Comparative Study on Physicochemical Properties, Stability and Bioavailability of All-E and Z-astaxanthin Nano-emulsions
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摘要: 探究两种虾青素几何异构体经纳米乳液包封后的物化特征、稳定性和生物利用率。本研究以高压均质法制备全反式虾青素纳米乳液（all-E-astaxanthin nano-emulsions，all-E-AST NEs）和顺式虾青素纳米乳液（Z-astaxanthin nano-emulsions，Z-AST NEs），采用粒度仪、色差仪、紫外可见光谱、红外光谱和扫描电镜等技术比较两种纳米乳液的物化特征；通过加热、光照和储藏条件多维度表征其稳定性；同时采用扩散模型法对其生物利用率进行评价。结果表明，all-E-AST NEs和Z-AST NEs的外观颜色分别为淡粉色和橙黄色，与all-E-AST NEs相比，Z-AST NEs的L*、a*和b*值显著提高（P<0.05），平均粒径、多分散性指数PDI分别降低30 nm和0.043，包封率显著提高6.1%（P<0.05），具有更强的紫外吸收；两种纳米乳液粉末的微观形态差异显著，取决于全反式虾青素的高结晶度和顺式虾青素的无定形态；all-E-AST NEs在加热、光照和长期储藏条件下的稳定性显著高于Z-AST NEs；Z-AST NEs的分配系数是all-E-AST NEs的3.54倍（P<0.05）。该研究表明全反式虾青素、顺式纳米乳液物化特征存在显著差异，且前者稳定性更好，后者生物利用率更高，为其在健康食品中的应用提供理论指导。Abstract: To explore the physicochemical characteristics, stability and bioavailability of two geometric isomers of astaxanthin encapsulated by nano-emulsion, in this study, all-E astaxanthin nano-emulsions (all-E-AST NEs) and Z-astaxanthin nano-emulsions (Z-AST NEs) were prepared through high-pressure homogenization. The physicochemical characteristics of the two nano-emulsions were compared using a particle size analyzer, colorimeter, ultraviolet-visible spectrum, infrared spectrum, and scanning electron microscope. The stability of the nano-emulsions was evaluated under a range of conditions, including heating, illumination, and storage. Moreover, the diffusion model method was employed to assess the bioavailability of astaxanthin isomers. The results demonstrated that the appearance colors of the all-E-AST NEs and Z-AST NEs were pale pink and orange yellow, respectively. Compared with all-E-AST NEs, the L*, a* and b* of Z-AST NEs were significantly increased (P<0.05), the average particle size and polydispersity index PDI were observed to decrease by 30 nm and 0.043, respectively. In addition, the encapsulation efficiency was markedly enhanced by 6.1% (P<0.05), and the Z-AST NEs exhibited heightened ultraviolet absorption. The micro-morphology of the two nano-emulsion powders exhibited notable disparities, contingent on the high crystallinity of all-E-astaxanthin and the amorphous state of Z-astaxanthin. Furthermore, the stability of all-E-AST NEs under high-temperature, illumination and long-term storage conditions was significantly higher than that of Z-AST NEs. Meanwhile, the partition factor of Z-AST NEs was 3.54 times that of all-E-AST NEs (P<0.05). Collectively, the findings of this study demonstrate that there are notable differences in physicochemical characteristics between all-E-AST and Z-AST NEs. The former exhibits superior stability, while the latter displays higher bioavailability. These observations provide theoretical guidance for the application of astaxanthin geometric isomer nano-emulsions in healthy food.
