Isolation and Identification of Pediococcus lactis in Human Intestinal Tract and Its Performance Analysis of Fermented Goji Berry Juice
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摘要: 为获取定植能力强和枸杞汁发酵性能优良的候选菌株，从人肠道中分离筛选出3株乳酸菌。通过形态、生理生化、16S rDNA序列分析及系统发育树构建进行鉴定，并对其耐酸、耐胆盐、耐人工胃液、肠液及其发酵性能进行研究，研究其定植能力和发酵性能。结果表明，经鉴定3株均为乳酸片球菌（Pediococcus lactis），分别编号为NXU_220218、NXU_220219和NXU_220220。其中NXU_220218在2~8 h生长速度较快，产酸能力较强，对酸、胆盐、人工胃液的耐受能力均优于NXU_220219和NXU_220220，在pH为2时的存活率约为67%，在浓度为0.3%的牛胆盐中的存活率约为65%，对人工胃液的耐受能力为72%，人工肠液的耐受能力达到95%。将菌株NXU_220218接种于枸杞汁中发酵，经测定发现发酵枸杞汁中的还原糖含量显著降低，自由基清除率显著提高，表明其对枸杞汁具有良好的发酵性能，可作为乳酸菌的候选菌株应用于枸杞汁的发酵。Abstract: In order to obtain candidate strains with strong colonization ability and excellent fermentation performance of goji berry juice, 3 strains of lactic acid bacteria were isolated and screened from human intestinal tract. They were identified by morphological, physiological and biochemical, 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree construction, and their acid resistance, bile salt resistance, artificial gastric fluid, intestinal fluid resistance and fermentation performance were studied. The results showed that all three strains were identified as Pediococcus lactis, numbered NXU_220218, NXU_220219 and NXU_220220, respectively. The growth rate from 2 to 8 h, the ability of NXU 220218 to produce acid was stronger, and the tolerance to acid, bile salt and artificial gastric juice was better than NXU 220219 and NXU 220220. The survival rate of NXU_220218 was 67% at pH2, 65% in bovine bile salt at 0.3% concentration, 72% tolerance to artificial gastric juice, and 95% tolerance to artificial intestinal juice. Finally, the NXU_220218 strain was inoculated and used in the preparation of fermented goji berry juice. It was found that the reducing sugar content and the free radical scavenging rate in the fermented goji berry juice were significantly reduced and increased, respectively, compared with the unfermented goji berry juice, indicating that the NXU_220218 strain had good fermentation performance for goji berry juice and could be used as a candidate strain of lactic acid bacteria for the fermentation of goji berry juice.
