各种自由基所引发的氧化损伤是致使体内各组织器官衰老损伤、病变的重要原因之一，许多重大疾病的诱发与之密切相关^[1-2]。目前广泛使用的抗氧化剂主要源于化学合成，具一定毒副作用，从天然药物中寻找安全无毒的抗氧化剂已成为国内外研究的热点^[3-5]。大量研究发现，黄酮类、酚类、皂苷、多糖等多类中药化学成分具有良好的抗氧化活性^[6-7]。我国地广物博，天然药用植物资源丰富，从中寻找安全、低毒、高效、价廉的天然抗氧化剂具有十分光明的前景^[5]。

福建观音座莲（Angiopteris fokiensis Hieron），又名牛蹄劳、马蹄蕨，为合囊蕨科（Marattiaceae）观音座莲属植物，主产于广东、福建和广西等地，常以根茎入药，具有清热解毒、止痛、凉血止血等功效^[8]，形如马蹄，可做食粮使用。现代研究发现，福建观音座莲含丰富的药用成分，如有机酸类、黄酮类、甾体类、酚类、多糖类以及变型二肽类物质等^[9-10]，其中，福建观音座莲多糖具有一定的抗癌作用和免疫活性；甾体类化合物可用于真菌感染、肿瘤和心脑血管等疾病的治疗^[11]。目前，对福建观音座莲的研究大多局限于资源现状研究、育苗及栽培技术研究等方面^[12-13]，对福建观音座莲叶总黄酮、总酚提取及活性研究未见报道。为了深入研究不同溶剂对福建观音座莲叶中成分萃取及活性的影响，试验测定各萃取部位中总黄酮与总酚含量，采用多种体外抗氧化活性评价方法研究其抗氧化作用，并分析活性与成分含量的相关性，以期为进一步开发利用福建观音座莲叶提供实验基础，同时为天然抗氧化剂的研发提供参考。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

福建观音座莲叶　2019年6月采自广东省梅州市大埔县丰溪林场；芦丁　纯度≥98%，安徽酷尔生物工程有限公司；V_C（纯度≥98%）、铁氰化钾、过硫酸钾、三氯乙酸、无水三氯化铁　西陇科学股份有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐　美国Sigma-Aldrich公司；福林酚、没食子酸　纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司；卵磷脂　广东长程医药生物科技有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氢氧化纳、二水磷酸二氢钠　均为国产分析纯。

BT125D电子分析天平、D-16C离心机　德国Sartorius公司；EMS-40A数显磁力搅拌水浴锅　康恒仪器有限公司；S100/S100H超声波清洗器　德国Elma公司；78-0070旋转蒸发仪　美国KD公司；DR6000紫外-可见分光光度计　美国HACH公司。

1.2   实验方法

1.2.1   样品制备

取干燥福建观音座莲叶185 g，粉碎，用10倍量95%乙醇超声（600 W，30 min）重复提取3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩得乙醇提取物（YE-Z，9.8 g），取醇提物8 g，混悬于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各萃取液浓缩后得相应浸膏：石油醚部位（YE-P，2.35 g）、乙酸乙酯部位（YE-E，0.42 g）、正丁醇部位（YE-B，1.49 g）及水部位（YE-W，2.99 g）。

1.2.2   样品总黄酮含量测定

参考文献[14-15]方法稍作修改。精密称取芦丁标准品5.0 mg，无水乙醇溶解定容至25 mL容量瓶中，摇匀即得芦丁标准溶液（0.2 mg/mL）。精密吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，加0.40 mL 5% NaNO₂溶液，摇匀，静置6 min；加入10% Al（NO₃）₃溶液0.40 mL，摇匀，静置 6 min；再加入4% NaOH溶液4.00 mL，无水乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min后，以不加芦丁标准溶液的试液作空白对照，在波长为510 nm处测定吸光度，平行测定3次。以芦丁标准溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

精密吸取不同质量浓度的待测样液3.00 mL按上述方法测定吸光度，代入标准曲线方程，计算样品总黄酮含量。

1.2.3   样品总酚含量测定

参考文献[16-17]方法稍作适当修改。精密称取10.0 mg没食子酸标品，纯水溶解后定容，摇匀即得没食子酸标准溶液（0.2 mg/mL）。分别精密吸取0.00~0.50 mL 6个梯度的标准溶液置于6个10 mL比色管中，各加5.00 mL纯水，再加0.50 mL Folin-酚试剂，摇匀，静置2 min，加 7.5% Na₂CO₃溶液2.00 mL，纯水定容至刻度，恒温水浴10 min，室温暗置1 h。以空白试剂为对照，于760 nm波长处测定吸光度，平行测定3次。以吸光度为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。