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Keywords:
- astaxanthin /
- nano-emulsion /
- geometric isomer /
- physicochemical characteristics /
- stability /
- bioavailability
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虾青素（3,3'-二羟基-4,4'-二酮-β,β'-胡萝卜素）广泛存在于甲壳类动物中，还存在于鱼、鸟、藻类及真菌等生物中[1]。雨生红球藻于2010年纳入新食品原料，成为生产虾青素的最主要来源，年产量达300吨[2]。虾青素含有长链不饱和共轭双键结构，这种独特结构赋予虾青素不同的几何异构体，如全反式、9-顺式和13-顺式[3]。在食品加工过程中，暴露于高温、光照、酸碱、高压以及金属离子存在的环境中时，全反式和顺式虾青素在一定条件下会相互转化。此外，据报道人体摄入全反式虾青素后，在血浆中检测到顺式构型，表明在胃肠道消化吸收过程中全反式虾青素会发生顺式异构化[4−5]。另外，顺式虾青素在预防与氧化应激相关的慢性疾病如炎症、衰老、皮肤损伤等诸多方面均优于全反式[6]，且富含顺式虾青素的饲料喂养禽类和虾类可以大幅度提升虾青素在蛋黄以及虾体中的沉积效率[7−8]。因此，虾青素几何异构体的生理活性及其在健康领域的应用成为研究热点。
全反式虾青素具有高疏水性和高结晶度特点，从而在水与脂质中溶解度较低，使其生物利用率在实际应用过程中受限；同时在加工和储藏过程中容易降解，导致虾青素的生物活性进一步丧失，因此长期以来提高虾青素的稳定性和生物利用率成为研究关注的焦点。递送体系如乳液、纳米粒子、脂质体等为解决虾青素上述问题提供了有效途径，纳米乳液由于其高效的制备过程以及高稳定性受到广泛关注[9−11]。研究表明顺式虾青素晶格能较低，因此溶剂分子在吸热脱离晶体结构并溶于溶液的能量越低，意味着其更容易在油相中溶解[12]，因此虾青素异构体的理化性质差异可能带来负载全反式、顺式虾青素的纳米乳液理化特性变化。此前研究发现，纳米结构脂质体赋予顺式番茄红素更好的水溶性和更高的生物利用率，且这些优势随顺式含量提高而加强，但脂质体中顺式番茄红素较全反式构型更不稳定[13−14]。另一研究报道，与全反式β-胡萝卜素相比，负载顺式构型的纳米悬浮液的物化特性发生显著改变，如包封效率更高、粒径更小，具有更强的紫外吸收，但体系更不稳定[15]。由此可见，递送体系的理化特征取决于包埋的类胡萝卜素顺反异构体，拓宽了目前仅包埋单一构型的研究。因此，虾青素异构体是否会引起递送体系特性差异有待研究。纳米乳液是虾青素常见递送载体，全反式虾青素纳米乳液（all-E astaxanthin nano-emulsions，all-E-AST NEs）和顺式虾青素纳米乳液（Z-astaxanthin nano-emulsions，Z-AST NEs）的物化特征、稳定性以及生物利用率的研究还鲜有报道。
由于负载虾青素异构体的纳米乳液性质差异未知，本研究旨在探索all-E-AST NEs、Z-AST NEs的物化特征、稳定性和生物利用率差异，通过高压均质法制备两种乳液，利用粒度仪、色差仪、紫外可见光光谱、红外光谱、扫描电镜多种手段对两种乳液的物化特征进行表征；同时考察两种纳米乳液的加热、光照以及储藏稳定性；并采用扩散模型法对两种纳米乳液的生物利用率进行探究，研究结果对于虾青素几何异构体纳米乳液在健康食品、水产养殖等领域的应用具有重要的指导意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
全反式虾青素（纯度>99%） 广东巨元生化有限公司；顺式虾青素（纯度>96%） 实验室制备；酪蛋白酸钠（BR，来源于牛奶） 上海麦克林生化科技有限公司；玉米油 山东鲁花集团有限公司；二氯甲烷（分析纯）、正己烷（分析纯）、无水乙醇（分析纯） 天津富宇精细化工有限公司；碘（分析纯）、硫代硫酸钠（分析纯） 天津福晨化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯） 上海泰坦科技股份有限公司；丙酮（分析纯） 广州化学试剂厂；二氯甲烷（色谱纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯） 美国J. T. Baker公司；叠氮化钠（纯度>99.5%） 美国Sigma-Aldrich有限公司；猪胆盐（胆酸含量60%） 上海源叶生物科技有限公司。
LC-15C高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器） 日本岛津公司；高效液相色谱柱（Diamonsil C18，4.6×250 mm，5 µm） 北京迪科马科技有限公司；RE212旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；ZS-90 Nano粒度仪 英国Malvern公司；SP60色差仪 美国爱色丽x-rite公司；PT2500E高速分散机 瑞士Kinematica公司；AH-BASIC高压均质机 ATS Engineering Incorporat公司；EVO MA 15钨灯丝扫描电镜 德国ZEISS公司；Vertex 70红外光谱仪 德国Bruker公司；Versa Max光栅型酶标仪 美国Molecular Devices公司；LED灯 温州蔚来电气技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 顺式虾青素制备
虾青素光照异构化参考陈晓枫[16]的方法并加以改进。分别称量200 mg全反式虾青素溶解于100 mL二氯甲烷，120 mg碘溶解于200 mL二氯甲烷中，混合后，放置于LED灯（450~465 nm）下光照搅拌10 min。称量148.9 mg硫代硫酸钠，溶解于300 mL三级水中，倒入反应完毕的虾青素-碘-二氯甲烷溶液中，搅拌10 min，以除去碘离子。待静置分层后，取下层溶液避光旋转蒸发，去除二氯甲烷，得到虾青素光照异构化粗产物。用无水乙醇溶解，超声悬浮，放置于4 ℃冰箱静置2 h，以4000 r/min离心20 min，去除沉淀后，用0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）有机系滤膜过滤后，旋蒸至干，将粉末放置于−20 ℃保存，得到含有顺式虾青素乙醇提纯粗产物。
