提取方法对百里香精油化学成分和抗氧化活性的影响

刘欢; 赵巨堂; 罗海涛; 任周营; 邵灯寅

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2021120146

提取方法对百里香精油化学成分和抗氧化活性的影响

1.
南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047
2.
江西中烟工业有限责任公司，江西南昌 330096

基金项目: 国家自然科学基金青年项目（31901648）；国家自然科学基金面上项目（31770861）；国家自然科学基金地区科学基金项目（31960464）。

详细信息

作者简介:
刘欢（1988−），男，博士，教授，研究方向：食品化学，E-mail：liu_huan2011@hotmail.com

通讯作者:
邵灯寅（1990−），男，硕士，工程师，研究方向：卷烟调香和产品开发，E-mail：dyshao1015@163.com

中图分类号: TS202.3
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出版历程
- 收稿日期: 2021-12-13
- 网络出版日期: 2022-08-02
- 刊出日期: 2022-09-30

Effect of Extraction Methods on Chemical Constituents and Antioxidant Activity of Essential Oil from Thymus vulgaris L.

1.
State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China
2.
Tobacco Jiangxi Industrial Co., Ltd., Nanchang 330096, China

摘要

摘要: 本文分别采用水蒸气蒸馏法（SD）、同时蒸馏萃取法（SDE）、冷等离子体辅助提取法（CPAE）从百里香叶片中提取精油，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析了三种精油中的挥发性成分，测定其精油中的总酚、总黄酮、花青素含量，通过DPPH•、ABTS⁺•、总抗氧化能力三个抗氧化指标评估了其体外抗氧化性，并将精油中的主要活性成分与抗氧化能力进行相关性分析，比较得出得率更高、抗氧化性更好的提取方法。结果表明，不同提取方法在精油得率上有显著性差异（P<0.05），SDE法的精油得率最高，达到了1.30%。经GC-MS分析，三种精油共检出了36种组分，主要成分均为2-茨醇（32.194%~32.515%）、香芹酚（17.265%~19.998%）、百里香酚（13.031%~15.202%）和α-松油醇（11.296%~12.012%），其中，SDE法和CPAE法比SD法制备得到的精油在以上活性成分上含量更高。在总酚、总黄酮、花青素的测定结果中，SDE法制备得到的精油中总酚和花青素含量更高，分别为133.67±0.20 mg GA/g EO、0.32±0.02 mg/g EO，CPAE法制得的精油总黄酮含量最高，达到了54.82 mg Rutin/g EO。在体外抗氧化性实验中，三种精油在实验浓度范围内对各项抗氧化指标都表现出较强的抗氧化性和明显的量效关系，其中，SDE法获得的精油对于自由基的清除效果更佳，在最高实验浓度下清除率均在96%以上。通过抗氧化相关性分析发现，百里香精油的抗氧化活性与酚类等物质的含量密切相关。综上，从各项实验结果来看，SDE法是一种更为可取的提取百里香精油的方法。
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- 化学成分 /
- 抗氧化
Abstract: The essential oils from Thymus vulgaris L. were extracted by using different methods of stream distillation (SD), simultaneous distillation extraction (SDE), and cold plasma assisted extraction (CPAE) separately, then the volatile components in the essential oils were identified by GC-MS. The contents of total phenols, flavonoids and anthocyanins in essential oil were determined. Its antioxidant activity in vitro was evaluated by three antioxidant indexes: DPPH•, ABTS⁺• and total antioxidant capacity, and the correlation between the main active components in essential oil and antioxidant capacity was analyzed. Therefore, the extraction method with higher rate and better antioxidant capacity was obtained. The results showed that different extraction methods had significant difference in yield (P<0.05). And the SDE method had the highest yield, reaching 1.30%. By GC-MS analysis, 36 components of the three essential oils were detected. The main volatile components were borneol (32.194%~32.515%), carvacrol (17.265%~19.998%), thymol (13.031%%~15.202%), α-terpinol (11.296%~12.012%). The SDE and CPAE methods had higher contents of main active ingredients than SD method. In the determination results of total phenols, total flavonoids and anthocyanins, the contents of total phenols and anthocyanins in the essential oil prepared by SDE method were 133.67±0.20 mg GA/g EO and 0.32±0.02 mg/g EO, respectively. The contents of total flavonoids in the essential oil prepared by CPAE method were the highest, reaching 54.82 mg Rutin/g EO. In vitro antioxidant experiments, the three essential oils showed strong antioxidant activity and obvious dose-effect relationship to various antioxidant indexes within the experimental concentration range. Among them, the essential oil obtained by SDE method had better scavenging effect on free radicals, and the scavenging rate was above 96% at the highest experimental concentration. Correlation analysis showed that the antioxidant activity of the essential oils were closely related to the content of phenols and other main substances. In conclusion, according to the experimental results, the SDE method is a more desirable method for the extraction of essential oils from Thymus vulgaris L..
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百里香（Thymus vulgaris L.）是唇形科（Labiatae）百里香属（Thymus）双子叶植物，因其植株具有浓郁的芳香而闻名，别名地椒、山椒、麝香草等^[1]。百里香原产于欧洲南部，在我国主要分布在甘肃、陕西等黄河以北地区，被作为食品的调味品而广泛种植，是一种重要的烹饪香料，可以去除食品中的腥味，给予其清香和草香味^[2]。百里香中除了含有大量挥发性香味成分外，还有碳水化合物、蛋白质和钙、铁、锌、硒等微量元素，具有很高的食用价值。百里香精油作为主要生物活性成分，其分析和应用正在不断研究与发展^[3-4]。

