Preparation and Antioxidant Activity Evaluation of Jerusalem Artichoke Polysaccharide-Zn Complex
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摘要: 本文以菊芋多糖和硫酸锌为原料制备菊芋多糖锌，在单因素实验的基础上结合响应面法优化菊芋多糖锌的制备工艺，并考察了多糖和多糖锌的体外抗氧化活性。结果表明，菊芋多糖锌最优制备工艺为：菊芋多糖与硫酸锌质量比为32:1、反应时间60 min、反应温度50 ℃、反应pH8.50，此条件下螯合率为87.06%±0.28%。体外抗氧化活性结果表明，在0.3~2.7 mg/mL浓度范围内，菊芋多糖和菊芋多糖锌复合物均具有较好的体外抗氧化性能，菊芋多糖锌对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基的最大清除能力分别为23.42%、13.47%、29.36%和18.50%。该研究结果可为菊芋多糖锌功能食品和营养补充剂的开发提供理论基础。Abstract: Jerusalem artichoke polysaccharide (JAP)-Zn complex was prepared using JAP and ZnSO4 as raw materials, and single factor and response surface methodology methods were applied for the optimization preparation process of JAP-Zn complex. Besides, the antioxidant activities in vitro of JAP and JAP-Zn complex were investigated. The optimal preparation process of the JAP-Zn complex was as follows: The weight ratio of JAP and ZnSO4 was 32:1, the reaction time was 60 min, the reaction temperature was 50 °C, and the reaction pH was 8.50. Under these conditions, the chelation rate was 87.06%±0.28%. The results of antioxidant activity in vitro showed that both JAP and JAP-Zn complex exhibited excellent antioxidant activity in the concentration range of 0.3~2.7 mg/mL. The maximum scavenging capacity of JAP-Zn complex on the maximum scavenging rates of DPPH free radical, hydroxyl free radical and superoxide anion free radical, ABTS+ free radical was 23.42%, 13.47%, 29.36% and 18.50%, respectively. The results would provide a theoretical basis for the development of functional foods and nutritional supplements for JAP and JAP-Zn complex.
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Keywords:
- Jerusalem artichoke /
- polysaccharide /
- zinc /
- process optimization /
- antioxidant activity
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菊芋又称洋姜、姜不辣，为菊科向日葵属多年生草本植物，具有耐寒、耐旱、耐贫瘠、抗病虫害等优势，可在未经开发的荒漠、滩涂和盐碱地广泛种植[1]。同时，菊芋是一种极具开发潜力的野生资源，有通便、消肿、降血糖、降血脂等多种功效[2-4]。菊芋的多种生物活性归因于其富含多糖、脂肪酸、萜类、酚酸类等多种成分，其中多糖含量最为丰富，约占其鲜重的14%~19%[4]。菊芋多糖主要由D-呋喃果糖经β（2→1）糖苷键连接而成[5]，具有调节血糖血脂[6-9]、增强免疫力[10]、抗菌[11]、促进体内矿物元素吸收[12-13]等功能。近年来，由于多糖安全、高生物相容性和成本低的特点被广泛应用于口服功能成分、营养元素或者益生菌的纳米载体[14-15]。也有一些研究证明，经过化学修饰后的多糖有更好的生物活性，例如硒多糖、铬多糖、锌多糖以及铁多糖等[16-20]。
锌是生物体所必需的微量元素之一，是体内多种酶合成的重要组成部分[21-22]。缺锌容易出现机体免疫低下、生长缓慢、贫血、营养不良、佝偻病、生殖能力减弱等症状[23-24]。传统补锌剂多为无机锌，生物利用率低，对胃肠道刺激较大[25]。多糖中含有多个羟基基团，可与锌离子以配位键结合形成多糖锌或者通过包埋形式靶向递送锌离子到达肠道[26-28]。与无机锌相比，多糖锌生物利用率提高，胃肠道刺激减小，能更高效、更安全地被人体吸收利用[29-31]。目前已合成的多糖锌主要有生姜皮多糖锌[32]、南瓜皮多糖锌[33]、罗耳阿太菌多糖锌[34]、孔石莼多糖锌[35]、金针菇多糖锌[36]等，有关菊芋多糖锌的制备及其抗氧化活性的研究尚未见报道。