配制正己烷/二氯甲烷/甲醇（100/200/3，V/V）的洗脱剂待用，加入60 mg顺式虾青素乙醇提纯粗产物，以3.5 mL/min流速匀速洗脱，取不同分离时间段样品，进行薄层色谱法分析，全反式虾青素和顺式虾青素在硅胶板有不同比移值，取与顺式虾青素有相同比移值的斑点，收集后氮吹，得到顺式虾青素样品。
1.2.2 虾青素纳米乳液以及粉末的制备
参考Liu等[17]的做法，并加以改进。取1 g酪蛋白酸钠分散在100 mL去离子水中，用磁力搅拌器以100 r/min搅拌3 h，形成1%的酪蛋白酸钠水溶液。分别取15 mg全反式虾青素、顺式虾青素溶于15 g玉米油中配成0.1%的虾青素油，全反式虾青素用磁力搅拌器在50 ℃下以100 r/min搅拌10 min，顺式虾青素不需加热搅拌溶解。采用高速分散机，以90%水相和10%油相比例混合（W/W），在1%酪蛋白酸钠水溶液中加入0.1 wt%的虾青素油，在11000 r/min下均质2 min，制备粗乳，然后用高压均质机在100 MPa下进行3次均质，每次均质10 min，加入叠氮化钠（0.02%，W/W）抑制微生物生长，空载乳液则用未添加虾青素的玉米油，按相同比例制备。取虾青素纳米乳液冻干后，得到纳米乳液粉末。
1.2.3 高效液相色谱法（HPLC）检测条件及分析
流动相A相为一级水，流动相B相为甲醇/乙腈/二氯甲烷（85/5/5，V/V）的混合溶液。A相比例5%，B相为95%，流速为1 mL/min。进样量20 μL，运行时间为20 min，柱温为25 ℃，紫外检测器波长为476 nm，采用等度洗脱方式对虾青素及其异构体进行检测。
为检测虾青素的含量，采用溶剂提取法对乳液中的虾青素进行提取。取50 μL虾青素纳米乳液加入4.95 mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，通过对476 nm处峰面积积分进行虾青素异构体的定量，根据HPLC保留时间，光谱数据和顺式峰（约360 nm）与异构体的主要吸收峰的相对强度相比，得到Q值，鉴定全反式、顺式虾青素。根据峰面积，计算出虾青素含量。
虾青素保留率及其异构体含量的计算公式如下：
R(%)=P1P2×100 C(%)=P3P4×100 式中：R表示虾青素保留率，%；P1表示反应后虾青素峰面积，mAu·min；P2表示反应前虾青素峰面积，mAu·min；C表示全反式（顺式）虾青素含量，%；P3表示全反式（顺式）虾青素峰面积，mAu·min；P4表示虾青素总峰面积，mAu·min。
包封率的计算：包封率指纳米乳液中被包封的虾青素占添加虾青素总量的百分量，计算公式如下：
EE(%)=C1C2×100 式中：EE表示纳米乳液包封率，%；C1表示纳米乳液中包封的虾青素质量，mg；C2表示加入制备纳米乳液的虾青素质量，mg。
1.2.4 平均粒径和PDI、Zeta电位测定
参考Yi等[18]的方法，对平均粒径、多分散性指数（PDI）和Zeta电位进行检测。将虾青素纳米乳液放入样品瓶中，用去离子水1:100稀释，制备乳液样品，采用动态光散射法测定平均粒径和PDI、Zeta电位。油滴和分散剂（水）的折射率值分别为1.45和1.33，并在25 ℃下进行。
1.2.5 色差测定
将全反式、顺式虾青素纳米乳液的颜色通过其外观进行判断。使用SP60色差仪获得包括L*、a*、b*色度值。吸取5 mL虾青素纳米乳液转移至透明培养皿中，在避光环境下测定乳液的L*、a*、b*值。
1.2.6 紫外光谱测定
酪蛋白水溶液：取0.1 g酪蛋白溶于10 mL一级水中，在4000 r/min下离心15 min，除去不溶物、以一级水为空白对照；全反式、顺式虾青素和空载纳米乳液：将纳米乳液按1:100一级水稀释，以一级水为空白对照；全反式、顺式虾青素油溶液：分别取15 mg全反式虾青素、顺式虾青素溶于15 g玉米油中，用磁力搅拌器在50 ℃下以100 r/min搅拌10 min，顺式虾青素不需加热搅拌溶解，配成0.1%的虾青素油。取0.1 mL 0.1%全反式、顺式虾青素油溶液按1:10丙酮稀释，以丙酮为空白对照。在200~800 nm波长范围内进行全波长扫描，测定上述溶液的紫外吸收。
1.2.7 傅里叶变换红外光谱测定
分别称取2 mg全反式、顺式虾青素纳米乳液粉末、全反式、顺式虾青素粉末、酪蛋白酸钠置于玛瑙研钵中研磨。取200 mg烘热干燥的精细溴化钾粉末加入上述样品中，一并研磨，混合均匀后，调节压力至20 MPa，保持30~60 s。待样品压制成透明均一的薄片，放入傅里叶红外光谱仪中进行光谱分析。选择在400~4000 cm−1波段进行扫描，扫描次数为64次，分辨率为4 cm−1。
1.2.8 扫描电镜观察
分别称取5 mg全反式、顺式虾青素纳米乳液粉末、全反式、顺式虾青素粉末，使用双面导电胶带，将样品粉末安装在平台上，在高真空蒸发器中溅射镀金1 h。使得样品表面的金属原子层厚度为10 nm左右，并在以5 mm工作距离和5 kV加速电压下使用SEM在4500倍条件下对样品进行观察。
1.2.9 纳米乳液热稳定性测定
取5 mL新鲜制备的all-E-AST NEs、Z-AST NEs移入带盖透明密封瓶中，置于60、70、80 、90和100 ℃水浴锅中避光加热30 min，分别取出冰水浴冷却至室温。对照组放置于室温25 ℃下，避光保存，以0.1 wt%的全反式、顺式虾青素油为空白对照。按1.2.4对虾青素纳米乳液的平均粒径、PDI、Zeta电位进行测定，按1.2.3对虾青素保留率以及异构体含量进行测定。
1.2.10 纳米乳液光稳定性测定
分别将5 mL虾青素纳米乳液移入带盖透明密封瓶中，暴露于室内LED灯下0.5、2、3.5、5、6.5 h，对照组室温下避光保存，以0.1 wt%的全反式、顺式虾青素油为空白对照。按1.2.4对虾青素纳米乳液的平均粒径、PDI、Zeta电位进行测定，按1.2.3对虾青素保留率以及异构体含量进行测定。
1.2.11 纳米乳液储藏稳定性测定
取5 mL虾青素纳米乳液移入带盖透明密封瓶中，用锡纸包裹，分别在温度为4、20、37 ℃中避光保存21 d，以适当的时间间隔0、3、6、9、12、15、18、21 d收集样本，以0.1 wt%的全反式、顺式虾青素油为空白对照。按1.2.4对虾青素纳米乳液的平均粒径、PDI、Zeta电位进行测定，按1.2.3对虾青素保留率以及异构体含量进行测定。
