Optimization of Process Conditions for Fermented Mulberry Leaf Tea and Analysis of Its Antioxidant Activity
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摘要: 为了对发酵桑叶茶工艺条件进行优化并探究桑叶茶经发酵后抗氧化活性的变化，该试验通过响应面分析法确定发酵桑叶茶在发酵温度、发酵时间和黑曲霉接种量3种变量条件下的最佳工艺条件，并测定发酵桑叶茶生物活性物质含量及其抗氧化性。结果表明，最佳工艺条件为发酵时间5 d 16 h，发酵温度30 ℃，接种量16.55%，此条件下所制发酵桑叶茶感官评分高达90分，且其总黄酮、总多糖、多酚、游离氨基酸、芦丁、槲皮素含量比桑叶绿茶分别升高了14.39%、12.67%、2.90%、3.46%、81.13%、19.35%，还检测到了含量7.55%±0.37%的茶褐素。此外，1/1000（g/mL）浓度下发酵桑叶茶对羟基自由基、DPPH自由基、超氧自由基的清除率和对二价铁离子的螯合率分别是桑叶绿茶的1.16倍、1.07倍、1.06倍和0.82倍，该研究结果为今后桑叶的进一步开发与应用提供理论基础和参考。Abstract: In order to optimize the fermentation process conditions of mulberry leaf tea and explore the changes in antioxidant activity of mulberry leaf tea after fermentation. This experiment used response surface analysis to determine the optimal process conditions for fermenting mulberry leaf tea under three variable conditions: Fermentation temperature, fermentation time, and inoculation amount of Aspergillus niger. The content of bioactive substances and antioxidant properties in fermented mulberry leaf tea were determinated. The findings indicated that 5 days and 16 hours of fermentation duration, 30 ℃ of fermentation temperature, and 16.55% of inoculation amount were the ideal process parameters, and that the fermented mulberry leaf tea scored as high as 90 on the sensory scale under these conditions. In addition, the content of total flavonoids, total polysaccharides, polyphenols, free amino acids, rutin, and quercetin in fermented mulberry leaf tea increased by 14.39%, 12.67%, 2.90%, 3.46%, 81.13%, and 19.35%, respectively, compared to mulberry leaf green tea. Tea brown pigment with a content of 7.55%±0.37% was also detected in fermented mulberry leaf tea. In addition, the scavenging rate of hydroxyl radicals, DPPH radicals, superoxide radicals and the chelating rate of divalent iron ions of fermented mulberry leaf tea at the concentration of 1/1000 (g/mL) were 1.16, 1.07, 1.06 and 0.82 times higher than that of mulberry leaf green tea, respectively. The results of this study provide theoretical basis and references for further development and application of mulberry leaf in the future.