百里香精油的用途十分广泛，由于其具有愉悦、宜人的香气在香精香料和化妆品工业被用作芳香剂、增味剂。同时百里香精油还表现出优良的抑菌、防腐和抗氧化性能，亦可有望成为人工合成添加剂的替代品^[5]。研究表明，精油的质量与提取方法息息相关，不同提取方法所展现出的物化性质有可能差异很大，直接关系着精油的应用效果^[6]。目前有关于百里香精油的研究多集中于对其抗氧化性和抗菌保鲜方面的探索，对于不同提取方法的考察鲜有报道。在各种提取方法中水蒸气蒸馏法（SD）是指将植物原料浸泡在容器中的水中，然后将混合物煮沸的过程，是一种传统而且最为常用的精油获取方式。同时蒸馏萃取（SDE）结合了水蒸气蒸馏与有机萃取两种方法的优点，在少量萃取溶剂存在的条件下便可制得更多的样品，更好地浓缩了香气成分，一定程度上避免了水蒸气蒸馏法提取后收集微量精油时因粘壁而损失的情况。两种方法最主要的区别是SDE法可以将有机蒸汽和样品蒸汽交汇后同时冷凝下来，即在不断的水蒸气蒸馏过程中进行溶剂萃取，对于精油的交换萃取更为彻底。等离子体辅助提取（CPAE）则是一种较为新颖的非热加工提取技术，等离子是由自由电子、离子、自由基、激发态粒子构成的整体呈电中性的导电流体，含有多种活性物质，主要用于杀菌保藏和组分改性^[7]，这种准中性电离气体会导致果皮表面蚀刻，这有助于使存在于角质层下方的油腺破裂，便于浸出。Ebadi等^[8]利用冷等离子体辅助提取柠檬马鞭草精油时，发现短时间的处理柠檬马鞭草对于得率的提高有着积极的影响，而且一定程度上改变了精油中挥发性成分的种类和含量。虽然近年来我国有文献报道过百里香精油的成分及提取工艺的影响，但是尝试的提取方法多为较常规的溶剂提取、微波提取等^[9-10]，在百里香精油提取上，对于同时蒸馏萃取和等离子体这种新型非热处理方法辅助提取精油的研究还有待拓展。

本研究采用SD法、SDE法和CPAE法制备百里香精油，综合比较了传统和新兴提取方法对于百里香精油得率、挥发性成分、抗氧化性的影响，考察百里香精油的主要活性物质与抗氧化能力的相关性，旨在获得更为科学有效的方法，为百里香精油的工业生产和综合利用提供理论依据和文献参考。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

百里香叶　品种为银叶百里香，产地为广西玉林。样品预处理：用蒸馏水将百里香清洗后，在60 ℃烘箱中干燥6 h，室温冷却后用粉碎机粉碎，然后过60目筛，收集后于干燥阴凉处保存备用。

无水硫酸钠、水杨酸、30%过氧化氢、过硫酸钾、抗坏血酸、氯化钠、正己烷、二氯甲烷、氯化钾、三氯化铁、无水乙酸钠、冰醋酸、无水乙醇、甲醇、七水合硫酸亚铁、氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化铝、无水碳酸钠　分析纯，西陇科学股份有限公司；福林酚试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-Azinobis-（3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）均为分析纯；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、芦丁标准品、没食子酸标准品、2-茨醇标准品、百里香酚标准品、香芹酚标准品均为色谱纯　索莱宝生物科技有限公司。

DZF-6055鼓风干燥箱　上海一恒科学仪器有限公司；HWS-24型电热恒温水浴锅　上海一恒科学仪器有限公司；DFY-500中药粉碎机　大德中药机械有限公司；KE-52AA旋转蒸发器、SHZ-III型循环水真空泵　上海亚荣生化仪器厂；Agilent7890-7000A气相色谱-三重串接四极杆质谱联用仪　美国安捷伦科技有限公司；ZNHW型智能恒温电热套　上海锦岐仪器设备有限公司；LE2202E电子天平　梅特勒托利多仪器有限公司；U-T6紫外可见分光光度计　屹谱仪器制造有限公司；BD/BC-218E冰柜　浙江星星冷链集成股份有限公司；WBFY-205型微波化学反应器　上海秋佐科学仪器有限公司；VORTEX 3旋涡振荡器　艾卡（广州）仪器设备有限公司；非平衡性大气压下介质阻挡放电（DBD）冷等离子体系统　实验室自主开发。

1.2 实验方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法（SD）提取百里香精油

称取50 g百里香粉后添加1000 mL蒸馏水以及1% NaCl，在组装好的挥发油提取器及冷凝装置中微沸条件下反应3 h，提取结束后冷却至室温，取10 mL正己烷把百里香精油萃取出来，之后添加3 g Na₂SO₄，然后置于−18 ℃冰箱冷冻8 h，滤除固体后旋蒸除去溶剂，将百里香精油收集备用。

1.2.2 同时蒸馏萃取（SDE）百里香精油

称取50 g百里香粉后添加500 mL蒸馏水以及1% NaCl，在另一个容器中加入50 mL二氯甲烷（分析纯）并放入60 ℃的水浴锅中，通过同时蒸馏萃取装置将两个容器连接起来，等两边蒸汽都开始冷凝后打开计时器，提取3 h后再把二氯甲烷收集起来并添加适量无水Na₂SO₄除去少量水分，然后置于−18 ℃冰箱冷冻8 h，滤除固体后旋蒸除去溶剂，将百里香精油收集备用。

1.2.3 冷等离子体辅助提取（CPAE）百里香精油

称取50 g百里香粉放入直径18 cm，高度3 cm的等离子体反应室中用等离子体处理，冷等离子体的产生是由非平衡性大气压下介质阻挡放电（DBD）冷等离子体系统实现的，该反应室由上下两个平面铜电极组成，电极之间的距离（放电空间）和电极两端的电势（电压）可以根据需要变化。所采用的系统利用大气（O₂、N₂）作为等离子体放电的来源，介质阻挡材料为聚氯乙烯（PVC），百里香粉在45 kV的高压和50 Hz的频率处理5 min结束，在原料中添加1000 mL蒸馏水以及1% NaCl，组装好挥发油提取器及冷凝装置在微沸条件下反应3 h，提取结束待收集管冷却后取10 mL正己烷把百里香精油萃取出来，之后加3 g Na₂SO₄，然后置于−18 ℃的冰箱冷冻8 h，滤除固体后旋蒸除去溶剂，将百里香精油收集备用。