本研究以菊芋多糖与硫酸锌为原料制备菊芋多糖锌，采用单因素和响应面试验优化菊芋多糖锌的制备工艺，并研究其体外抗氧化活性，为新型补锌剂的开发提供理论参考和依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
菊芋干切片 河北石家庄晋州；硫酸锌、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 均为分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；盐酸（优级纯）、氢氧化钠（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；浓硝酸 优级纯，苏州晶瑞化学股份有限公司；锌标准储备液（1000 μg/mL） 国家检验认证有限公司；1,1-2二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 化学纯，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；硫酸亚铁 化学纯，博山化学试剂厂；水杨酸 分析纯，上海源叶生物科技有限公司；ABTS 上海麦克林科技有限公司；过硫酸钾 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚 北京索莱宝科技有限公司；透析袋（500、2000 Da） 怡康科贸生物试剂耗材实验有限公司。
7800型电感耦合等离子体质谱仪（inductively coupled plasma mass spectrometer，ICP-MS） 美国安捷伦；Avanti J-15R型冷冻高效台式离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；SECURA224-ICN型电子天平 赛多利斯仪器（北京）有限公司；S210型pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；DKZ-2B型水浴恒温振荡器 上海一恒科技仪器有限公司；FD-304冷冻干燥机 济南骏德仪器有限公司；全波长酶标仪 广州伯齐生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菊芋多糖锌的制备
参考Li等[37]方法提取菊芋多糖，并通过Sevage法脱除蛋白和卢晓明[38]方法脱除果胶成分，经浓缩、透析、醇沉后获得菊芋多糖。参照黄靖等[39]研究，采用硫酸锌法制备菊芋多糖锌。将菊芋多糖和硫酸锌分别溶于水，将两种溶液等体积混匀，设计不同的反应质量比、反应时间、反应温度和反应pH后于恒温水浴振荡器中进行反应，反应结束后加入4倍体积无水乙醇，醇沉，10000 r/min离心10 min，取沉淀复溶，用截留分子量为500 Da的透析袋透析72 h，真空冷冻干燥得菊芋多糖锌。
1.2.2 多糖含量测定
1.2.2.1 标准曲线的绘制
分别取0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用超纯水补齐至2 mL，然后分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液，震荡摇匀，立即加入5 mL浓硫酸，放入沸水加热15 min，取出冷却至室温，在490 nm处测其吸光度。以标准品浓度（X）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程：Y=0.0757X+0.0495，R2=0.9992。
1.2.2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[40]。将菊芋多糖配制为0.1 mg/mL的多糖溶液。取0.5 mL样品于试管中，加入1.5 mL超纯水，1.0 mL 5%苯酚溶液，5 mL浓硫酸，立即摇匀，放入沸水加热15 min，取出冷却至室温，在490 nm处测其吸光度。将测得的吸光度带入标准曲线，计算菊芋多糖含量。
1.2.3 螯合率的测定
1.2.3.1 锌标曲的绘制
取1 mL锌标准溶液（1 mg/mL）用2%硝酸定容至100 mL容量瓶中制备10 mg/L的锌标准中间液。分别移取1、2、4、6、8、10 mL锌标准中间液用2%硝酸定容至100 mL，制备0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的锌标准系列溶液。以ICP-MS测定待测元素和内标元素的信号为响应值，得到标准曲线方程：Y=0.9801X+0.0142，R2=0.9998，式中：Y为比率；X为锌离子浓度，μg/L。
1.2.3.2 螯合率的计算
参照李文文等[32]的方法计算螯合率，精确移取一定体积制备完全的多糖锌混合液，然后加入4倍体积的无水乙醇，醇沉，离心，吸取上清液用2%硝酸稀释，用ICP-MS测定锌离子的螯合率。螯合率计算公式如下：
螯合率(%)=H1−H2H1×100 式中：H1表示混合液中锌离子的初始浓度，μg/mL；H2表示上清液中锌离子的浓度，μg/mL。
1.2.4 单因素实验
分别选取多糖与硫酸锌质量比、反应时间、反应温度、反应pH四个因素进行单因素实验，以螯合率为考察指标，考察以上四个因素对螯合率的影响。