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Keywords:
- ferment /
- mulberry leaf tea /
- bioactive substances /
- process optimization /
- antioxidant properties
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桑叶（Morus alba L.）是一种常见的药食两用植物，《本草纲目》记载了：“桑为治消渴之圣药”；“桑椹以叶煮汁服，止渴润燥”；“桑为去湿之圣药”等说法[1]。现代医学研究发现，桑叶中含有多种生物活性物质，如黄酮类、桑叶多糖、γ-氨基丁酸、1-脱氧野尻霉素（DNJ）、芦丁、槲皮素等，尤其是黄酮类物质具有较强的抗氧化活性[2]。冯拓等[3]指出桑叶是天然的抗氧化剂来源，随着人们越来越崇尚健康生活和功能食品，因而，具有抗氧化性等功效的桑叶也越来越受到人们关注。目前桑叶的主要加工方式为制茶，所制桑叶茶会有特殊的香气，不仅可以给食品增加香味，还能提高食品营养价值。市场上常见的桑叶茶是未经过发酵的桑叶绿茶，陈永丽等[4]研究表明桑叶绿茶口感微涩，且不能产生独有的降解酶和风味酶。Mas等[5]研究发现发酵这一过程可以把桑叶中部分蛋白质水解成氨基酸，纤维素水解成可溶性糖，这些分解物发生非酶褐变反应，能够改善桑叶的青草味道，增加其耐泡性，同时可以提升茶的品质[6]。此外，部分酚类物质经发酵可被氧化成茶褐素，所以发酵桑叶茶的茶汤颜色呈棕褐色[2]，同时，发酵可增加桑叶茶中黄酮类、桑叶多糖、γ-氨基丁酸等生物活性物质含量，其营养价值和口感均得到提升。
近年来国内外有关桑叶茶抗氧化活性的研究对象均是桑叶绿茶，发酵桑叶茶抗氧化活性的报道较少，且发酵桑叶茶的生产工艺受发酵时间、发酵菌种和发酵温度等多因素影响，发酵工艺参数不好控制，因此探究发酵桑叶茶的最佳提取工艺及其抗氧化活性，对进一步开发桑叶的利用价值，促进其在健康食品和保健领域的应用具有一定的研究意义。本研究拟通过单因素-响应面试验确定发酵桑叶茶最佳工艺条件，并通过测定其对羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧自由基的清除能力及对二价铁离子螯合能力，分析比较新鲜桑叶、桑叶绿茶和发酵桑叶茶的抗氧化能力。优化发酵桑叶茶工艺条件并研究其抗氧化活性，对于提高桑叶的利用价值、开发新型茶饮品以及对人体健康的保健作用具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜桑叶、桑叶绿茶 于 2022 年 9 月 20 日购买自辽宁省阜新市彰武县五峰镇高山台村航天科技园桑树圃，新鲜桑叶为成熟期长势茂盛且无病虫害的白桑（Morus alba）树叶，桑叶绿茶是由上述桑叶经清洗、切条、炒制、杀青、揉制和干燥而得到；黑曲霉 中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC2039）；Tris（三羟甲基氨基甲烷） 淮安和元化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海蓝季科技发展有限公司；盐酸、芦丁标准品、槲皮素标准品、氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl） 北京索莱宝科技有限公司；三氯化铁、铁氰化钾、水杨酸、抗坏血酸、氢氧化钠、氯化亚铁 国药集团化学试剂有限公司；Ferro zine（菲洛嗪）、EDTA（乙二胺四乙酸） 石家庄杰克化工有限公司；柠檬酸钠、三氯乙酸、磷酸氢二钠 上海化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
Lbe Tash IU-200型紫外分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司；SCA-J型恒温水浴锅 中国仪成医疗器械有限公司；SHZ-C（Ⅲ）型循环水式真空泵 五和华正仪器厂有限公司；EHX-6604B型电热干燥箱 上海菁华科技仪器有限公司；SS-1022型粉碎机 恒煜商贸有限公司；BSA124S型分析天平 德国赛多利斯公司；XFH-40MA型全自动压力蒸汽灭菌器 浙江新丰医疗器械有限公司；PHS-25型台式计pH计 上海力辰邦西仪器科技有限公司；XRT-XG型微波灭菌器 青岛新锐特自动化有限公司；SHA-BA型恒温水浴振荡器 常州金南仪器制造有限公司；MJ-701型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵桑叶茶生产工艺路线
1.2.2 发酵桑叶茶制备步骤
