Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Naturally Fermented Pickles from Ningxia and Its Application in Goji Berry Juice Fermentation
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摘要: 以宁夏银川市采集的家庭自制的3份发酵泡菜制品为材料，从中筛选产酸量较高的乳酸菌，通过形态观察、生理生化试验及分子生物学方法对其进行鉴定，并对其耐酸、耐胆盐及发酵性能进行测定，筛选性能优良的乳酸菌，最后将其应用到发酵枸杞汁中。结果表明，筛选得到5株产酸量较高的乳酸菌，经鉴定分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum NXU_19010）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus NXU_19023）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus NXU_19006）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus NXU_19022）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei NXU_19004）。其中菌株瑞士乳杆菌NXU_19022的耐酸、耐胆盐及生长性能较好，在6 h左右优先进入生长对数期，其在pH为2时的存活率约为92%，在牛胆盐含量百分比为0.9%时的存活率约为18%。NXU_19022发酵后使枸杞汁中多糖含量提高约29%，多酚含量约为原来的91%，感官评分最高。能显著提高自由基清除率和改善发酵枸杞汁的风味品质。采用非靶向代谢组学对NXU_19022发酵前后枸杞汁的挥发性成分进行分析，其中显著性差异代谢产物有20种，脂类物质含量上调，呈香味及甜味物质含量上调。表明该菌株具有良好的发酵特性，可进一步开发利用作为发酵产品的生产菌株。Abstract: Using 3 home-made fermented pickles from Yinchuan city of Ningxia as material, lactic acid bacteria with high acid production were selected,and identified through morphological observation, physiological and biochemical tests and molecular biology techniques, and their acid resistance, bile salt resistance,salt tolerance and fermentation ability were determined.The lactic acid bacteria with excellent performance were screened and finally applied to fermented Goji berry juice. The results showed that 5 strains of lactic acid bacteria with high acid production were obtained,one strains was identified as Lactobacillus plantarum NXU_ 19010, one strain was identified as Lactobacillus rhamnosus NXU_ 19023, one strain was identified as Lactobacillus pentosus NXU_ 19006, one strain was identified as Lactobacillus helveticus NXU_ 19022, one strain was identified as Lactobacillus paracasei NXU_ 19004.Among them, Lactobacillus helveticus NXU_ 19022 had good acid resistance, bile salt resistance and growth performance, at about 6 h, it began to be logarithmic growth phase, thesurvival rate was about 92% at pH2 and the survival rate was about 18% when the bile salt content was 0.9%. the polysaccharide content of fermented Goji berry juice by NXU_ 19022 increased by 29%, and the polyphenol content fermented Goji berry juice decreased to 91%, the sensory score was the best and could significantly improve the free radical scavenging rate and flavor quality of fermented Goji berry juice. Analyzed the volatile components of unfermented and fermentad Goji berry juice by the non-targeted metabonomics analysis technology, a total of 20 metabolites were identified as differential metabolites. The content of lipids, aroma and sweet substances increased. The results showed that the strain had good fermentation characteristics and could be further developed and utilized as a production strain of fermentation products.
