Preparation and Antioxidant Study of PEG-Modified EGCG/Cur Composite Liposomes
-
摘要: 本研究采用薄膜水合法制备表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）/姜黄素（Cur）复合脂质体（EGCG/Cur-L），通过单因素实验确定最佳制备工艺。为了增加脂质体的稳定性，对EGCG/Cur-L表面进行二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）修饰，并对两种脂质体的包封率、粒径分布、微观形态和修饰效果进行研究，同时采用DPPH法评价脂质体的氧化稳定性。结果表明：EGCG/Cur-L的最佳工艺为：卵磷脂与胆固醇质量比为6:1，PBS缓冲溶液pH为6.5，EGCG添加量为6 mg，Cur添加量为3 mg，水化温度为55 ℃。EGCG包封率为68.78%，Cur包封率为90.23%，平均粒径为183.8±5.4 nm，多分散系数（PDI）为0.178±0.01，平均Zeta-电位为−34.7±0.62 mV。修饰后EGCG包封率为60.31%，Cur包封率为88.53%。表面修饰后Cur的包封率无明显变化，EGCG包封率有所下降；动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）结果表明，修饰后脂质体的平均粒径从未修饰的183.8 nm增大到374.5 nm；Zeta-电位和傅里叶红外分析结果表明DSPE-PEG2000成功修饰在脂质体表面，且不改变脂质体内部结构。修饰脂质体DPPH清除率最高，在15 d内氧化稳定性均大于其他脂质体，表明DSPE-PEG2000可以增强脂质体的抗氧化能力。
-
关键词:
- 脂质体 /
- 表没食子儿茶素没食子酸酯 /
- 姜黄素 /
- 表面修饰 /
- 聚乙二醇
Abstract: In this study, epigallocatechin gallate (EGCG)/curcumin (Cur) composite liposomes (EGCG/Cur-L) were prepared by thin-film hydrophoresis, and the optimal preparation process was determined by single-factor test. To increase the stability of liposomes, the surface of the composite liposomes was modified with distearoyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol 2000 (DSPE-PEG2000), and the encapsulation rate, particle size distribution, micromorphology, and modification effect of both liposomes were investigated, and the oxidative stability of liposomes was evaluated by DPPH method. The results showed that the optimal process for the composite liposomes was: Lecithin to cholesterol mass ratio of 6:1, PBS buffer solution pH of 6.5, EGCG added amount 6 mg, Cur added amount 3 mg, and hydration temperature of 55 ℃. The encapsulation rate of EGCG was 68.78%, the encapsulation rate of Cur was 90.23%, the average particle size was 183.8±5.4 nm, the polydispersity coefficient (PDI) was 0.178±0.01, and the average Zeta-potential was −34.7±0.62 mV. The encapsulation rate of EGCG after modification was 60.31%, and the encapsulation rate of Cur was 88.53%. After surface modification, the encapsulation rate of Cur did not change significantly, and the encapsulation rate of EGCG decreased, dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM) results showed that the average particle size of the modified liposomes increased from the unmodified 183.8 nm to 374.5 nm, Zeta-potential and Fourier infrared analysis indicated that DSPE-PEG2000 was successfully modified on the liposome surface and did not change the internal structure of the liposomes. The modified liposomes had the highest DPPH scavenging rate and all had greater oxidative stability than other liposomes within 15 days, indicating that DSPE-PEG2000 could enhance the antioxidant capacity of liposomes.-
Keywords:
- liposomes /
- epigallocatechin gallate /
- curcumin /
- surface modification /
