Influence of Hsian-tsao Polysaccharide on Structural and Physicochemical Properties of Myofibrillar Proteins in Frozen Surimi and Its Gel Characteristics
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摘要: 针对冻藏引起蛋白质变性导致鱼糜凝胶质量劣化问题，实验以传统商业抗冻剂（4%蔗糖+4%山梨醇）为对照，研究添加仙草多糖HTP（0%、1%、1.5%、2%、4%，w/w）对冻藏（0、30、60 d）鱼糜肌原纤维蛋白（MP）结构和理化性质（表面疏水性、浊度、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryl Amide Gel Eectrophoresis，SDS-PAGE）、荧光光谱）及鱼糜凝胶特性（红外光谱、电子舌、持水力、凝胶强度、蒸煮损失率）的影响。结果表明，与未添加组相比，添加HTP可降低冻藏鱼糜MP的表面疏水性和浊度，阻碍MP聚集；电泳和荧光光谱证实HTP有效改善冻藏MP变性聚集；此外，添加HTP可提高鱼糜凝胶强度、增加持水力和降低蒸煮损失率，与HTP改变鱼糜蛋白质结构变化有关（如蛋白质的β-折叠结构增加和表面疏水性降低）；同时，HTP对冻藏鱼糜凝胶滋味（鲜味、咸味和丰富度）的影响不明显（P>0.05）。随着HTP添加量增加，冻藏鱼糜凝胶特性的改善效果呈现先增强后减弱趋势。经冻藏30和60 d，添加1.5%HTP的鱼糜凝胶强度较未添加组分别增加2.17倍和2.09倍，持水力分别增加11.06%和17.47%，蒸煮损失率分别降低22.55%和19.56%（P<0.05），其MP表面疏水性分别降低31.84%和29.43%，浊度分别降低52.81%和2.43%（P<0.05）。因此，添加适量的HTP可减缓冷冻鱼糜MP变性程度及改善鱼糜凝胶特性，为HTP在冷冻糜制品中的应用提供理论参考。Abstract: Addressing the issue of gel degradation in frozen surimi triggered by protein denaturation, this study employed a conventional commercial cryoprotectant blend (4% sucrose+4% sorbitol) as a control to examine the effects of adding Hsian-tsao polysaccharide HTP (0%, 1%, 1.5%, 2%, 4%, w/w) on the structural and physicochemical properties (including surface hydrophobicity, turbidity, SDS-PAGE profiles, and fluorescence spectroscopy) of myofibrillar proteins (MP) as well as the gel characteristics (including inferred from Fourier transform infrared spectroscopy, electronic tongue analysis, water-holding capacity, gel firmness, and cooking loss) of frozen surimi during 0, 30, and 60 d of storage. The findings demonstrated that, as compared to control, incorporating HTP reduced the surface hydrophobicity and turbidity of frozen MP, inhibiting their aggregation. SDS-PAGE analysed and fluorescence spectroscopy confirmed the efficacy of HTP in alleviating the denaturation and aggregation of frozen MP. Additionally, HTP addition was shown to augment gel strength, enhance water-holding capabilities, and reduce cooking losses, phenomena linked to HTP-induced alterations in protein structure, specifically an increase in β-sheet content and a decrease in surface hydrophobicity. Notably, HTP did not significantly alter the taste attributes (umami, saltiness, and richness) of frozen surimi gels (P>0.05). As HTP increased, the enhancement of gel properties in frozen surimi followed a trend of initial improvement, which then declined. Specifically, after 30 and 60 d of freezing, the gel strength of surimi with 1.5% HTP added increased 2.17-fold and 2.09-fold, water-holding capacity rose by 11.06% and 17.47%, and cooking loss rates diminished by 22.55% and 19.56%, respectively (P<0.05). Concurrently, the surface hydrophobicity of MP declined by 31.84% and 29.43%, paralleled by a decrease in turbidity by 52.81% and 2.43% (P<0.05). Consequently, adding HTP can mitigate the extent of MP denaturation in frozen surimi and improve its gel properties, thereby providing a theoretical basis for the application of HTP in frozen surimi products.