1.2.12 扩散模型法测定虾青素生物利用率
参考王群[19]的做法，并加以改进。利用扩散模型法评估全反式、顺式虾青素纳米乳液以及全反式、顺式虾青素的生物利用率。取4.5 mL纳米乳液和0.5 mL的胆盐水溶液（1 wt%）混合后，与5 mL大豆油混合。全反式、顺式虾青素纳米乳液在适当的时间间隔0、0.5、1、1.5、2、3、6、9、12、24 h取样，以全反式、顺式虾青素为对照，使用酶标仪根据标准曲线定量。在此模型中，两种乳液中虾青素以及虾青素几何异构体的生物利用率以分配系数（PF）表示。PF值的计算公式如下：
PF(%)=MoilMi×100 式中：Moil表示油相中虾青素的质量；Mi表示样品中起始虾青素的质量。
1.3 数据处理
每组实验重复平行测定三次，结果表示为平均值±标准差。利用软件SPSS22.0对实验数据进行显著性分析，P<0.05为差异显著，使用Origin绘制图像。
2. 结果与讨论
2.1 两种虾青素纳米乳液中的全反式和顺式异构体比例
首先考察了纳米乳液高压均质过程是否会对虾青素的异构化造成影响。图1A为顺式虾青素和全反式虾青素的HPLC图谱，图1B为Z-AST NEs和all-E-AST NEs中顺式虾青素和全反式虾青素（B）的HPLC图谱，虾青素异构体的鉴定根据已有报道和Q值（顺式峰的吸光度与主峰吸光度的比值）[16,20]。经测定，制备乳液前的全反式虾青素和顺式虾青素的纯度分别为98.3%，91.6%，全反式虾青素中含有1.1%的13-顺式虾青素，未检测出15-顺式虾青素。顺式虾青素中9-顺式、13-顺式占比分别为19.2%，72.4%；all-E-AST NEs中全反式虾青素占比95.1%，Z-AST NEs中顺式虾青素比例为89.6%，其中9-顺式、13-顺式和15-顺式分别占总顺式虾青素的12.4%、79.5%和8.1%，制备前后无显著差异（P>0.05），表明纳米乳液的高压均质过程并未造成虾青素的异构化。
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图 1 高压均质处理前顺式虾青素和全反式虾青素（A）和纳米乳液中顺式虾青素和全反式虾青素（B）的HPLC图谱Figure 1. HPLC chromatogram of Z-astaxanthin and all-E astaxanthin before high-pressure homogenization treatment (A) and Z-astaxanthin and all-E astaxanthin in nanoemulsion (B)2.2 两种虾青素纳米乳液的物化特征
乳液的粒径和电位决定其稳定性。图2A显示两种虾青素纳米乳液均为单峰分布，说明乳液分散相分布集中、油滴大小均一；Z-AST NEs粒径（239.3 nm）显著小于all-E-AST NEs粒径（269.3 nm）。多分散性指数PDI反映纳米乳液粒径分布的均匀程度，Z-AST NEs的PDI值比all-E-AST NEs小0.043，差异显著（P<0.05），说明Z-AST NEs的颗粒分布更均匀、乳液体系更稳定（图2B）。Zeta电位用于表示颗粒之间相互排斥或吸引力的强度，以预测纳米乳液的稳定性，以往的报道研究表明至少需要±30 mV的Zeta电位才足以维持体系稳定性[21]。如图2C，all-E-AST NEs和Z-AST NEs的Zeta电位分别为−34.8和−36.4 mV，两者均为稳定体系，由于Zeta电位用于表征粒子表面电荷密度，包封的物质对于乳液液滴的界面电荷基本无影响。
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图 2 纳米乳液粒径分布（A）、PDI（B）、Zeta电位（C）、包封率（D）和纳米乳液外观及其色差（E）注：不同小写字母表示组间存在显著性差异（P<0.05）。Figure 2. Particle size distribution (A), PDI (B), Zeta potential (C) , encapsulation efficiency (D) of nano-emulsions and appearance and chromatism of nano-emulsions (E)包封率决定乳液的性能与应用。Z-AST NEs的包封率（87.4%）显著高于all-E-AST NEs（81.3%）（P<0.05）（图2D），由于顺式虾青素呈现不定形态，在油相中的溶解度高，均质过程不易析出，从而导致两种乳液粒径和包封率产生显著差异[22]。乳液颜色是反映虾青素乳液产品外观的直接指标，L*（明度值）、a*（红度/绿度）和b*（黄度/蓝度）常用于度量食品产品的外观颜色。从图2E中可以直观观察到all-E-AST NEs和Z-AST NEs的外观颜色分别为淡粉色和橙黄色。Z-AST NEs的L*、a*和b*值相较all-E-AST NEs分别显著提高9.07、9.54、15.12个单位（P<0.05）。以往研究表明，全反式β-胡萝卜素纳米悬浮液颜色为淡红黄色，顺式β-胡萝卜素纳米悬浮液颜色为深黄色[23]。类胡萝卜素的包封率影响纳米乳液颜色，同时后续探讨的顺反虾青素异构体的结构差异同样会影响纳米乳液颜色。
以上结果表明，顺反虾青素两种乳液呈现不同的色泽，Z-AST NEs具有更小更均匀的粒径和更高的包封率，因此有必要进一步揭示全反式和顺式虾青素纳米乳液存在差异的原因。
2.3 两种虾青素纳米乳液的紫外可见光谱分析
紫外可见分光光谱是基于不同物质在特定波长下呈现吸收峰，进而分析物质间相互作用的快捷方法。由图3可见，酪蛋白酸钠水溶液的特征吸收峰在225 nm和276 nm，前者主要是肽键的吸收峰，后者是色氨酸和酪氨酸残基的吸收峰[24]。全反式、顺式虾青素油溶液在476 nm出现虾青素的特征吸收峰，在365 nm处出现虾青素顺式峰，且顺式虾青素油溶液在365 nm处的吸收更强，反映油中包含更多的顺式虾青素[25]。
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图 3 纳米乳液及其组分的紫外可见光谱Figure 3. Ultraviolet-visible spectrum of nano-emulsions and its components两种纳米乳液的虾青素特征吸收峰（476 nm）消失，呈现肽键的单一的吸收峰，表明乳液中虾青素与酪蛋白酸钠相互作用，纳米乳液成功将虾青素包埋[26]。从量子化学角度，紫外可见光光谱中吸收峰的强度与物质的摩尔消光系数呈正相关，顺式虾青素的摩尔消光系数低于全反式，从而导致紫外可见光光谱中吸收峰的强度下降[27]。然而Z-AST NEs的紫外吸收较all-E-AST NEs更高，可能是因为Z-AST NEs中负载的虾青素含量更高。有研究表明，当利用递送体系包封胡萝卜素异构体时，紫外吸收光谱会因为胡萝卜素异构体的物化性质差异而发生变化，顺式β-胡萝卜素纳米悬浮液由于包封率的提升，其紫外吸收更强[23]。