- polyethylene glycol
-
表没食子儿茶素没食子酸酯[（−）-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]是一种水溶性极强的天然抗氧化剂，具有很强的抗氧化活性，同时还具有抗炎症、抗肿瘤、预防心血管疾病、神经变性疾病以及延缓衰老等功效[1-2]，被广泛应用于制药、化妆品、食品等行业[3-5]，但EGCG存在的生物利用度低、膜通透性较差、代谢清除速率快以及缺乏稳定性等问题限制了EGCG的利用潜力[6-8]。姜黄素（Curcumin，Cur）是一种来源于姜黄植物的多酚化合物，它具有不同的生物活性，如抗氧化、心脏保护、保肝、抗癌、抗关节炎和降血糖等功效[9-11]，但姜黄素水溶性差以及生物利用率低也限制了其在食品、制药等行业的应用。
脂质体（Liposome，L）是一种由磷脂等两亲分子构成的双分子层闭合囊泡，结构主要由亲水室和脂质双分子层构成，具有共同包封亲水化合物和疏水化合物的能力。脂质体主要用于生物活性化合物（Bioactive compounds，BAC）的可持续释放和提高化合物的稳定性[12]，如将抗原包裹在脂质体中，脂质体穿透组织并到达淋巴系统，然后脂质体缓慢释放抗原并保证抗原完整性，可以增加疫苗的有效接种率。在脂质体制备中通常会加入胆固醇以保持磷脂分子膜的刚性和流动性，胆固醇可以诱导磷脂的疏水链紧密堆积，增强脂质双层膜的稳定性。脂质体作为活性物质载体能够起到一定的缓释作用，并具有靶向性、细胞亲和性以及生物相容性等生理特性[13]。包载物渗漏以及脂质体聚集是传统脂质体现存的主要问题，可以通过对脂质体表面修饰为其提供多层保护达到防止渗漏的效果。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（Distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol 2000，DSPE-PEG2000）是一种具有生物相容性、生物可降解性的两亲性分子，疏水端能够嵌入到脂质膜中，亲水部分能在脂质体表面形成一层蘑菇状或刷状结构[14]，可以很好地保护脂质体，减少与血液成分的相互作用、防止脂质体与蛋白吸附，并防止网状内皮系统（Reticuloendothelial system，RES）的吞噬。Song等[15]利用DSPE-PEG2000作为稳定剂制备了CUR和TET复合脂质体，并获得了更好的理化性质。Begum 等[16]使用DSPE-PEG2000制备了塞来昔布隐形脂质体，在体内和体外均获得了较好的效果。
本研究制备了EGCG/Cur-L，通过单因素实验确定脂质体的制备工艺，并在EGCG/Cur-L的基础上对脂质体表面进行修饰，制备了DSPE-PEG2000-L，且对这两种脂质体的粒度、形态、电位、修饰效果以及抗氧化能力进行了考察。本研究将亲水性与疏水性化合物共同包封在同一脂质体内，为同时利用脂质体的疏水空腔和亲水空腔包载活性成分提供参考。并使用DSPE-PEG2000对脂质体表面进行修饰，为修饰前后脂质体的氧化稳定性提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大豆卵磷脂 纯度>90%，采用溶剂萃取法和柱层析法自提；表没食子儿茶素没食子酸酯 纯度>90%，西安东峰生物科技有限公司；姜黄素（纯度>98%）、胆固醇（纯度>95%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DSPE-PEG2000 纯度>95%，芃硕生物有限公司；PBS缓冲溶液 实验室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 纯度>98.5%，麦克林试剂有限公司 ；三氯甲烷、甲醇 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
DF-101S恒温磁力搅拌器 巩义市予化仪器有限责任公司；RE52CS-1旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；AK-030A钰洁超声波清洗器 深圳钰洁清洗设备公司；UV-1600可见分光光度计 美国Spectrophotometer公司；Agilent-1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；NANO-ZSE纳米粒度、Zeta-电位分析仪 英国马尔文仪器公司；JEM-1400 Flash透射电子显微镜 日本电子株式会社；Nicolet全反射傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司。
1.2 实验方法
1.2.1 复合脂质体的制备
采用薄膜水合法制备EGCG/Cur-L[17]。称取适量的大豆卵磷脂、胆固醇、姜黄素于50 mL圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入三氯甲烷和甲醇混合溶液（2:1，V/V）15 mL。充分溶解后置于旋转蒸发仪，水浴温度为45 ℃。待圆底烧瓶中溶液蒸干，瓶内壁形成一层淡黄色的薄膜，加入含有EGCG的PBS溶液15 mL，超声处理10 min，在55 ℃下水化30 min，过0.45 μm微孔滤膜，得到EGCG/Cur-L，于4 ℃下避光保存；按照上述条件制备空白脂质体（un-L）、EGCG脂质体（EGCG-L）、Cur脂质体（Cur-L）。
1.2.2 EGCG和Cur包封率的测定
1.2.2.1 EGCG标准曲线的建立
精确称取EGCG标准品2.5 mg于25 mL容量瓶中，纯水定容后配制为0.1 mg/mL的EGCG标准品母液，分别精密吸取1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，用纯水定容，过0.22 μm有机膜后按照下述色谱条件进样。
色谱条件：Eclipse Plus C18色谱柱（150 nm×4.6 nm，5 μm）；流动相：甲醇-水-乙酸（30:68:2）；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min，检测波长：274 nm，进样量：20 μL。
以峰面积y（mAU×S）为纵坐标，EGCG的质量浓度（µg/mL）为横坐标，得到标准曲线为：y=38472x−64285，R2=0.9996。结果表明EGCG在10~100 µg/mL范围内线性良好。
1.2.2.2 Cur标准曲线的建立