实验前将新鲜桑叶和桑叶绿茶密封，置于4 ℃冰箱保鲜。参照贾冬英等[7]的方法并稍作改进，挑选新鲜、无病虫害的桑叶，洗净晾干后进行萎凋和揉捻，于常压下蒸15~20 min，冷却至室温，得到预处理桑叶；将其放入无菌锥形瓶于60 ℃渥堆4 h，再将桑叶水分含量调整至40%，灭菌，冷却后在无菌条件下接种黑曲霉进行发酵，得到湿发酵桑叶茶；将湿发酵桑叶茶置于110 ℃条件下进行干燥，使其水分含量达到5%~8%，即得发酵桑叶茶[5]。
1.2.3 发酵桑叶茶单因素实验
孢子悬浮液的制备：将4 ℃储藏黑曲霉置于225 mL无菌水的锥形瓶中，超声振荡60 min，至黑曲霉孢子分散均匀，得到6×106 CFU/mL的悬浮液。在400 W，60 s微波灭菌条件下，对加水量5%的1.2.2所得接种前的桑叶进行灭菌处理。取5只烧杯，分别编号1、2、3、4、5，倒入100 g上述灭菌后的桑叶，在发酵温度32 ℃、接种量15%条件下，设置发酵时间3、5、7、9、11 d进行水平实验；同样地，在发酵时间5 d、接种量15%条件下，设置发酵温度28、30、32、34、36 ℃进行水平实验；在发酵时间5 d、发酵温度32 ℃条件下，设置接种量5%、10%、15%、20%、25%进行水平实验[6]。
1.2.4 发酵桑叶茶响应面分析
结合单因素实验得到的结果，基于Design-Expert 13软件进行Box-Behnken试验设计，以得出最好工艺参数。以感官评分（Y值）为考察指标，选取发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）3个因素为自变量，每个自变量的低、中、高试验水平分别以−1、0、1进行编码。试验因素水平设计见表1。
表 1 试验因素水平Table 1. Experimental factors and levels因素 水平 −1 0 1 A发酵时间（d） 5 7 9 B发酵温度（℃） 30 32 34 C接种量（%） 10 15 20 1.2.5 发酵桑叶茶感官评分
参照卢丽等[8]的方法，并稍作修改。试验结束后，分别称取发酵桑叶茶5 g，加入250 mL沸水，冲泡5 min，由20位专业感官评审员（年龄在20~30岁和30~40岁之间的评审员各10人，男女各10人）打分评定。采用评分法，按照表2所示细则打分，取20位感官评审员平均分，即为感官评分。
表 2 感官评定标准Table 2. Sensory evaluation standards指标 评分标准 得分 叶底黄褐、明亮，叶质较柔软，紧捏成团 9~15 叶底（15分） 叶底黄绿欠匀，叶质较硬，手捏少许碎断 5~8 叶底暗绿，叶质硬实，紧捏易碎 1~4 澄清、透亮、光泽度较好、色泽诱人 28~30 澄清、透亮、具有产品应有色泽 24~27 汤色（30分） 澄清、无夹杂物、色泽诱人 20~23 微浑、无光泽、色泽一般 15~19 浑浊、无光泽、色泽差 <15 茶香浓郁，呈现出特有的菌香、甜香和混合香，
回甘悠长、丰满9~15 香气（15分） 香味略平淡，同时略带青草气 5~8 茶香体现不明显且带严重青草气和豆腥味 1~4 风味协调、口感醇正、独特茶香 38~40 茶体饱满、茶香柔和、酸涩适中 34~37 不酸、不涩、回甘且纯正 30~33 滋味（40分） 偏酸、微涩、带苦味、欠浓郁 25~29 很酸、很涩、很苦、口感平淡、有青草异味 <25 1.2.6 样品液的制备
将新鲜桑叶和桑叶绿茶以及1.2.2所得发酵桑叶茶在110 ℃条件下干燥至恒重后用粉碎机粉碎备用。参照冯拓等[3]的方法并稍作修改，准确称取1 g上述粉碎的样品，分别按照质量体积比（g/mL）1:2500、1:2000、1:1500、1:1000和1:500沸水浸提45 min，每15 min振动均匀，趁热抽滤，备用，得到不同浓度待测样品液，用于后续三种桑叶产品对羟自由基、DPPH自由基和超氧自由基清除率以及对亚铁离子螯合率的测定。
1.2.7 生物活性物质含量分析
参照郑升海等[1]的方法测总黄酮；国家标准GB/T 8313-2018测多酚和槲皮素[9]；国家标准GB/T 40632-2021测总多糖[10]；胡海洋等[11]的方法测芦丁；胡圆圆等[12]的方法测茶褐素；国家标准GB/T 30987-2020测游离氨基酸[13]；国家标准GB/T 40642-2021测1-脱氧野尻霉素[14]；国家标准GB/T8305-2013测水浸出物[15]。
1.2.8 抗氧化活性分析
1.2.8.1 羟自由基清除率的测定
参照Dondurmacioglu等[16]的方法，取2 mL 1.2.6所得不同浓度样品液，分别加入2 mL浓度为6 mmol/L的FeSO4和H2O2溶液，摇匀，反应10 min，再加入等浓度等量的水杨酸，混匀，待30 min后，在波长510 nm处，测OD值，以维生素C为阳性对照，蒸馏水为空白对照，测定各种桑叶产品羟自由基清除能力。计算公式如下：
清除率(%)=[A′0−(A′i−A′j)]A′0×100 式中：A′i：样品吸光值；A′0：没有样品参加反应时的吸光值；A′j：没有水杨酸参加反应时的吸光值。