精密吸取不同质量浓度的待测样液1.00 mL按上述方法测定吸光度，代入标准曲线方程，计算样品总酚含量。

1.2.4   抗氧化活性评价

1.2.4.1   清除ABTS⁺·作用测定

参考文献[18-19]方法稍做修改。将2.45 mmol/L过硫酸钾溶液与7.0 mmol/L ABTS溶液等体积混合，避光反应12~16 h，得ABTS⁺溶液。用适量磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4）稀释ABTS⁺溶液至在波长734 nm处的吸光度为0.800±0.020，得ABTS⁺工作液；精密吸取上述溶液3.90 mL，加入至0.10 mL不同浓度待测液中，摇匀，室温暗置10 min，以磷酸盐缓冲液调零，测定其在波长为734 nm处的吸光度（A_i）；以等量无水乙醇代替样液，同法测定吸光度（A₀）；以等量磷酸盐缓冲液代替ABTS⁺工作液同法测定吸光度（A_j），以V_C为对照，平行测定3次。清除率按下式计算：

1.2.4.2   清除DPPH·作用测定

参考文献[20-21]方法稍做修改。吸取不同浓度的待测样液2.00 mL，加入2.00 mL 0.15 mmol/LDPPH工作液，摇匀，室温暗置20 min，测定其在波长为517 nm处的吸光度（A_i）；以等量无水乙醇代替样液，同法测定吸光度（A₀）；以等量无水乙醇代替0.15 mmol/L DPPH工作液的吸光度（A_j）。以V_C为对照，平行测定3次。清除率按下式计算：

1.2.4.3   铁还原能力测定

参考文献[22-23]方法并做修改。吸取2.50 mL不同浓度的待测样液至25 mL比色管，加入磷酸盐缓冲液（2.0 mol/L，pH6.6）与 1%铁氰化钾溶液各2.50 mL，摇匀，50 ℃恒温箱避光反应20 min，迅速冷却，加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液，摇匀，离心10 min（6000 r/min）。取2.50 mL上清液，加入0.1% FeCl₃溶液0.50 mL和蒸馏水2.00 mL，摇匀，于波长700 nm处测定吸光度（A_i）；同法测定以等量无水乙醇代替样品溶液的吸光度（A₀）和以等量蒸馏水代替反应试剂的吸光度（A_j）。以V_C为对照，平行测定3次。还原能力按下式计算：

1.2.4.4   抑制脂质过氧化能力测定

参考文献[24-25]方法，分别取卵磷脂溶液、0.4 mmol/L FeSO₄溶液和不同浓度的待测样液各1 mL，依次加入至10 mL试管，摇匀，37 ℃避光水浴1 h，加入2 mL TCA-TBA-HCl混合液，90~100 ℃水浴15 min，急速冷却后离心10 min（3000 r/min），取上清液，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液调零，于波长535 nm处测定其吸光度（A_i）；同法测定以等量无水乙醇代替待测液的吸光度（A₀）与以等量蒸馏水代替卵磷脂溶液的吸光度（A_j）。以V_C为对照，平行测定3次。抑制率按下式计算：

1.3   数据处理

各试验重复3次，数值均以${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$表示，采用Origin 8.5和Excel 2010软件进行数据处理与绘图，得到相应的半数清除浓度（IC₅₀）。采用Pearson法分析抗氧化活性与总黄酮、总酚含量的相关性。

2.   结果与分析

2.1   总黄酮与总酚含量分析

以质量浓度为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y），得芦丁线性方程：y=12.02x+0.0204（R²=9993），线性范围为0.02~0.06 mg/mL；没食子酸线性方程：y=98.35x+0.0295（R²=0.9997），线性范围为0.002~0.01 mg/mL。如图1、图2所示，福建观音座莲叶提取物各萃取部位均含有总黄酮、总酚，但含量差异明显，总黄酮含量高低排序：YE-E>YE-P>YE-Z>YE-B>YE-W，总酚含量高低排序：YE-E>YE-B>YE-W>YE-Z>YE-P。其中YE-E的总黄酮、总酚含量均为最高，分别为271.05±2.82 mg/mL和59.62±3.23 mg/mL，表明黄酮和酚类化合物可高度富集于乙酸乙酯部位中。该结果与赵晋彤等^[27]对粗茎鳞毛蕨总酚、总黄酮含量测定结果一致，其研究显示乙酸乙酯萃取部位的总酚、总黄酮含量最高。

图  1  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位总黄酮含量

注：醇提物：YE-Z；石油醚：YE-P；乙酸乙酯：YE-E；正丁醇：YE-B；水：YE-W；图2同。

Figure  1.  Content of total flavonoids in different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