精密称取Cur标准品2.5 mg于25 mL容量瓶中，乙醇溶液定容，并分别精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL容量瓶中并用乙醇定容。在424 nm下用紫外分光光度计测定吸光度，以吸光度（y）为纵坐标，Cur的质量浓度c（mg/mL）为横坐标，得到标准曲线为：y=0.1472c−0.001，R2=0.9986。
1.2.2.3 EGCG包封率的计算
EGCG包封率的计算采用透析法测定[18]。取1 mL样品于10 mL离心管中，并加入5 mL甲醇溶液和4 mL超纯水，超声20 min使其破乳，利用高效液相色谱法测定脂质体中EGCG的总量，记为W总；取3 mL脂质体样品于透析袋中（截留分子量为3.5 kD），并置于150 mL超纯水中，缓慢搅拌8 h，取1 mL透析外液测定EGCG含量，记为W游。包封率的计算公式为：
包封率(%)=W总−W游W总×100 1.2.2.4 Cur包封率的计算
采用离心法计算Cur包封率[19]。取1 mL样品于10 mL离心管中，加入5 mL甲醇溶液和4 mL超纯水，超声20 min使其破乳，吸取1 mL于10 mL离心管中并用乙醇定容，在424 nm测定Cur的含量，记为W总；另取1 mL脂质体样品于10 mL离心管中并定容，在8000 r/min下离心15 min，收集上清液1 mL置于10 mL离心管中并用乙醇溶液定容，在424 nm处测定Cur的游离含量，记为W游。包封率的计算公式为：
包封率(%)=W总−W游W总×100 1.2.3 单因素实验优化
在固定条件：卵磷脂与胆固醇质量比6:1，EGCG与Cur质量比为2:1，水化温度为50 ℃，PBS缓冲液pH为6.5，EGCG添加量为8 mg，Cur添加量为4 mg的基础上，分别考察了卵磷脂与胆固醇质量比（4:1、5:1、6:1、7:1、8:1）、PBS缓冲液的pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、水化温度（45、50、55、60、65 ℃）、EGCG和Cur添加量（EGCG添加量4、6、8、10、12 mg，Cur添加量2、3、4、5、6 mg）四个因素对EGCG/Cur-L包封率和粒径分布的影响。
1.2.4 DSPE-PEG2000-L的制备及包封率的测定
在1.2.3的制备条件下，将20 mg[20]的DSPE-PEG2000加入到圆底烧瓶中，并与大豆卵磷脂、胆固醇和姜黄素在体积比2:1三氯甲烷和甲醇溶液中充分混合后进行旋蒸，蒸干后加入含有EGCG等体积的PBS溶液，超声处理10 min，水化30 min，过0.45 μm微孔滤膜，即得DSPE-PEG2000-L，于4 ℃下避光保存。按1.2.2中的方法测定DSPE-PEG2000-L中EGCG与Cur的包封率。
1.2.5 粒径分布及Zeta-电位的测定
分别取un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L悬浮液1 mL，用PBS稀释至10 mL，取2 mL装入马尔文比色皿中，采用NANO-ZSE纳米粒度及Zeta-电位分析仪测定脂质体的粒径分布、多分散性系数及Zeta-电位。
1.2.6 透射电子显微镜观察（TEM）表征
采用磷钨酸负染法[21]对EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L进行前处理，取适量样品滴于铜网上，用滤纸吸干边缘多余的样品后，将铜网浸泡于1%的磷钨酸溶液中染色2 min，取出后用滤纸吸干边缘多余溶液后自然晾干，置于TEM下观察形态。
1.2.7 傅里叶红外光谱（FT-IR）表征
称取适量un-L、EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L进行冻干，将冻干后的样品用傅里叶变换红外光谱仪扫描。使用带有ATR模式的红外光谱仪进行检测，参数如下，光谱范围：650~4000 cm−1；分辨率：4 cm−1，扫描32次。
1.2.8 DPPH自由基清除率及氧化稳定性
在1.2.1条件下制备了EGCG-L和Cur-L。DPPH自由基清除率参考Tan等[22]的方法并稍作修改，分别向1 mL的un-L、EGCG/Cur-L、EGCG-L、Cur-L、DSPE-PEG2000-L的脂质体样品中加入3 mL的DPPH乙醇溶液（0.4 mmol/L）。均匀混合后，避光静置1 h，在517 nm处测得混合溶液的吸光值，测得A样。空白组为乙醇代替DPPH溶液，测得A空，对照组为蒸馏水代替脂质体样品，测得A对照。DPPH自由基清除活性的百分比计算如下：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A样−A空A对照)×100 式中：A样是1 mL脂质体和3 mL DPPH吸光度；A空是1 mL脂质体和3 mL乙醇的吸光度；A对照是1 mL蒸馏水和3 mL DPPH吸光度。
将上述制备的脂质体样品置于4 ℃下避光保存，在样品储存3、6、9、12、15 d取样，按照上述方法测定DPPH自由基清除率，测定脂质体的氧化稳定性。
1.3 数据处理
所有实验平行测定三次，数据以平均值±标准差（SD）表示，数据处理使用IBM SPSS Statistics 26.0版本，使用Origin pro 2019进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验优化结果
2.1.1 卵磷脂与胆固醇质量比对包封率及粒径大小的影响
固定其它条件不变，只改变卵磷脂与胆固醇质量比（4:1、5:1、6:1、7:1、8:1），固定磷脂的添加量为80 mg，制备EGCG/Cur-L，考察卵磷脂与胆固醇质量比对EGCG/Cur-L粒径分布及包封率的影响。结果如图1所示，EGCG和Cur的包封率随着卵磷脂与胆固醇质量比的增大呈现出先增大后减小的趋势，这与焦岩等[23]的结果一致。在磷脂与胆固醇的质量比为6:1时，EGCG和Cur的包封率最高（69.17%±3.16%，89.77%±0.85%）。在磷脂比例增大的同时，脂质体的粒径也在逐渐增大。胆固醇能使脂质双分子层的有序性增加，使磷脂酰基的迁移受到限制，使双分子层膜的硬度增加[24]。在胆固醇含量较低时，包封率会随着胆固醇的含量升高而变大，较高的胆固醇含量会导致包封率下降，这可能是由于在胆固醇含量较高时，组成脂质体的磷脂相对含量较少[25]，不易对脂质体双层膜起到保护作用，且高含量的胆固醇可能会与脂溶性的Cur形成竞争关系并阻碍其包封进脂质体内，使得在高胆固醇含量时Cur的包封率较低。因此，确定卵磷脂与胆固醇的质量比为6:1。