1.2.4 百里香精油得率的计算

$\rm 百里香精油得率({\text{%}})=\frac{百里香精油质量(g)}{百里香质量(g)}\times 100$

1.2.5 GC-MS分析条件

1.2.5.1 色谱条件

色谱柱： HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：初始温度60 ℃，保持3 min，以6 ℃/min 升温至240 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升温至280 ℃，保持3 min。进样口温度250 ℃，载气为氦气，流量：1 mL/min，进样量：1 μL；分流比：20:1。

1.2.5.2 质谱条件

电离方式EI，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃，溶剂延迟4 min；扫描离子质量范围35~550 amu。对照质谱库NIST08结合标准品进行成分定性，使用面积归一化法计算百里香精油各组分的相对含量。

1.2.6 总酚、总黄酮、总花青素含量的测定

1.2.6.1 精油中总酚含量的测定

参考文献[11]的方法，将3种精油配制为1 mg/mL乙醇-精油溶液，将0.5 mL的乙醇-精油溶液与2.5 mL的Foline-Ciocalteu试剂（用蒸馏水1:10稀释）和2 mL的7.5%碳酸钠溶液在试管中混合，摇匀。将混合物在45 ℃的热水浴中保持15 min。由试剂空白作为参比，在765 nm处测量吸光度。以没食子酸（Gallic acid，GA）作为标准品并按上述方法绘制标准曲线，得到回归方程y=9.17619x+0.03195（R²=0.99903），总酚含量以每克精油中没食子酸的毫克数表示。

1.2.6.2 精油中总黄酮含量的测定

参照文献[12]的方法，将三种精油配为1 mg/mL乙醇-精油溶液，吸取1.0 mL乙醇-精油溶液于10 mL试管中，加蒸馏水4.4 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，混匀，静置5 min；再加入10%氯化铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；然后加4%氢氧化钠溶液2.0 mL，摇匀，静置15 min。由试剂空白作为参比，在510 nm处测定吸光度。以芦丁（Rutin）作为标准品并按上述方法绘制标准曲线，得到回归方程y=1.09702x+0.00752（R²=0.99979），总黄酮含量以每克精油中芦丁的毫克数表示。

1.2.6.3 精油中花青素含量的测定

参考文献[13]的方法，将三种精油配成1 mg/mL乙醇-精油溶液，取1 mL样品溶液加入到试管中，然后加入2 mL氯化钾缓冲液（pH1.0），充分混合，室温下放置30 min。用蒸馏水作空白调零，在510和700 nm下测量混合物的OD值。然后样液与乙酸钠缓冲液（pH4.5）类似地合并，并分别在相同波长下测量这些溶液的吸光度。测量重复3次。总花青素含量计算公式如下：

$\rm C=\frac{A\times V\times n\times M}{\varepsilon \times m}$

$\rm A=(A_{520}-A_{700})_{pH1.0} -(A_{520}-A_{700})_{pH4.5}$

式中，C为花青素含量，mg/g；A为两种缓冲液吸光度的差值；A₅₂₀表示样品在520 nm处测得的吸光度；A₇₀₀表示样品在700 nm处测得的吸光度；V为精油溶液体积，mL；M为矢车菊-3-葡糖苷的相对分子质量，449.2 ；n为稀释倍数；ε为摩尔消光系数，26900（矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数）；m为样品质量，g。

1.2.7 DPPH自由基清除能力测定

参考文献[14]的方法，将1 mL精油稀释液用移液枪转移到5 mL离心管中，再移取1 mmol/L的DPPH反应液2 mL，涡旋后在阴暗条件下反应30 min，测得混合液在517 nm下的吸光值A₁，无水乙醇代替精油测得A₀，无水乙醇代替DPPH反应液测得A₂，用无水乙醇调零，以抗坏血酸作为阳性对照，平行操作重复3次。清除率按下式计算：

$\rm \mathrm{R}=\frac{A_{0}-\left(A_{1}-A_{2}\right)}{A_{0}} \times 100$

式中，R：清除率，%；A₀：空白组吸光值；A₁：样品组吸光值；A₂：无水乙醇代替DPPH反应液所得吸光值。

1.2.8 ABTS自由基清除能力测定

参考文献[15]的方法，分别用10 mL容量瓶配制好7 mmol/L ABTS溶液与2.5 mmol/L过硫酸钾溶液后在烧杯中混合，避光保存16 h后即为ABTS储备液，然后用无水乙醇将其稀释成734 nm下OD值为0.70±0.02即得淡绿色的ABTS工作液。将1 mL精油-无水乙醇稀释液与3 mL上述工作液在5 mL离心管中混合后于阴暗条件下反应30 min，在734 nm 处测定吸光值A₁，无水乙醇代替精油测得A₀，无水乙醇代替ABTS工作液测得A₂，用无水乙醇调零，以抗坏血酸为阳性对照，平行操作重复3次。清除率按下式计算：

$\rm \mathrm{R}=\frac{A_{0}-\left(A_{1}-A_{2}\right)}{A_{0}} \times 100$

式中，R：清除率，%；A₀：空白组吸光值；A₁：样品组吸光值；A₂：无水乙醇代替ABTS工作液所得吸光值。

1.2.9 总抗氧化能力测定（FRAP法）

参考文献[16]的方法测定总抗氧化能力。FRAP工作液的配置：将0.3 mol/L醋酸缓冲溶液（用1 mol/L HCl调至pH3.6）、10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）盐酸溶液和20 mmol/L FeCl₃溶液按10:1:1体积比配制，现用现配。分别取0.2~1.6 mmol/L FeSO₄ 0.1 mL，加入1.8 mL FRAP工作液和3.1 mL的蒸馏水，37 ℃下水浴30 min，在593 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.4990x+0.0223（R²=0.9990）。分别取0.1 mL精油-乙醇溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），同法处理，用无水乙醇调零，测定吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照，样品的总抗氧化能力以FRAP值表示，1 FRAP=1 mmol/L FeSO₄，即样品的抗氧化能力相当于FeSO₄浓度。