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鱼糜是采用去骨、去皮的鱼肉经洗涤、切碎、斩拌等工序制成。其营养价值高，深受消费者喜爱。然而，鱼糜及其产品，如鱼肠、鱼糕等[1−2]，易腐败变质，常采用低温冷冻贮藏以延长货架期。但冻藏会引起冰晶生长和蛋白质变性等问题，导致鱼糜凝胶质地劣化，降低感官品质。肌原纤维蛋白（Myofibrillar protein，MP）作为鱼糜蛋白质的主要组分，其结构特性与鱼糜制品的质构特性和感官品质密切相关[3]。然而，在冻藏过程中MP易变性，引起巯基含量下降，表面疏水性增加，蛋白质交联聚集，从而降低鱼糜的凝胶形成能力和持水性[4]。向鱼糜中添加抗冻剂可抑制冰晶生长，增加MP结构的稳定性，是减缓鱼糜制品冷冻变性的有效途径之一。Sun等[3]研究发现，瘘管洋葱茎多糖在冷冻贮藏过程中对鳙鱼肌原纤维蛋白具有良好的稳定性。Tao等[4]研究发现，γ-聚谷氨酸对鱼糜冷冻贮藏起到冷冻保护作用，适用于鱼糜的生产、储存和运输。Liu等[5]研究发现，魔芋葡甘露聚糖可改善冷冻鱼糜的理化性质，同时可降低鱼糜产品的甜度。研究者更加关注开发具有多功能性的添加剂，不但能增强鱼糜凝胶特性或持水性，而且能赋予鱼糜功能性。现已有相关文献研究了添加功能性多糖（魔芋低聚糖[6]、菊粉[7]、淀粉[8]、燕麦β葡聚糖[9]等）以改善鱼糜凝胶特性，提高鱼糜产品的质量。
仙草（Hsian-tsao）又称凉粉草（Mesona chinensis blume）为一年生草本植物，其提取物广泛用于淀粉凝胶产品（龟苓膏、黑凉粉）和凉茶饮料产品，深受消费者喜爱，产生巨大经济效益。研究发现，仙草多糖（Hsian-tsao polysaccharide，HTP）是其提取物中的有效成分，具有良好的生物活性，例如抗氧化、降血糖和降脂等活性[10]，能够与淀粉产生协同增效作用[11]。然而，目前关于HTP与蛋白质等成分相互作用研究缺乏，从而限制其在食品加工的应用。近年来，研究报道HTP可改善肉类蛋白凝胶质构特性，如提高凝胶持水性，增加硬度，增加延展性等[12]。此外，You等[13]研究发现HTP与蛋白相互作用，促进了蛋白质二级结构从α-螺旋向β-折叠结构转变，增强凝胶形成作用力。但HTP对冻藏鱼糜凝胶特性的影响研究少有报道。前期发现，添加适量HTP可改善冻藏鱼糜凝胶特性，但其对冻藏鱼糜MP产生何种影响尚不清晰。因此，实验以罗非鱼为研究对象，以传统商业抗冻剂（4%蔗糖+4%山梨醇，CC）为阳性对照组，采用电泳、光谱学（紫外光谱、荧光光谱、红外光谱）、质构仪、电子舌等技术手段，探讨−18 ℃冻藏过程中HTP对鱼糜肌原纤维蛋白结构和理化性质及热诱导鱼糜凝胶特性的影响，为HTP在改善蛋白质冷冻变性中的应用提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜罗非鱼（体重约1.0 kg） 广西钦州市鸿发市场；仙草纯胶粉（食品级） 厦门兴顺祥泰食品有限公司；蔗糖（食品级）、山梨醇（食品级）、Tris、盐酸、氢氧化钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、尿素、氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝、牛血清蛋白、溴酚蓝 上海金穗生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒 南京碧云天生物技术有限公司。
Evolution201紫外分光光度计 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RF-5301PC荧光分光光度计 日本Hitachi公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；SA402B电子舌 日本Insent公司。
1.2 实验方法
1.2.1 仙草多糖（HTP）的制备
参照周昕仪等[14]方法制备HTP。纯胶粉溶于水（10%，w/V），加入2%乙酸锌和2%亚铁氰化钾溶液，静置30 min，离心（8000 r/min，20 min），收集上清液，加入乙醇至80%（V/V），静置过夜，离心（5000 r/min，5 min），收集沉淀，复溶（重复2次），透析，冻干制备HTP。基本成分（干基）：多糖（68.21±3.51）g/100 g，蛋白质（6.94±0.35）g/100 g，脂肪（1.52±0.08）g/100 g，灰分（18.36±1.27）g/100 g，分子质量44502 Da。
1.2.2 鱼糜的制备
参考Chen等[15]的方法，并稍作修改。鲜鱼经前处理后（去头、皮、内脏、骨刺），清洗、切碎，斩拌（1800 r/min，3 min）；分别加入HTP（1%、1.5%、2%、4%，w/w）和传统商业抗冻剂（4%山梨醇+4%蔗糖，阳性对照组CC），继续斩拌（2500 r/min，4 min），采用冰浴控温（<10 ℃）。将样品置于−18 ℃冻藏不同时间（0、30、60 d），分为两组：一组（未加热）用于蛋白质结构和理化性质分析，另一组（加热）用于鱼糜凝胶特性分析。