以上结果表明，全反式和顺式虾青素成功实现纳米包埋，Z-AST NEs纳米乳液的紫外吸收更强可能与其负载的顺式虾青素含量更高有关。
2.4 两种虾青素纳米乳液的红外光谱分析
红外吸收光谱波峰的数目、位置以及吸收谱带的强度，可以反映物质结构上的特点，通过傅立叶变换红外光谱对两种纳米乳液的冻干粉末及其虾青素、酪蛋白酸钠进行分析，评估乳液组分之间的相互作用。如图4为扣除空气背景值后的4000~400 cm−1红外光谱，全反式虾青素特征吸收峰出现在1650、1552和962 cm–1处，分别对应C=O伸缩振动、芳香环中C=C的伸缩振动以及共轭体系中的C-H伸缩振动，顺式虾青素的特征吸收峰往高波数方向发生6 cm−1的偏移，与其它类胡萝卜素异构体的红外光谱报道现象类似，且由于顺式异构化的作用，虾青素特征吸收峰强度明显降低[28−29]。酪蛋白酸钠的特征吸收峰出现在2962、1656 cm–1处，分别对应着CH2和CH3的伸缩振动，肽键的羰基拉伸；虾青素在2962 cm–1处同样有着强的CH2和CH3的伸缩振动。
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图 4 两种纳米乳液粉末及其组分的傅里叶变换红外光谱图Figure 4. Fourier transform infrared spectrum of nano-emulsions powder and its components乳液粉末的吸收峰中没有发现虾青素的特征吸收峰，且虾青素在2962 cm–1处强的CH2和CH3振动吸收峰显著降低，从而表明酪蛋白成功将虾青素包封。在2400~2000 cm−1区域，配合物的特征波段也有一些变化，如在2065 cm–1处出现了一个新的峰，此区域为虾青素共轭大π键形成的吸收峰，可能在酪蛋白与虾青素相互作用下，形成具有不同光谱波段的配合物[30]。同时，在3200~3600 cm–1处的峰通常表示C-H键的伸缩振动，可能与虾青素与酪蛋白之间氢键的形成有关，表明纳米乳液成功将虾青素包埋[31]。另外，纳米乳液红外光谱显示肽键的羰基拉伸的吸收峰向低波数方向移动，且Z-AST NEs的冻干粉末肽键羰基拉伸的吸收峰（1641 cm–1）更强，表明顺式虾青素与酪蛋白结合更紧密[32]。
以上结果表明，纳米乳液成功将全反式、顺式虾青素包封，且Z-AST NEs中虾青素与酪蛋白的结合更紧密，相互作用更强。
2.5 两种纳米乳液粉末的微观形态
为了进一步深入探究all-E-AST NEs和Z-AST NEs的形态差异，利用扫描电镜观察两种纳米乳液粉末的微观形态。从图5A和5B的扫描电镜图像可以看到，由于共轭多烯链的π-π堆积的相互作用导致了全反式虾青素的高结晶度，呈现不规则多边形；顺式虾青素由于空间位阻作用，降低了π-π堆积的相互作用力，导致其形态为不定形态，说明类胡萝卜素异构化会发生微观形态的变化，与以往的报道研究类似[33]。因此，全反式和顺式虾青素的结构呈现显著差异，从而引起纳米乳液各种理化特征的不同。
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图 5 全反式（A）和顺式（B）虾青素粉末、全反式（C）和顺式（D）虾青素纳米乳液粉末的扫描电镜图像及其虾青素纳米乳液粉末外观（E、F）Figure 5. Scanning electron microscope images of all-E-astaxanthin powder (A) and Z-astaxanthin powder (B), all-E-astaxanthin nano-emulsion powder (C) and Z-astaxanthin nano-emulsion powder (D) and appearance of astaxanthin nano-emulsions powder (E, F)如图5C和5D所示，两种乳液粉末形态呈现显著差异，all-E-AST NEs的冻干粉末较粗糙，可能与全反式虾青素较强的结晶性有关；Z-AST NEs的冻干粉末更平整光滑、均匀且没有孔状结构，从而赋予Z-AST NEs具有更高复水性以及更高的生物利用率[34]。all-E-AST NEs和Z-AST NEs的冻干粉末外观分别呈现粉红色和橙红色（图5E和5F），与2.2观察到的乳液颜色特征一致。
以上结果表明，两种乳液粉末的微观形态具有明显差异，Z-AST NEs经冻干后，形成质地更紧密、光滑、颜色更鲜艳的粉末，取决于顺式虾青素的不定形态。
2.6 两种虾青素纳米乳液的热稳定性
加热是常见的现代食品加工处理手段，选取常用的加热温度（60~100 ℃）对纳米乳液进行处理，考察其热稳定性。如图6A，与室温25 ℃乳液相比，两种乳液的粒径、Zeta电位均无显著变化，说明乳液在加热过程中基本结构未被破坏。全反式虾青素纳米乳液的粒径显著高于顺式纳米乳液（P<0.05），且全反式纳米乳液粒径小于270 nm，说明在以上温度条件下加热，两种构型虾青素乳液都具有较好的稳定性，顺式纳米乳液依旧保持着更低的粒径。纳米乳液加热过程中粒径略微变小，可能是经过热处理后的虾青素与吸附在界面上的酪蛋白发生疏水相互作用，从而使得酪蛋白在界面产生构象重排，导致乳液粒径略微变小[35]，但与乳液初始粒径无显著差异。如图6B，两种纳米乳液的PDI值均保持在小于0.2，表明热处理后所有液滴仍分布在狭窄范围内，两者稳定性都很好。由于酪蛋白变性温度约为122 ℃，因此酪蛋白稳定的纳米乳液通常具有良好的热稳定性[17,36]，纳米乳液在60~100 ℃的加热温度下相对稳定。