1.3 数据处理

利用Excel（2010版本，美国微软公司）和SPSS（25.0版本，美国IBM公司）进行数据处理和分析，方差分析（ANOVA）采用邓肯多重比较（α=0.05），相关性分析以Pearson相关系数表示；使用Origin（2018版本，美国IBM公司）对实验数据进行作图。所有测定重复三次，结果以平均值±标准差表示。

2. 结果与分析

2.1 提取方法对精油得率的影响

所有样品的色状均一，呈现淡黄色。不同提取方法下的百里香精油得率如图1所示，可以看出在三种提取方法下百里香精油的得率有显著差异（P<0.05），得率从高到低依次是SDE（1.30%）>CPAE（1.17%）>SD（0.98%）。本研究中，SDE法相比SD法萃取更为完全，所以提取效果更好，而CPAE可能是通过等离子体的作用引起离子和电子的轰击，导致百里香表面的刻蚀，使油腺体破裂，从而提高了得率^[17]。精油得率受原料生长环境因素和提取方法的影响很大^[18]。徐世千等^[9]采用了水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法和超临界CO₂萃取法来提取百里香精油，得率在0.19%~0.27%，其中，超临界CO₂萃取法的产量最高，但是质量较差，不利于进一步利用。也有研究者优化超高压提取和微波提取百里香精油，最佳条件下得率在1.04%~1.11%之间^[19]。

图 1 不同提取方法对百里香精油得率的影响

注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Figure 1. Effect of different extraction methods on yield of essential oil from Thymus vulgaris L．

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2.2 提取方法对精油化学成分的影响

2.2.1 百里香精油挥发性成分分析

本实验采用GC-MS对三种方法提取的百里香精油进行了挥发性成分分析，结果如表1所示，总计鉴定出36种化合物，占总成分的98.670%~99.774%，其中，萜烯化合物含量占总成分的6.368%~9.976%，醇类化合物含量占总成分的50.348%~51.575%，酮类化合物含量占总成分的1.448%~1.744%，酚类化合物占总成分的30.296%~35.200%，其他化合物占总成分的4.395%~7.681%。

表 1 百里香精油成分的 GC-MS 分析

Table 1. GC-MS analysis of essential oil from Thymus vulgaris L．

类别	保留时间（min）	分子式	化合物	相对含量（%）
类别	保留时间（min）	分子式	化合物	SD	SDE	CPAE
萜烯	10.105	C₁₀H₁₆	α-蒎烯（α-Pinene）	0.982±0.052^a	0.428±0.023^b	0.138±0.071^c
	10.518	C₁₀H₁₆	莰烯（Camphene）	2.084±0.151^a	1.025±0.134^b	0.388±0.117^c
	11.234	C₁₀H₁₆	β-蒎烯（β-Pinene）	0.221±0.092^a	−	−
	11.447	C₁₀H₁₆	β-月桂烯（β-Myrcene）	0.199±0.051^a	−	−
	12.216	C₁₀H₁₆	α-松油烯（α-Terpinene）	0.230±0.043^a	0.168±0.080^b	−
	12.544	C₁₀H₁₆	柠檬烯（l-Limonene）	0.424±0.053^a	0.303±0.021^b	0.211±0.074^c
	13.318	C₁₀H₁₆	γ-松油烯（γ-Terpinene）	0.953±0.095^a	0.596±0.054^b	0.395±0.088^c
	14.103	C₁₀H₁₆	萜品油烯（Terpinolene）	0.193±0.022^a	−	−
	21.196	C₁₅H₂₄	α-可巴烯（α-Copaene）	0.205±0.051^a	0.209±0.028^a	0.181±0.034^b
	22.242	C₁₅H₂₄	β-石竹烯（β-Caryophyllene）	3.615±0.021^a	3.507±0.033^b	3.61±0.028^a
	22.968	C₁₅H₂₄	α-律草烯（α-Caryophyllene）	0.024±0.005^b	0.183±0.004^a	0.187±0.011^a
	23.353	C₁₅H₂₄	α-依兰油烯（α-Muurolene）	−	−	0.166±0.056^a
	23.825	C₁₅H₂₄	4,9-依兰油二烯（4,9-Muuroladiene）	−	−	0.187±0.031^a
	24.163	C₁₅H₂₄	γ-杜松烯（γ-Cadinene）	0.410±0.022^b	0.407±0.019^b	0.439±0.031^a
	24.29	C₁₅H₂₄	δ-杜松烯（δ-Cadinene）	0.436±0.043^b	0.425±0.021^c	0.466±0.018^a
			萜烯总含量	9.976	7.251	6.368
醇类	14.113	C₁₀H₁₈O	二氢香芹醇（Cyclohexanol）	−	0.165±0.085^a	0.154±0.089^a
	14.322	C₁₀H₁₈O	芳樟醇（Linolool）	2.507±0.031^b	2.566±0.022^a	2.491±0.046^c
	16.259	C₁₀H₁₈O	2-茨醇（Borneol）	32.194±0.014^c	32.515±0.029^a	32.465±0.021^b
	16.458	C₁₀H₁₈O	4-萜品醇（4-Terpineol）	2.058±0.017^a	1.799±0.013^c	1.846±0.020^b
	16.618	C₁₀H₁₈O	侧柏醇（Thujyl alcohol）	0.444±0.023^c	0.513±0.025^b	0.636±0.013^a
	16.787	C₁₀H₁₈O	α-松油醇（α-Terpineol）	11.296±0.011^c	12.012±0.007^a	11.862±0.020^b
	25.546	C₁₅H₂₄O	斯巴醇（Spathulenol）	−	−	0.19±0.025^a
	26.228	C₁₅H₂₆O	库贝醇（Cubenol）	−	−	0.221±0.061^a
	26.7	C₁₅H₂₆O	T-杜松醇（T-Cadinol）	1.651±0.046^a	0.643±0.033^b	1.448±0.029^a
	26.986	C₁₅H₂₆O	α-杜松醇（α-Cadinol）	0.198±0.031^b	0.163±0.022^c	0.262±0.017^a
			醇类总含量	50.348	50.376	51.575
酮类	15.699	C₁₀H₁₆O	樟脑（Camphor）	1.473±0.016^a	1.448±0.012^b	1.476±0.018^a
	16.947	C₁₀H₁₆O	二氢香芹酮（Cyclohexanone）	−	−	0.268±0.013^a
			酮类总含量	1.473	1.448	1.744
酚类	19.05	C₁₀H₁₄O	百里香酚（Thymol）	13.031±0.081^b	15.202±0.098^a	15.159±0.052^a
	19.321	C₁₀H₁₄O	香芹酚（Carvacrol）	17.265±0.241^b	19.998±0.132^a	19.914±0.097^a
			酚类总含量	30.296	35.200	35.073
其他	12.434	C₁₀H₁₄	对聚伞花烃（p-Cymene）	2.735±0.048^a	1.590±0.079^b	0.982±0.076^c
	17.729	C₁₁H₁₈O₂	甲酸異莰酯（Sobornyl formate）	0.275±0.024^a	0.292±0.021^a	0.306±0.027^a
	17.958	C₁₁H₁₆O	2-异丙基-1-甲氧基-4-甲基苯（2-Isopropyl-1-methoxy-4-methylbenzene）	1.166±0.011^a	1.127±0.014^a	1.127±0.019^a
	25.702	C₁₅H₂₄O	石竹素（Caryophyllene oxide）	1.29±0.021^c	1.386±0.026^b	1.621±0.028^a
	26.15	C₁₅H₂₆O	香橙烯氧化物2（Aromadendrene oxide-2）	−	−	0.174±0.029^a
	27.083	C₁₅H₂₄O	异香橙烯环氧化物（Isoaromadendrene epoxide）	−	−	0.348±0.036^a
	39.866	C₂₇H₅₄	正二十七烷（Heptacosane）	2.215±0.041^a	−	−
			其他总含量	7.681	4.395	4.558
			合计	99.774	98.670	99.318
注：“−”表示未检出；同行中不同字母表示差异显著（P<0.05）。