![]()
图 1 卵磷脂与胆固醇质量比对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响Figure 1. Effect of mass ratio of lecithin to cholesterol on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution2.1.2 EGCG/Cur添加量对包封率及粒径大小的影响
固定其它条件不变，只改变活性物质添加量（Cur添加量为2、3、4、5、6 mg），EGCG与Cur以质量比2:1进行制备EGCG/Cur-L，考察活性物质添加量对EGCG/Cur-L粒径分布及包封率的影响。结果如图2所示，EGCG和Cur的包封率随着Cur添加量的增大呈现先增大后减小的趋势并趋于稳定，在Cur添加量为3 mg时，EGCG和Cur的包封率均达到最高（68.48%±2.0%，88.57%±1.68%），随着添加量增加，EGCG和Cur的包封率趋于稳定，变化趋势不明显，可能是由于该含量下磷脂双分子的包封能力达到饱和，过量的活性物质会影响脂质体的包封率[26]。EGCG/Cur-L的粒径出现先上升后下降再上升的趋势，在EGCG 添加量10 mg，Cur添加量5 mg时粒径最小。因此，确定EGCG的最佳添加量为6 mg，Cur的最佳添加量为3 mg。
![]()
图 2 Cur添加量对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响Figure 2. Effect of concentrations of Cur on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution2.1.3 水化温度对包封率及粒径大小的影响
其他条件不变，只改变温度（45、50、55、60、65 ℃），制备EGCG/Cur-L，考察温度变化对EGCG/Cur-L对粒径分布及包封率的影响。结果如图3所示，随着水化温度的升高，Cur和EGCG的包封率整体呈现先升高后下降的趋势，EGCG/Cur-L在55 ℃时包封率最高（91.09%±1.89%，70.02%±1.40%），但EGCG/Cur-L的粒径随温度升高而增大。水化温度是制备脂质体的一个重要因素，在大于卵磷脂的相变温度时，磷脂会以液晶相呈现，使磷脂分子进行自组装形成脂质体，在磷脂相变温度以下，磷脂会以凝胶状态呈现，此时磷脂分子的疏水性尾部被紧密包裹无法形成脂质体。在水化温度高于大豆卵磷脂（大豆卵磷脂的相变温度为−20 ℃）的相转变温度10 ℃以上时，会得到较理想的包封率，这也与Marianecci等[27]报道相符。当温度过高时，会使磷脂膜的流动性加大，导致脂质双分子层的氢键断裂和磷脂松动[28-29]，进而可能导致包载物渗漏使得脂质体发生聚集，导致粒径增加，因此确定最佳水化温度为55 ℃。
![]()
图 3 水化温度对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响Figure 3. Effect of temperature of EGCG/Cur on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution2.1.4 PBS缓冲液pH对包封率及粒径大小的影响
其他条件不变，只改变PBS缓冲液的pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），制备EGCG/Cur-L，考察PBS缓冲液pH对EGCG/Cur-L粒径及包封率的影响。结果如图4所示，在pH为6.5及以下时，EGCG包封率较为稳定，在大于6.5时EGCG包封率下降，EGCG/Cur-L的粒径整体呈现先升高后降低再升高的趋势，在pH为7.0时粒径最小。EGCG在中性或碱性溶液条件下易发生降解，在pH为酸性和弱酸性条件下，EGCG能够稳定存在。可能由于EGCG在未包封于脂质体前就发生了降解导致包封率下降。Cur在中性或碱性条件下会脱质子化而导致降解[30-31]，在pH为7.0以上时，Cur的包封率下降较大，可能是由于Cur在此条件下发生了降解而导致含量减少，因此缓冲液的最佳pH为6.5。
![]()
图 4 PBS缓冲液的pH对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响Figure 4. Effect of pH of PBS buffer on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution通过实验，得到EGCG/Cur-L制备工艺为：卵磷脂与胆固醇质量比为6:1，PBS缓冲液的pH为6.5，EGCG添加量为6 mg，Cur添加量为3 mg，水化温度为55 ℃。EGCG包封率为68.78%，Cur包封率为90.23%， EGCG/Cur-L的平均粒径为183.8±5.4 nm。
2.2 un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的包封率、粒径分布和Zeta-电位
DSPE-PEG2000-L中EGCG包封率为60.31%，Cur包封率为88.53%。EGCG/Cur-L EGCG包封率为68.78%，Cur包封率为90.23%，修饰前后Cur的包封率并无明显变化，该结果与Hu等[32]的结果类似；而EGCG包封率有所下降，可能由于在脂质体水化阶段前加入DSPE-PEG2000会使头部亲水部分被包封在脂质体内[33]，与亲水性的EGCG竞争脂质体空腔内部空间，导致被包封的EGCG减少。
un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的粒径分布如图5所示，结果显示，un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的平均粒径分别为122.5±1.7、183.8±5.4、374.5±3.1 nm。EGCG/Cur-L可能由于在双分子层内部包封了脂溶性的姜黄素，导致在脂质体自组装过程中磷脂双分子层的间隙变大、脂质体的粒径较空白脂质体变大；DSPE-PEG2000的疏水性尾部插入在脂质体的表面，在脂质体表面形成了一层“PEG”冠，从而增加了脂质体外部体积，与空白脂质体和未修饰脂质体相比，粒径更大。un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的平均Zeta-电位分别为−30.8±0.97、−34.7±0.62、−3.25±0.32 mV，多分散系数分别为0.252、0.178、0.380。可发现包埋EGCG/Cur并未引起un-L表面电位明显的变化，而DSPE-PEG2000-L的电位变为−3.25 mV，说明DSPE-PEG2000已经修饰在了脂质体表面，该结果与Vijayakumar等[34]的结果一致。