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Keywords:
- intestinal /
- Pediococcus lactis /
- isolation /
- identification /
- goji berry juice /
- fermentation properties /
- tolerability
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枸杞中含有多种活性成分。其中枸杞多糖是最丰富的活性成分，具有丰富的药理活性和保健活性[1]，如降血糖、抗氧化、增强免疫力等作用[2−3]。枸杞中的有效成分可以改善肠道微生物群的组成和丰度[4]，而枸杞对肠道微生物组、微生物代谢产物及其相互作用的影响的研究仍然非常有限[5]。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类对宿主有益的活性微生物，进入并定植在胃肠道后，能够与宿主共生，从而构成一个复杂的微生态环境[6]。乳酸菌不仅可以调节人体代谢平衡，还是发酵产品中的主要微生物[7]，其在发酸过程中，不仅可以改善食品本身带有的气味及产品特性，还可以提高产品营养价值[8−10]。此外，乳酸菌在发酵过程中，产生大量的蛋白酶及各种微量的脂肪酶，可将食品中的大分子物质蛋白质和脂肪降解为更易被人体吸收的小分子氨基酸及脂肪酸等。其自身不仅可以合成维生素B1、B2、B3、B5等，还可以产生某些游离氨基酸或氨基酸衍生物，抑制丙烯疏胺的合成[11−12]。乳酸菌在食品行业应用广泛，常被用来发酵酸奶及其他乳制品、蔬菜以及肉制品等[13]。由于枸杞自身并没有突出的香味，并且药味浓重，使用商业乳酸菌发酵剂发酵的枸杞汁风味和口感不佳，影响了乳酸菌发酵枸杞汁饮品的生产和市场开发[14]。因此，开发新的发酵剂来改善枸杞汁的药味浓重和口感不佳具有重要意义，而从人肠道筛选一株安全、有益且发酵性能优良的乳酸菌的相关研究较少。
本研究从人肠道分离筛选乳酸菌，通过形态观察、分子生物学方法对其进行鉴定，并对其耐酸、耐胆盐及发酵性能进行测定，筛选性能优良的乳酸菌，最后将其应用到发酵枸杞汁中。对发酵前后的枸杞汁中多糖、还原糖及抗氧化能力进行对比分析，以期改善发酵枸杞汁的品质和风味，为发酵枸杞汁的工业化生产和新发酵剂的制备提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
枸杞 宁夏中宁枸杞产业创新研究院提供（采收时间：2021年6月）；细菌基因组DNA提取试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；6%苯酚、浓硫酸、3,5-二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）、0.2 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、30 mmol/L吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）、338 μmol/L 还原型辅酶Ⅰ（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、72 μmol/L 氯化硝基四氮唑蓝（Nitrotetrazolium blue chloride，NBT） 国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖 北京擎科生物科技有限公司；牛胆盐、HCl 特正商贸有限公司；MRS培养基 青岛高科技工业园海生物技术有限公司。
BXM-30R压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；LRH-250生化培养箱 广东省医疗器械厂；BIO-RAD凝胶成像系统 美国 BIO-RAD 公司；BIO-RAD CFX96梯度PCR仪 美国 BIO-RAD 公司；FR980恒温培养箱 上海复日科技有限公司；SpectraMax iD3多功能酶标仪 美谷分子仪器上海有限公司；S210 pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株分离筛选
招募3位无消化系统疾病的志愿者，并且最近3个月没有接受抗生素治疗。制备10%（w/v）人类粪便悬液：称取2 g新鲜人类粪便，在超净台中加入10 mL无菌PBS旋涡1~5 min，使粪便充分打散，释放肠道微生物。500 r/min离心5 min，使粪便中的渣滓沉降至管底，取上清至Ep管中，再加入PBS涡旋离心，使粪便中的渣滓沉降至管底，取上清至50 mL无菌Ep管中，得到人粪便菌悬液[15]。