1.2.3 肌原纤维蛋白提取
参考陈旭等[16]的方法并稍作修改。取5 g鱼糜，加入10倍体积Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L NaC1-20 mmol/L Tris-HCl，pH7）充分匀浆（5000 r/min，30 s），于4 ℃离心（10000 r/min，10 min），收集沉淀。加入10倍体积的Tris-HCl 缓冲液（0.6 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.0），充分匀浆（5000 r/min，30 s），于4 ℃提取1 h，于4 ℃离心（10000 r/min，10 min），所得上清液为肌原纤维蛋白（Myofibrillar protein，MP）溶液。采用双缩脲法测定MP浓度。
1.2.4 HTP对冻藏鱼糜MP结构和理化性质的影响
1.2.4.1 浊度分析
样品在340 nm测定吸光值，以吸光值来表达肌原纤维蛋白浊度大小。
1.2.4.2 表面疏水性分析
参考申辉[17]的方法测定。取1 mL MP分散液与200 μL溴酚蓝（1 mg/mL）混匀，室温反应10 min，离心（4000 r/min，15 min），收集上清液，在595 nm处测定吸光度，记为Abs样品。取1 mL缓冲液（含0.6 mol/L NaCl）与200 μL溴酚蓝溶液混匀，同上述操作步骤后测定吸光度，记为Abs空白。MP的表面疏水性以溴酚蓝结合量（μg）表示：
溴酚蓝结合量(µg)=200×(Abs空白−Abs样品)Abs空白 (1) 1.2.4.3 SDS-PAGE
将样品与上样缓冲液（5×）混合备用。参数：12%分离胶，5%浓缩胶，样品上样量10 μL，Marker上样量5 μL。先用低电压（30~60 V）电泳，后用120 V电泳至结束，染色1 h，脱色。
1.2.4.4 荧光光谱分析
用Tris-HCI缓冲液稀释MP至0.5 mg/mL，激发波长295 nm，狭缝宽度5 nm，扫描范围300~500 nm。
1.2.5 鱼糜凝胶制备
取不同冻藏时间鱼糜置于4 ℃过夜，添加2.5%（w/w）NaCl斩绊，其中心温度不超过10 ℃；调整水分含量至80%，灌入塑料肠衣（直径45 mm）、封口；采用二段法加热（40 ℃保持30 min，然后于90 ℃加热20 min），冰浴冷却至室温。
1.2.6 HTP对冻藏鱼糜凝胶特性的影响
1.2.6.1 电子舌测定
参考高可安等[18]的方法测定。取15.0 g样品，加入100 mL去离子水，匀浆，静置15 min；离心（10000 r/min，10 min），收集上清液测定。
1.2.6.2 红外光谱测定
参考Zhou等[19]的方法测定。样品冻干后采用红外光谱仪扫描，参数：范围400~4000 cm−1，分辨率4 cm−1，扫描32次，25 ℃）。对酰胺I区（1600~1700 cm−1）进行去卷积、拟合，计算其二级结构相对含量。
1.2.6.3 持水力（WHC）测定
参考You等[20]的方法测定。采用公式（2）计算持水力。
持水力(%)=WfWi×100 (2) 式中：Wi为离心前质量，g，Wf为离心后质量，g。
1.2.6.4 凝胶强度测定
参考高可安等[18]的方法测定。将样品切成圆柱体（直径20 mm，高30 mm），采用质构仪下测定鱼糜凝胶破裂强度（g）和凹陷深度（mm）。参数设定：压缩模式，探头TA18，测试速度1.0 mm/s，下压16 mm，触发值5 g。采用公式（3）计算凝胶强度。
凝胶强度(g⋅mm)=破断强度(g)×凹陷深度(mm) (3) 1.2.6.5 蒸煮损失率测定
参考吴芳等[21]的方法测定。采用公式（4）计算蒸煮损失率。
蒸煮损失率(%)=A−BA×100 (4) 式中：A为蒸煮前质量，g，B为蒸煮后质量，g。
1.3 数据处理
采用SPSS 19.0处理数据和Origin 2021作图，结果以均数±标准差（n=3）表示，结合Duncan多重检验比较进行显著性分析（P<0.05，差异显著）。
2. 结果与分析
2.1 仙草多糖对冻藏鱼糜MP结构和理化性质的影响
2.1.1 表面疏水性分析