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Keywords:
- Lactobacillus /
- pickle /
- separate /
- identification /
- Gojiberry juice /
- fermentation performance
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乳酸菌是一类对宿主有益的活性微生物，进入并定植在胃肠道后，能够与宿主共生，从而构成一个复杂的微生态环境，对宿主发挥其益生作用，例如改善肠道菌群结构，维持肠道的微生态平衡，提高宿主的免疫力[1]。但是具有益生功能的乳酸菌多从酸奶中筛选得到，可应用于植物基原料发酵的乳酸菌相对较少。传统发酵蔬菜是潜在的优质乳酸菌的自然资源库，为制备不同种类的乳酸菌发酵剂提供了选择。从传统发酵分离得到的乳酸菌不仅能改善食品原有的苦味、涩味等不良气味，还可提高发酵食品的营养价值，而且还能进一步提高发酵食品的生理保健机能[2-3]。
宁夏枸杞子（Lycium barbarum L.）可作为日常食用和药用，枸杞果实中含有丰富的营养物质，主要包括多糖、多肽、生物碱、黄酮类、萜烯类、有机酸、木脂素、酚酰胺、类胡萝卜素等多种化合物，而多糖是枸杞果实中含量最丰富的活性成分，具有不同的药理活性和保健作用[4]。由于枸杞自身并没有突出的香味，并且药味浓重，使用商业乳酸菌发酵剂发酵的枸杞汁风味和口感不佳，影响了乳酸菌发酵枸杞汁饮品的生产和市场开发[5]。因此，开发新的发酵剂来改善枸杞汁的药味浓重和口感不佳具有重要意义。
本研究从宁夏银川市采集的泡菜中分离筛选乳酸菌，通过形态观察、生理生化实验及分子生物学方法对其进行鉴定，并对其耐酸、耐胆盐及发酵性能进行测定，筛选性能优良的乳酸菌，最后将其应用到发酵枸杞汁中。对发酵前后的枸杞汁中多糖及多酚含量进行对比分析，以期改善发酵枸杞汁的品质和风味，为发酵枸杞汁的工业化生产和发酵剂的制备提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
泡菜样品 从宁夏银川市采集3份不同家庭制作的发酵泡菜；宁夏中宁枸杞 市售；福林试剂（AR）没食子酸（AR） 麦克林公司；NaCl（AR） 北京奥博星生物技术有限责任公司；DPPH、ABTS苯酚 国药集团化学试剂有限公司；牛胆盐、HCl 特正商贸有限公司。
FR980恒温培养箱 上海复日科技有限公司；UV-752紫外可见分光光度计 上海精科实业有限公司；HH-3A数显恒温水浴锅 上海丙林电子科技有限公司；DL-CJ-1N超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Agilent8890B-5977B气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司；PHSJ-3F实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株分离筛选
将采集的样品用生理盐水稀释至10−6、10−7、10−8梯度，将其分为两组进行平行实验，使用MRS培养基对不同样品进行10−6、10−7、10−8梯度培养，涂布后的样品在37 ℃的培养箱培养36~48 h后，在两组平行实验中选取不同形状，颜色，大小和形态的单个菌落进行划线培养。划线后在37 ℃的培养箱中培养36~48 h。将划线培养后的菌传到MRS液体培养基中置于37 ℃的培养箱中培养24~36 h[6]。将通过液体培养过的菌液接着在MRS的固体培养基上进行划线，反复划线提高菌株的纯度以便于进行筛选。划线培养后进行液体培养，一般液体传代培养2~3代部分进行乳酸菌的检测实验，部分用脱脂乳保存后置于−80 ℃冰箱储存。
1.2.2 菌株鉴定
初步鉴定：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[7]有关细菌形态和生理生化特性等对分离出的菌株进行鉴定。
分子生物学鉴定：使用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒对挑选的乳酸菌进行基因提取，采用16S rDNA的通用引物进行PCR扩增[8]。引物为：27F（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）其PCR扩增体系为：模板DNA 2 μL，10× PCR Buffer 5 μL，2× Taq PCR Master Mix 0.5 μL，dNTP 4 μL，引物（F+R）3μL，双蒸水（ddH2O）35.5 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，72 ℃末端延伸10 min，30个循环；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。