1.2.8.2 DPPH自由基清除率的测定
参照东方等[17]的方法，取0.3 mL 1.2.6所得待测液，在离心管中加入DPPH乙醇溶液2.7 mL，作为测试样，用等体积的乙醇代替待测样作对照，3 mL的乙醇溶液作为空白组，避光且在25 ℃下水浴30 min，在波长517 nm处测吸光度，以维生素C为阳性对照，测定各种桑叶产品DPPH自由基清除能力。计算公式如下：
清除率(%)=A0−AxA0×100 式中：A0：对照吸光值；Ax：样品溶液吸光值。
1.2.8.3 超氧自由基清除率的测定
参照玄红专等[18]的方法，取4.5 mL浓度为0.05 mol/L Tris-HCl pH8.2缓冲液和0.1 mL的蒸馏水混匀，在37 ℃水浴锅里（同时把邻苯三酚放在水浴锅里）预热，等待20 min，马上和邻苯三酚（0.5 mL 3 mmol/L）混匀，在波长325 nm处测吸光值，上述操作确保在3 min之内做完，再加入0.1 mL 1.2.6所得的各样品液，重复上述步骤，以维生素C为阳性对照，10 mmol/L HCl溶液为空白对照，测定各种桑叶产品超氧自由基清除能力。计算公式如下：
清除率(%)=Aa−AbAa×100 式中：Aa：没有样品参加反应时的吸光值；Ab：样品溶液吸光值。
1.2.8.4 对Fe2+螯合能力的测定
参照王昌禄等[19]的方法，用EDTA对Fe2+的螯合能力作为衡量标准，分别取1 mL 1.2.6所得样品液，依次加入3.5 mL蒸馏水和0.1 mL FeCl2溶液，反应10 min后，最后加入0.2 mL Ferro zine，在波长为562 nm处测吸光值，以蒸馏水为空白对照，分别计算并比较各种桑叶产品对Fe2+的螯合率。计算公式如下：
螯合率(%)=(1−A″A″0)×100 式中：A″：样品溶液吸光值；A″0：没有样品参加反应时的吸光值。
1.3 数据处理
样品测定采用3次重复，用SPSS 26.0软件对数据结果进行单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），Design-Expert 13软件进行响应面设计及分析，Origin 2018软件作图。
2. 结果与分析
2.1 发酵桑叶茶单因素实验
本试验选择发酵时间（d）、发酵温度（℃）和接种量（%）3个因素，进行单因素实验，结果如图1所示。
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图 1 发酵时间、发酵温度以及接种量对发酵桑叶茶的影响Figure 1. Effect of fermentation time, fermentation temperature and inoculation amount on fermented mulberry leaf tea从发酵时间来看，发酵桑叶茶感官评分随着发酵时间增加而不断提高，发酵第7 d时，得到最高感官评分88分，但在发酵第7 d以后，感官评分急剧下降。推测发酵第7 d之前，由于发酵时间越久，黑曲霉的生长越旺盛，利用叶片中的营养物质更均衡，于是产生的代谢产物变多，增加发酵茶的风味物质[20]，发酵第7 d之后，可能是因为过多的黑曲霉使发酵底物腐败变质，极大影响了感官评分[21]。从发酵温度来看，伴随温度的不断上升，感官评分呈先上升再下降的趋势，感官评分在32 ℃达到最高为87分。说明在32 ℃发酵桑叶茶能较好地保持微生物的湿热作用，帮助微生物生长发育，高温可能会导致一些有机物质的分解或者不利的化学反应发生，从而影响茶叶的口感和香气，温度升高也可能影响茶叶中的挥发性化合物的挥发速率，进而影响茶叶的香气和口感，导致感官评分降低[22]。从接种量（浓度为6×106 CFU/mL的黑曲霉菌液）来看，接种量15%时作为一个分界点，接种量小于15%时，感官评分随接种量的增加而增大，当接种量超过15%，感官评分反而下降。可能是因为接种量小于15%时，发酵桑叶茶的底物暂时不会达到饱和状态，黑曲霉在桑叶叶片上生长趋势较好，感官评分不断提高[23]，接种量超过15%时，此时发酵桑叶茶的底物已经饱和，黑曲霉接种量的增加反而破坏了发酵桑叶茶的品质。综上，接种量选择15%，发酵时间选择7 d，发酵温度选择32 ℃。
2.2 发酵桑叶茶响应面分析
通过单因素实验结果，现选择A发酵时间（d）、B发酵温度（℃）、C接种量（%）作为3个因素，以感官评分（Y）作为响应值，利用3因素3水平的响应面试验方法，研究各个因素对发酵桑叶茶加工工艺的影响，试验设计与结果见表3。