不同HTP添加量对冻藏鱼糜MP表面疏水性的影响如图1所示。随着冻藏时间增加，MP表面疏水性增强。未添加组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其MP表面疏水性较0 d分别增加17.60%和31.60%，表明冷冻导致鱼糜MP变性。添加商业抗冻剂组（CC组）鱼糜冻藏30 d和60 d时，其MP表面疏水性较未添加组（相同冻藏时间）分别降低32.34%和35.56%，表明商业抗冻剂可有效改善鱼糜MP冷冻变性程度。添加HTP后，不同冻藏时间鱼糜MP表面疏水性较未添加组显著降低（P<0.05），且在1%HTP添加量时，鱼糜冻藏30 d和60 d后，其MP表面疏水性较未添加组（相同冻藏时间）分别降低50.84%和40.28%，较CC组分别降低27.34%和7.33%。当HTP>1%时，冻藏鱼糜MP表面疏水性降低程度减弱；例如，添加1.5%HTP时冻藏鱼糜MP表面疏水性较未添加组分别降低31.84%（30 d）和29.43%（60 d）。添加HTP降低MP表面疏水性与HTP引入大量亲水性基团（-OH、-COOH）有关，一方面HTP与MP发生相互作用改变MP结构，另一方面HTP位于MP结构表面附近干扰疏水基团与ANS结合。另外，HTP添加量增加（>1%），MP表面疏水性增大，与HTP促进MP结构展开暴露部分疏水性基团有关。You等[22]发现HTP降低肌球蛋白表面疏水性，与HTP和肌球蛋白相互作用形成复合物改变蛋白质结构有关，支持本研究结果。结果表明HTP可有效改善冻藏鱼糜MP聚集程度。
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2.1.2 浊度分析
不同HTP添加量对冻藏鱼糜MP浊度的影响如图2所示。随着冻藏时间增加，鱼糜MP浊度逐渐增大。冻藏30 d和60 d时，未添加组鱼糜MP浊度较0 d分别增加118.59%和136.70%，表明冻藏导致MP变性聚集。CC组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其MP浊度较0 d分别增加62.72%和128.54%，较未添加组（相同冻藏时间）分别降低1.78%和增加27.39%。当HTP<4%时，不同冻藏时间鱼糜MP浊度较未添加组显著降低（P<0.05）；且在1.5%HTP添加量时，鱼糜MP浊度较未添加组（相同冻藏时间）分别降低52.81%（30 d）和2.43%（60 d），较CC组分别降低51.95%（30 d）和23.41%（60 d）；然而，HTP增至4%时，冻藏60 d鱼糜MP浊度较未添加组增加14.66%。通常，蛋白质浊度增加表明发生聚集[23]。添加适量的HTP，MP浊度降低，表明HTP减缓冻藏MP发生变性聚集的程度，与HTP促进MP结构展开、降低其表面疏水性有关（图1）；然而随着HTP添加量增加（4%），MP表面疏水性增强，在一定程度上促进MP聚集；同时，研究证实HTP与肌球蛋白分子间存在静电作用和氢键作用，形成复合物[23]，导致复合体系浊度增加。因此，添加适量HTP可改善冻藏引起的MP变性聚集。
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图 2 不同HTP添加量对冻藏MP浊度的影响Figure 2. Effect of different HTP addition levels on the turbidity of frozen MP2.1.3 SDS-PAGE分析
不同HTP添加量对冻藏鱼糜MP电泳条带的影响如图3所示，主要包括肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC，200 kDa）、肌动蛋白（Actin，48 kDa）和原肌球蛋白（Tropomyosin（TM），35 kDa）和肌球蛋白轻链（Myosin light chain（MLC），17 kDa）[3,18]。在0 d时，所有样品泳道分离胶顶部未出现聚集物，且随着HTP增加肌动蛋白和原肌球蛋白条带颜色加深。冻藏30 d，未添加组样品泳道分离胶顶部出现聚集物，且随着HTP增加，分离胶顶部聚集物减少，肌动蛋白和原肌球蛋白条带颜色加深。冻藏60 d，所有样品的肌动蛋白和原肌球蛋白条带颜色均加深。添加HTP对MP条带的影响与商业抗冻剂（CC组）类似，表明HTP具有低温保护MP结构的作用；此外，长时间冻藏导致MP变性聚集，添加HTP可改善MP变性聚集程度（如图1表面疏水性结果证实）。Feng等[24]研究发现，促进肌动球蛋白解离可改善鱼肉质地，提高保水性。因此，添加HTP可促进肌动球蛋白解离，这对冻藏鱼糜凝胶特性具有一定的改善作用。
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图 3 不同HTP添加量对冻藏MP电泳条带的影响Figure 3. Effect of different HTP addition levels on the electrophoretic bands of frozen MP2.1.4 荧光光谱分析