将得到的PCR扩增产物用Colibri核酸纯度测定仪测定浓度，进行1%琼脂糖凝胶电泳，以确认聚合酶链反应扩增片段。若PCR扩增产物在1500 bp左右，将PCR扩增产物送至上海生物工程有限责任公司进行测序。DNA编码用DNA star软件中的Seq Man进行序列拼接、校对；将处理好的测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank数据中进行局部序列比对基本检索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列[9-10]。采用MEGA-X软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树[11]。
1.2.3 乳酸菌生长曲线
取2%乳酸菌菌悬液接种于MRS液体培养基中37 ℃培养，从0 h开始，每隔2 h取样一次，用分光光度法（波长600 nm）时测吸光度值（OD）。以空白培养基作为对照，一种菌液每次取样做三次重复。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作生长曲线[12]。
1.2.4 乳酸菌耐酸能力
用盐酸将MRS液体培养基调pH至2.0，121 ℃灭菌20 min，冷却备用。按合适的接种量将菌悬液接种到pH为2.0的MRS液体培养基中，37 ℃培养4 h，每种乳酸菌做三个重复，采用平板菌落计数法测定各个乳酸菌的活菌数[13]。与未经过酸化的培养基培养的菌株做对比，计算乳酸菌的相对生长比率[14]。
相对生长比率(%)=N2N1×100 式中：N2为酸耐受4 h的活菌数，CFU/mL；N1为酸耐受前的活菌数，CFU/mL。
1.2.5 乳酸菌耐胆盐能力
称取一定量的牛胆盐于MRS液体培养基中，使其质量分数分别为0%（空白）、0.3%、0.6%和0.9%，调节pH至6.5±0.2，121 ℃灭菌15 min，冷却备用。按合适的接种量将菌悬液分别接种至含0%（空白）、0.3%、0.6%及0.9%含不同牛胆盐的MRS培养基中，37 ℃培养24~36 h后观察不同浓度胆盐培养液中菌体的生长情况，测定其波长为600 nm时OD值，计算乳酸菌对胆盐的耐受力[15]。
乳酸菌耐胆盐存活率(%)=N1N0×100 式中：N1为不同浓度牛胆盐的OD值，测定波长为600 nm；N0为未加牛胆盐的OD值，测定波长为600 nm。
1.2.6 乳酸菌发酵枸杞汁的制备
将枸杞汁和水以1:5的比例混合浸泡5~6 h，浸泡时加入0.05%（w/v）异抗坏血酸钠，在浸泡结束后加入0.15%（w/v）的果胶酶，混匀后进行打浆，将打浆完的枸杞汁进行过滤，滤去枸杞籽，并用柠檬酸将枸杞汁的pH调至4.5左右，加糖量为料液的4%，混匀后进行55 ℃，25 min水浴巴氏杀菌。水浴完将培养好的乳酸菌菌悬液按5%的接种量接入枸杞汁中，轻轻摇晃，放入37 ℃培养箱中培养12 h。对发酵前后的枸杞汁进行多酚含量测定、多糖含量测定、抗氧化性实验及感官评价。
1.2.7 多酚含量的测定
取采用福林酚法测定[16-17]。取1.0 mL适当稀释后的待测样品于10 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚试剂，摇匀，加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，其加入样品、福林酚试剂、15%Na2CO3溶液的比例为1:2.5:2.5，后加水定容至刻度，摇匀。40 ℃水浴60 min，静置冷却20 min，测定其在波长778 nm时的吸光度值。其标准曲线的制作为吸取200 mg/L没食子酸0.0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL分别置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，得到没食子酸工作液。然后分别取没食子酸工作液1.0 mL于10 mL比色管中，再根据比例加入福林酚试剂和15% Na2CO3溶液。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线y=0.1252x−0.0148计算待测液中总多酚的浓度。
1.2.8 多糖含量的测定
使用苯酚-硫酸法测多糖[18-19]。取待测样品10 mL，加入30 mL 95% 乙醇在4 ℃下静置 24 h，用滤布过滤，用冷乙醇冲洗沉淀2次，待风干后用40 mL水溶解沉淀。取上述水溶液1 mL加入1 mL 5%苯酚溶液，再向混合液中加入5 mL浓硫酸，充分混匀，静置10 min，于40 ℃水浴锅放置15 min，取出后立即冷却至室温。测定其在490 nm波长下吸光度值。其标准曲线测定为取葡萄糖（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于不同具塞试管中，每个具塞试管分别加水定容至2.0 mL，加1 mL 5%苯酚溶液，摇匀后加入5 mL浓硫酸摇匀，其余操作参照以上所述。带入标准曲线y=0.8243x−0.0098中计算枸杞汁中多糖的浓度。
