Optimization of Extraction Process and Structure Characterization of Coffee Melanoidins
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摘要: 本研究以云南小粒咖啡为研究对象，优化咖啡类黑精提取工艺，利用100、50、30 kDa的滤膜分级，基于分子形貌、光谱学特性表征不同分子量段的咖啡类黑精结构。结果表明：咖啡类黑精最佳提取工艺为：料液比1:16（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间60 min。凝胶渗透色谱结果表明咖啡类黑精在溶液中呈现紧密球形结构，分子量大小主要为4.56×104和2.94×104 Da，占比分别为72.5%和27.5%。X-射线衍射表明咖啡类黑精内部结晶性很弱，属无定形结构。微观形貌特征分析表明未经分级处理的咖啡类黑精呈表面粗糙且存在孔隙的不规则团聚球形，分级处理后聚合结构消失，呈不规则片状和长条状。黑褐色程度及基础成分含量随分子量的减小而降低。紫外可见光谱研究表明不同分子量组分在285和320 nm处呈现出弱吸收峰。傅里叶红外光谱显示可能存在羧基、羟基、氨基及甲基等基团。三维荧光谱图中荧光峰位在λex=400 nm，λem=480~490 nm，表明咖啡类黑精有芳香环、杂环，存在刚性结构。通过对咖啡类黑精进行优化提取、分级及结构表征，为进一步研究云南小粒咖啡类黑精的形成、转化及基本结构提供一定的数据支撑。Abstract: In this study, Yunnan arabica coffee beans were selected as the research object, and the extraction process of coffee melanoidins were optimized. Filter membrane fractionation of 100, 50 and 30 kDa were used to characterize the structure of coffee melanoidins of different molecular weight segments based on molecular morphology and spectroscopy characteristics. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: Solid-liquid ratio 1:16 (g/mL), extraction temperature 80 ℃, extraction time 60 min. The results of gel permeation chromatography showed that the coffee melanoidins tight spherical structure in the solution, and the molecular weight were mainly 4.56×104 and 2.94×104 Da, accounting for 72.5% and 27.5%. X-ray diffraction showed that the coffee melanoidins were amorphous and had weak crystallization. The analysis of micromorphological characteristics showed that the coffee melanoidins without fractionation treatment were irregularly agglomerated spherical with rough surface and pores. After fractionation treatment, the polymerization structure disappeared and showed irregular flake and long strip shape. The degree of black-brown and the content of basic components decreased with the decrease of molecular weight. The UV-Vis spectra showed that different molecular weight components had weak absorption peaks at 285 and 320 nm. Fourier infrared spectroscopy showed that there might be carboxyl, hydroxyl, amino and methyl groups. The 3D-EEMs had λex=400 nm, λem=480~490 nm, indicated that coffee melanoidins concentrate had aromatic ring, heterocycle and rigid structure. Through the optimization of extraction, fractionation and structure characterization of coffee melanoidins, it would provide certain data support for further research on the formation, transformation and basic structure of Yunnan arabica coffee melanoidins.