![]()
图 5 un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的粒度分布Figure 5. Particle size distribution of un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L2.3 脂质体形貌表征
EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的透射电镜如图6所示，结果显示EGCG/Cur-L与DSPE-PEG2000-L都呈现球状结构，且DSPE-PEG2000-L粒径较EGCG/Cur-L更大。DSPE-PEG2000-L表面有一层白色冠状包裹，说明DSPE-PEG2000已成功修饰在脂质体表面。
![]()
图 6 EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的透射电镜图Figure 6. TEM images of EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L2.4 FT-IR分析
图7为un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的红外光谱图，2926.1和2852.1 cm−1处的特征峰分别对应着磷脂分子内CH2的不对称、对称伸缩振动[35]，修饰脂质体在这两处特征峰未发生较大偏移，说明DSPE-PEG2000并不影响脂质内部结构[36]。在1735.8 cm−1处的磷脂中羰基伸缩振动的特征峰基本无变化。EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L与un-L的FTIR光谱整体相似，EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L几乎没有出现EGCG与Cur的特征峰，说明EGCG与Cur包封在脂质体和修饰脂质体中。脂质体在1735.8 cm−1处C=O的特征峰发生了蓝移且强度增大，推测是DSPE-PEG2000中C=O与大豆卵磷脂分子中C=O重叠共同作用的结果，蓝移的原因可能是出现了氢键的加强或体系出现了新的氢键[37]。另外，1109.2 cm−1处为DSPE-PEG2000中PEG头部醚键的伸缩振动[38]，在修饰脂质体中DSPE-PEG2000的醚键吸收峰由1109.2 cm−1向低频1082.0 cm−1轻微移动，在修饰脂质体中，DSPE-PEG2000的C-O吸收峰由1146.1 cm−1向低频1141.2 cm−1轻微移动，推测DSPE-PEG2000的PEG头部与磷脂双分子层发生了静电作用，同时也说明了DSPE-PEG2000已成功修饰在脂质体的表面。
![]()
图 7 Cur、EGCG、DSPE-PEG2000、un-L、EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L的红外光谱图Figure 7. Infrared spectra of Cur, EGCG, DSPE-PEG2000, un-L, EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L2.5 DPPH自由基清除率及稳定性
为研究脂质体的抗氧化稳定性，制备了un-L、Cur-L、EGCG-L、EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L。各种脂质体的DPPH自由基清除能力如图8所示，分别为8.98%±1.07%、35.2%±3.39%、50.08%±1.35%、60.59%±1.05%、73.33%±2.93%。un-L的DPPH自由基清除能力可能是由于磷脂分子具有一定的抗氧化能力[39]。Cur-L和EGCG-L的自由基清除能力均大于un-L，这表明EGCG和Cur的加入可以提高脂质体的抗氧化能力。EGCG和Cur为多酚类化合物，主要通过H原子供体或作为电子供体清除自由基发挥抗氧化作用，OH基团的数量和位置对其抗氧化能力至关重要[40]，EGCG的OH基团数量相对于Cur更多，因此EGCG-L的DPPH自由基清除能力相对较强。EGCG/Cur-L的自由基清除能力大于Cur-L和EGCG-L，而DSPE-PEG2000-L的DPPH自由基清除能力更强，可能由于改变的脂质体表面电荷以及增加了脂质体亲水性以及掩盖了表面疏水性结合位点，让EGCG更好地发挥抗氧化活性。
![]()
图 8 un-L、Cur-L、EGCG-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的DPPH自由基清除能力Figure 8. DPPH radical scavening activity of un-L, Cur-L, EGCG-L, EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L图9为储存15 d后脂质体的DPPH自由基清除能力保留率，un-L、Cur-L、EGCG-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L分别为67.89%±0.87%、79.35%±1.02%、78.52%±0.54%、81.10%±1.06%、91.17%±0.35%。其中，EGCG-L、Cur-L、EGCG/Cur-L抗氧化稳定性差别不大，un-L抗氧化稳定性下降明显，可能是由于脂质体双分子层膜的氧化导致。DSPE-PEG2000-L抗氧化稳定性最高，DSPE-PEG2000头部的聚乙二醇可以增加脂质体表面空间位阻和防止脂质双分子层氧化[41]，可以表明修饰脂质体可以增加抗氧化稳定性。
![]()