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图 6 加热对两种纳米乳液的粒径、Zeta电位（A）、PDI（B）的影响注：不同大写字母（A, B, C）代表同一纳米乳液在不同温度条件下具有显著性差异（P<0.05），不同小写字母（a, b, c）代表同一温度不同纳米乳液间具有显著性差异（P<0.05）；图7同。Figure 6. Effect of heating on particle size, Zeta potential (A), PDI (B) in two nano-emulsions虾青素对热敏感，在较高温度下，往往容易发生降解和异构化。如图7A和7B，对于虾青素保留率，经过100 ℃热处理后，两种纳米乳液all-E-AST NEs和Z-AST NEs中的分别为78.02%和60.85%，全反式和顺式植物油中的分别为72.12%和25.13%。虾青素保留率和异构体含量的差值即为虾青素异构化率，对于虾青素异构化率，在100 ℃条件下，Z-AST NEs中顺式虾青素全反化异构化率为57.22%，all-E-AST NEs中虾青素异构化率为7.54%，植物油中的顺式虾青素有67.7%全反化、全反式构型有12.4%顺式化，因此纳米乳液中的虾青素构型稳定性优于植物油中的虾青素，但顺式虾青素较易全反化。从能量的角度上看，通过比较吉布斯自由能，顺式虾青素的能量高于全反式[37]，即认为顺式虾青素热稳定性更差，更容易降解与异构化，纳米乳液和植物油中两种虾青素的热稳定性差异与吉布斯自由能的报道呈现的结果一致。
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图 7 加热对乳液中（A）和植物油中（B）虾青素保留率和异构体含量的影响Figure 7. Effect of heating on astaxanthin remaining rate and isomer content in nano-emulsions (A) and in vegetable oil (B)以上结果表明，两种纳米乳液在短时加热情况下，粒径、PDI和Zeta电位基本稳定，Z-AST NEs中虾青素的全反化异构化率较高，all-E-AST NEs的热稳定性优于Z-AST NEs。同时，纳米乳液中的全反式、顺式构型的虾青素的保留率均高于植物油，异构化程度低于植物油，因此纳米乳液更有利于提高虾青素几何异构体稳定性。
2.7 两种虾青素纳米乳液的光稳定性
光照是食品、饮料加工过程中常见的对产品品质产生影响的因素，将乳液暴露于光照环境中一段时间以衡量光照对纳米乳液的影响。随着曝光时间增加，两种纳米乳液的粒径均显著增大（P<0.05），但Zeta电位差异不显著。如图8A可知，经过6.5 h照射，Z-AST NEs粒径增加幅度（30.2 nm）显著高于all-E-AST NEs增加程度（18.5 nm）。如图8B可知，all-E-AST NEs和Z-AST NEs的PDI分别增加0.182和0.257。已有研究报道，紫外线照射后蛋白质会被降解，从而影响其官能团和电荷分布；在光照过程中，光线会在乳液中产生自由基，自由基可能会导致氧化或与带电基团反应，从而“中和”位于乳液液滴表面的电荷，使得净电荷减少，减少的电荷削弱了乳液液滴之间的静电斥力，形成聚集，最终导致液滴粒径变大、乳液体系不稳定[38]。Z-AST NEs更容易在光照下失去稳定性，其原因可能是顺式虾青素在光线的作用下，容易回复异构化，产生全反式虾青素，导致结晶度提高，从而造成纳米乳液液滴尺寸增大[39]。
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图 8 光照对两种纳米乳液的粒径、Zeta电位（A）、PDI（B）的影响注：不同大写字母（A, B, C）代表同一纳米乳液在不同光照时间下具有显著性差异（P<0.05），不同小写字母（a, b, c）代表同一光照时间不同纳米乳液间具有显著性差异（P<0.05）；图9同。Figure 8. Effects of lighting on particle size, Zeta potential (A), PDI (B) in two nano-emulsions虾青素对光照敏感，在光照作用下，容易发生降解以及虾青素的全反式和顺式构型的相互转化[40]。从图9A，9B可知，经6.5 h光照后，all-E-AST NEs和Z-AST NEs的虾青素保留率分别为90.70%和82.93%，植物油中的全反式和顺式虾青素的保留率分别为84.93%和76.11%，说明纳米乳液相较植物油对虾青素的光稳定性效果更好，且更有效地保护全反式虾青素免受光线照射引起的光化学降解。报道研究证明纳米乳液具有强烈散射光的能力，从而保护虾青素避免受到光线的照射而降解[17]。Z-AST NEs和all-E-AST NEs中顺式虾青素、全反式虾青素含量分别下降18.83%和4.49%，植物油中的顺式虾青素和全反式虾青素分别下降34.45%和4.13%，顺式虾青素在光照条件下更容易异构化为全反式结构，且纳米乳液对于顺式虾青素的全反化稳定效果优于植物油。
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图 9 光照对乳液中（A）和植物油中（B）保留率和虾青素异构体含量的影响Figure 9. Effects of lighting on astaxanthin remaining rate and isomer content in nano-emulsions (A) and in vegetable oil (B)以上结果表明，在光照情况两种纳米乳液的粒径和PDI有所增加，虾青素的保留率均较高，all-E-AST NEs的稳定性更好，对全反式虾青素的保护效果优于Z-AST NEs。且纳米乳液对虾青素异构体的光稳定性优于植物油，尤其顺式构型。
2.8 两种虾青素纳米乳液的储藏稳定性
由于纳米乳液中水相和油相存在正自由能，因此在长期放置中，容易产生絮凝、聚集等现象，使得体系稳定性和包封物质稳定性下降。为了考察纳米乳液在储藏期间的稳定性，将纳米乳液在4、20、37 ℃条件下保存21 d，以上温度分别为常见冷藏温度以及人体温度。
如图10，在37 ℃储藏21 d后，all-E-AST NEs、Z-AST NEs的粒径分别达到1138、1824.2 nm，较初始乳液增大4.2倍和6.7倍，电位分别上升至−32.02和−32.34 mV，PDI分别达到1和0.485；4 ℃条件乳液粒径仅增大1.12倍和1.14倍，电位分别上升至−31.89和−34.04 mV，PDI分别达到0.186和0.264；20 ℃粒径仅增大1.19倍和1.31倍，电位分别上升至−31.98和−33.12 mV，PDI达到0.415和0.445，说明温度对纳米乳液的储藏稳定性有显著影响，且Z-AST NEs更不稳定。