表 3 Box-Behnken试验方案与结果Table 3. Scheme and results of Box-Behnken test试验号 A发酵时间 B发酵温度 C接种量 Y感官评分（分） 1 0 0 0 87 2 −1 0 −1 69 3 1 −1 0 78 4 0 0 0 89 5 1 0 −1 78 6 1 1 0 85 7 1 0 1 84 8 0 −1 −1 74 9 −1 0 1 80 10 −1 1 0 78 11 0 −1 1 82 12 0 0 0 88 13 0 1 1 85 14 0 0 0 86 15 −1 −1 0 80 16 0 1 −1 76 17 0 0 0 89 通过Design Expert 13软件，将表3中17组响应值进行二元回归拟合分析，建立A发酵时间（d）、B发酵温度（℃）、C接种量（%）3个因素与感官评分（Y）之间的二次多项式模型，得到如下方程：Y=87.80+2.25A+1.25B+4.25C+2.25AB−1.25AC+0.25BC−4.52A2−3.02B2−5.53C2，从表4可以看出：方程回归项的模型P<0.05，具有差异显著性，但失拟项（P=0.3287>0.05）差异不显著。还可以看出，B、AB影响显著（P<0.05），A、C、A2、B2、C2影响极显著（P<0.01）。从F值大小得出，3个因素对感官评分Y值的影响大小排列顺序为：接种量>发酵时间>发酵温度。
表 4 响应面试验结果方差分析Table 4. Analysis of variance of response surface test results方差来源 平方和 自由度 均方差 F P 显著性 模型 505.08 9 56.12 26.54 0.0001 显著 A发酵时间 40.50 1 40.50 19.16 0.0032 ** B发酵温度 12.50 1 12.50 5.91 0.0453 * C接种量 144.50 1 144.50 68.34 <0.0001 ** AB 20.25 1 20.25 9.58 0.0174 * AC 6.25 1 6.25 2.96 0.1292 BC 0.2500 1 0.2500 0.1182 0.7410 A2 86.21 1 86.21 40.78 0.0004 ** B2 38.53 1 38.53 18.22 0.0037 ** C2 128.53 1 128.53 60.79 0.0001 ** 残差 14.80 7 2.11 失拟项 8.00 3 2.67 1.57 0.3287 不显著 纯误差 6.80 4 1.70 总离差 519.88 16 注：F表示F检验所得值，P表示置信度；**表示差异极显著（P<0.01），*表示差异显著（P<0.05）。 2.3 发酵桑叶茶感官评分三维响应曲面分析
利用Design-Expert 13软件对表3的17组数据进行分析，结果如图2所示，发酵温度、发酵时间和接种量对发酵桑叶茶感官评分存在一定的交互作用，坡度越陡表示响应值对于因素的敏感性越高，因素间的交互作用越显著[18]。由图2和表4可知，发酵时间与发酵温度间的交互作用较强，对感官评分影响显著（P<0.05），发酵时间与接种量、发酵温度与接种量的交互作用略弱，对感官评分的影响不显著。
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图 2 发酵桑叶茶响应面优化3D曲面Figure 2. Optimized 3D response surface for fermented mulberry leaf tea2.4 最优工艺条件验证
Design-Expert软件给出的最优发酵桑叶茶工艺条件为：发酵时间5.68 d，发酵温度30.08 ℃，接种量16.55%，此条件下发酵桑叶茶感官评分为87分。考虑到生产实际，调整工艺条件为发酵时间5 d 16 h，发酵温度30 ℃，接种量16.55%。为验证实验可靠性，在此条件下不断实验，该条件下发酵桑叶茶感官评分高达90分，说明该优化条件可信。
2.5 生物活性物质含量分析
按照1.2.7所述对发酵桑叶茶中生物活性物质进行检测，结果如表5所示。经过发酵的桑叶茶其总黄酮、总多糖、多酚、游离氨基酸、芦丁、槲皮素含量与桑叶绿茶相比，分别增加了14.39%、12.67%、2.90%、3.46%、81.13%、19.35%，发酵桑叶茶中的芦丁含量上升最为明显，而1-脱氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）含量对比桑叶绿茶显著下降（P<0.05），可能在发酵桑叶茶工艺过程中，高温破坏了DNJ的结构，微生物作用将部分DNJ转变成其他物质，造成了DNJ含量流失[24]，但具体原因需进一步验证；其次，发酵桑叶茶的水浸出物最多，说明茶叶中可溶性物质充分溶解，茶汤的滋味会更加纯正，营养价值更高[25]；最后，只在发酵桑叶茶里发现有茶褐素，更加说明本试验工艺优化较为成功，在改善了桑叶绿茶滋味的基础上，又促使发酵桑叶茶中原有的生物活性物质含量增加，还产生了新鲜桑叶和桑叶绿茶没有的茶褐素[26]。黑曲霉能分泌酸性蛋白酶，糖苷酶、葡萄糖淀粉酶和乳酸酶等丰富的胞外酶类，使茶叶内含物质更易渗出，从而实现大分子物质小分子化，促使发酵桑叶茶汤色由绿黄明亮转变为红褐，茶汤的收敛性和苦涩味降低，使发酵桑叶茶产生茶褐素[20]。郑升海等[1]通过冠突散囊菌发酵桑叶茶来探究品质变化的研究表明，发酵桑叶茶多糖、总黄酮、多酚含量均与桑叶绿茶相比分别下降了76.10%、12.14%和7.10%，而DNJ含量和水浸出率是桑叶绿茶的3倍，可能是发酵菌种不同导致结果产生差异。