将人粪便菌悬液用无菌PBS稀释至10−6、10−7、10−8，分别涂布于MRS固体平板。37 ℃培养24~36 h后，在平板中选取形态、颜色、大小不同的单菌落，进行液体培养基培养，随后在固体培养基上划线培养，以提高菌株的纯度[16]。
1.2.2 革兰氏染色
将菌种进行划线培养，挑单菌液体培养后进行革兰氏染色，菌液涂片固定。滴加结晶紫后，染色1 min，水洗。滴加碘液后染色1 min，水洗。用95%的酒精脱色约30 s，水洗，吸去水分。滴加番红后，染色1 min，水洗。吸干或在空气中凉干后，油镜镜检[17]。
1.2.3 菌株鉴定
初步鉴定：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[18]有关细菌形态和生理生化特性等对分离出的菌株进行鉴定。
采用16s rDNA基因进行分子生物学鉴定，以乳酸片球菌NXU-220218、NXU-220219、NXU-220220菌株的基因组为模板进行PCR扩增，正反向引物为8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系为（20 μL）：模板DNA 2 μL，KOD酶（5 U/μL）0.4 μL，10×KOD buffer 2 μL，2 mmol/L d NTPs 2 μL，引物（F+R）1.2 μL。MgSO4 1.2 μL，dd H2O 11.2 μL，PCR扩增参数设置为：94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸。得到的PCR扩增产物进行1.5%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳。确认聚合酶反应扩增片段，若PCR扩增产物在1800 bp左右，则可送测序，将16s rDNA序列于NCBI进行BLAST同源序列检索[19−20]，比较筛出菌株与已知菌株的系统发育关系和系统地位，如果同源性大于99%，则确认为同一类细菌，借助Mega X软件建立系统发育树[21−22]。
1.2.4 乳酸菌生长曲线
取2%乳酸菌悬液接种于MRS液体培养基中37 ℃培养，从0 h开始，每隔2 h取样一次，用分光光度法（波长600 nm）测吸光度值（OD）。以空白培养基作为对照，一种菌液每次取样做三次重复。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作生长曲线[23]。
1.2.5 乳酸菌产酸能力
取2%乳酸菌菌悬液接种于MRS液体培养基中37 ℃培养，从0 h开始，每2 h取样一次，测定其pH。以空白培养基作为对照，一种菌液每次取样做三次重复。以时间为横坐标，pH为纵坐标，制作产酸曲线[24]。
1.2.6 乳酸菌耐酸能力
用盐酸将MRS液体培养基pH调至2.0，121 ℃灭菌15 min，冷却备用。按合适的接种量将菌悬液接种到pH为2.0的MRS液体培养基中，37 ℃培养4 h，每种乳酸菌做三个重复，采用平板菌落计数法测定各个乳酸菌的活菌数。与未经过酸化的培养基培养的菌株作对比，计算乳酸菌的相对生长比率[25]，即存活率。
相对生长比率(%)=N2N1×100 式中：N1为酸耐受前的活菌数，CFU/mL；N2为酸耐受4 h的活菌数，CFU/mL。
1.2.7 乳酸菌耐胆盐能力
取一定的牛胆盐于MRS液体培养基中，使其质量分数分别为0%（空白）、0.3%、0.5%和0.7%，调节pH至6.5±0.2，121 ℃灭菌15 min，冷却备用。按合适的接种量将菌悬液分别接种至不同浓度牛胆盐的MRS培养基中，37 ℃培养24~36 h后观察不同浓度胆盐培养液中菌株的生长情况，测定其波长为600 nm时OD值，计算乳酸菌在胆盐中的存活能力[26]。
乳酸菌耐胆盐存活率(%)=N1N0×100 式中：N0为未加牛胆盐的OD值，测定波长为600 nm；N1为添加不同浓度牛胆盐的OD值，测定波长为600 nm。
1.2.8 乳酸菌对人工胃液和人工肠液耐受性实验
人工胃液的配制：NaCl 0.20%、胃蛋白酶0.30%，HCl调pH至2.5，用孔径0.20 μm微孔滤膜过滤除菌，制得人工胃液备用[27]。
人工肠液制备：胰腺液：胰蛋白酶0.10%，调pH至8.0，过滤除菌备用。胆液：胆盐1.80%，调pH至8.0，过滤除菌备用。将胰腺液和胆液以2:1混合即为人工肠液[28]。
按体积分数1%的接种量接种到pH为2.5的人工胃液中混匀，37 ℃、100 r/min摇床中培养，分别于0、1、2、3 h后取样，在600 nm波长处测定其透光率，并进行乳酸菌活菌计数。
存活率(%)=人工胃液处理3h后活菌数(CFU/mL)人工胃液中初始菌数(CFU/mL)×100 按体积分数1%的接种量接种到人工肠液，混匀，37 ℃、100 r/min摇床培养，分别于0、1、2、3、4 h后取样，在600 nm波长处测定其透光率，并进行乳酸菌活菌计数。