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图 10 不同储藏温度对两种纳米乳液的粒径、Zeta电位和PDI的影响注：不同大写字母（A, B, C）代表同一纳米乳液在4、20、37 ℃温度下不同储藏天数下具有显著性差异（P<0.05），不同小写字母（a, b, c）代表同一储藏天数在4、20、37 ℃温度下不同纳米乳液间具有显著性差异（P<0.05）；图11同。Figure 10. Effects of different storage temperatures on particle size, Zeta potential and PDI of two nano-emulsions如图11A和图11B，经过37 ℃条件下储藏21 d，all-E-AST NEs、Z-AST NEs中的虾青素保留率为47.68%和32.43%，在相同条件下，植物油中的全反式、顺式虾青素的保留率为41.30%和58.27%；在4 ℃条件下储藏，保留率为82.15%和73.36%，植物油中的全反式、顺式虾青素的保留率为69.17%和73.24%，说明储藏温度对纳米乳液和植物油中虾青素稳定性有显著影响，且在较低温度下，纳米乳液对虾青素的稳定效果更好。all-E-AST NEs中虾青素的全反式异构体含量与Z-AST NEs中的顺式异构体相比，在不同温度下储藏发生顺式和全反式异构体相互转化的变化量更低，在37 ℃条件下储藏21 d，仅有3.04%的全反式虾青素异构化为顺式AST，而Z-AST NEs在此条件下储藏，15.49%的顺式虾青素回复异构化为全反式构型，顺式虾青素的含量显著降低（P<0.05）。植物油中的全反式虾青素有22.47%发生顺式化，以及10.81%顺式虾青素发生全反化，纳米乳液对于虾青素几何异构体的稳定性效果显著优于植物油。
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图 11 不同储藏温度对纳米乳液和植物油中虾青素保留率和异构体含量的影响Figure 11. Effects of different storage temperatures on the remaining rate and isomer content of astaxanthin in nano-emulsions and in vegetable oil在利用分离乳清蛋白稳定的负载虾青素的纳米乳液研究中，经过37 ℃条件下14 d储存，虾青素含量下降13%，与酪蛋白稳定的纳米乳液中的虾青素保留率接近[40]。Z-AST NEs中虾青素储藏稳定性较低与Ono等[23]报道的负载顺式-β-胡萝卜素的纳米悬浮液中β-胡萝卜素的稳定性较差现象类似，可见类胡萝卜素经过顺式异构化后，在递送体系中的稳定性降低。
以上结果表明，纳米乳液更有效地避免全反式虾青素在储藏过程中产生降解与异构化。
2.9 两种虾青素纳米乳液的生物利用率
生物利用率常用于评估某种物质在生物体中能够被利用的程度。虾青素必须溶解在油相中，才能转移到小肠内的混合胶束中，进一步被吸收利用，因此脂质溶解虾青素的能力决定了虾青素的生物利用率，扩散模型法的分配系数（PF：Partition Factors）被广泛用于评估脂溶性物质的生物利用率[41]。双相释放常用于描述短时快速起效，长时间持续强效的药物释放模式，如图12所示，两种乳液均有双相释放的现象，即在释放的2 h内，释放率已达到释放稳态的PF值的一半。截止释放结束，24 h内all-E-AST NEs和Z-AST NEs的PF值分别达到26.9%和95.4%；Z-AST NEs的PF值是all-E-AST NEs的3.54倍。全反式和顺式虾青素的PF值分别为27.6%和97.5%，纳米乳液中全反式、顺式虾青素的PF值与对应几何构型虾青素的PF值无显著差异（P>0.05）。纳米乳液可以提高脂溶性色素的水分散性，从而提高生物利用率，但是游离虾青素和纳米乳液中的虾青素扩散到油中的过程无明显差异，因此在此模型下，纳米乳液并未提高虾青素生物利用率。
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图 12 24 h两种纳米乳液中虾青素的分配系数Figure 12. Partition factors of astaxanthin in two kinds of nano-emulsions for 24 h相比传统乳液，纳米乳液具有更小的液滴尺寸、更大的表面积，以提高脂溶性活性物质在水中的分散性，使其更高效地被人体吸收[42]。本研究中Z-AST NEs平均粒径更小，意味着人体内对其吸收更快速。虾青素对油相的亲和力会影响其在纳米乳液中的分布，顺式虾青素的弯折结构以及呈现出的不定形态，降低了在油相中产生聚集与结晶的可能，此外溶解度更高，因此更迅速从乳液中释放出来，从而提高了PF值，使得Z-AST NEs中的虾青素生物利用率显著升高（P<0.05），而在脂质体中全反式、顺式番茄红素的生物利用率测定实验中，45％顺式构型占比的番茄红素比全反式构型高2倍[13]。本研究中，纳米乳液中顺式虾青素的分配系数更高，可以更高比例地扩散在脂溶性物质中，从而促进了纳米乳液中虾青素的吸收。
3. 结论
本研究比较了全反式和顺式虾青素纳米乳液的物化特征、稳定性和生物利用率，并揭示了其存在差异的潜在原因。Z-AST NEs和all-E-AST NEs分别呈现橙黄色和淡粉色，色差变化显著，与all-E-AST NEs相比，Z-AST NEs的平均粒径和PDI显著降低（P<0.05），包封率提高6.1%，具有更高紫外吸收，且粉末外观更光滑、紧密，虾青素与组分的相互作用增强。all-E-AST NEs的光照、加热、储藏稳定性更高，不仅体现在乳液的稳定，而且虾青素保留率高于Z-AST NEs，异构化程度低。Z-AST NEs的分配系数显著提高（P<0.05），更容易扩散在油相中，表明其具有更高的生物利用率。因此，全反式和顺式虾青素纳米乳液的显著差异与虾青素的几何构型密切相关，顺式虾青素的不定形态赋予其乳液更高的负载率和生物利用率，但是其稳定性有待于进一步提高，从而在健康领域发挥更大的益处。研究结果为揭示虾青素几何异构体纳米乳液的性能提供指导，为虾青素异构体纳米乳液在健康领域的应用提供依据。
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图 1 高压均质处理前顺式虾青素和全反式虾青素（A）和纳米乳液中顺式虾青素和全反式虾青素（B）的HPLC图谱