微环境变化引起的芳香族氨基酸残基（主要是色氨酸）荧光强度变化可用于分析蛋白质三级结构变化[25]。不同HTP添加量对冻藏MP荧光光谱的影响如图4所示。未添加组MP经冻藏30 d和60 d后其荧光强度较0 d分别增加71.6%和21.4%，表明冻藏引起MP变性聚集。与未添加组和CC组相比，添加HTP后的MP荧光强度明显降低，且随着HTP添加量的增加，MP的最大荧光强度逐渐减小，添加4%HTP时MP荧光强度最低；特别是，在冻藏60 d时，添加HTP组的最大荧光强度均比CC组低。结果证实HTP可减缓冻藏引起的MP变性聚集程度，这与表面疏水性结果（图1）变化一致，表明HTP可促进MP结构展开。因此，添加HTP可有效改善冻藏MP变性聚集。
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图 4 不同HTP添加量对冻藏MP荧光发射光谱的影响Figure 4. Effect of different HTP addition levels on fluorescence emission spectra of frozen MP2.2 HTP对冻藏鱼糜凝胶特性的影响
2.2.1 红外光谱分析
不同HTP添加量对鱼糜凝胶红外光谱的影响如图5所示。所有样品都表现出特征酰胺带，包括酰胺A、酰胺I、酰胺II和酰胺III，波数和峰高略有变化，未出现新的波峰，表明HTP和鱼糜蛋白质间以物理作用力为主。鱼糜蛋白的峰值出现在3278 cm−1（酰胺A，表示N-H或O-H拉伸）、1627 cm−1（酰胺I，表示C-O和C-N拉伸）、1540 cm−1（酰胺II，表示C-N拉伸和N-H弯曲）和1228 cm−1（酰胺III，表示C-O拉伸）[1,14,20]。添加HTP，鱼糜蛋白的酰胺A和酰胺I向高波数移动，表明HTP和鱼糜蛋白分子之间的相互作用会影响蛋白质结构。
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图 5 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶傅里叶变换红外光谱和二级结构的影响Figure 5. Effect of different HTP addition levels on Fourier transform infrared spectra and secondary structure of frozen surimi gels不同HTP添加量对鱼糜蛋白质二级结构相对含量的影响如图5所示。未添加组冻藏30 d、60 d的β-折叠含量较0 d增加3.1%、3.32%，α-螺旋含量降低1.43%、1.86%，表明冻藏过程中蛋白分子间聚集程度逐渐增大[26]，冻藏会导致蛋白质二级结构由有序向无序转变[16]。冻藏30 d、60 d时，CC组鱼糜蛋白质的β-折叠相对含量较未添加组分别增加1.74%、0.19%，其α-螺旋含量分别降低0.82%、0.40%；而添加1.5%HTP组其β-折叠相对含量较未添加组分别增加0.93%、1.56%，其α-螺旋含量分别降低0.43%、0.09%，具有类似CC抗冻作用效果。结果证实HTP对冻藏鱼糜蛋白质具有一定的保护作用。
2.2.2 电子舌分析
不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶滋味的影响如图6所示。咸味和酸味的无味点分别为-6和-13，其他指标的无味点均为0，大于无味点的味觉项目为评价对象[27]。鲜味、丰富度、咸味和酸味的味觉指标都高于无味点，即为鱼糜样品的主要味觉指标。对于未添加组，与0 d相比，冻藏后（30 d、60 d），鱼糜的酸味、丰富度、咸味的响应值均增加，鱼糜滋味的变化可能与微生物引起的蛋白质降解和碳水化合物代谢有关[28]，丰富度则与多种风味物质的产生有关。与未添加组相比，添加组鱼糜滋味变化主要集中在酸味响应值，其他滋味响应值变化不显著，表明添加HTP对冻藏鱼糜鲜味、咸味和丰富度的影响不明显，可用于冻藏鱼糜蛋白质低温保护。
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图 6 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶滋味的影响Figure 6. Effect of different HTP addition levels on the taste of frozen surimi gels2.2.3 持水力分析