存活率(%)=人工肠液处理4h后活菌数(CFU/mL)人工肠液中初始菌数(CFU/mL)×100 1.2.9 乳酸菌发酵枸杞汁的制备
将枸杞和水以1:10的比例混合浸泡5~6 h，加入0.15%（w/v）的果胶酶进行打浆，然后进行过滤除籽，并用柠檬酸将枸杞汁的pH调至4.5左右，混匀后进行65 ℃，30 min水浴巴氏杀菌。冷却至室温后将培养好的乳酸菌菌悬液按5%的接种量接入枸杞汁中，轻轻摇晃，放入37 ℃培养箱中培养48 h。对发酵前后的枸杞汁进行多糖、还原糖含量测定、抗氧化性实验。
1.2.10 枸杞汁中含糖量的测定
1.2.10.1 枸杞汁中多糖含量的测定
使用苯酚−硫酸法测多糖含量[29−30]。取待测样品或不同浓度标准品0.3 mL，在冰水浴中加入0.2 mL 6%苯酚溶液；振荡摇匀后迅速加入1 mL浓硫酸，加入后迅速在冰上转动试管，加速热量释放，以不放热或微量放热为宜。混匀后沸水浴20 min，冷却至室温。酶标仪进行测定。每孔加样加入150 µL测定液，在490 nm测定各孔吸光度。
1.2.10.2 枸杞汁中还原糖含量的测定
使用DNS法测定还原糖[31]，取待测样品或不同浓度标准品0.4 mL，加入0.8 mL DNS试剂，混匀后沸水浴5 min，冷却至室温。酶标仪进行测定。每孔加样加入150 µL测定液，在最大吸收波长处（540 nm）测定各孔吸光度。
1.2.11 枸杞汁抗氧化能力的测定
1.2.11.1 DPPH自由基清除能力测定
参考Bai等[32]报道方法略有修改，在试管中先加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，再加入枸杞样品溶液2 mL，混匀后于37 ℃，避光反应30 min，517 nm处测定吸光度，计算DPPH自由基的清除率。
DPPH自由基清除率(%)=(1−AsAc)×100 式中，Ac：2 mL PBS+2 mL DPPH甲醇溶液的吸光值；As：2 mL样品溶液+2 mL DPPH甲醇溶液的吸光值。
1.2.11.2 超氧阴离子自由基清除活性测定
参考马妮等[33]的方法，向96孔板中依次加入50 μL 338 μmol/L NADH溶液和50 μL 30 mmol/L PMS溶液，充分混匀后加入50 μL 72 μmol/L NBT溶液，混匀后加入50 μL不同发酵时间枸杞样品，混匀后室温反应15 min，在560 nm处测定吸光度，记为As，用相同体积的PBS溶液代替样品溶液，测定其吸光值，记为Ac。
超氧阴离子自由基清除率(%)=(1−AsAc)×100 式中，Ac：对照组吸光度；As：样品组吸光度。
1.2.12 感官评分标准
为进行发酵枸杞汁的感官评价，由12名均具有食品感官研究背景的老师和学生组成感官评定小组，对发酵枸杞汁的色泽、口感、香气、组织状态等进行1~10分评定，评分标准如表1所示。
表 1 感官评分标准Table 1. Sensory scoring criteria项目 评分标准 分数 色泽 鲜红色 6~10 深红色，略无光泽 1~5 口感 酸甜适中，黏稠性适中 6~10 滋味协调性好，有一定的黏稠性 1~5 香气 枸杞香味足，无异味 6~10 枸杞香味较小，无异味 1~5 组织状态 质地均匀，稳定性较好，无分层 6~10 稳定性较好，略有分层 1~5 1.3 数据处理
实验重复三次以上，实验结果以平均值±标准差表示，采用MEGA-X软件构建系统发育树；Excel 2020进行数据统计分析；用Graph Pad Prism 8.0.1软件对实验数据作图。
2. 结果与分析
2.1 人肠道乳酸菌的分离和鉴定
2.1.1 菌株形态
从MRS平板上获得3株单菌。图1A是三株单菌的单菌落图，可以看出菌落均呈乳白色、菌落较小、圆形、表面湿润且光滑，边缘整齐，用接种环容易挑起，为片球菌属。本研究还通过革兰氏染色分析了细菌形态，如图1B所示，这三种菌株均为革兰氏阳性细菌，其细胞壁厚，革兰氏染色后均为紫色，与李慧芬等[34]的研究结果一致，在显微镜下均为球状或杆状，成对、成链或聚团状排列，无芽孢。
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图 1 乳酸菌菌落形态和革兰氏染色分析注：A为乳酸片球菌形态学，B为乳酸片球菌革兰氏染色结果。Figure 1. Lactic acid bacteria colony morphology and Gram stain analysis2.1.2 分子生物学鉴定
提取菌株的基因组DNA，利用特异性引物扩增16s rDNA。如图2所示，对所提取的菌株基因组DNA进行扩增，在1600 bp附近观察到了目的产物，条带整齐，表明PCR产物可用于测序分析。