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咖啡是茜草科（Rubiaceae Juss.）咖啡属（Coffea）植物的种子，按其大小分为小粒、中粒、大粒咖啡，作为世界三大饮料之一，咖啡产量、消费度均居热带经济作物之首[1]。云南省咖啡种植面积占全国98%以上[2]，云南小粒种咖啡浓而不苦，略带果酸风味，深受消费者喜爱，其植物化学和生物学特性逐渐使人们认识到咖啡是一种潜在的功能性食品[3]。
咖啡类黑精是咖啡豆烘焙过程中，咖啡豆中的羰基和氨基化合物发生美拉德反应所形成的一类结构复杂、聚合度不等的棕褐色、大分子聚合物的混合体[4]。提取工艺的差异会不同程度地影响咖啡类黑精的得率、分子量分布、结构特征和生物活性功能。目前国内外分离提取咖啡类黑精的方法大致有溶剂萃取法、醇沉、大孔树脂吸附、酶解法等[5]。Borrelli等[6]用90 ℃的热水按料液比1:6（w/w）提取咖啡液，并用二氯甲烷萃取脱脂后冻干，咖啡液提取率为17%。刘亚玲等[7]用水浸提-有机溶剂沉淀联用法分析云南不同地区烘焙咖啡豆中的类黑精组成成分。由于咖啡类黑精结构复杂，Bekedam等[8]在研究咖啡类黑精分子结构时，采用美拉德反应中间体的结构性能模型系统，将咖啡类黑精分为低分子质量（<3 kDa）和高分子质量（>12 kDa）类黑精，发现低分子质量类黑精中含有咖啡因、绿原酸和一些含氮小分子物质，高分子质量类黑精中含有阿拉伯半乳聚糖、酚基、蛋白质等物质。咖啡类黑精作为咖啡中还原糖和蛋白质/氨基酸残基美拉德反应的产物，具有功能性糖分子和蛋白质的生理功能，可以清除机体自由基、抗氧化、减肥、抗菌、降血糖和改善肠道微环境[9-11]。
目前，国内外关于对咖啡的研究集中在咖啡因、绿原酸、葫芦巴碱等生物活性物质，以及发酵方式、烘焙条件、萃取方式对云南小粒咖啡感官、品质的影响[12-14]。针对云南小粒咖啡类黑精化合物的组成、性质、分子量分布和光谱学特性尚不明确，精确的分子结构亟待阐明。本实验通过优化提取云南小粒咖啡类黑精工艺及制备不同分子质量产物（>100、50~100、30~50、<30 kDa），通过凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography，GPC）、扫描电镜（SEM）、X-射线衍射（XRD）、紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和三维荧光光谱（3D-EEMs）共同表征咖啡类黑精的主要分子结构特征。为进一步研究云南小粒咖啡类黑精的形成、转化及基本结构提供一定的数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
咖啡豆 2021年产季云南普洱卡蒂姆咖啡生豆，购自昆明捷思贸易有限公司；无水乙醇 广东光华科技股份有限公司；牛血清蛋白 广州赛国生物科技有限公司；葡聚糖分子量标准品T-500 索莱宝科技有限公司；没食子酸 西亚化学科技有限公司；溴化钾 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯，用水均为超纯水。
SANTOKER R500E烘焙机 北京三豆客科技有限公司；FD-IA-50冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；HS 153卤素水分测定仪 瑞士Mettler-Toledo；CM5分光色差计 日本柯尼卡美能达；Synergy H1全波长荧光酶标仪 美国Biotek；凝胶渗透色谱仪（Optilab T-rEX示差检测器、DAWN HELEOS Ⅱ激光光散射检测器） Wyatt technology；UV-1800紫外分光光度仪 翱艺仪器有限公司；F97Pro荧光分光光度计 深圳三利有限公司；VERTEX70傅里叶红外光谱仪 德国Bruker；Flex SEM1000扫描电镜 江苏金海创科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 烘焙咖啡豆的制备
采用SANTOKER R500E烘焙机对咖啡生豆进行烘焙。气源是液化石油气，火力100，风门4，转速为60 r/min。每种烘焙度咖啡生豆质量约700 g，入豆时炉内温度180 ℃，1 min 30 s时使炉内温度降至100 ℃，之后持续升温至235 ℃。在10 min 30 s（200 ℃，一爆开始，咖啡呈肉桂色）结束烘焙为浅度烘焙豆、14 min 27 s（213 ℃，二爆开始，咖啡呈浓茶色）结束烘焙为中度烘焙豆、18 min 5 s（235 ℃，二爆密集，咖啡豆外观呈深棕色，表面有一层油脂）结束烘焙为深度烘焙豆。
1.2.2 类黑精原料豆的筛选
参考杨庆丽等[15]提取类黑精的方法，将烘焙得到的浅、中、深度烘焙咖啡豆用粉碎机打粉，过50目标准筛，采用水提醇沉法进行类黑精提取并计算其得率。咖啡类黑精得率计算公式如下：
1.2.3 咖啡类黑精提取工艺