不同HTP添加量对鱼糜凝胶持水力的影响如图7所示。随着冻藏时间增加，鱼糜凝胶持水力下降。未添加组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其凝胶持水力较0 d分别降低3.52%和10.97%，表明冷冻导致鱼糜凝胶持水力下降。CC组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其凝胶持水力较未添加组（相同冻藏时间）分别增加5.75%和9.31%，表明商业抗冻剂能够提高鱼糜凝胶的持水能力。添加1.5% HTP添加量时，鱼糜冻藏30 d和60 d后，其持水力较未添加组（相同冻藏时间）分别增加11.06%、17.47%；然而，当HTP>2%时，鱼糜凝胶持水力显著降低（P<0.05）。HTP富含亲水性基团（-OH、-COOH），与水分子间存在大量氢键作用，进而提高鱼糜凝胶的持水力。添加适量的HTP促进鱼糜MP形成凝胶网络结构，且HTP作为有效填充物增强其凝胶强度，提高鱼糜凝胶持水力；相反，添加过量HTP会破坏鱼糜凝胶网络形成，减小鱼糜凝胶强度和持水力（图7）。You等[20]报道适量HTP可促进肌球蛋白凝胶网络结构形成，而过量HTP阻碍肌球蛋白聚集，不利于凝胶网络结构形成，支持本研究结果。因此，添加适量的HTP可促进与蛋白质之间的相互作用，形成均匀致密的凝胶网络结构，提高鱼糜的持水能力，改善鱼糜凝胶品质。
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图 7 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶持水力的影响Figure 7. Effect of different HTP addition levels on the water holding capacity of frozen surimi gels2.2.4 凝胶强度分析
不同HTP添加量对鱼糜凝胶强度的影响如图8所示。随着冻藏时间增加，鱼糜凝胶强度呈下降趋势。未添加组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其凝胶强度较0 d分别降低53.85%和56.41%，表明冷冻导致鱼糜凝胶强度下降。CC组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其凝胶强度较未添加组（相同冻藏时间）分别增加91.92%和89.64%，表明商业抗冻剂能够提高鱼糜的凝胶强度。添加1.5% HTP的鱼糜冻藏30 d和60 d后，其凝胶强度较未添加组（相同冻藏时间）分别增加了2.17和2.09倍，较CC组分别增加65.33%和62.83%；然而，当HTP>1.5%时，鱼糜凝胶强度显著降低（P<0.05）。鱼糜破断强度和凹陷深度整体上呈现先增加后减小的趋势，且在添加1.5%HTP时均达最大值，其破断强度和凹陷深度较未添加组（相同冻藏时间）分别增加144%、135%（30 d）和30.33%、31.2%（60 d），较CC组分别增加41.01%、39.8%（30 d）和17.33%、16.48%（60 d）。结果表明，添加HTP可增强鱼糜凝胶破断力、形变和凝胶强度。HTP是一种含糖醛酸结构的阴离子多糖，富含亲水性基团（-OH、-COOH），可与鱼糜蛋白质竞争水分，致使鱼糜蛋白浓度增加，提高凝胶强度，且HTP吸水溶胀对鱼糜基质产生局部压力，促使形成紧凑、稳固的凝胶网络结构[29]；同时，适量的HTP填充于凝胶网络，促进MP与HTP相互作用，有利于增强凝胶网络结构。然而添加过量的HTP（>2%）降低鱼糜凝胶破断强度和凹陷深度，其原因为过量的HTP分散在鱼糜凝胶网络中，阻碍蛋白分子之间的交联，导致凝胶强度降低。这与汲晨洋等[30]和Yu等[31]的研究结论一致。因此，添加适量的HTP可以改善冻藏鱼糜凝胶强度。
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图 8 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶强度的影响注：A、B、C分别表示0、30、60 d不同HTP添加量对冷藏鱼糜凝胶强度的影响变化。Figure 8. Effect of different HTP addition levels on gel strength of frozen surimi gels2.2.5 蒸煮损失率分析
不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶蒸煮损失率的影响如图9所示。随着冻藏时间增加，鱼糜凝胶蒸煮损失率升高。未添加组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其凝胶蒸煮损失率较0 d分别升高2.36%和8.91%，表明冷冻导致鱼糜凝胶蒸煮损失率升高。CC组鱼糜冻藏30 d和60 d时，其凝胶持水力较未添加组（相同冻藏时间）分别降低12.36%和12.64%，表明商业抗冻剂能够降低鱼糜凝胶的蒸煮损失率。添加HTP后，冻藏30 d和60 d的鱼糜凝胶蒸煮损失率较未添加组显著降低（P<0.05），且在1.5%HTP添加量时，鱼糜冻藏30 d和60 d后，其蒸煮损失率较未添加组（相同冻藏时间）分别下降22.55%和19.56%，较CC组分别降低11.63%和7.92%。结果表明，添加适量的HTP，能降低鱼糜凝胶的蒸煮损失率，并能减少其营养物质、水分的流失，原因是HTP促进鱼糜形成紧密的凝胶网状结构，锁住了更多的水分[21]。但进一步增加HTP（>1.5%）导致蒸煮损失率升高，与凝胶强度（图8）和持水力（图7）变化结果一致。因此，适量的HTP使鱼糜凝胶网格结构更加紧密，改善冻藏鱼糜凝胶蒸煮损失。朱静等[32]报道适量魔芋葡甘聚糖可降低紫薯猪肉丸蒸煮损失率，支持本研究结果。