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图 2 16s rDNA扩增产物电泳图注：M为2000 DNA Maker，1为乳酸片球菌菌株NXU_220218，2为乳酸片球菌菌株NXU_220219，3为乳酸片球菌菌株NXU_220220。Figure 2. 16s rDNA amplification product electrophoresis通过16s rDNA第一代基因测序，经NCBI数据库进行比对，经鉴定三株菌株均为乳酸片球菌，分别命名为NXU_220218、NXU_220219、NXU_220220。根据系统进化树结果可知（图3），菌株NXU_220218与Pediococcus acidilactici SRCM103367同源性最高，NXU_220219与NXU_220220同Pediococcus acidilactici SRCM102732同源性最高，相似度均达到99%以上。结合其形态学确定三株菌均为乳酸片球菌种（Pediococcus lactis）。
2.2 3株乳酸片球菌的生长能力
接着比较了三株细菌的生长特征。由图4可知，三株乳酸片球菌在2~8 h间处于对数生长期，30 h后进入稳定期。此外，NXU_220218的生长能力最好，三株细菌平稳期时在波长为600 nm时测定的OD值均在1.0左右，由此可知，乳酸片球菌可以在MRS液体培养基中生长的很好，并且存活率较高，而NXU_220219和NXU_220220生长速度无显著性差异，其48 h内生长趋势与陈亚男等[35]研究结果相似。
2.3 3株乳酸片球菌的产酸能力分析
如图5所示，0~2 h菌株处于生长适应期，产酸较少，代谢缓慢，在对数期产酸较多，菌株代谢加快，pH下降迅速。三株细菌在24 h后产酸基本进入稳定期，其中，NXU_220218产酸速度较其余两株菌较快，但三株细菌产酸能力并无显著性差异。
2.4 3株乳酸片球菌的耐酸、耐胆盐性能分析
耐酸耐胆盐为探究乳酸菌耐受性的重要指标。通常耐酸耐胆盐能力越好，细菌定植于人体肠道的能力就越强。从图6A可以看出，于pH为2的酸性培养基培养4 h后，三株菌对酸均有一定的耐受能力。其中，NXU_220218菌株的存活率较高于其余两株细菌，其存活率达到了67%，表现出对酸较强的耐受性。
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图 6 乳酸菌菌株耐酸、耐胆盐能力检测注：A为菌株NXU_220218、NXU_220219、NXU_220220在pH为2条件下的活菌存活率；B为菌株NXU_220218、NXU_220219、NXU_220220在浓度为0.3%、0.5%、0.7%的胆盐中的活菌存活率；不同小写字母表示菌株之间差异显著（P<0.05）；图7同。Figure 6. Lactic acid bacteria strain acid resistance and bile salt resistance test从图6B中可以看出，在浓度为0.3%的牛胆盐液体培养基中，所有菌株的存活率均较高，三株细菌中NXU_220218的存活率较高，达到了65%，其余两株菌存活率达到了50%。在浓度为0.5%的牛胆盐液体培养基中，所有菌株的存活率明显降低，但均在40%以上，在此浓度下NXU_220218的存活率较高，达到了53%，其余两株菌存活率达到了45%。在浓度为0.7%的牛胆盐液体培养基中，三株菌株的存活率进一步降低，三株细菌中NXU_220218的存活率相对较高，其存活率达到了43%，而其余两株菌存活率达到了32%。
2.5 3株乳酸片球菌的对人工胃液和肠液的耐受能力分析
益生菌经口服进入机体后，先后接触胃肠道的内环境。肠道中细菌的生长受pH、消化液、营养成分等多种因素的影响。小肠中pH约为7.6，一般食物在小肠中停留时间为3~18 h。因此，微生物若要定植肠道发挥作用，需耐受小肠中的胰蛋白酶及碱性环境。本研究人工肠液pH为8.0，通过菌落计数检测菌株对人工肠液的耐受性，结果如图7所示。由图7A可以看出，三株乳酸片球菌在人工胃液中均具有一定的耐受力，存活率均在60%以上，其中NXU_220218的耐受能力最强。由图7B可以看出，三株乳酸菌在人工肠液中存活率均较高，达到了85%。三株细菌之间并无显著性差异，说明乳酸片球菌可能具有更强的肠道定植能力。
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图 7 乳酸片球菌对人工胃液、肠液耐受能力分析注：A为乳酸片球菌对人工胃液耐受能力，B为乳酸片球菌对人工肠液耐受能力。Figure 7. Analysis of the tolerance of Pasciococcus lactis to artificial gastric juice and intestinal fluid2.6 乳酸片球菌NXU_220218对枸杞汁的发酵性能研究
枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞活性成分中的一种水溶性多糖，具有促进免疫、抗氧化、降血糖血脂等作用[36]，然而作为一种高分子聚合物，大多数植物多糖口服后不能被人体细胞直接降解利用，而是通过肠道微生物分解代谢发挥作用，微生物将多糖降解为还原性低聚糖和单糖，故本研究通过测定枸杞中多糖和还原糖含量来评价菌种的发酵能力。