1.2.9 DPPH自由基及ABTS自由基清除率的测定
取2 mL DPPH无水乙醇溶液和0.2 mL样品溶液加1.8 mL无水乙醇溶液，测定其在波长517 nm处的吸光度值记为A1。用等量的无水乙醇代替样品溶液作为样品对照组，并将吸光度值记为A0。用等量的无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液作为空白对照，并将吸光度值记录为A2[20-21]。测定DPPH自由基清除率能力的计算公式：
DPPH的自由基的清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 取2.6 mmol/L过硫酸钾与ABTS溶液等体积混合，室温避光静置16~18 h，制成ABTS储备液。用磷酸缓冲液（PBS）将ASTS缓冲液稀释至其在波长734 nm时的吸光度值为0.7左右记为A0，将2 mL的ABTS稀释液与0.2 mL的不同样品混合，室温静置反应6 min后测定734 nm处的吸光度值记为A[22]。测定ABTS自由基清除率能力的计算公式：
ABTS自由基清除率(%)=A0−AA0×100 1.2.10 感官评分标准
为进行发酵枸杞汁的感官评价，由12人均具有食品感官研究背景的老师和学生组成感官评定小组，对发酵枸杞汁的色泽、口感、香气和组织状态进行评定，评分标准如表1所示。
表 1 感官评分标准Table 1. Sensory evaluation standard项目 评分标准 分数 色泽 鲜红色，有光泽 15~20 深红色，略无光泽 8~14 褐色，光泽 0~7 口感 酸甜适中，粘稠性适中 15~20 滋味协调性好，有一定的粘稠性 8~14 滋味一般，过酸或过甜，粘稠性差 0~7 香气 枸杞香味足，无异味 21~30 枸杞香味较小，无异味 11~20 枸杞微弱或有异味 0~10 组织状态 质地均匀，稳定性较好，无分层 21~30 稳定性较好，略有分层 11~20 稳定性差，有分层 0~10 1.2.11 发酵与未发酵枸杞汁中挥发性成分测定
取1000 µL样品加入800 µL乙酸乙酯；涡旋30 s混匀后，冰水浴超声萃取30 min；将样品于−20 ℃静置30 min，然后高速离心15 min（4 ℃，13000 r/min）；取上清，装入1.5 mL离心管中；再加700 μL乙酸乙酯重复萃取一次，合并两次上清液，氮气吹干；加入200 µL乙酸乙酯复溶，涡旋2 min后，冰水浴超声10 min，高速离心；取上清到进样小瓶中进行GC-MS代谢组学分析。色谱条件：进样量1 µL。样品经DB-5MS毛细管柱（40 m×0.25 mm×0.25 µm，Agilent 122-5532G）分离后进入质谱检测。进样口温度 260 ℃，升温程序：初始温度 60 ℃，平衡 0.5 min，然后以8 ℃/min 的速度升至310 ℃，并维持6 min。质谱条件：传输线温度为 310 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV。
将原始数据件经MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）软件进行搜库鉴定及数据预处理，该软件首先将质谱信息与代谢数据库进行匹配，根据质谱匹配度鉴定代谢物。内标峰以及任何已知的假阳性峰（包括噪音、柱流失和衍生物化试剂峰）均已从数据矩阵中去除，并进行去冗余和峰合并。
1.3 数据处理
实验重复3次以上取平均值，实验结果以平均值±标准差表示，采用MEGA-X软件构建系统发育树；用统计分析软件SPSS 25.0的LSD法对实验数据进行方差分析和显著性检验；Excel 2019进行数据统计分析；用Graph Pad Prism 8.0.1软件对实验数据作图。MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）软件进行峰提取、对齐等数据预处理操作，最终得到代谢物鉴定结果及数据矩阵，结合T 检验和VIP（OPLS-DA）筛选出差异代谢物。
2. 结果与分析
2.1 乳酸菌的鉴定结果
2.1.1 形态学鉴定
在MRS培养基上共挑选出五种最具特点的单菌落进行纯化，图1是五种乳酸菌的菌落形态，根据其都为边缘整齐、表面及边缘光滑，乳白色凸起的圆形菌落，且通过革兰氏染色初步判定这五种单菌落均为革兰氏阳性菌，将其归为乳酸菌类[23]，且在显微镜下均为杆状。
2.2 分子生物学鉴定