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百里香精油中的主要成分（含量超过10%）有4个，含量最高的是2-茨醇（32.194%~32.515%），又称为龙脑、冰片，它具有一定清热明目的功效和类似薄荷和胡椒的香气特征^[19]；其次是香芹酚（17.265%~19.998%）和百里香酚（13.031%~15.202%），它们是从叶绿体中产生的含氧单萜，有着浓郁的麝香味被广泛用于制作香料^[8]，也是评估百里香精油质量的重要参数；然后是α-松油醇（11.296%~12.012%），它有着较强的抑菌、抗氧化和驱蚊活性^[20-21]。百里香精油是这些高含量化合物的天然来源。与已发表的报道相比，本研究百里香精油的挥发性成分中，2-茨醇代替百里香酚成为精油中含量最高的组分，这种差异主要是由于原料产地和生长条件的不同而导致的。Miguel等^[22]的研究也给出了较为接近的结果，观察到不同采收期、采集地的百里香精油的2-茨醇含量在10.7%~30.8%范围内，Borges等^[23]也发现百里香精油（原料产地为巴西）的挥发性成分中以2-茨醇为主要化合物，而更多文献显示出用该品种百里香所提的精油其百里香酚含量在39.5%~71.29%之间，占据主导地位，2-茨醇含量则在1.19%~2.14%之间^[11,24]。在其他组分中，p-聚伞花烃和γ-萜品烯是所有百里香品种都具有的成分，也有研究者报道γ-萜品烯可以通过中间产物p-聚伞花烃来合成百里香酚^[25-26]。

研究表明，提取参数中的许多因素，如温度、时间、提取过程的类型以及原料产出的地点、土壤成分、湿度、海拔等许多其他环境因素都会影响精油的含量和组成^[27]。三种方法在成分上所表现出的差异可以归因于SDE法中有机蒸汽与样品蒸汽可以进行更彻底的交换和萃取，从而获取更多有效成分；而在CPAE法中等离子体的应用会产生活性物质和自由基，可能导致精油化合物的氧化降解或异构化^[17]。

总体而言，与传统的SD法相比，SDE法和CPAE法得到更高的2-茨醇、百里香酚和香芹酚含量，精油质量更高。

2.2.2 百里香精油总酚、总黄酮、花青素含量分析

目前为止进行的研究已经证实，百里香不仅被认为是酚类和类黄酮的重要来源，而且还具有作为天然抗氧化剂的前景^[11]。总酚、总黄酮和花青素含量是广泛用于评估样品中抗氧化活性的重要指标。不同提取方法得到的百里香精油抗氧化活性含量如表2所示，水蒸气蒸馏法相比其他方法总酚当量最低，只有129.51 mg 没食子酸当量，SDE法的精油总酚含量最高，可达133.67 mg没食子酸当量，但两者并无显著差异（P>0.05）。这与GC-MS结果分析里三种样品酚类含量的比较结果相一致。总黄酮的含量在47.53~54.82 mg Rutin/g EO之间，SDE法与CPAE法得到的精油在总黄酮含量上有显著差异（P<0.05）。花青素的含量在0.08~0.32 mg/g EO，其中，SDE法提取的百里香精油中含量最高，其次是CPAE法和SD法，而且SDE法与其他方法相比有显著性差异（P<0.05）。

表 2 百里香精油中总酚、总黄酮、花青素含量

Table 2. Contents of total phenols, flavonoids and anthocyanins in Thymus vulgaris L. essential oil

提取方法	总酚（mg GA/g EO）	总黄酮（mg Rutin/g EO）	花青素（mg/g EO）
SD	129.51±1.47^a	51.49±5.28^ab	0.08±0.02^b
SDE	133.67±0.20^a	47.53±4.75^b	0.32±0.02^a
CPAE	130.50±0.99^a	54.82±4.96^a	0.11±0.01^b
注：同一列不同字母表示差异显著（P<0.05）。

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2.3 提取方法对精油抗氧化活性的影响

2.3.1 百里香精油对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除活性测试是最常用的抗氧化活性评估方法^[28]。由图2可以看出，在0.5~5 mg/mL浓度范围内，随着浓度的增大，三种精油对DPPH自由基都有着良好的清除能力，呈现出明显的量效关系。SDE法提取的精油在2 mg/mL时清除率便可达到95%以上，此时已接近同浓度V_C的清除活性，但总体上抗氧化活性要弱于V_C。SDE法、CPAE法、SD法精油的IC₅₀分别为0.57、0.86、1.28 mg/mL，所以DPPH抗氧化活性排序为：SDE>CPAE>SD。