由图8A可以看出，三株细菌均能利用枸杞多糖进行发酵，与空白组相比，菌株发酵后，枸杞多糖含量显著降低。0~6 h，菌株利用枸杞多糖的含量达到最大，说明此时菌株利用多糖的能力最强，6~48 h，随着发酵时间的延长，多糖的含量逐渐降低，最终趋于平稳，说明此时菌株利用多糖的能力达到最大，证明多糖含量降低与菌株息息相关，菌株利用枸杞多糖进行发酵，其研究结果与王艳萍等[37]研究结果一致。但是，三株乳酸片球菌利用多糖的能力无显著差异，此外，本研究还检测了发酵液中还原糖含量的动态变化。图8B显示，菌株接种至枸杞汁中使其还原糖含量显著下降，枸杞汁中的还原糖浓度在前12 h快速下降；说明此时菌株分解代谢多糖后利用了还原糖，故还原糖也由刚开始的最高含量逐渐降低，12~48 h，随着发酵时间的延长，还原糖的含量逐渐降低，最终趋于平稳，说明此时菌株利用还原糖的能力达到最大，其研究结果与王艳萍等[37]研究结果一致。而三株菌中NXU_220218利用还原糖的速率较强于其余两株细菌。
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图 8 枸杞汁乳酸菌发酵液中多糖、还原糖浓度的动态监测Figure 8. Dynamic monitoring of total sugar and reducing sugar concentration in fermentation broth of lactic acid bacteriain goji berry juice2.7 乳酸片球菌NXU_220218发酵枸杞汁的DPPH自由基及超氧阴离子自由基清除率分析
为了更好地验证乳酸菌发酵枸杞汁后酚类物质的抗氧化能力，故检测了乳酸菌发酵对枸杞汁DPPH和超氧阴离子自由基清除能力的影响。如图9A所示，与空白组相比，三株细菌均对发酵枸杞汁的DPPH自由基清除能力有一定的影响，0~12 h，随着发酵时间的增加，发酵液的DPPH自由基清除率逐渐升高，在12 h时，NXU_220218发酵的枸杞汁中的酚类物质对DPPH自由基的清除率达到最大，为57%，此结果与黄宁馨等[38]研究结果相似。NXU_220218和NXU_220219的DPPH自由基清除率较强，12 h后，NXU_220218和NXU_220219的DPPH自由基清除率没有显著变化。但是NXU_220220呈现不同的变化趋势，其DPPH自由基清除率在12~36 h仍然维持上升趋势，36~48 h，DPPH自由基清除率不再改变，说明枸杞发酵液可以有效清除DPPH自由基，稳定后三株菌发酵的枸杞汁DPPH自由基清除能力不变，可能是三株菌属于同一菌种，故代谢产物差异较小。
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图 9 乳酸菌发酵枸杞汁的DPPH自由基及超氧阴离子自由基清除率分析注：A为发酵枸杞汁对DPPH自由基的清除作用，B为发酵枸杞汁对超氧阴离子自由基的清除作用。Figure 9. Analysis of DPPH radical and superoxide anion radical scavenging rate of lactic acid bacteria fermented goji berry juice图9B所示，与空白组相比，三株细菌对发酵枸杞汁对超氧阴离子自由基的清除能力有一定影响，说明枸杞成分可以有效清除超氧离子自由基，0~12 h，随着发酵时间的增加，发酵液的超氧阴离子自由基清除率逐渐升高，这可能是乳酸菌发酵过程中的酶（如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等）将高分子质量的酚类化合物转化为游离酚类物质，以及高分子质量的多糖降解而暴露出更多的活性基团。在12 h时，NXU_220218发酵的枸杞汁中的酚类物质对超氧阴离子自由基的清除率最大达42%，这与张金兰等[39]研究结果类似；12 h后，三组样品的超氧阴离子自由基清除率不再受发酵时间影响，且无显著性差异，可能是三株菌同属同一菌种，其代谢物间差异较小。
2.8 3种乳酸片球菌发酵枸杞汁感官评价
在评价指导员的指导下筛选出12位接受过“食品感官评定”课程并参与训练的评价员进行感官品评。由图10可知，不同菌株发酵对枸杞汁的感官品质影响不同。菌株NXU_220218发酵枸杞汁的色泽、口感、香气、组织状态强于其余两株菌，其中色泽、香气、组织状态达到8分；NXU_220219的色泽强于NXU_220220，而未发酵的枸杞汁与发酵的枸杞汁相比，经过菌株发酵的枸杞汁其色泽、口感、香气、组织状态均强于未发酵的枸杞汁，说明经过菌株发酵，产生了乙醇，且酮类物质含量与种类的增加，赋予了枸杞香味。
3. 结论