通过16S rDNA第一代基因测序在NCBI基因库进行比对其同源率均在99%以上，经鉴定菌株NXU-19010为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株NXU-19023为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），菌株NXU_19006为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus），菌株NXU_19022为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），菌株NXU-19004为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）（图2）。
2.3 乳酸菌的生长曲线
由图3可以看出这五种菌在12 h后基本进入稳定期，在2~8 h间处于对数生长期。NXU_19006的生长能力较缓慢，NXU_19022的生长能力最好，最快进去平稳期。在达到平稳期时在波长为600 nm时测定的OD值均在2左右。所测得菌株生长曲线与白长胜等[24]筛选的乳酸菌在24 h内的生长趋势一致。
2.4 耐酸耐胆盐能力
耐酸耐胆盐作为乳酸菌重要的特征之一，耐酸耐胆盐能力越好，定植于人体肠道的能力就越强。才会在肠道里生存并发挥其作用[25]。
从图4可以看出，这五种乳酸菌对酸都有一定的耐受能力，均在pH为2的酸性培养基培养4 h时的存活率均在90%左右。本实验所得乳酸菌的耐酸实验结果与贺晓洁[26]的研究结果相似。其中NXU_19022菌株的存活率最高，NXU_19004此菌株的存活率较低。
从图5中可以看出，在牛胆盐质量分数为0.3%的液体培养基中，所有菌株的存活率较高，均在90%以上，其中NXU_19022的存活率最高，NXU_19023的存活率最低；在牛胆盐质量分数为0.6%的液体培养基中，所有菌株的存活率明显降低，存活率均在20%左右，其中NXU_19010的存活率最高，NXU_19006的存活率最低；在牛胆盐质量分数为0.9%的液体培养基中，所有菌株的存活率也有明显降低，其中NXU_19006的存活率最高，NXU_19004的存活率最低。当牛胆盐质量百分比为0.3%时，本实验所测得的结果高于李利等[27]测得的乳酸菌在此条件下的存活率；当牛胆盐质量百分比为0.6%时，本实验所测得的结果与李利等[27]所测得的结果基本一致。
2.5 乳酸菌发酵枸杞汁中多酚及多糖的含量测定及感官评分
枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞中活性成分中的一种水溶性多糖，其是一种对人体健康有益的活性物质，具有促进免疫、抗氧化、降血糖血脂等作用[28]。实验表明不同菌株发酵枸杞汁，其多糖含量不同，发酵后的枸杞汁（除NXU_19010）中多糖含量与未发酵比较显著增加（P<0.05），其中NXU_19022与其它发酵组呈显著差异，多糖含量显著提高（P<0.05）。多糖含量增多可能是菌株产生胞外多糖，NXU_19022菌株产胞外多糖的能力优于其它几株乳酸菌产胞外多糖能力。
从表中可以看出发酵枸杞汁中多酚含量与未发酵枸杞汁中多酚含量基本呈显著下降趋势（P<0.05），其中NXU_19010发酵枸杞汁中的多酚含量与未发酵及其它菌株发酵枸杞汁中多酚含量均呈不显著差异（P>0.05）。NXU_19004发酵后多酚含量下降最多，为未发酵枸杞汁的84%，NXU_19010发酵后枸杞汁中多酚含量下降较少，为原来的92%。发酵后多酚含量下降可能是乳酸菌在发酵过程中将发酵液中的多酚物质做为营养物质代谢消耗了。
综合来看，NXU_19010发酵枸杞汁中多酚含量下降不显著（P>0.05），但多糖含量下降显著（P<0.05），感官评分与未发酵枸杞汁相比显著改善（P<0.05）。NXU_19022发酵枸杞汁中多糖含量显著提高（P<0.05），感官评分中口感显著改善（P<0.05），但与未发酵枸杞汁相比，多酚含量显著下降（P<0.05），与其它发酵组无显著差异（P>0.05），多酚含量降为原来91%。比NXU_19010发酵枸杞汁中多酚含量减少0.86%（表2）。
表 2 未发酵及不同乳酸菌发酵枸杞汁后多酚、多糖含量和感官评分Table 2. Polyphenol, polysaccharide content and sensory evaluation of wolfberry juice fermented by non fermented and different lactic acid bacteria样品 多酚含量（mg/mL） 多糖含量（mg/mL） 感官评价 未发酵枸杞汁 5.08±0.05b 4.17±0.02b 65.67±2.58a NXU_19006发酵 4.38±0.14a 5.50±0.01e 81.00±1.78c NXU_19004发酵 4.25±0.51a 5.22±0.02c 81.00±1.78d NXU_19022发酵 4.62±0.07a 5.36±0.01d 89.67±1.21b NXU_19023发酵 4.60±0.04a 5.22±0.01c 76.50±1.37c NXU_19010发酵 4.66±0.08ab 3.52±0.01a 78.33±0.81b 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.6 DPPH自由基及ABTS自由基清除率