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图 9 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶蒸煮损失率的影响Figure 9. Effect of different HTP addition levels on the cooking loss rate of frozen surimi gels3. 结论
本文研究了HTP添加量对不同冻藏时间（0、30、60 d）鱼糜MP结构和理化性质及鱼糜凝胶特性的影响。冻藏引起鱼糜MP发生变性聚集；添加HTP影响鱼糜MP分子间相互作用，降低MP的表面疏水性和浊度，减弱MP聚集程度；SDS-PAGE和荧光光谱证实HTP有效改善冻藏MP变性聚集。此外，添加HTP可提高冻藏鱼糜凝胶强度，增加持水力，降低蒸煮损失率，与HTP改变鱼糜蛋白质结构有关（β-折叠结构增加，表面疏水性降低）。因此，HTP不仅具有商业抗冻剂作用效果，对冻藏鱼糜MP具有低温保护作用，还具有改善冻藏鱼糜凝胶特性的效果，为HTP在冻藏鱼糜制品的应用提供理论参考。
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图 2 不同HTP添加量对冻藏MP浊度的影响
Figure 2. Effect of different HTP addition levels on the turbidity of frozen MP
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图 3 不同HTP添加量对冻藏MP电泳条带的影响
Figure 3. Effect of different HTP addition levels on the electrophoretic bands of frozen MP
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图 4 不同HTP添加量对冻藏MP荧光发射光谱的影响
Figure 4. Effect of different HTP addition levels on fluorescence emission spectra of frozen MP
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图 5 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶傅里叶变换红外光谱和二级结构的影响
Figure 5. Effect of different HTP addition levels on Fourier transform infrared spectra and secondary structure of frozen surimi gels
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图 6 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶滋味的影响
Figure 6. Effect of different HTP addition levels on the taste of frozen surimi gels
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图 7 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶持水力的影响
Figure 7. Effect of different HTP addition levels on the water holding capacity of frozen surimi gels
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图 8 不同HTP添加量对冻藏鱼糜凝胶强度的影响
注：A、B、C分别表示0、30、60 d不同HTP添加量对冷藏鱼糜凝胶强度的影响变化。
Figure 8. Effect of different HTP addition levels on gel strength of frozen surimi gels
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