本研究通过从人肠道中分离出发酵性能优良的乳酸菌，通过形态和16s rDNA分子生物学方法对菌株进行鉴定。共筛选得到三株乳酸菌分别为乳酸片球菌NXU_220218、乳酸片球菌NXU_220219、乳酸片球菌NXU_220220。根据生长能力、产酸能力及耐酸、耐胆盐、耐人工胃液肠液能力相关实验结果分析，其中NXU_220218生长速度最快，产酸能力最强，在酸性条件下存活率达到67%，在0.3%的牛胆盐中存活率达到65%，在人工胃液中其存活率达到了72%，而在人工肠液中其存活率达到了95%，且能够使枸杞汁中的还原糖含量显著性降低，能显著提高枸杞汁对DPPH和超氧阴离子自由基的清除率。结果表明，NXU_220218在人体内的定植能力较强，发酵性能良好。说明通过发酵作用肠道微生物可以代谢枸杞中的多糖，体外抗氧化实验结果表明发酵后的枸杞汁抗氧化活性总体显著增高，说明肠道菌发酵枸杞汁过程生成有抗氧化性的产物，综上，来源于人肠道的乳酸片球菌NXU_220218可发酵利用枸杞多糖，可为解释多糖的潜在作用机制和多糖的更好利用提供合理参考，但详细的机制还需要进一步研究，同时本研究也为从人肠道分离筛选出其他新型发酵剂提供了理论支撑，为开发富含活菌和多种活性成分的枸杞发酵产品工业化生产提供了参考依据。
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图 1 乳酸菌菌落形态和革兰氏染色分析
注：A为乳酸片球菌形态学，B为乳酸片球菌革兰氏染色结果。
Figure 1. Lactic acid bacteria colony morphology and Gram stain analysis
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图 2 16s rDNA扩增产物电泳图
注：M为2000 DNA Maker，1为乳酸片球菌菌株NXU_220218，2为乳酸片球菌菌株NXU_220219，3为乳酸片球菌菌株NXU_220220。
Figure 2. 16s rDNA amplification product electrophoresis
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图 6 乳酸菌菌株耐酸、耐胆盐能力检测
注：A为菌株NXU_220218、NXU_220219、NXU_220220在pH为2条件下的活菌存活率；B为菌株NXU_220218、NXU_220219、NXU_220220在浓度为0.3%、0.5%、0.7%的胆盐中的活菌存活率；不同小写字母表示菌株之间差异显著（P<0.05）；图7同。
Figure 6. Lactic acid bacteria strain acid resistance and bile salt resistance test
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图 7 乳酸片球菌对人工胃液、肠液耐受能力分析
注：A为乳酸片球菌对人工胃液耐受能力，B为乳酸片球菌对人工肠液耐受能力。
Figure 7. Analysis of the tolerance of Pasciococcus lactis to artificial gastric juice and intestinal fluid
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图 8 枸杞汁乳酸菌发酵液中多糖、还原糖浓度的动态监测
Figure 8. Dynamic monitoring of total sugar and reducing sugar concentration in fermentation broth of lactic acid bacteriain goji berry juice
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图 9 乳酸菌发酵枸杞汁的DPPH自由基及超氧阴离子自由基清除率分析
注：A为发酵枸杞汁对DPPH自由基的清除作用，B为发酵枸杞汁对超氧阴离子自由基的清除作用。
Figure 9. Analysis of DPPH radical and superoxide anion radical scavenging rate of lactic acid bacteria fermented goji berry juice
表 1 感官评分标准
Table 1 Sensory scoring criteria
项目 评分标准 分数 色泽 鲜红色 6~10 深红色，略无光泽 1~5 口感 酸甜适中，黏稠性适中 6~10 滋味协调性好，有一定的黏稠性 1~5 香气 枸杞香味足，无异味 6~10 枸杞香味较小，无异味 1~5 组织状态 质地均匀，稳定性较好，无分层 6~10 稳定性较好，略有分层 1~5 
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