1.2.3.1 单因素实验
根据类黑精溶于水而不溶解于乙醇等有机溶剂的特点，并结合Wang等[16]的提取方法，分别探究料液比、提取温度、提取时间对咖啡类黑精得率的影响。
a.料液比对咖啡类黑精得率的影响：准确称取5.00 g样品15份，按料液比1:4、1:8、1:12、1:16、1:20（g/mL）分别加入超纯水，置于80 ℃水浴锅中水浴60 min，过滤，重复浸提3次，合并滤液。滤液减压浓缩（50 ℃，0.08 MPa）至同体积，然后用二氯甲烷萃取脱脂（3~5次），于40 ℃水浴锅中去除二氯甲烷后，以提取液：无水乙醇（3:7，v/v）醇沉12 h，离心（4000 r/min，15 min）收集沉淀，冷冻干燥，称重计算其得率。
b.提取温度对咖啡类黑精得率的影响：准确称取5.00 g样品15份，按料液比1:12（g/mL）加入超纯水，分别于50、60、70、80、90、100 ℃温度下浸提60 min，过滤，重复浸提3次，合并滤液。滤液减压浓缩至同体积，然后用二氯甲烷萃取脱脂，去除二氯甲烷，以提取液：无水乙醇（3:7，v/v）醇沉12 h，离心收集沉淀，冷冻干燥，称重计算其得率。
c.提取时间对咖啡类黑精得率的影响：准确称取5.00 g样品15份，按料液比1:12（g/mL）加入超纯水，置于80 ℃水浴锅中，分别浸提15、30、45、60、75、90 min，过滤，重复浸提3次，合并滤液。滤液减压浓缩至同体积，然后用二氯甲烷萃取脱脂，去除二氯甲烷，以提取液：无水乙醇（3:7，v/v）醇沉12 h，离心收集沉淀，冷冻干燥，称重计算其得率。
1.2.3.2 正交试验
为进一步确定最佳工艺条件，在单因素实验基础上，选取料液比、提取温度、提取时间对咖啡类黑精得率影响较显著的因素，分别记为A、B、C。每项因素各设置3个水平，进行L9（34）正交试验，以类黑精得率为指标，如表1所示。
表 1 正交试验因素水平设计Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment水平 因素 A料液比（g/mL） B提取温度（℃） C提取时间（min） 1 1:8 70 60 2 1:12 80 75 3 1:16 90 90 1.2.4 咖啡类黑精分子量分布及成分分析
1.2.4.1 咖啡类黑精分子量大小及分布测定
利用凝胶渗透色谱法[17]，确定类黑精分子量大小及分布情况后进行膜分离。将样品溶解在0.1 mol/L NaNO3水溶液终浓度为1 mg/mL，并通过孔径为0.45 μm的过滤器过滤。根据化合物的性质，采用合适分子量范围的凝胶排阻色谱柱（Ohpak SB-805 HQ（300×8 mm）、Ohpak SB-804 HQ（300×8 mm）、Ohpak SB-803 HQ（300×8 mm）），柱温45 ℃，进样量为100 μL，流动相A（0.1 mol/L NaNO3），流速为0.4 mL/min，洗脱梯度：等度100 min。
1.2.4.2 咖啡类黑精膜分离
根据GPC测定结果，将咖啡类黑精配制成2 g/L的溶液，抽滤，依次用相对分子量截留值为100、50、30 kDa的滤膜分级得到截留液和滤出液，将各组分冷冻干燥，称重，计算各组分所占比例。
1.2.4.3 咖啡类黑精理化成分测定
水分含量的测定采用METTLER TOLEDO HS153型快速水分测定仪；色差测定采用CM5分光色差计测定；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[18]；多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[19]；还原糖含量测定采用DNS法[20]；总多酚含量测定福林酚比色法[21]；总黄酮含量测定采用硝酸铝法[22]。
1.2.5 咖啡类黑精结构表征
1.2.5.1 微观形貌特征分析（SEM）
将0.10 g样品固定到金属样品台上，在3.00 kV的加速电压下观察样品的颗粒形貌，选取50倍和150倍的电镜扫描图用于分析。
1.2.5.2 X-射线衍射（XRD）分析
采用Cu（Kα）为射线源；管电压40 kV，管电流40 mA；扫描范围2θ=10°~80°，步长为0.013°，扫描速率4.845°/min，进行X-射线衍射分析[23]。
1.2.5.3 紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）分析
将不同分子量组分配制成浓度为0.5 mg/mL的溶液，进行光谱扫描，扫描波长范围：200~900 nm。
1.2.5.4 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析
采用溴化钾（KBr）压片法[24]，不同分子量样品按1%的比例与KBr混合均匀，研磨，压片后置于傅里叶红外光谱分析仪测试，扫描波数范围为4000~400 cm−1，分辨率为4 cm−1，扫描64次后取平均值得到样品的红外光谱图。
1.2.5.5 三维荧光光谱（3D-EEMs）分析
将不同分子量组分用超纯水配制成浓度为0.5 mg/mL，按以下设定的参数进行扫描。3D-EEMs参数设置[25]：发射波长（Emission wavelength，λem）=200~900 nm，激发波长（Excitation wavelength，λex）=200~900 nm，每隔10 nm激发扫描一次，扫描速度为3×104 nm/min，激发带宽、发射带宽为10 nm，光电倍增管增益（Photomultiplier tube，PMT）=850 V，响应时间自动匹配。