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图  2  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位总酚含量

Figure  2.  Total phenol content in different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

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2.2   抗氧化活性分析

2.2.1   对ABTS⁺自由基清除作用

由图3可知，福建观音座莲叶各萃取部位在实验浓度范围内，随着样品质量浓度增大，其清除ABTS⁺自由基的能力增强。YE-E对ABTS⁺自由基清除能力最显著，在浓度为1.62 mg/mL时，其清除率达95.68%。由表1可知，YE-E清除ABTS⁺自由基IC₅₀值为0.47±0.05 mg/mL，YE-P、YE-W清除ABTS⁺自由基IC₅₀值分别为2.65±0.13和2.48±0.12 mg/mL，综上，福建观音座莲叶各部位清除ABTS⁺自由基的能力从强到弱依次为：YE-E>YE-B>YE-Z>YE-W>YE-P。但与阳性对照V_C有明显差距。产生该结果的原因在于不同成分极性不同，根据相似相溶原理，通过不同极性溶剂对福建观音座莲叶醇提取物进行萃取后，可以有效的将福建观音座莲叶醇提取物中不同极性物质进行分离，结果表明福建观音座莲清除ABTS⁺自由基的有效成分为富集于中等极性的乙酸乙酯萃取物中。

图  3  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位对ABTS⁺自由基清除作用

Figure  3.  Scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on ABTS⁺ free radicals

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表  1  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位对ABTS⁺自由基清除作用的IC₅₀（${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$，n=3）

Table  1.  IC₅₀ of the scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on ABTS free radicals (${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$, n=3)

样品	YE-Z	YE-P	YE-E	YE-B	YE-W	VC
IC50（mg/mL）	2.01±0.08	2.65±0.13	0.47±0.05	1.41±0.09	2.48±0.12	0.110±0.005

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2.2.2   对DPPH自由基清除作用

由图4可知，福建观音座莲叶各萃取部位具有不同程度清除DPPH自由基的能力，在一定的质量浓度范围内，各部位对DPPH自由基的清除率随质量浓度升高而增大。当质量浓度为0.8 mg/mL时，清除率由高到低依次为：V_C>YE-E>YE-P>YE-B>YE-Z>YE-W，以YE-E清除率最强（95.91%），水部位清除率最弱（41.76%）。由表2可知：YE-E清除DPPH自由基的IC₅₀值为0.19±0.022 mg/mL，明显低于其他极性提取物，抗氧化能力强，表明福建观音座莲叶清除DPPH自由基的活性物质主要集中在YE-E中。

图  4  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位对DPPH自由基清除作用

Figure  4.  Scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on DPPH free radicals

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表  2  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位对DPPH自由基清除作用的IC₅₀（${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$，n=3）

Table  2.  IC₅₀ of the scavenging effect of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract on DPPH free radicals (${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$，n=3)

样品	YE-Z	YE-P	YE-E	YE-B	YE-W	VC
IC50（mg/mL）	0.80±0.04	0.70±0.03	0.19±0.02	0.73±0.04	1.15±0.07	0.00037±0.00021

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表  3  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位铁还原能力的线性分析

Table  3.  Linear analysis of iron reduction ability of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

样品	线性方程	r
YE-Z	Y=0.4399x+0.0037	0.9992
YE-P	Y=0.2261x+0.0322	0.9850
YE-E	Y=0.9007x+0.1706	0.9801
YE-B	Y=0.5601x−0.0037	0.9995
YE-W	Y=0.506x+0.0270	0.9999
VC	Y=52.895x+0.0039	0.9998

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福建观音座莲叶各萃取部位对DPPH自由基的清除活性与ABTS自由基不一致，其可能在于：在经过不同极性溶剂萃取后，不同部位具有含量不同且极性结构不同的酚类和黄酮类成分，不同含量且不同极性结构的酚类和黄酮类协同作用可能导致其趋势不一致；不同抗氧化体系的发挥抗氧化的机理的不同，从而需要结构不同的抗氧化活性物质才能发挥活性^[26]。

2.2.3   对铁的还原能力

由图5可知，福建观音座莲叶各萃取部位均表现出一定还原能力，且还原能力随质量浓度增大而不断增强，呈正相关性。在同质量浓度下，YE-E的还原能力明显大于其他部位，YE-B和YE-W的还原能力在0.05~0.8 mg/mL浓度范围内相差不大，在浓度为0.8~1.6 mg/mL才出现差异，各部位的还原能力大小依次为：VC>YE-E>YE-B>YE-W>YE-Z>YE-P。由表3线性分析可知，YE-W、YE-B、YE-E、YE-P、YE-Z的质量浓度与吸光度的相关系数（r）分别为0.9999、0.9995、0.9801、0.9850、0.9992，表明福建观音座莲叶各部位的还原能力在0.05~1.6 mg/mL浓度范围内有良好的相关性。该活性所需质量浓度范围与同为蕨类植物的粗茎鳞毛蕨不同萃取部位对还原能力测定浓度范围接近，该研究显示粗茎鳞毛蕨乙酸乙酯萃取物还原能力（IC₅₀值为0.05 mg/mL），提示乙酸乙酯可能是富集蕨类抗氧化活性物质的有效溶剂^[27]。