图 9 un-L、Cur-L、EGCG-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的DPPH自由基清除能力稳定性Figure 9. Stability of DPPH radical scavenging ability of un-L, Cur-L, EGCG-L, EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L3. 结论
对EGCG/Cur-L的制备工艺进行研究，得到了EGCG/Cur-L的制备工艺条件：卵磷脂与胆固醇的质量比为6:1，Cur添加量为3 mg，EGCG添加量为6 mg，水化温度为55 ℃，PBS缓冲液pH为6.5。表征结果显示，修饰脂质体与EGCG/Cur-L均呈现圆整、规则的球状。修饰脂质体粒径比EGCG/Cur-L粒径更大，电位绝对值减小；与未修饰脂质体包封率相比，修饰脂质体EGCG包封率有所下降，Cur包封率不变。自由基清除能力结果表明：un-L、Cur-L、EGCG-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的DPPH自由基清率分别为8.98%±1.07%、35.2%±3.39%、50.08%±1.35%、60.59%±1.05%、73.33%±2.93%，自由基清除能力DSPE-PEG2000-L>EGCG/Cur-L>EGCG-L>Cur-L>un-L，DSPE-PEG2000对脂质体表面修饰可以提高脂质体的抗氧化能力，15 d的DPPH清除保留率表明DSPE-PEG2000能够提高脂质体的氧化稳定性。本研究为脂质体共同包封亲水化合物与疏水化合物提供了依据，并为DSPE-PEG2000修饰脂质体的自由基清除能力奠定了一定的理论基础。
-
![]()
图 1 卵磷脂与胆固醇质量比对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响
Figure 1. Effect of mass ratio of lecithin to cholesterol on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution
![]()
图 2 Cur添加量对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响
Figure 2. Effect of concentrations of Cur on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution
![]()
图 3 水化温度对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响
Figure 3. Effect of temperature of EGCG/Cur on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution
![]()
图 4 PBS缓冲液的pH对EGCG/Cur-L包封率及粒径分布的影响
Figure 4. Effect of pH of PBS buffer on EE of EGCG/Cur-L and particle size distribution
![]()
图 5 un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的粒度分布
Figure 5. Particle size distribution of un-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L
![]()
图 6 EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的透射电镜图
Figure 6. TEM images of EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L
![]()
图 7 Cur、EGCG、DSPE-PEG2000、un-L、EGCG/Cur-L和DSPE-PEG2000-L的红外光谱图
Figure 7. Infrared spectra of Cur, EGCG, DSPE-PEG2000, un-L, EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L
![]()
图 8 un-L、Cur-L、EGCG-L、EGCG/Cur-L、DSPE-PEG2000-L的DPPH自由基清除能力
Figure 8. DPPH radical scavening activity of un-L, Cur-L, EGCG-L, EGCG/Cur-L and DSPE-PEG2000-L
-
[1] GAN R Y, LI H B, SUI Z Q, et al. Absorption, metabolism, anti-cancer effect and molecular targets of epigallocatechin gallate (EGCG): An updated review[J]. Crit Rev Food Sci Nutr,2018,58:1−18. doi: 10.1080/10408398.2014.971353
[2] HAYKAWA S, SAITO K, MIYOSHI N, et al. Anti-cancer effects of green tea by either anti-or pro-oxidative mechanisms[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,2016,17:1649−1654. doi: 10.7314/APJCP.2016.17.4.1649
[3] SAHADEVAN R, SINGH S, BINOY A, et al. Chemico-biological aspects of (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) to improve its stability, bioavailability and membrane permeability: Current status and future prospects[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2022:1−30.