图6、图7是未发酵枸杞汁组（UFGJ）和不同乳酸菌发酵枸杞汁组对自由基DPPH和ABTS的清除能力的实验结果。其中，不同组对DPPH自由基的清除能力有显著差异（P<0.05），与未发酵组相比NXU_19022发酵枸杞汁的DPPH自由基清除能力显著提高（P<0.05），其它发酵组相较未发酵组显著降低（P<0.05），可能是菌株间代谢产物差异较大，降低了发酵液中的抗氧化性物质。另外，不同组对ABTS自由基的清除能力基本无明显提高或降低，仅NXU_19022发酵枸杞组对ABTS自由基清除能力有显著提高（P<0.05），其它发酵组与未发酵组变化不大。可能是由于发酵菌株的不同。
根据已确定的发酵条件使用优势菌株瑞士乳杆菌NXU_19022进行发酵，共发酵12 h。每2 h取样测一次乳酸产量，做六次重复。乳酸菌发酵过程中将原料的碳水化合物转化成乳酸，乳酸产量随着发酵时间延长逐渐增加，故以乳酸产量作为发酵过程中的检测指标且认为乳酸产量突增时发酵开始进入对数期。选择未发酵的枸杞汁与乳酸产量突增时（发酵6 h）的发酵枸杞汁进行发挥发性成分分析[29]。
2.7 发酵前后挥发性成分分析
2.7.1 挥发性成分对比
表3可以看出，枸杞汁发酵前后共检测出24种挥发性成分，其中醇类2种；脂类1种；酸类6种；酚类1种；酮类2种；烯烃类3种；烷烃类1种；其它类8种。与未发酵的枸杞汁相比，醇类物质在发酵枸杞汁中含量均增加。酚类物质含量下降，在酸类物质中只有2-乙基己酸的含量增加，其余均为下降，酮类物质中4-甲基伞形酮的含量增加，烯烃类物质含量均下降，棕榈酸甲酯含量增加。其中，醇类物质通常呈现出令人愉快的香味及甜味，也可与酸类物质反应生成脂类物质，使酸类物质含量下降，脂类物质含量上调，脂类物质也常呈现出令人愉悦的甜香及果香[30-31]。随着发酵时间延长，呈香物质含量可能会随之增加，进而改善枸杞原来药味重的缺点（表3）。
表 3 发酵前后枸杞汁中挥发性物质的组成、含量Table 3. Composition and content of volatile substances in wolfberry juice before and after fermentation编号 中文名称 保留时间（min） 未发酵枸杞汁
（μg/kg）发酵枸杞汁
（μg/kg）含量
变化1 2,3-丁二醇 5.737 4.02±0.48 4.98±0.23 Up 2 2-乙基甲苯 16.19 2.47±0.34 3.01±0.17 Up 3 联苯 18.788 3.59±0.23 5.27±0.02 Up 4 22-羟基胆固醇 31.946 5.48±0.08 4.79±0.11 Down 5 4-乙烯基苯酚 10.511 4.89±0.05 4.43±0.02 Down 6 2-乙基己酸 8.361 4.86±0.13 5.7±0.08 Up 7 3-甲基-L-组氨酸 21.419 4.87±0.1 4.29±0.34 Down 8 苯甲酰甲酸 30.58 4.69±0.07 4.01±0.11 Down 9 L-丙氨酸 31.102 4.56±0.06 3.77±0.12 Down 10 苯甲酸 33.968 4.77±0.07 3.86±0.33 Down 11 DL-2-羟基丁酸 34.208 4.44±0.04 4.13±0.1 Down 12 4-甲基伞形酮 12.37 3.26±0.2 3.65±0.09 Up 13 甲基庚烯酮 22.145 4.29±0.12 3.67±0.13 Down 14 双戊烯 22.068 5.21±0.11 4.54±0.16 Down 15 反式角鲨烯 29.384 4.62±0.05 4.18±0.06 Down 16 β-月桂烯 34.385 4.99±0.07 4.65±0.13 Down 17 棕榈酸甲酯 20.03 4.88±0.05 4.54±0.07 Up 18 2-苯乙酰胺 7.803 3.51±0.27 4.57±0.16 Up 19 烟酰胺 15.581 6.19±0.03 6.46±0.03 Up 20 二十七烷 31.825 5.01±0.07 4.24±0.15 Down 21 碳酰二胺脲 31.832 4.17±0.08 3.39±0.07 Down 22 4-羟基喹啉 34.205 4.46±0.06 4.09±0.08 Down 23 N-乙酰基-5-甲氧基色胺 36.03 3.75±0.06 2.78±0.14 Down 24 苯并噻唑 36.051 3.46±0.1 2.29±0.05 Down 注：Up：表示升高；Down：表示下降。 