1.3 数据处理
应用SPSS 19.0软件进行数据处理，结果以平均值±标准差（±SD）表示。采用独立样本t检验比较组间的差异性，P<0.05为差异具有统计学意义。统计图采用Origin 2019b、GraphPad Prism 8制作。
2. 结果与分析
2.1 类黑精原料豆的筛选
咖啡豆烘焙曲线（图1A），在相同烘焙温度程序条件下，可制备得到不同烘焙度咖啡豆，在10 min 30 s结束烘焙为浅度烘焙豆、14 min 27 s结束烘焙为中度烘焙豆、18 min 5 s结束烘焙为深度烘焙豆。根据烘焙曲线制备咖啡豆，可以使不同时间、不同批次烘培的咖啡豆保持一致性，以提供不断复制相同咖啡豆为参照。从图1B可以看出，随着烘焙度的增加，咖啡类黑精得率显著增加（P<0.05），类黑精得率分别为浅度（7.21%±0.34%）、中度（9.39%±0.49%）、深度（10.76%±0.67%），故采用深度烘焙咖啡豆作为实验对象。
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图 1 不同烘焙度咖啡豆烘焙曲线及类黑精得率注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；图2同。Figure 1. Roast curve and yield rate of coffee melanoidins of coffee beans with different roast degree2.2 咖啡类黑精的提取工艺优化
2.2.1 料液比、提取温度、提取时间对咖啡类黑精得率的影响
由图2A可知，随料液比的增加，咖啡类黑精得率呈先上升后下降的趋势。当料液比为1:12（g/mL）时类黑精得率显著增加（P<0.05），得率为9.37%±0.49%，之后逐渐降低。原因可能是在一定范围内增加溶剂影响固、液相主体之间的浓度差，有助于提高溶剂扩散率和传质速率，但溶剂量过大会导致浸出的类黑精对未浸出产物有一定抑制作用或出现饱和现象[26]。故选择最佳的料液比为1:12（g/mL）。
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图 2 不同提取条件对咖啡类黑精得率的影响Figure 2. Effects of different extraction conditions on the yield rate of coffee melanoidins由图2B可知，随提取温度的增加，咖啡类黑精得率呈先上升后下降的趋势。当提取温度达到80 ℃时，类黑精的提取得率显著增加（P<0.05），得率为10.39%±0.20%。其原因可能是温度升高加大了分子间的相互作用、溶解度及扩散速率，当温度升至90 ℃时，类黑精的原有结构遭到破坏，导致其分解、转换或挥发散失[27]。故选择最佳的提取温度为80 ℃。
由图2C可知，随提取时间延长，咖啡类黑精得率呈先增后降的趋势。提取时间为60、75 min类黑精的得率分别为8.86%±0.37%、9.34%±0.31%，差异不显著（P>0.05），而当提取时间增至90 min时，得率显著降低（P<0.05）。原因可能是随时间的延长，类黑精浓度趋向饱和状态，或使其他非类黑精聚合物溶出[28]。故选取最佳提取时间为75 min。
2.2.2 正交试验结果
由表2可知，RB>RA>RC，各因素对类黑精提取影响的大小次序为：提取温度>料液比>提取时间。最佳提取工艺水平组合为A3B2C1，即料液比1:16（g/mL），提取温度为80 ℃，提取时间为60 min。在此条件进行3次重复性验证实验，测得咖啡类黑精得率为：10.80%±0.10%，此结果高于正交试验中任意组合，说明正交试验结果可靠，提取工艺可行。
表 2 正交试验结果Table 2. Results of orthogonal experiments实验号 因素 得率（%） A料液比 B提取温度 C提取时间 1 1 1 1 8.22±0.21 2 1 2 3 9.59±0.20 3 1 3 2 8.78±0.42 4 2 1 2 8.42±0.33 5 2 2 1 10.15±0.23 6 2 3 3 9.52±0.39 7 3 1 3 8.89±0.13 8 3 2 2 10.61±0.51 9 3 3 1 10.23±0.26 K1 8.86 8.51 9.53 K2 9.36 10.12 9.27 K3 9.91 9.51 9.33 R 1.05 1.61 0.26 较优组合 A3 B2 C1 因素主次 B > A > C 由表3中F值可知，在3个因素中，提取温度（B）对咖啡类黑精得率影响最大，其次为料液比（A），提取时间（C）对咖啡类黑精得率影响最小，这与表2中极差结果相一致。
表 3 正交设计方差分析Table 3. Variance analysis of the orthogonal experiments因素 离差平方和（SS） 自由度（df） 均方 F P A 1.644 2 0.822 31.528 * B 3.949 2 1.975 75.724 * C 0.113 2 0.057 2.173 误差 0.052 2 注：*表示在P<0.05水平下显著相关。 2.3 咖啡类黑精分子量分级及成分分析
2.3.1 咖啡类黑精分子量大小及分布情况