图 2 百里香精油对DPPH 自由基的清除能力

Figure 2. Scavenging activity of Thymus vulgaris L. essential oil on DPPH free radicals

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不同精油间抗氧化性的差异可能归因于酚类化合物含量的不同^[29]。因此，表现出较高抗氧化活性的精油其总酚含量可能更高。近年来，百里香精油的抗氧化能力已经得到深入研究。百里香精油里富含的百里香酚和香芹酚与它们较高的自由基清除活性密切相关^[27]。酚类化合物的抗氧化原理可以解释为由于其化学结构允许它们向自由基供氢，从而使自由基被还原。此外，由单萜酚和倍半萜组成的精油已被认为具有更高的抗氧化能力^[30]。

2.3.2 百里香精油对ABTS自由基的清除能力

由图3可知，在0.02~1 mg/mL浓度范围内，随着浓度的增大，三种精油对ABTS自由基都有着良好的清除能力，呈现出明显的量效关系。SDE法提取的精油在1 mg/mL时已接近同浓度V_C的清除活性，CPAE法相比SD法抗氧化效果略有提高，但差距并不明显。SDE法、CPAE法、SD法精油的IC₅₀分别为0.018、0.022、0.028 mg/mL，所以ABTS抗氧化活性排序为：SDE>CPAE>SD。Mayara等^[31]也报道了百里香精油极强的ABTS自由基清除活性，除此之外还研究了百里香精油主要挥发性成分的单体抗氧化性，发现只有百里香酚和香芹酚具有高效清除自由基的功能（IC₅₀分别为3.7 μg/mL和3.4 μg/mL），而单体松油烯和芳樟醇并没有表现出抗氧化活性。也有报道称α-松油醇对于ABTS自由基也具有可观的清除效果^[32]。总体而言，百里香精油对ABTS自由基的清除活性主要来自其酚类物质。

图 3 百里香精油对ABTS自由基的清除能力

Figure 3. Scavenging activity of Thymus vulgaris L. essential oil on ABTS free radicals

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2.3.3 百里香精油总抗氧化能力

金属离子的存在会加速活性氧化物的形成同时激发氧化反应的产生。将金属离子还原可以阻止这一反应并提供氧化稳定性^[33]。因此，本实验采用铁离子还原法测定百里香精油的还原能力。由图4可知，在0.2~1.2 mg/mL浓度范围内，V_C和百里香精油的总抗氧化能力呈明显的剂量依赖效应，V_C的FRAP值在2.795~5.593 mmol/L之间，三种方法所得精油的总抗氧化能力没有明显的差异，其中，SDE法的精油FRAP值在0.275~1.053 mmol/L范围内，相比SD法（0.244~1.022 mmol/L）和CPAE法（0.283~0.998 mmol/L）精油的FRAP值略高。总抗氧化能力顺序为：SDE>SD>CPAE。百里香的高还原力与其百里香酚和香芹酚的含量有着密切关系，主要是由于芳香环上的羟基具有很强的供氢能力^[34]。

图 4 百里香精油总抗氧化能力

Figure 4. Total antioxidant capacity of Thymus vulgaris L. essential oil

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2.3.4 百里香精油的化学成分与抗氧化性相关性分析

精油的生物活性组分与其抗氧化性之间有着明显的相关性^[35]。如表3所示，DPPH自由基清除能力与总酚呈显著性正相关（P<0.05），与2-茨醇、百里香酚、香芹酚、α-松油醇含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.838、0.818、0.820、0.843，可见这几种成分是百里香精油中清除DPPH自由基的关键物质。ABTS自由基清除能力与2-茨醇、α-松油醇含量呈显著正相关（P<0.05），与花青素含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数达到了0.990，可知2-茨醇、α-松油醇和花青素在清除ABTS自由基时起到重要作用。总抗氧化能力与总酚含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.821。除此之外，可以看出百里香酚和香芹酚的含量呈现出极强的相关性，而且香芹酚含量高的精油，百里香酚含量也较高，这可能是因为它们之间具有生物合成关系，Thompson等^[36]的研究也得出了与本文类似的结果。经过Pearson相关性分析也进一步证实，百里香精油的抗氧化活性与酚类物质的含量密切相关。

表 3 不同方法提取的百里香精油抗氧化性与主要化学成分的相关系数

Table 3. Correlation coefficients between antioxidant activity and main chemical components of essential oil extracted by different methods

	总酚	总黄酮	花青素	2-茨醇	百里香酚	香芹酚	α-松油醇	DPPH	ABTS	总抗氧化力
总酚	1
总黄酮	−0.018	1
花青素	0.487	−0.749^*	1
2-茨醇	0.410	−0.171	0.695^*	1
百里香酚	0.369	−0.058	0.598	0.992^**	1
香芹酚	0.373	−0.067	0.606	0.993^**	1.000^**	1
α-松油醇	0.425	−0.218	0.733^*	0.999^**	0.983^**	0.985^**	1
DPPH	0.698^*	−0.145	0.665	0.838^**	0.818^**	0.820^**	0.843^**	1
ABTS	0.496	−0.702^*	0.990^**	0.737^*	0.645	0.653	0.773^*	0.679^*	1
总抗氧化力	0.821^**	−0.425	0.603	0.153	0.061	0.068	0.191	0.471	0.59	1
注：在0.05水平上（双尾），显著相关；*在0.01水平上（双尾），极显著相关。