根据具有明显差异代谢物（P<0.05，VIP≥1）绘制热图，如图8所示，未发酵组（UFGJ1）中有（R_1、R_2、R_3、R_4、R_5、R_6）6个平行组；发酵组（FGJR_6h）中有（R6h_1、R6h_2、R6h_3、R6h_4、R6h_5、R6h_6）6个平行组。从图中可以看出未发酵枸杞汁与发酵枸杞汁中的代谢产物有显著差异。共有20种代谢产物VIP≥1。其中发酵后物质含量上调的有4种物质，其余均为下调。可能是选择的是发酵6 h时与未发酵枸杞汁作比较，物质含量上调可能是NXU_19022代谢的产物使枸杞汁中物质含量增加，物质下调可能此时NXU_19022代谢正处于对数时期，对营养物质消耗较大，与NXU_19022的生长曲线图一致，此刻处于对数期。
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图 8 发酵前后枸杞汁代谢产物变化热图Figure 8. Heat map of the composition content of wolfberry juice before and after fermentation2.7.2 特征风味主成分分析
对发酵前后的枸杞汁进行主成分分析（PCA），观察图可得：前两个主成分上方差累计贡献率64.4%，其中第一主成分（PC1）是46.40%，第二主成分（PC2）是18.00 %。在主成分分析图中，其中明显可以看出（R_1、R_2、R_3、R_4、R_5、R_6）未发酵组（UFGJ1）聚在一起；（R6h_1、R6h_2、R6h_3、R6h_4、R6h_5、R6h_6）发酵组（FGJR_6h）聚在一起。可以清晰的观察发酵前后枸杞汁各自聚类，区分度较明显，组内差异较小（图9）。
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图 9 发酵前后的枸杞汁进行主成分分析注：FGJR_6h表示枸杞汁发酵6 h组，其包含6个平行组分别为R6h_1、R6h_2、R6h_3、R6h_4、R6h_5、R6h_6；UFGJ1表示未发酵枸杞汁组，其包含6个平行组分别为R_1、R_2、R_3、R_4、R_5、R_6。Figure 9. Principal component analysis of wolfberry juice before and after fermentation3. 结论
本实验主要通过从宁夏当地发酵泡菜中筛选优势乳酸菌，分离筛选并对其进行16S rDNA分子生物学鉴定。共得到五种不同的乳酸菌分别为植物乳杆菌NXU_19010，鼠李糖乳杆菌NXU_19023，戊糖乳杆菌NXU_19006，瑞士乳杆菌NXU_19022，副干酪乳杆菌NXU_19004。其中NXU_19022的生长性能及体外抗性实验耐酸耐胆盐性能最好。并用分离得到的5种乳酸菌进行枸杞汁发酵，其中NXU_19022发酵枸杞汁能显著提高枸杞汁的多糖含量，感官评分也优于其它组，在抗氧化性实验中显著提高了DPPH和ABTS自由基的清除率（P<0.05），但发酵后会降低枸杞汁中多酚的含量，可采用复配其它菌株来提高发酵后枸杞汁中多酚的含量。通过对未发酵与NXU_19022发酵6 h的枸杞汁进行挥发性成分分析，结果表明，发现发酵前后枸杞汁的组分含量变化显著，通过热图也能较好看出各组代谢物含量的变化。共检测出24类物质，醇类2种；脂类1种；酸类6种；酚类1种；酮类2种；烯烃类3种；烷烃类1种；其它类8种。其中醇类物质变化较为明显，酸类物质中2-乙基己酸的含量增加，脂类物质含量上调，其它类物质变化较小，其中呈香味及甜味物质含量上调，可能随着发酵时间的延长，呈香和甜味物质含量也会随之增加，进而改善枸杞汁的风味。在主成分分析中，发现发酵前后枸杞汁能较好的区分，发酵前后枸杞汁各自聚类，区分度较明显，组内差异较小，说明发酵6 h后组分含量发生显著变化。综上，乳酸菌NXU_19022可通过发酵有效的改善发酵枸杞汁的品质，改善枸杞汁的组分含量，为提升发酵枸杞汁质量提供了依据和思路。
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图 8 发酵前后枸杞汁代谢产物变化热图
Figure 8. Heat map of the composition content of wolfberry juice before and after fermentation
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图 9 发酵前后的枸杞汁进行主成分分析
注：FGJR_6h表示枸杞汁发酵6 h组，其包含6个平行组分别为R6h_1、R6h_2、R6h_3、R6h_4、R6h_5、R6h_6；UFGJ1表示未发酵枸杞汁组，其包含6个平行组分别为R_1、R_2、R_3、R_4、R_5、R_6。
Figure 9. Principal component analysis of wolfberry juice before and after fermentation
