结果的平均值分析，有机奶的δ¹³C值的整体情况比普通奶的δ¹³C值更偏负，这与赵超敏等^[2]有机奶粉所研究的结果一致，δ¹³C 值反映了奶牛饲料中C3植物与C4植物的比值，理论上有机牛奶的奶牛是食用天然牧草长大的，这些牧草主要都是C3植物^[27−28]，C3植物的δ¹³C值变化范围为−23‰至−35‰之间，普通牛奶的奶牛主要食用的玉米属于C4植物，C4植物的δ¹³C值变化范围在−9‰至−19‰之间，因此从理论上分析，有机奶的δ¹³C应该比普通奶更偏负。但由于有机奶的奶牛所食用的并非只有有机牧场的牧草，还包括其他进口燕麦等一定比例的饲料，且存在其他含有C元素的物质对结果有影响，所以导致有机奶和普通奶的δ¹³C数值有交叉，但是从单因素方差分析P<0.01，说明存在显著差异，因此碳稳定同位素比值可以作为区分有机奶和普通奶的一种技术手段。

2.1.2 有机奶与普通牛奶稳定氮同位素比值的差异分析

通过氮同位素元素分析仪测得63个样品数据，共计39个有机奶和24个普通奶，对比分析了有机奶和普通奶的δ¹⁵N值，有机奶的δ¹⁵N的中位值为3.40‰，普通奶的δ¹⁵N的中位值为2.81‰。有机奶和普通奶的δ¹⁵N具有显著的差异（P<0.01），从δ¹⁵N平均比值来分析，有机奶中δ¹⁵N比值明显高于普通牛奶，王世成等^[23]所研究的有机番茄中氮同位素比值明显高于普通番茄，两者结论较为一致，δ¹⁵N 值反映了奶牛饲料中¹⁵N与¹⁴N的比值，理论上来说有机牧草不允许使用人造肥料，有机牧场的奶牛所食用的饲料主要为有机牧草，有机牧草中高含量的¹⁵N使有机奶中¹⁵N比例增高^[23]，而普通牧草的种植允许使用化肥，因此牛奶中氮同位素比取决于土壤中的氮源，有机奶中δ¹⁵N比值明显高于普通牛奶，氮同位素比值也可以作为区分有机奶和普通奶的一种技术手段。

2.2 液相色谱高分辨质谱分析有机牛奶和普通奶组成成分

2.2.1 UPLC-Q-Orbitrap谱图分析

采用正离子模式对有机奶和普通奶进行分析，图1为有机奶和普通奶的总离子流图，由图1可知，谱图基线较为平稳，说明仪器有较好的稳定性，图像可信度较高，有机奶和普通奶的原始数据经过Compound Discover软件降噪后进一步分析研究，提取了所有化合物的质谱信息，共提取1682个化合物，下述分析以1682个正离子检测进行研究。

图 1 普通奶（A）和有机奶（B）单个样品的总离子流图

Figure 1. Total ion chromatogram for a random single ordinary milk (A) and organic milk (B)

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2.2.2 液相色谱-高分辨质谱的主成分分析

将有机奶和普通奶的1682种化合物信息导入SIMCA-P软件，进行PCA主成分分析，用以判别有机奶和普通奶之间的差异，但PCA不能很好地将两种牛奶分开，由于PCA无监督分析方法存在组内的误差和无关的随机误差，所以本研究采用了有监督的判别方法OPLS-DA（正交偏最小二乘-判别分析）进行代谢差异物的筛选，OPLS-DA不同于PCA，运用正交偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本类别之间的关系模型，来实现对样本类别的预测，能够更科学|更客观的区分代谢物的组间差异。如图2所示，有机奶样品主要分布在该置信区间的左侧，普通奶样品主要分布在置信区间的右侧，有机奶和普通奶样品区分效果佳。本次OPLS-DA模型分析得到2个主成分，该模型的参数R²和Q²分别为0.997和0.709，均大于0.5，说明该模型稳定性可靠。从图2可以看出不同的样品分布在不同的象限，普通奶差异较小，聚集在一起，而有机奶差异较大，较为分散，这是有机奶中包括不同泌乳期的有机牛奶的缘故，该结果表明有机奶和普通奶的代谢成分在种类、数量和含量上存在显著的差异。