图  5  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位的铁还原能力

Figure  5.  Iron reduction ability of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract

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表  4  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位抑制脂质过氧化能力的IC₅₀（${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$，n=3）

Table  4.  IC₅₀ of different extracted parts of Angiopteris Fokiensis Hieron leaf extract to inhibit lipid peroxidation (${\rm{\bar X}} \pm {\rm{SD}}$, n=3)

样品	YE-Z	YE-P	YE-E	YE-B	YE-W	VC
IC50（mg/mL）	0.52±0.08	0.38±0.04	0.26±0.02	4.90±0.27	2.69±0.35	0.0040±0.0003

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2.2.4   抑制脂质过氧化的能力

多不饱和脂肪酸在生物体内发生脂质过氧化会产生大量过氧化物和丙二醛等有毒物质，诱发细胞的氧化损伤，导致组织、器官的氧化病变等不良影响^[28]。福建观音座莲叶提取物及不同萃取部位对脂质过氧化的抑制能力结果如图6，在质量浓度为0.4 mg/mL时，YE-E抑制率达73.05%，且抑制能力随质量浓度增大呈明显增强趋势，而YE-W与YE-B随质量浓度的增大抑制能力变化不明显。因此，各部位抑制能力大小依次为：V_C>YE-E>YE-Z>YE-P>YE-W>YE-B。由表4可知，YE-E抑制脂质过氧化的能力最强，其IC₅₀值为0.26±0.02 mg/mL远小于其他提取物，YE-B抑制脂质过氧化能力最弱，IC₅₀值为4.90±0.27 mg/mL，表明福建观音座莲叶抑制脂质过氧化的活性成分主要富集于YE-E中。

图  6  福建观音座莲叶提取物不同萃取部位抑制脂质过氧化的能力

Figure  6.  Ability of different extracted parts of Angiopteris fokiensis Hieron leaf extract to inhibit lipid peroxidation

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2.2.5   抗氧化活性与成分含量相关性分析

由表5可知，福建观音座莲叶各萃取部位的抗氧化活性与其总黄酮、总多酚呈极显著正相关（P<0.01）。具体表现为：清除DPPH、ABTS⁺自由基能力与总黄酮相关性最高（P<0.01），铁还原能力与总酚最为相关（P<0.01），抑制脂质过氧化能力则与两者相关性相当（P<0.01）。综上，总黄酮与总酚是福建观音座莲叶发挥抗氧化活性的物质基础。

表  5  抗氧化活性与成分含量的相关系数

Table  5.  Correlation coefficient between antioxidant activity and component content

分析指标	总黄酮	总酚
清除ABTS+自由基能力	0.998**	0.995**
清除DPPH自由基能力	0.985**	0.977**
铁还原能力	0.981**	1.000**
抑制脂质过氧化能力	0.968**	0.968**
注：**双侧极显著相关（P<0.01），*双侧显著相关（P<0.05）。

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3.   结论

本研究表明福建观音座莲叶各萃取部位均含有总黄酮、总酚类成分和抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位总黄酮（271.05±2.82 mg/g）与总酚（59.62±3.23 mg/g）含量最高，且乙酸乙酯部位抗氧化活性优于其他部位，其清除DPPH、ABTS⁺自由基的IC₅₀值分别为0.19±0.02和0.47±0.05 mg/mL，抑制脂质过氧化的IC₅₀值为0.26±0.02 mg/mL。相关性分析显示，福建观音座莲叶各部位的总黄酮、总多酚含量均与抗氧化活性呈极显著正相关（P<0.01），表明黄酮和酚类化合物是其发挥抗氧化作用的物质基础。综上显示，乙酸乙酯部位为福建观音座莲叶抗氧化最有效部位。通过本实验可以初步确定该活性部位中主要活性物质为酚类和黄酮类化合物，因此，后期应重点对福建观音座莲叶乙酸乙酯提取物中的酚类和黄酮类成分进行分离纯化，明确其活性单体成分，分析构效关系，进一步丰富福建观音座莲的科学内涵，对后续开发新型抗氧剂具有重要的指导意义。