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3. 结论

本研究采用SD法、SDE法和较为新颖的CPAE法制得了三种百里香精油，从得率上看，CPAE法比SD法有了一定的提高，但SDE法可以在同样的时间里获得最多的精油且有着显著差异（P<0.05）。通过GC-MS分析了三种百里香精油的挥发性成分，共鉴定出了36种组分，组分和含量上三种精油有着一定差异，在主要活性成分上SDE法和CPAE法都展现出比SD法更高的含量。对百里香精油进行了总酚、总黄酮和花青素含量的测定，SDE法的精油中三种活性物质也呈现出较高的含量，这与三种精油的GC-MS分析结果中酚类物质的含量水平相一致。三种精油对于DPPH、ABTS自由基都有很强的清除能力，也具有一定的总抗氧化能力。总体上来说，三种精油的抗氧化能力顺序为SDE>CPAE>SD。通过活性成分和抗氧化能力的相关性分析表明，百里香精油的自由基清除能力与酚类物质的含量呈现很强的正相关性。综合来看，SDE法不论是在品质和效率上都是制备百里香精油的最优方法。百里香精油作为有前景的天然抗氧化剂，如何开发出更加安全、稳定的递送载体从而更广泛、高效地应用于食品和医疗事业将会是未来研究的重点。

图 1 不同提取方法对百里香精油得率的影响

注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Figure 1. Effect of different extraction methods on yield of essential oil from Thymus vulgaris L．

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图 2 百里香精油对DPPH 自由基的清除能力

Figure 2. Scavenging activity of Thymus vulgaris L. essential oil on DPPH free radicals

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图 3 百里香精油对ABTS自由基的清除能力

Figure 3. Scavenging activity of Thymus vulgaris L. essential oil on ABTS free radicals

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图 4 百里香精油总抗氧化能力

Figure 4. Total antioxidant capacity of Thymus vulgaris L. essential oil

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表 1 百里香精油成分的 GC-MS 分析

Table 1 GC-MS analysis of essential oil from Thymus vulgaris L．

类别	保留时间（min）	分子式	化合物	相对含量（%）
类别	保留时间（min）	分子式	化合物	SD	SDE	CPAE
萜烯	10.105	C₁₀H₁₆	α-蒎烯（α-Pinene）	0.982±0.052^a	0.428±0.023^b	0.138±0.071^c
	10.518	C₁₀H₁₆	莰烯（Camphene）	2.084±0.151^a	1.025±0.134^b	0.388±0.117^c
	11.234	C₁₀H₁₆	β-蒎烯（β-Pinene）	0.221±0.092^a	−	−
	11.447	C₁₀H₁₆	β-月桂烯（β-Myrcene）	0.199±0.051^a	−	−
	12.216	C₁₀H₁₆	α-松油烯（α-Terpinene）	0.230±0.043^a	0.168±0.080^b	−
	12.544	C₁₀H₁₆	柠檬烯（l-Limonene）	0.424±0.053^a	0.303±0.021^b	0.211±0.074^c
	13.318	C₁₀H₁₆	γ-松油烯（γ-Terpinene）	0.953±0.095^a	0.596±0.054^b	0.395±0.088^c
	14.103	C₁₀H₁₆	萜品油烯（Terpinolene）	0.193±0.022^a	−	−
	21.196	C₁₅H₂₄	α-可巴烯（α-Copaene）	0.205±0.051^a	0.209±0.028^a	0.181±0.034^b
	22.242	C₁₅H₂₄	β-石竹烯（β-Caryophyllene）	3.615±0.021^a	3.507±0.033^b	3.61±0.028^a
	22.968	C₁₅H₂₄	α-律草烯（α-Caryophyllene）	0.024±0.005^b	0.183±0.004^a	0.187±0.011^a
	23.353	C₁₅H₂₄	α-依兰油烯（α-Muurolene）	−	−	0.166±0.056^a
	23.825	C₁₅H₂₄	4,9-依兰油二烯（4,9-Muuroladiene）	−	−	0.187±0.031^a
	24.163	C₁₅H₂₄	γ-杜松烯（γ-Cadinene）	0.410±0.022^b	0.407±0.019^b	0.439±0.031^a
	24.29	C₁₅H₂₄	δ-杜松烯（δ-Cadinene）	0.436±0.043^b	0.425±0.021^c	0.466±0.018^a
			萜烯总含量	9.976	7.251	6.368
醇类	14.113	C₁₀H₁₈O	二氢香芹醇（Cyclohexanol）	−	0.165±0.085^a	0.154±0.089^a
	14.322	C₁₀H₁₈O	芳樟醇（Linolool）	2.507±0.031^b	2.566±0.022^a	2.491±0.046^c
	16.259	C₁₀H₁₈O	2-茨醇（Borneol）	32.194±0.014^c	32.515±0.029^a	32.465±0.021^b
	16.458	C₁₀H₁₈O	4-萜品醇（4-Terpineol）	2.058±0.017^a	1.799±0.013^c	1.846±0.020^b
	16.618	C₁₀H₁₈O	侧柏醇（Thujyl alcohol）	0.444±0.023^c	0.513±0.025^b	0.636±0.013^a
	16.787	C₁₀H₁₈O	α-松油醇（α-Terpineol）	11.296±0.011^c	12.012±0.007^a	11.862±0.020^b
	25.546	C₁₅H₂₄O	斯巴醇（Spathulenol）	−	−	0.19±0.025^a
	26.228	C₁₅H₂₆O	库贝醇（Cubenol）	−	−	0.221±0.061^a
	26.7	C₁₅H₂₆O	T-杜松醇（T-Cadinol）	1.651±0.046^a	0.643±0.033^b	1.448±0.029^a
	26.986	C₁₅H₂₆O	α-杜松醇（α-Cadinol）	0.198±0.031^b	0.163±0.022^c	0.262±0.017^a
			醇类总含量	50.348	50.376	51.575
酮类	15.699	C₁₀H₁₆O	樟脑（Camphor）	1.473±0.016^a	1.448±0.012^b	1.476±0.018^a
	16.947	C₁₀H₁₆O	二氢香芹酮（Cyclohexanone）	−	−	0.268±0.013^a
			酮类总含量	1.473	1.448	1.744
酚类	19.05	C₁₀H₁₄O	百里香酚（Thymol）	13.031±0.081^b	15.202±0.098^a	15.159±0.052^a
	19.321	C₁₀H₁₄O	香芹酚（Carvacrol）	17.265±0.241^b	19.998±0.132^a	19.914±0.097^a
			酚类总含量	30.296	35.200	35.073
其他	12.434	C₁₀H₁₄	对聚伞花烃（p-Cymene）	2.735±0.048^a	1.590±0.079^b	0.982±0.076^c
	17.729	C₁₁H₁₈O₂	甲酸異莰酯（Sobornyl formate）	0.275±0.024^a	0.292±0.021^a	0.306±0.027^a
	17.958	C₁₁H₁₆O	2-异丙基-1-甲氧基-4-甲基苯（2-Isopropyl-1-methoxy-4-methylbenzene）	1.166±0.011^a	1.127±0.014^a	1.127±0.019^a
	25.702	C₁₅H₂₄O	石竹素（Caryophyllene oxide）	1.29±0.021^c	1.386±0.026^b	1.621±0.028^a
	26.15	C₁₅H₂₆O	香橙烯氧化物2（Aromadendrene oxide-2）	−	−	0.174±0.029^a
	27.083	C₁₅H₂₄O	异香橙烯环氧化物（Isoaromadendrene epoxide）	−	−	0.348±0.036^a
	39.866	C₂₇H₅₄	正二十七烷（Heptacosane）	2.215±0.041^a	−	−
			其他总含量	7.681	4.395	4.558
			合计	99.774	98.670	99.318
注：“−”表示未检出；同行中不同字母表示差异显著（P<0.05）。