图 2 有机奶和普通奶样品的OPLS-DA得分图

Figure 2. Score plot of OPLS-DA between organic milk and ordinary milk

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由于有机奶依据泌乳期分为泌乳早期奶和泌乳晚期奶两种，因此同时对不同泌乳期和普通奶进行差异分析，如图3所示，有机泌乳早期奶和有机泌乳晚期奶与普通奶分布在不同的置信区间，区分效果佳。但是有机泌乳早期奶活性成分差异较大，样品点较分散。本次OPLS-DA模型分析得到2个主成分，R²和 Q² 分别为 0.928和0.773，均大于0.5，说明该模型稳定性可靠。这结果也表明不同泌乳期的有机奶其含量、种类和数量相差较大，但能够与普通奶有所区分。

图 3 泌乳早期有机奶、泌乳晚期有机奶和普通奶的OPLS-DA得分图

Figure 3. Score plot of OPLS-DA between early lactation, later lactation of organic milk and ordinary milk

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2.2.3 有机牛奶和普通牛奶差异性组分的分析

通过Compound Discover软件分析共有1682个化合物，对有机奶和普通奶间数据峰面积均值进行比对形成S-PLOT图（图4）。在S-PLOT图的右侧象限为普通奶的代谢物，左侧象限为有机奶的代谢物，距离中心原点越远的代谢物表示在两者之间的差异越大，从图上可以看到，有机奶中的差异性化合物种类远远多于普通奶，通过Compound Discover软件匹配mzcloud、chemspider等数据库，识别了294个化合物的信息，如保留时间、分子量、一级质谱碎片和二级质谱碎片等，并查阅了相关文献，进一步确认相关化合物的信息，从结果分析，牛奶成分中除了乳糖、葡萄糖等糖类，肌酸、氨基酸等有机酸类，还包括饲料里产生的葛根素，以及次生代谢物胆碱等，另外还有环境暴露的一些化合物例如塑化剂等。

图 4 有机奶和普通奶的S-plot图

Figure 4. S-plot of organic milk and ordinary milk

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其中含量较高的包括α-乳糖，普通奶中的乳糖含量是有机乳中的1~2倍，这与Wu等^[29]的研究是一致的。胆碱在有机泌乳早期奶含量较高，是普通奶中的2倍左右，肌酸在普通奶中含量是有机奶中的1~2倍，异亮氨酸在有机奶中的含量是普通奶中的2~3倍。

经过Simca-p筛查共发现651种VIP 值大于1的物质，同时依据t检验（t-test）的P值（P<0.05）筛查差异性代谢物，经与数据库匹配确证发现，以下5种化合物成分在有机和普通牛奶中在含量、数量上存在较大差异（见表2），有机泌乳早期奶中组氨酸含量高于普通奶的138倍，有机泌乳晚期奶组氨酸含量高于普通奶的22倍，其他4种物质包括2,6-二氨基甲苯、3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺、6-正己基氨基嘌呤、二乙烟酰胺含量也均高于普通奶。

表 2 有机奶和普通奶样品部分差异物

Table 2. Partial different metabolites of organic milk and ordinary milk

序号	化合物	分子式	母离子（m/z）	P值	VIP	差异倍数（有机泌乳早期奶/普通奶）	差异倍数（有机泌乳晚期奶/普通奶）
1	2,6-二氨基甲苯	C₆H₁₇FN₄O₂	196.133	1.48×10⁻⁴	2.54	117	42
2	3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺	C₆H₁₀N₄	138.091	7.64×10⁻⁵	2.37	623	289
3	6-正己基氨基嘌呤	C₁₁H₁₇N₅	219.149	3.53×10⁻⁴	2.10	630	241
4	二乙烟酰胺	C₁₀H₁₄N₂O	178.111	7.64×10⁻⁵	2.24	514	182
5	组氨酸	C₆H₉N₃O₂	155.070	8.05×10⁻⁴	1.48	138	22