分子量是表征聚合物结构和性质的基础数据之一，由于类黑精组成的复杂性和易变性，所用测定方法不尽相同，使得即使是同一来源的类黑精分子量的测定值也不一致。凝胶渗透色谱根据分子筛的原理进行分离，利用示差检测器测定样品浓度，结合Astra V软件分析，结果见图3A和表4。咖啡类黑精分子出峰时间为56~71和71~76 min，其分子量基本在2.94×104 Da以上，主要分布在4.56×104和2.94×104 Da两个区域，分布比例为72.5%和27.5%。由lg（R.M.S. Radius）和lg（Molar Mass）之比得到的斜率大小即构象指数可显示咖啡类黑精分子在溶液中的形态，结果见分子构型图（图3B）。通常情况下，斜率=1表示分子为棒状，斜率=0.5~0.6表示无规则线团，斜率=1/3表示球形[29]。测定结果斜率为0.02±0.00远小于1/3，则表明咖啡类黑精分子在溶液中呈紧密的球形构象。
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图 3 咖啡类黑精凝胶渗透色谱图注：A：绝对分子量分析图；B：分子构型图。Figure 3. Gel permeation chromatogram of coffee melanoidins表 4 咖啡类黑精分子量大小及分布情况Table 4. Molecular weight and molecular weight distribution results of coffee melanoidins咖啡类黑精 组分A（Da） 组分B（Da） Mn 4.56×104（±2.80%） 2.94×104（±4.60%） Mw 5.89×104（±2.70%） 3.12×104（±4.60%） Mw/Mn 1.291 1.063 占比（%） 72.5 27.5 2.3.2 咖啡类黑精膜分离情况
不同分子量分级截留产物占比由大到小依次为：大于100 kDa>50~100 kDa>30~50 kDa>小于30 kDa，见表5。其中，>100 kDa组分占比最高（56.51%），即高分子量组分咖啡类黑精含量最丰富。类黑精黑褐色的程度随分子量的减小而降低，如图4所示。低分子量组分的颜色最浅，为淡黄色及微弱绿色，高分子量组分的颜色最深，这可能是因为咖啡豆在烘焙过程中随着美拉德反应的进行，还原糖和氨基化合物作为反应底物，逐渐参与类黑精的形成，并进一步与多糖骨架结合形成了较高分子量的黑褐色类黑精[30]。
表 5 咖啡类黑精分级组分质量和所占比例Table 5. Quality and proportion of components in coffee melanoidins fraction组分 >100 kDa 50~100 kDa 30~50 kDa <30 kDa 质量（g） 3.39±0.12 1.07±0.04 0.95±0.06 0.46±0.03 占比（%） 56.51±2.07 17.81±0.74 15.75±0.97 7.63±0.52 2.3.3 咖啡类黑精基础成分分析
由表6可知，固体色差结果显示不同分子量组分色泽度存在显著差异（P<0.05），且与图4相符，随分子量的增加而逐渐增加，即随着聚合度的增加，咖啡类黑精黑褐度也随之提高。可以推测美拉德反应中的显色物质主要来自高分子量的类黑精[31]。不同分子量组分水分含量、蛋白质、还原糖、多酚、黄酮含量存在显著差异（P<0.05），均呈现出随分子量的降低而降低的趋势，主要集中在高分子量组分（>100 kDa）中，且黄酮含量较高为17.20%±0.54%。多糖组分在粗提物中含量为22.37%±1.33%，经分级后，主要集中在30~50 kDa和50~100 kDa这2个分子量段。综上所述，经分级处理，能显著改变不同分子量组分的组成成分含量（P<0.05），且咖啡类黑精是以糖类、蛋白质、酚类物质共存的混合物。
表 6 不同分子量组分基础成分Table 6. Basic components of different molecular weight fractions指标 未分级 >100 kDa 50~100 kDa 30~50 kDa <30 kDa L* 58.61±0.25a 27.97±0.42e 41.53±0.69c 45.39±0.38b 39.65±0.43d a* 6.25±0.03b 5.07±0.06d 8.16±0.05a 8.11±0.12a 5.25±0.06c b* 17.64±0.06b 8.74±0.11e 16.66±0.15c 21.61±0.17a 15.64±0.18d 水分（%） 7.22±0.38d 14.58±0.69a 10.79±0.37b 5.88±0.10e 8.57±0.08c 蛋白质（%） 8.91±0.44b 12.24±0.46a 3.18±0.23c 2.85±0.14d 1.04±0.10e 还原糖（%） 4.89±0.12b 6.99±0.33a 4.02±0.18c 3.92±0.07c 2.53±0.10d 多糖（%） 22.37±1.33a 15.34±2.45c 19.84±1.25b 19.29±1.01b 12.31±0.76d 多酚（%） 11.10±0.37b 12.25±0.45a 10.59±0.84c 9.21±0.24d 7.62±0.12e 黄酮（%） 12.75±0.18b 17.20±0.54a 10.36±0.63c 7.13±0.35d 4.36±0.30e 注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05），具有统计学意义。 2.4 咖啡类黑精的结构表征