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表 2 百里香精油中总酚、总黄酮、花青素含量

Table 2 Contents of total phenols, flavonoids and anthocyanins in Thymus vulgaris L. essential oil

提取方法	总酚（mg GA/g EO）	总黄酮（mg Rutin/g EO）	花青素（mg/g EO）
SD	129.51±1.47^a	51.49±5.28^ab	0.08±0.02^b
SDE	133.67±0.20^a	47.53±4.75^b	0.32±0.02^a
CPAE	130.50±0.99^a	54.82±4.96^a	0.11±0.01^b
注：同一列不同字母表示差异显著（P<0.05）。

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表 3 不同方法提取的百里香精油抗氧化性与主要化学成分的相关系数

Table 3 Correlation coefficients between antioxidant activity and main chemical components of essential oil extracted by different methods

	总酚	总黄酮	花青素	2-茨醇	百里香酚	香芹酚	α-松油醇	DPPH	ABTS	总抗氧化力
总酚	1
总黄酮	−0.018	1
花青素	0.487	−0.749^*	1
2-茨醇	0.410	−0.171	0.695^*	1
百里香酚	0.369	−0.058	0.598	0.992^**	1
香芹酚	0.373	−0.067	0.606	0.993^**	1.000^**	1
α-松油醇	0.425	−0.218	0.733^*	0.999^**	0.983^**	0.985^**	1
DPPH	0.698^*	−0.145	0.665	0.838^**	0.818^**	0.820^**	0.843^**	1
ABTS	0.496	−0.702^*	0.990^**	0.737^*	0.645	0.653	0.773^*	0.679^*	1
总抗氧化力	0.821^**	−0.425	0.603	0.153	0.061	0.068	0.191	0.471	0.59	1
注：在0.05水平上（双尾），显著相关；*在0.01水平上（双尾），极显著相关。

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施引文献(10)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 水蒸气蒸馏法（SD）提取百里香精油
1.2.2 同时蒸馏萃取（SDE）百里香精油
1.2.3 冷等离子体辅助提取（CPAE）百里香精油
1.2.4 百里香精油得率的计算
1.2.5 GC-MS分析条件
1.2.5.1 色谱条件
1.2.5.2 质谱条件
1.2.6 总酚、总黄酮、总花青素含量的测定
1.2.6.1 精油中总酚含量的测定
1.2.6.2 精油中总黄酮含量的测定
1.2.6.3 精油中花青素含量的测定
1.2.7 DPPH自由基清除能力测定
1.2.8 ABTS自由基清除能力测定
1.2.9 总抗氧化能力测定（FRAP法）
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 提取方法对精油得率的影响
2.2 提取方法对精油化学成分的影响
2.2.1 百里香精油挥发性成分分析
2.2.2 百里香精油总酚、总黄酮、花青素含量分析
2.3 提取方法对精油抗氧化活性的影响
2.3.1 百里香精油对DPPH自由基的清除能力
2.3.2 百里香精油对ABTS自由基的清除能力
2.3.3 百里香精油总抗氧化能力
2.3.4 百里香精油的化学成分与抗氧化性相关性分析
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 水蒸气蒸馏法（SD）提取百里香精油
1.2.2 同时蒸馏萃取（SDE）百里香精油
1.2.3 冷等离子体辅助提取（CPAE）百里香精油
1.2.4 百里香精油得率的计算
1.2.5 GC-MS分析条件
1.2.5.1 色谱条件
1.2.5.2 质谱条件
1.2.6 总酚、总黄酮、总花青素含量的测定
1.2.6.1 精油中总酚含量的测定
1.2.6.2 精油中总黄酮含量的测定
1.2.6.3 精油中花青素含量的测定
1.2.7 DPPH自由基清除能力测定
1.2.8 ABTS自由基清除能力测定
1.2.9 总抗氧化能力测定（FRAP法）
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 提取方法对精油得率的影响
2.2 提取方法对精油化学成分的影响
2.2.1 百里香精油挥发性成分分析
2.2.2 百里香精油总酚、总黄酮、花青素含量分析
2.3 提取方法对精油抗氧化活性的影响
2.3.1 百里香精油对DPPH自由基的清除能力
2.3.2 百里香精油对ABTS自由基的清除能力
2.3.3 百里香精油总抗氧化能力
2.3.4 百里香精油的化学成分与抗氧化性相关性分析
3. 结论

参考文献(36)

施引文献

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提取方法对百里香精油化学成分和抗氧化活性的影响

作者简介: 刘欢（1988−），男，博士，教授，研究方向：食品化学，E-mail：liu_huan2011@hotmail.com

通讯作者: 邵灯寅（1990−），男，硕士，工程师，研究方向：卷烟调香和产品开发，E-mail：dyshao1015@163.com

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