表 5 生物活性物质含量Table 5. Bioactive substances content有效成分 总黄酮
（mg/g）总多糖
（mg/g）多酚
（mg/g）游离氨基酸
（mg/g）芦丁
（mg/g）槲皮素
（mg/g）1-脱氧野尻霉素
（mg/g）水浸出物
（%）茶褐素
（%）新鲜桑叶 13.84±0.26a 21.56±0.37a 2.08±0.28a 13.40±0.14a 0.50±0.22a 0.010±0.001a 2.10±0.31a 46.56±1.97a 0 桑叶绿茶 12.86±0.18a 22.34±0.21b 2.07±0.31a 15.90±0.09ab 0.53±0.30a 0.031±0.004b 2.62±0.42b 46.94±2.04a 0 发酵桑叶茶 14.71±0.21b 25.17±0.30c 2.13±0.22b 16.45±0.26ab 0.96±0.25b 0.037±0.002b 2.19±0.36a 47.30±1.89b 7.55±0.37 注：同列肩标小写字母不同表示组间差异显著（P<0.05）。 2.6 发酵桑叶茶抗氧化活性
2.6.1 羟自由基清除率
按照1.2.8.1所述测定新鲜桑叶、桑叶绿茶、发酵桑叶茶及维生素C对羟自由基的清除能力，结果如图3所示。1/1000（g/mL）浓度时新鲜桑叶、桑叶绿茶、发酵桑叶茶对羟自由基的清除率分别是维生素C的0.67倍、0.58倍和0.65倍，随着样品浓度升高，三者对羟自由基的清除能力波动不大，新鲜桑叶对羟自由基清除率最高，可能是桑叶绿茶和发酵桑叶茶在制作工程中，揉捻和高温等操作破坏了桑叶中的某些抗氧化物质，使得桑叶绿茶和发酵桑叶茶对羟自由基清除率降低。发酵桑叶茶对羟自由基的清除率稳定在60%左右，高于桑叶绿茶，可能是桑叶茶经发酵后总多糖等生物活性物质含量提高，导致发酵桑叶茶抗氧化活性大于桑叶绿茶[27]。这与Unban等[28]研究结果一致，茶叶经发酵后总多酚、总多糖、总黄酮、总单宁和总儿茶素含量升高，导致发酵阿萨姆（Assam）茶对羟自由基清除率比未发酵茶升高12.96%。
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图 3 维生素C和桑叶产品对羟自由基的清除作用Figure 3. Scavenging effect of vitamin C and mulberry leaf products on hydroxyl radicals2.6.2 DPPH自由基清除率
按照1.2.8.2所述测定维生素C、新鲜桑叶、桑叶绿茶及发酵桑叶茶对DPPH自由基的清除能力，结果如图4所示。随着样品浓度的升高，三者对DPPH自由基的清除能力一直在升高，清除率和浓度呈现正相关线性关系，而维生素C对DPPH自由基的清除能力基本保持在97%以上。新鲜桑叶清除DPPH自由基的能力要大于桑叶绿茶和发酵桑叶茶，1/1000（g/mL）浓度时，新鲜桑叶、桑叶绿茶、发酵桑叶茶对DPPH自由基的清除率分别为维生素C的0.92倍、0.33倍和0.40倍，推测原因可能是具有抗氧化能力的生物活性物质，其中一部分因发酵氧化成了有色物质，一些原有的抗氧化物质在制茶过程中可能会被降解或转化为其他化合物。发酵桑叶茶对DPPH自由基的清除率要略高于桑叶绿茶，1/500（g/mL）浓度时发酵桑叶茶对DPPH自由基的清除率达到59%，故推测在发酵中黑曲霉的参与有利于桑叶茶产品的抗氧化性物质的形成和提高。冯拓等[3]研究了16种不同茶叶的抗氧化活性，结果显示大部分茶叶对DPPH自由基的清除率在38.30%~77.59%之间，与本研究结果基本一致。
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图 4 维生素C和桑叶产品对DPPH自由基的清除作用Figure 4. Scavenging effect of vitamin C and mulberry leaf products on DPPH radicals2.6.3 超氧自由基清除率
按照1.2.8.3所述测定维生素C、新鲜桑叶、桑叶绿茶及发酵桑叶茶对超氧自由基的清除能力，结果如图5所示。清除率和浓度呈现正相关线性关系，1/1000（g/mL）浓度下，新鲜桑叶、桑叶绿茶、发酵桑叶茶对超氧自由基的清除率分别是维生素 C 的 0.41 倍、0.62 倍和 0.69 倍，桑叶绿茶和发酵桑叶茶对超氧自由基的清除率相近，发酵桑叶茶在1/500浓度时清除率达到42%，推测是发酵桑叶茶在渥堆和发酵的过程中，某些生物活性成分被高温分解或者转化生成原来没有的抗氧化物质，这些物质可能具有清除超氧自由基的能力，也有可能是微生物和酶的作用，使多糖类物质暴露出很多活性基团，这些活性基团有助于对超氧自由基进行清除[29]。这与Chan等[30]的研究结果基本一致，与桑叶绿茶相比，发酵桑叶茶对超氧自由基的清除能力和总抗氧化活性分别升高48.64%和34.59%。总体来说，桑叶产品清除超氧自由基的能力都较强，三者对清除超氧自由基的能力大小依次为：发酵桑叶茶>桑叶绿茶>新鲜桑叶。