2.4.1 咖啡类黑精的微观形貌特征分析
如图5所示，未经分级处理的咖啡类黑精呈不规则的团聚球状结构，表面粗糙，且存在孔隙，这可能是由于类黑精的糖羟基会以非共价键连接并形成分子内或分子间氢键，分子之间彼此缠结、聚集[32]。经分级后，团聚球状结构消失。>100 kDa组分呈现出不规则片状及长条状，且观察到片状存在两个面，粗糙面和平滑面。原因可能是分级处理使咖啡类黑精分子间作用力、范德华力发生改变，使聚合物表观改变[33]。50~100 kDa组分呈现出更细小的平滑片状且表面附着一些尖刺状。30~50 kDa组分存在两个面，主要观察到的是粗糙面，且观察到大量孔洞存在。出现孔洞的原因可能是通过分级处理后，聚合物之间连接的化学健发生断裂[34]。<30 kDa组分片状更细碎，以各种形状存在。表明分级处理能将类黑精按分子量大小不同而分成不同组分，改变咖啡类黑精的物质组成及表观结构。
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图 5 不同分子量的咖啡类黑精组分微观形貌Figure 5. Micromorphology of different molecular weight coffee melanoidins fractions2.4.2 咖啡类黑精的X-射线衍射（XRD）分析
利用X-射线衍射技术考察咖啡类黑精的结晶形态和结晶度。结果如图6所示，咖啡类黑精衍射图谱出现弥散衍射特征，不同分子量组分分别在21.22°（>100 kDa）、20.55°（50~100 kDa）、23.16°（30~50 kDa）、22.52°（<30 kDa）附近有弥散的宽峰，表明咖啡类黑精以非结晶态存在，内部结晶性很弱，属于无定形结构。
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图 6 不同分子量组分的X-射线衍射图谱Figure 6. X-ray diffraction patterns of different molecular weight fractions2.4.3 咖啡类黑精的紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）分析
如图7所示，不同分子量组分能观察到1个或者2个弱紫外吸收峰，分别在285和320 nm附近处。在285 nm处的最大吸收可以解释为蛋白质、咖啡因的存在；320 nm处可以解释为绿原酸和咖啡酸的存在[35]。Hofmann[36]研究发现，在260~360 nm范围内是类黑精的典型特征吸收光谱。也有研究表明，在280、320、420 nm处的吸光值分别代表美拉德反应3个不同阶段的褐变程度[37-39]，其中大分子组分（>100 kDa）出现1个弱吸收峰，其余分子量组分出现2个弱吸收峰，推测这种现象可能是因为咖啡豆在烘焙过程中发生美拉德反应生成了许多中间体有色物质，增大了发色团结合程度，导致色素沉着效应，最大吸收波长相互叠加，使得类黑精的特征吸收峰发生偏移或者消失[40]。
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图 7 不同分子量咖啡类黑精的紫外光谱Figure 7. Wavelength spectra of coffee melanoidins with different molecular weight2.4.4 咖啡类黑精的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析
图8显示出不同分子量咖啡类黑精的官能团信息。在特征频率区：3410 cm−1附近显示了一个宽且强烈的谱带，这是O-H基团及分子间氢键的典型拉伸振动。2926 cm−1处的弱峰是糖类物质烷基上的C-H伸缩振动引起[41]。1601、1404 cm−1附近的吸收带分别归于酰胺II带（1655~1590 cm−1）和酰胺III带（1420~1400 cm−1）。酰胺II带和酰胺III带的吸收峰响应值较高，这可能是因为糖类与蛋白质相互交联、聚合使得类黑精的骨架结构发生了变化。1264 cm−1附近的吸收峰归属于羧酸的C-O伸缩振动[42]。在糖类的指纹区（1200~850 cm−1）存在一系列重叠的特征吸收峰，1147、1073 cm−1的吸收峰归属于葡萄糖环的拉伸振动、C-O-C糖苷键伸缩振动[43]，且在878 cm−1左右存在吸收峰，表明可能存在β构型的多糖，故推测咖啡类黑精组分中的多糖为β-糖苷键连接的吡喃糖[44]。在812、615 cm−1附近出现了其他特征吸收带。
综上所述，咖啡类黑精中含有蛋白质、肽、氨基酸等氨基化合物和糖类、羰基化合物等反应底物以及美拉德反应的相关中间体化合物如：还原酮、醛类及挥发性杂环化合物等，且存在显著的酰胺带和糖类特征吸收带，这表明Maillard反应使类黑精骨架发生了结构上的部分改变。
2.4.5 咖啡类黑精的三维荧光光谱（3D-EEMs）分析
在等高线荧光光谱图（图9）上能找到不同激发-发射波长对应的荧光强度和荧光峰的位置分布。类黑精水溶液荧光强度随分子量的增加而减弱。低分子量（<30 kDa）组分的荧光强度最大，其荧光值为10000，高分子量（>100 kDa）类黑精组分的荧光强度最小，其荧光值低至1444。其原因可能是分级处理使酚类、氨基类化合物解聚生成具有刚性结构的小分子物质，从而使荧光强度增强，而高分子量组分颜色较深存在荧光猝灭现象[45]。不同分子量类黑精水溶液在λex=250~600 nm，λem=320~700 nm范围内出现荧光峰。均在λex=400 nm，λem=480~490 nm处有1个明显的荧光峰位。根据代表性化合物的荧光特征[46]，推测咖啡类黑精中含有羧基、羰基、芳香基、烷烃等基团。