Figure 1. HPLC chromatogram of Z-astaxanthin and all-E astaxanthin before high-pressure homogenization treatment (A) and Z-astaxanthin and all-E astaxanthin in nanoemulsion (B)
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图 2 纳米乳液粒径分布（A）、PDI（B）、Zeta电位（C）、包封率（D）和纳米乳液外观及其色差（E）
注：不同小写字母表示组间存在显著性差异（P<0.05）。
Figure 2. Particle size distribution (A), PDI (B), Zeta potential (C) , encapsulation efficiency (D) of nano-emulsions and appearance and chromatism of nano-emulsions (E)
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图 3 纳米乳液及其组分的紫外可见光谱
Figure 3. Ultraviolet-visible spectrum of nano-emulsions and its components
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图 4 两种纳米乳液粉末及其组分的傅里叶变换红外光谱图
Figure 4. Fourier transform infrared spectrum of nano-emulsions powder and its components
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图 5 全反式（A）和顺式（B）虾青素粉末、全反式（C）和顺式（D）虾青素纳米乳液粉末的扫描电镜图像及其虾青素纳米乳液粉末外观（E、F）
Figure 5. Scanning electron microscope images of all-E-astaxanthin powder (A) and Z-astaxanthin powder (B), all-E-astaxanthin nano-emulsion powder (C) and Z-astaxanthin nano-emulsion powder (D) and appearance of astaxanthin nano-emulsions powder (E, F)
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图 6 加热对两种纳米乳液的粒径、Zeta电位（A）、PDI（B）的影响
注：不同大写字母（A, B, C）代表同一纳米乳液在不同温度条件下具有显著性差异（P<0.05），不同小写字母（a, b, c）代表同一温度不同纳米乳液间具有显著性差异（P<0.05）；图7同。
Figure 6. Effect of heating on particle size, Zeta potential (A), PDI (B) in two nano-emulsions
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图 7 加热对乳液中（A）和植物油中（B）虾青素保留率和异构体含量的影响
Figure 7. Effect of heating on astaxanthin remaining rate and isomer content in nano-emulsions (A) and in vegetable oil (B)
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图 8 光照对两种纳米乳液的粒径、Zeta电位（A）、PDI（B）的影响
注：不同大写字母（A, B, C）代表同一纳米乳液在不同光照时间下具有显著性差异（P<0.05），不同小写字母（a, b, c）代表同一光照时间不同纳米乳液间具有显著性差异（P<0.05）；图9同。
Figure 8. Effects of lighting on particle size, Zeta potential (A), PDI (B) in two nano-emulsions
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图 9 光照对乳液中（A）和植物油中（B）保留率和虾青素异构体含量的影响
Figure 9. Effects of lighting on astaxanthin remaining rate and isomer content in nano-emulsions (A) and in vegetable oil (B)
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图 10 不同储藏温度对两种纳米乳液的粒径、Zeta电位和PDI的影响
注：不同大写字母（A, B, C）代表同一纳米乳液在4、20、37 ℃温度下不同储藏天数下具有显著性差异（P<0.05），不同小写字母（a, b, c）代表同一储藏天数在4、20、37 ℃温度下不同纳米乳液间具有显著性差异（P<0.05）；图11同。
Figure 10. Effects of different storage temperatures on particle size, Zeta potential and PDI of two nano-emulsions
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图 11 不同储藏温度对纳米乳液和植物油中虾青素保留率和异构体含量的影响
Figure 11. Effects of different storage temperatures on the remaining rate and isomer content of astaxanthin in nano-emulsions and in vegetable oil
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