[4] RU W Y, JIN C H, KANG Y G, et al. In vitro study on anti-inflammatory effects of epigallocatechin-3-gallate-loaded nano-and microscale particles[J]. International Journal of Nanomedicine,2017,12:7007−7013. doi: 10.2147/IJN.S146296
[5] BIMONTE S, CASCELLA M, BARBIERI A, et al. Current shreds of evidence on the anticancer role of EGCG in triple negative breast cancer: An update of the current state of knowledge[J]. Infectious Agents and Cancer,2020,15:1−6. doi: 10.1186/s13027-019-0268-z
[6] ALMATROODI S A, ALMATROUDI A, KHAN A A, et al. Potential therapeutic targets of epigallocatechin gallate (EGCG), the most abundant catechin in green tea, and its role in the therapy of various types of cancer[J]. Molecules,2020,25:3146. doi: 10.3390/molecules25143146
[7] DAI W, RUAN C, ZHANG Y, et al. Bioavailability enhancement of EGCG by structural modification and nano-delivery: A review[J]. Journal of Functional Foods,2020,65:103732. doi: 10.1016/j.jff.2019.103732
[8] SMITH A J, KAVURU P, ARORA K K, et al. Crystal engineering of green tea epigallocatechin-3-gallate (EGCG) cocrystals and pharmacokinetic modulation in rats[J]. Molecular Pharmaceutics,2013,10(8):2948−2961. doi: 10.1021/mp4000794
[9] HOSSEINI A, HOSSEINZADEH H. Antidotal or protective effects of Curcuma longa (turmeric) and its active ingredient, curcumin, against natural and chemical toxicities: A review[J]. Biomed Pharmacother,2018,99:411−21. doi: 10.1016/j.biopha.2018.01.072
[10] EGAN M E, PEARSON M, WEINER S A, et al. Curcumin, a major constituent of turmeric, corrects cystic fibrosis defects[J]. Science,2004,304:600−602. doi: 10.1126/science.1093941
[11] 刘伟, 顾秀竹, 吴筱霓, 等. 姜黄素药理作用的研究进展[J]. 华西药学杂志,2021,36:336−340. [LIU Wei, GU Xiuzhu, WU Xiaoni, et al. Research progress on the pharmacological effects of curcumin[J]. West China Pharmaceutical Journal,2021,36:336−340. doi: 10.13375/j.cnki.wcjps.2021.03.022 [12] PATTNI B S, CHUPIN V V, TORCHILIN V P. New developments in liposomal drug delivery[J]. Chemical Reviews,2015,115:10938−10966. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00046
[13] AJEESHKUMAR K K, ANEESH P A, RAJU N, et al. Advancements in liposome technology: preparation techniques and applications in food, functional foods, and bioactive delivery: A review[J]. Compr Rev Food Sci Food Saf,2021,20:1280−306.
[14] PAOLINO D, ACCOLLA M L, CILURZO F, et al. Interaction between PEG lipid and DSPE/DSPC phospholipids: An insight of PEGylation degree and kinetics of de-PEGylation[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2017,155:266−275. doi: 10.1016/j.colsurfb.2017.04.018
[15] SONG J W, LIU Y S, GUO Y R, et al. Nano-liposomes double loaded with curcumin and tetrandrine: Preparation, characterization, hepatotoxicity and anti-tumor effects[J]. International Journal of Molecular Sciences,2022,23:6858. doi: 10.3390/ijms23126858
[16] BEGUM M Y, RA M O, ALQAHTANI A, et al. Development of stealth liposomal formulation of celecoxib: In vitro and in vivo evaluation[J]. Plos One,2022,17:e0264518. doi: 10.1371/journal.pone.0264518
[17] RAMADASS S K, ANANTHARAMAN N V, SUBRAMANIAN S, et al. Paclitaxel/epigallocatechin gallate coloaded liposome: A synergistic delivery to control the invasiveness of MDA-MB-231 breast cancer cells[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2015,125:65−72. doi: 10.1016/j.colsurfb.2014.11.005
[18] 曹振大, 梁蓉. 表没食子儿茶素没食子酸酯脂质体的制备及其透皮性能研究[J]. 日用化学工业,2020,50:609−614, 637. [CAO Zhenda, LIANG Rong. Preparation of epigallocatechin gallate liposomes and their transdermal properties[J]. Daily Chemical Industry,2020,50:609−614, 637. [19] 严佳蕾, 王小永. 壳聚糖修饰脂质体对姜黄素的包载作用[J]. 中国测试,2016,42:61−66. [YAN Jialei, WANG Xiaoyong. Encapsulation of curcumin by chitosan-modified liposomes[J]. China Test,2016,42:61−66. doi: 10.11857/j.issn.1674-5124.2016.01.014 [20] ZHANG W, WANG Z, WU C, et al. The effect of DSPE-PEG2000, cholesterol and drug incorporated in bilayer on the formation of discoidal micelles[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences,2018,125:74−85. doi: 10.1016/j.ejps.2018.09.013
[21] CHARCOSSET C, JUBAN A, VALOUR J P, et al. Preparation of liposomes at large scale using the ethanol injection method: Effect of scale-up and injection devices[J]. Chemical Engineering Research and Design,2015,94:508−515. doi: 10.1016/j.cherd.2014.09.008
[22] TAN C, XUE J, ABBAS S, et al. Liposome as a delivery system for carotenoids: Comparative antioxidant activity of carotenoids as measured by ferric reducing antioxidant power, DPPH assay and lipid peroxidation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:6726−6735. doi: 10.1021/jf405622f