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9 不同分子量组分等高线荧光光谱图9. Contour fluorescence spectra of different molecular weight fractions3. 结论
在料液比1:16（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间60 min条件下，制备的咖啡类黑精含量达10.80%。咖啡类黑精结构复杂，从形貌上看咖啡类黑精为紧密的球形结构，内部结晶性很弱，属于无定形结构。未分级的咖啡类黑精呈表面粗糙有孔隙的不规则团聚球形，经分级处理后，团聚球形结构消失，呈现出不规则片状和长条状。因此，推测咖啡类黑精依靠分子内和分子间力相互作用堆积在一起，呈现球状不稳定聚集，当受到外界影响则发生分离解构。
咖啡类黑精分子量大小主要为4.56×104 Da和2.94×104 Da，占比分别为72.5%和27.5%；利用100、50、30 kDa的滤膜逐级分级后，含量占比随分子量的减小而减小，黑褐色程度也随之减弱，且不同分子量组分之间物质含量存在显著差异（P<0.05），>100 kDa组分最高，高于未分级组分，最低的是<30 kDa组分。说明其主体成分以>100 kDa的物质为主，复杂且颜色较深。目前，关于不同分子量对咖啡类黑精颜色的影响的研究很少。本研究结果可为咖啡中类黑精相关的褐变机制提供参考。
光谱学研究表明咖啡类黑精糖骨架的存在，且与蛋白质、咖啡因、绿原酸等物质相结合，存在芳香环、杂环，具有刚性结构，且可能含有羰基化合物和氨基化合物，如糖类、蛋白质以及美拉德反应的中间体Amadori化合物（C=O）和吡嗪（C-N）等，结构中存在显著的酰胺带和糖类特征吸收带，表明其类黑精骨架因Maillard反应发生了结构上的部分改变。这些结果与前人对类黑精结构组成的研究相一致[47-48]，咖啡类黑精由多苯环的黑褐色色素、多糖残基、蛋白残基组成，主要的功能性基团为羧基、羟基、氨基以及甲基等基团。通过凝胶渗透色谱、扫描电镜、X-射线衍射、紫外-可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱和三维荧光光谱等分析方法对咖啡类黑精的结构进行了表征。与单一方法相比，这些方法的联合使用使得类黑精结构具有更可靠的论证。但由于咖啡类黑精组成结构的复杂性，对天然复杂大分子物质的研究手段有所欠缺，为明确咖啡类黑精的生物可及性和生物利用度及其咖啡类黑精在咖啡生豆烘焙过程中的转化形成尚需进一步探索。
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图 1 不同烘焙度咖啡豆烘焙曲线及类黑精得率
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；图2同。
Figure 1. Roast curve and yield rate of coffee melanoidins of coffee beans with different roast degree
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图 2 不同提取条件对咖啡类黑精得率的影响
Figure 2. Effects of different extraction conditions on the yield rate of coffee melanoidins
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图 3 咖啡类黑精凝胶渗透色谱图
注：A：绝对分子量分析图；B：分子构型图。
Figure 3. Gel permeation chromatogram of coffee melanoidins
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图 5 不同分子量的咖啡类黑精组分微观形貌
Figure 5. Micromorphology of different molecular weight coffee melanoidins fractions
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图 6 不同分子量组分的X-射线衍射图谱
Figure 6. X-ray diffraction patterns of different molecular weight fractions
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图 7 不同分子量咖啡类黑精的紫外光谱
Figure 7. Wavelength spectra of coffee melanoidins with different molecular weight