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图 5 维生素C和桑叶产品对超氧自由基的清除作用Figure 5. Scavenging effect of vitamin C and mulberry leaf products on superoxide radicals2.6.4 对Fe2+螯合能力
按照1.2.8.4所述测定新鲜桑叶、桑叶绿茶及发酵桑叶茶对Fe2+的螯合能力，结果如图6所示。总体来说，三种样品对Fe2+的螯合能力都很弱，发酵桑叶茶对Fe2+的螯合能力最弱。新鲜桑叶中含有一些天然的鞣酸等活性成分，这些活性成分具有良好的螯合能力，可以与Fe2+形成稳定的络合物，然而，当桑叶经过发酵处理时，鞣酸往往会被氧化、分解或降解，从而减少了发酵桑叶茶对Fe2+的螯合能力；其次，微生物产生的代谢产物可能与桑叶中的活性成分竞争结合Fe2+，降低了发酵桑叶茶对Fe2+的螯合效率[17]。三种样品在浓度为1/1000（g/mL）时对Fe2+的螯合率分别为6.51%、1.53%和1.51%，这个浓度可以作为日后生产功能性桑叶茶饮料的一个参考[31]，目前有关茶叶对Fe2+螯合能力的报道较少，后续需要进一步对其探究。
3. 结论
本研究通过单因素-响应面试验确定了发酵桑叶茶的最佳工艺条件是：发酵时间5 d 16 h，发酵温度30 ℃，黑曲霉接种量16.55%。通过对发酵桑叶茶生物活性物质检测发现，总黄酮、总多糖、多酚、游离氨基酸、芦丁、槲皮素含量比桑叶绿茶分别升高了14.39%、12.67%、2.90%、3.46%、81.13%、19.35%，并生成了新鲜桑叶和桑叶绿茶中没有的茶褐素，本研究为茶褐素的来源提供了一条新途径。进一步通过抗氧化实验反映了本研究所得发酵桑叶茶与桑叶绿茶相比具有较好的抗氧化能力，1/1000（g/mL）浓度下发酵桑叶茶对羟自由基、DPPH自由基和超氧自由基的清除能力分别是维生素C的0.65倍、0.40倍和0.69倍，对Fe2+螯合率为1.51%。综合来看，与桑叶绿茶相比，发酵桑叶茶抗氧化活性升高，此外，发酵桑叶茶在黑曲霉作用下，其总黄酮、总多糖、多酚类、游离氨基酸、芦丁、槲皮素含量均上升，这一结果为今后开发具有抗氧化性发酵桑叶茶产品提供了一定的理论依据和指导。但是，本研究仅以辽宁阜新地区白桑树叶为原料进行研究，未考虑其他因素对其抗氧化活性影响，因此，后续需要进行更多关于不同地区和不同品种桑叶抗氧化活性差异性研究。
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图 1 发酵时间、发酵温度以及接种量对发酵桑叶茶的影响
Figure 1. Effect of fermentation time, fermentation temperature and inoculation amount on fermented mulberry leaf tea
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图 2 发酵桑叶茶响应面优化3D曲面
Figure 2. Optimized 3D response surface for fermented mulberry leaf tea
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图 3 维生素C和桑叶产品对羟自由基的清除作用
Figure 3. Scavenging effect of vitamin C and mulberry leaf products on hydroxyl radicals
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图 4 维生素C和桑叶产品对DPPH自由基的清除作用
Figure 4. Scavenging effect of vitamin C and mulberry leaf products on DPPH radicals
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图 5 维生素C和桑叶产品对超氧自由基的清除作用
Figure 5. Scavenging effect of vitamin C and mulberry leaf products on superoxide radicals
表 1 试验因素水平
Table 1 Experimental factors and levels