[23] 焦岩, 李大婧, 刘春泉, 等. 叶黄素纳米脂质体的制备工艺优化及其氧化稳定性[J]. 食品科学,2017,38(18):259−265. [JIAO Yan, LI Dajing, LIU Chunquan, et al. Optimization of preparation process and oxidative stability of lutein nanoliposomes[J]. Food Science,2017,38(18):259−265. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201718040 [24] SOMJID S, KRONGSUK S, JOHNS J R. Cholesterol concentration effect on the bilayer properties and phase formation of niosome bilayers: A molecular dynamics simulation study[J]. Journal of Molecular Liquids,2018,256:591−8. doi: 10.1016/j.molliq.2018.02.077
[25] MARANHAO R C, VITAL C G, TAVONI T M, et al. Clinical experience with drug delivery systems as tools to decrease the toxicity of anticancer chemotherapeutic agents[J]. Expert Opinion on Drug Delivery,2017,14:1217−1226. doi: 10.1080/17425247.2017.1276560
[26] LU Q, LI D C, JIANG J, et al. Preparation of a tea polyphenol nanoliposome system and its physicochemical properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59:13004−13011. doi: 10.1021/jf203194w
[27] MARIANECCI C, MARZIO L D, RINALDI F, et al. Niosomes from 80s to present: The state of the art[J]. Advances in Colloid and Interface Science,2014,205:187−206. doi: 10.1016/j.cis.2013.11.018
[28] ROG T, PASENKIEWUCZ-GIERULA M. Effects of epicholesterol on the phosphatidylcholine bilayer: A molecular simulation study[J]. Biophysical Journal,2003,84:1818−1826. doi: 10.1016/S0006-3495(03)74989-3
[29] SUłKOWSKI W W, PENTAK D, NOWAK K, et al. The influence of temperature, cholesterol content and pH on liposome stability[J]. Journal of Molecular Structure,2005,744−747:737−747. doi: 10.1016/j.molstruc.2004.11.075
[30] MANDAL S, BANERJEE C, GHOSH S, et al. Modulation of the photophysical properties of curcumin in nonionic surfactant (Tween-20) forming micelles and niosomes: A comparative study of different microenvironments[J]. The Journal of Physical Chemistry B,2013,117:6957−6968. doi: 10.1021/jp403724g
[31] ANAND P, KUNNUMAKKARA A B, NEWMAN R A, et al. Bioavailability of curcumin: Problems and promises[J]. Molecular Pharmaceutics,2007,4:807−818. doi: 10.1021/mp700113r
[32] HU J, WANG J, WANG G, et al. Pharmacokinetics and antitumor efficacy of DSPE-PEG2000 polymeric liposomes loaded with quercetin and temozolomide: Analysis of their effectiveness in enhancing the chemosensitization of drug-resistant glioma cells[J]. International Journal of Molecular Medicine,2016,37:690−702. doi: 10.3892/ijmm.2016.2458
[33] ELIASEN R, ANDRESEN T L, LARSEN J B. PEG-lipid post insertion into drug delivery liposomes quantified at the single liposome level[J]. Advanced Materials Interfaces,2019,6:1801807. doi: 10.1002/admi.201801807
[34] VIJAYAKUMAR M R, KOSURU R, VUDDANDA P R, et al. Trans resveratrol loaded DSPE PEG 2000 coated liposomes: An evidence for prolonged systemic circulation and passive brain targeting[J]. Journal of Drug Delivery Science and Technology,2016,33:125−135. doi: 10.1016/j.jddst.2016.02.009
[35] WANG L, LI L, XU N, et al. Effect of carboxymethylcellulose on the affinity between lysozyme and liposome monolayers: Evidence for its bacteriostatic mechanism[J]. Food Hydrocolloids,2020,98:105263. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.105263
[36] 刘欣, 罗志刚, 李小林. 海藻酸钠-壳聚糖表面修饰维生素C/β-胡萝卜素复合脂质体的制备[J]. 现代食品科技,2020,36:163−169. [LIU Xin, LUO Zhigang, LI Xiaolin. Preparation of sodium alginate-chitosan surface-modified vitamin C/β-carotene complex liposomes[J]. Food Science and Technology,2020,36:163−169. [37] SHUAI C A, YZ A, YH B, et al. Fabrication of multilayer structural microparticles for co-encapsulating coenzyme Q10 and piperine: Effect of the encapsulation location and interface thickness[J]. Food Hydrocolloids,2020,109:106090. doi: 10.1016/j.foodhyd.2020.106090
[38] WU F G, LUO J J, YU Z W. Infrared spectroscopy reveals the nonsynchronicity phenomenon in the glassy to fluid micellar transition of DSPE-PEG2000 aqueous dispersions[J]. Langmuir,2010,26:12777−84. doi: 10.1021/la101539z
[39] KOPRIVNJAK O, SKEVIN D, VALIC S, et al. The antioxidant capacity and oxidative stability of virgin olive oil enriched with phospholipids[J]. Food Chemistry,2008,111:121−126. doi: 10.1016/j.foodchem.2008.03.045
[40] CHRN X, DENG Z, ZHANG C, et al. Is antioxidant activity of flavonoids mainly through the hydrogen-atom transfer mechanism[J]. Food Research International, 2018, 10: 108081.
[41] 蔡晓璇, 吕应年, 戚怡. 长循环脂质体的应用领域和作用机制[J]. 中国组织工程研究,2022,26:2613−2617. [CAI Xiaoxuan, LYU Yingnian, QI Yi. Application fields and mechanisms of action of long-circulating liposomes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering,2022,26:2613−2617. -
期刊类型引用(1)
1. 代思雨，汤颖，刘念，何璐，谷淼，冯琛博，任瑾，方正杰. 芹菜素脂质体的制备、修饰、表征及抗氧化活性研究. 食品工业科技. 2025(01): 190-200 . 
本站查看
其他类型引用(0)
下载:
下载:
计量
- 文章访问数: 256
- HTML全文浏览量: 111
- PDF下载量: 23
- 被引次数: 1