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9 不同分子量组分等高线荧光光谱图
9. Contour fluorescence spectra of different molecular weight fractions
表 1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平 因素 A料液比（g/mL） B提取温度（℃） C提取时间（min） 1 1:8 70 60 2 1:12 80 75 3 1:16 90 90 
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表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiments
实验号 因素 得率（%） A料液比 B提取温度 C提取时间 1 1 1 1 8.22±0.21 2 1 2 3 9.59±0.20 3 1 3 2 8.78±0.42 4 2 1 2 8.42±0.33 5 2 2 1 10.15±0.23 6 2 3 3 9.52±0.39 7 3 1 3 8.89±0.13 8 3 2 2 10.61±0.51 9 3 3 1 10.23±0.26 K1 8.86 8.51 9.53 K2 9.36 10.12 9.27 K3 9.91 9.51 9.33 R 1.05 1.61 0.26 较优组合 A3 B2 C1 因素主次 B > A > C
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表 3 正交设计方差分析
Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiments
因素 离差平方和（SS） 自由度（df） 均方 F P A 1.644 2 0.822 31.528 * B 3.949 2 1.975 75.724 * C 0.113 2 0.057 2.173 误差 0.052 2 注：*表示在P<0.05水平下显著相关。
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表 4 咖啡类黑精分子量大小及分布情况
Table 4 Molecular weight and molecular weight distribution results of coffee melanoidins
咖啡类黑精 组分A（Da） 组分B（Da） Mn 4.56×104（±2.80%） 2.94×104（±4.60%） Mw 5.89×104（±2.70%） 3.12×104（±4.60%） Mw/Mn 1.291 1.063 占比（%） 72.5 27.5
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表 5 咖啡类黑精分级组分质量和所占比例
Table 5 Quality and proportion of components in coffee melanoidins fraction
组分 >100 kDa 50~100 kDa 30~50 kDa <30 kDa 质量（g） 3.39±0.12 1.07±0.04 0.95±0.06 0.46±0.03 占比（%） 56.51±2.07 17.81±0.74 15.75±0.97 7.63±0.52
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表 6 不同分子量组分基础成分
Table 6 Basic components of different molecular weight fractions
指标 未分级 >100 kDa 50~100 kDa 30~50 kDa <30 kDa L* 58.61±0.25a 27.97±0.42e 41.53±0.69c 45.39±0.38b 39.65±0.43d a* 6.25±0.03b 5.07±0.06d 8.16±0.05a 8.11±0.12a 5.25±0.06c b* 17.64±0.06b 8.74±0.11e 16.66±0.15c 21.61±0.17a 15.64±0.18d 水分（%） 7.22±0.38d 14.58±0.69a 10.79±0.37b 5.88±0.10e 8.57±0.08c 蛋白质（%） 8.91±0.44b 12.24±0.46a 3.18±0.23c 2.85±0.14d 1.04±0.10e 还原糖（%） 4.89±0.12b 6.99±0.33a 4.02±0.18c 3.92±0.07c 2.53±0.10d 多糖（%） 22.37±1.33a 15.34±2.45c 19.84±1.25b 19.29±1.01b 12.31±0.76d 多酚（%） 11.10±0.37b 12.25±0.45a 10.59±0.84c 9.21±0.24d 7.62±0.12e 黄酮（%） 12.75±0.18b 17.20±0.54a 10.36±0.63c 7.13±0.35d 4.36±0.30e 注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05），具有统计学意义。
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