因素 水平 −1 0 1 A发酵时间（d） 5 7 9 B发酵温度（℃） 30 32 34 C接种量（%） 10 15 20 
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表 2 感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards
指标 评分标准 得分 叶底黄褐、明亮，叶质较柔软，紧捏成团 9~15 叶底（15分） 叶底黄绿欠匀，叶质较硬，手捏少许碎断 5~8 叶底暗绿，叶质硬实，紧捏易碎 1~4 澄清、透亮、光泽度较好、色泽诱人 28~30 澄清、透亮、具有产品应有色泽 24~27 汤色（30分） 澄清、无夹杂物、色泽诱人 20~23 微浑、无光泽、色泽一般 15~19 浑浊、无光泽、色泽差 <15 茶香浓郁，呈现出特有的菌香、甜香和混合香，
回甘悠长、丰满9~15 香气（15分） 香味略平淡，同时略带青草气 5~8 茶香体现不明显且带严重青草气和豆腥味 1~4 风味协调、口感醇正、独特茶香 38~40 茶体饱满、茶香柔和、酸涩适中 34~37 不酸、不涩、回甘且纯正 30~33 滋味（40分） 偏酸、微涩、带苦味、欠浓郁 25~29 很酸、很涩、很苦、口感平淡、有青草异味 <25
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表 3 Box-Behnken试验方案与结果
Table 3 Scheme and results of Box-Behnken test
试验号 A发酵时间 B发酵温度 C接种量 Y感官评分（分） 1 0 0 0 87 2 −1 0 −1 69 3 1 −1 0 78 4 0 0 0 89 5 1 0 −1 78 6 1 1 0 85 7 1 0 1 84 8 0 −1 −1 74 9 −1 0 1 80 10 −1 1 0 78 11 0 −1 1 82 12 0 0 0 88 13 0 1 1 85 14 0 0 0 86 15 −1 −1 0 80 16 0 1 −1 76 17 0 0 0 89
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表 4 响应面试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance of response surface test results
方差来源 平方和 自由度 均方差 F P 显著性 模型 505.08 9 56.12 26.54 0.0001 显著 A发酵时间 40.50 1 40.50 19.16 0.0032 ** B发酵温度 12.50 1 12.50 5.91 0.0453 * C接种量 144.50 1 144.50 68.34 <0.0001 ** AB 20.25 1 20.25 9.58 0.0174 * AC 6.25 1 6.25 2.96 0.1292 BC 0.2500 1 0.2500 0.1182 0.7410 A2 86.21 1 86.21 40.78 0.0004 ** B2 38.53 1 38.53 18.22 0.0037 ** C2 128.53 1 128.53 60.79 0.0001 ** 残差 14.80 7 2.11 失拟项 8.00 3 2.67 1.57 0.3287 不显著 纯误差 6.80 4 1.70 总离差 519.88 16 注：F表示F检验所得值，P表示置信度；**表示差异极显著（P<0.01），*表示差异显著（P<0.05）。
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表 5 生物活性物质含量
Table 5 Bioactive substances content
有效成分 总黄酮
（mg/g）总多糖
（mg/g）多酚
（mg/g）游离氨基酸
（mg/g）芦丁
（mg/g）槲皮素
（mg/g）1-脱氧野尻霉素
（mg/g）水浸出物
（%）茶褐素
（%）新鲜桑叶 13.84±0.26a 21.56±0.37a 2.08±0.28a 13.40±0.14a 0.50±0.22a 0.010±0.001a 2.10±0.31a 46.56±1.97a 0 桑叶绿茶 12.86±0.18a 22.34±0.21b 2.07±0.31a 15.90±0.09ab 0.53±0.30a 0.031±0.004b 2.62±0.42b 46.94±2.04a 0 发酵桑叶茶 14.71±0.21b 25.17±0.30c 2.13±0.22b 16.45±0.26ab 0.96±0.25b 0.037±0.002b 2.19±0.36a 47.30±1.89b 7.55±0.37 注：同列肩标小写字母不同表示组间差异显著（P<0.05）。
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