表 1 感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard
项目 评分标准 分数 色泽 鲜红色，有光泽 15~20 深红色，略无光泽 8~14 褐色，光泽 0~7 口感 酸甜适中，粘稠性适中 15~20 滋味协调性好，有一定的粘稠性 8~14 滋味一般，过酸或过甜，粘稠性差 0~7 香气 枸杞香味足，无异味 21~30 枸杞香味较小，无异味 11~20 枸杞微弱或有异味 0~10 组织状态 质地均匀，稳定性较好，无分层 21~30 稳定性较好，略有分层 11~20 稳定性差，有分层 0~10 
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表 2 未发酵及不同乳酸菌发酵枸杞汁后多酚、多糖含量和感官评分
Table 2 Polyphenol, polysaccharide content and sensory evaluation of wolfberry juice fermented by non fermented and different lactic acid bacteria
样品 多酚含量（mg/mL） 多糖含量（mg/mL） 感官评价 未发酵枸杞汁 5.08±0.05b 4.17±0.02b 65.67±2.58a NXU_19006发酵 4.38±0.14a 5.50±0.01e 81.00±1.78c NXU_19004发酵 4.25±0.51a 5.22±0.02c 81.00±1.78d NXU_19022发酵 4.62±0.07a 5.36±0.01d 89.67±1.21b NXU_19023发酵 4.60±0.04a 5.22±0.01c 76.50±1.37c NXU_19010发酵 4.66±0.08ab 3.52±0.01a 78.33±0.81b 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 3 发酵前后枸杞汁中挥发性物质的组成、含量
Table 3 Composition and content of volatile substances in wolfberry juice before and after fermentation
编号 中文名称 保留时间（min） 未发酵枸杞汁
（μg/kg）发酵枸杞汁
（μg/kg）含量
变化1 2,3-丁二醇 5.737 4.02±0.48 4.98±0.23 Up 2 2-乙基甲苯 16.19 2.47±0.34 3.01±0.17 Up 3 联苯 18.788 3.59±0.23 5.27±0.02 Up 4 22-羟基胆固醇 31.946 5.48±0.08 4.79±0.11 Down 5 4-乙烯基苯酚 10.511 4.89±0.05 4.43±0.02 Down 6 2-乙基己酸 8.361 4.86±0.13 5.7±0.08 Up 7 3-甲基-L-组氨酸 21.419 4.87±0.1 4.29±0.34 Down 8 苯甲酰甲酸 30.58 4.69±0.07 4.01±0.11 Down 9 L-丙氨酸 31.102 4.56±0.06 3.77±0.12 Down 10 苯甲酸 33.968 4.77±0.07 3.86±0.33 Down 11 DL-2-羟基丁酸 34.208 4.44±0.04 4.13±0.1 Down 12 4-甲基伞形酮 12.37 3.26±0.2 3.65±0.09 Up 13 甲基庚烯酮 22.145 4.29±0.12 3.67±0.13 Down 14 双戊烯 22.068 5.21±0.11 4.54±0.16 Down 15 反式角鲨烯 29.384 4.62±0.05 4.18±0.06 Down 16 β-月桂烯 34.385 4.99±0.07 4.65±0.13 Down 17 棕榈酸甲酯 20.03 4.88±0.05 4.54±0.07 Up 18 2-苯乙酰胺 7.803 3.51±0.27 4.57±0.16 Up 19 烟酰胺 15.581 6.19±0.03 6.46±0.03 Up 20 二十七烷 31.825 5.01±0.07 4.24±0.15 Down 21 碳酰二胺脲 31.832 4.17±0.08 3.39±0.07 Down 22 4-羟基喹啉 34.205 4.46±0.06 4.09±0.08 Down 23 N-乙酰基-5-甲氧基色胺 36.03 3.75±0.06 2.78±0.14 Down 24 苯并噻唑 36.051 3.46±0.1 2.29±0.05 Down 注：Up：表示升高；Down：表示下降。
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