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2.2.4 有机牛奶和普通牛奶代谢物成分层次聚类分析

热图是对实验数据分布情况进行分析的直观可视化方法，可通过颜色深浅和差异来直观展示研究对象的差异，并对样品进行聚类分析（见图5A和图5B），在图5A中右侧为有机奶，左侧为普通奶，从图5A可以看出右侧有机奶中代谢物较多，且有机奶和普通奶组数据分别能够较好的聚集在一起，说明代谢物聚集效果良好。由图5B可以看出6-正己基氨基嘌呤、2,6-二氨基甲苯、组氨酸、3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺、二乙烟酰胺在有机泌乳早期奶中含量较高，在有机泌乳晚期奶中含量较低，而胆碱在有机泌乳早期奶含量较高，α-乳糖、肌酸等在普通奶中的含量较有机奶中要高一些，尤其是有机泌乳早期奶中含量很低，这与吕牧军等^[30]研究结论一致，常乳的乳糖含量比初乳高。总体来说，有机奶中代谢物数量大于普通奶中代谢物的数量，尽管部分化合物在有机泌乳早期和晚期也不尽相同，但通过上面5种差异较大的代谢物可将有机奶和普通奶进行区分。

图 5 有机奶和普通奶代谢物成分层次聚类分析色温图

注：A为所有代谢物，B为主要代谢物。

Figure 5. Metabolites correlation heat-map of organic milk and ordinary milk

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3. 结论

本文采用稳定同位素比例质谱和高分辨质谱两种分析技术共同对有机奶和普通奶进行差异性的分析研究。首先通过对有机奶和普通奶进行C和N同位素平均比值分析，有机奶的δ¹³C比普通奶更偏负，有机奶中δ¹⁵N比值明显高于普通奶，从统计学意义上分析，由于单因素方差分析P<0.01，因此具有显著性差异，说明碳氮稳定同位素比值可以作为区分有机奶和普通奶的一种技术手段。其次结合UPLC-Q-Orbitrap进行代谢组学分析，通过Simca-p筛查共发现651种VIP 值大于1的物质，经与数据库匹配确证发现，包括5种化合物成分在有机和普通牛奶中在含量、数量上存在较大差异，例如有机泌乳早期奶中组氨酸含量高于普通奶的138倍，有机泌乳晚期奶组氨酸含量高于普通奶的22倍，这些化合物可作为有机奶和普通奶的差异性特征成分。另外含量较高的α-乳糖在普通奶中的含量是有机奶中1~2倍，普通奶中肌酸含量是有机奶中的1~2倍；胆碱在有机泌乳早期奶含量较高，是普通奶中的2倍左右，异亮氨酸在有机奶中的含量是普通奶中的2~3倍。因此该研究初步判定通过C和N同位素比值、这些差异性成分基本可区分内蒙乳企的有机奶和普通奶，该结论对有机奶和普通奶的差异化成分研究提供一定的科学依据。

图 1 普通奶（A）和有机奶（B）单个样品的总离子流图

Figure 1. Total ion chromatogram for a random single ordinary milk (A) and organic milk (B)

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图 2 有机奶和普通奶样品的OPLS-DA得分图

Figure 2. Score plot of OPLS-DA between organic milk and ordinary milk

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图 3 泌乳早期有机奶、泌乳晚期有机奶和普通奶的OPLS-DA得分图

Figure 3. Score plot of OPLS-DA between early lactation, later lactation of organic milk and ordinary milk

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图 4 有机奶和普通奶的S-plot图

Figure 4. S-plot of organic milk and ordinary milk

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图 5 有机奶和普通奶代谢物成分层次聚类分析色温图

注：A为所有代谢物，B为主要代谢物。

Figure 5. Metabolites correlation heat-map of organic milk and ordinary milk

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表 1 有机奶和普通奶样品δ¹³C和δ¹⁵N值对比

Table 1 δ¹³C and δ¹⁵N in organic milk and ordinary milk

样品	δ¹³C范围（‰）	δ¹³C中位值（‰）	δ¹⁵N范围（‰）	δ¹⁵N中位值（‰）
有机奶（n=39）	−30.60~−23.06	−27.46	3.02~3.82	3.40
普通奶（n=24）	−31.39~−22.16	−27.36	2.43~3.25	2.81

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表 2 有机奶和普通奶样品部分差异物

Table 2 Partial different metabolites of organic milk and ordinary milk

序号	化合物	分子式	母离子（m/z）	P值	VIP	差异倍数（有机泌乳早期奶/普通奶）	差异倍数（有机泌乳晚期奶/普通奶）
1	2,6-二氨基甲苯	C₆H₁₇FN₄O₂	196.133	1.48×10⁻⁴	2.54	117	42
2	3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺	C₆H₁₀N₄	138.091	7.64×10⁻⁵	2.37	623	289
3	6-正己基氨基嘌呤	C₁₁H₁₇N₅	219.149	3.53×10⁻⁴	2.10	630	241
4	二乙烟酰胺	C₁₀H₁₄N₂O	178.111	7.64×10⁻⁵	2.24	514	182
5	组氨酸	C₆H₉N₃O₂	155.070	8.05×10⁻⁴	1.48	138	22

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参考文献(30)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 同位素质谱测定方法
1.2.1.1 同位素质谱样品的制备
1.2.1.2 样品中碳氮同位素比值分析
1.2.1.3 同位素比质谱仪参数
1.2.1.4 元素分析仪参数
1.2.1.5 碳氮同位素比值测定
1.2.2 高分辨质谱测定方法
1.2.2.1 高分辨质谱样品前处理
1.2.2.2 高分辨质谱仪器参数
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 有机牛奶和普通牛奶稳定碳氮同位素比值的分析
2.1.1 有机与普通牛奶稳定碳同位素比值的分析
2.1.2 有机奶与普通牛奶稳定氮同位素比值的差异分析
2.2 液相色谱高分辨质谱分析有机牛奶和普通奶组成成分
2.2.1 UPLC-Q-Orbitrap谱图分析
2.2.2 液相色谱-高分辨质谱的主成分分析
2.2.3 有机牛奶和普通牛奶差异性组分的分析
2.2.4 有机牛奶和普通牛奶代谢物成分层次聚类分析
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 同位素质谱测定方法
1.2.1.1 同位素质谱样品的制备
1.2.1.2 样品中碳氮同位素比值分析
1.2.1.3 同位素比质谱仪参数
1.2.1.4 元素分析仪参数
1.2.1.5 碳氮同位素比值测定
1.2.2 高分辨质谱测定方法
1.2.2.1 高分辨质谱样品前处理
1.2.2.2 高分辨质谱仪器参数
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 有机牛奶和普通牛奶稳定碳氮同位素比值的分析
2.1.1 有机与普通牛奶稳定碳同位素比值的分析
2.1.2 有机奶与普通牛奶稳定氮同位素比值的差异分析
2.2 液相色谱高分辨质谱分析有机牛奶和普通奶组成成分
2.2.1 UPLC-Q-Orbitrap谱图分析
2.2.2 液相色谱-高分辨质谱的主成分分析
2.2.3 有机牛奶和普通牛奶差异性组分的分析
2.2.4 有机牛奶和普通牛奶代谢物成分层次聚类分析
3. 结论

参考文献(30)

施引文献

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基于碳氮稳定同位素比值和UPLC-Q-Orbitrap代谢组学技术的有机奶和普通奶的成分差异研究

作者简介: 聂雪梅（1978−），女，硕士，副研究员，研究方向：食品安全，E-mail：niexuemei_00@163.com

通讯作者: 许秀丽（1983−），女，博士，研究员，研究方向：食品安全，E-mail：xuxiuli_78@163.com。

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