1.2.4.1 多糖与硫酸锌质量比对螯合率的影响
取0.2 g/L的硫酸锌溶液，分别按多糖与硫酸锌的质量比为15:1、20:1、25:1、30:1、35:1等体积混合，调整pH为6，于60 ℃反应60 min，按照1.2.3.2方法计算多糖-锌的螯合率。
1.2.4.2 反应时间对螯合率的影响
取0.2 g/L的硫酸锌溶液，按多糖与硫酸锌的质量比为25:1等体积混合、反应温度为60 ℃，反应pH为6，分别反应30、60、90、120、150 min，按照1.2.3.2方法计算多糖-锌的螯合率。
1.2.4.3 反应温度对螯合率的影响
取0.2 g/L的硫酸锌溶液，按多糖与硫酸锌的质量比为25:1等体积混合、反应时间为60 min、反应pH为6，分别在30、40、50、60、70 ℃的条件下进行反应，按照1.2.3.2方法计算多糖-锌的螯合率。
1.2.4.4 反应pH对螯合率的影响
取0.2 g/L的硫酸锌溶液，按多糖与硫酸锌的质量比为25:1等体积混合、反应温度为60 ℃、反应时间为60 min，分别在反应pH为5、6、7、8、9的条件下进行反应，按照1.2.3.2方法计算多糖-锌的螯合率。
1.2.5 响应面试验
以单因素实验为基础，以菊芋多糖与硫酸锌的质量比、反应时间、反应温度、反应pH为自变量，以螯合率为响应值，进行响应面试验设计。采用Design-Expert 8.0.6.1统计分析软件建立Box-Behnken模型进行回归分析，来确定菊芋多糖螯合锌的最优工艺条件。响应面试验设计因素与水平见表1。
表 1 响应面试验因素水平表Table 1. Factors and Levels of response surface test水平 因素 A多糖和硫酸锌
质量比B反应时间
（min）C反应温度
（℃）D反应pH −1 25:1 30 40 7 0 30:1 60 50 8 1 35:1 90 60 9 1.2.6 体外抗氧化活性测定
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定
采用DPPH比色法测定样品的DPPH自由基清除能力[41]。分别吸取1.0 mL不同浓度（0.3、0.9、1.5、2.1、2.7 mg/mL）的多糖和多糖锌溶液与0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液等体积混合，震荡摇匀，避光静置30 min，在517 nm波长处测定各样品的吸光值。DPPH自由基清除率的计算公式如下：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中：A1为反应完样品的吸光值，A2为样品溶液自身的吸光值，A0为空白对照的吸光值。
1.2.6.2 羟基自由基清除能力测定
采用水杨酸法测定样品的羟基自由基清除能力[42]。在试管中分别加入1 mL不同浓度（0.3、0.9、1.5、2.1、2.7 mg/mL）的多糖和多糖锌溶液，并依次向试管中加入1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液和1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，摇匀静置5 min，再加入1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液启动反应，混合均匀，在37 ℃下静置30 min，在510 nm波长处测定各样品的吸光值。羟基自由基清除率的计算公式如下：
羟基自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中：A1为反应完样品的吸光值，A2为样品溶液自身的吸光值，A0为空白对照的吸光值。
1.2.6.3 超氧阴离子自由基清除能力测定
采用邻苯三酚自氧化法测定样品的超氧阴离子自由基清除能力[42]。将4.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）分别与1 mL不同浓度（0.3、0.9、1.5、2.1、2.7 mg/mL）的多糖和多糖锌溶液混匀，25 ℃静置20 min，并在该温度下加入100 μL 30 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀，反应5 min后立即加入1 mL 8 mmol/L的盐酸溶液终止反应，在320 nm波长下测各样品的吸光值。超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下：
超氧阴离子自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中：A1为反应完样品的吸光值，A2为样品溶液自身的吸光值，A0为空白对照的吸光值。
1.2.6.4 ABTS+自由基清除能力测定
按照Wootton-beard等[43]的方法测定样品对ABTS+自由基的清除能力。配制ABTS+溶液，用磷酸盐缓冲液（pH7.4）将ABTS+溶液稀释至吸光值为0.70±0.02的溶液备用。在试管中分别加入0.1 mL不同浓度（0.3、0.9、1.5、2.1、2.7 mg/mL）的多糖和多糖锌溶液与2 mL稀释好的ABTS+溶液，混匀，避光静置5 min，在734 nm波长下测定各样品的吸光值。ABTS+自由基清除率的计算公式如下：
ABTS+自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中：A1为反应完样品的吸光值，A2为样品溶液自身的吸光值，A0为空白对照的吸光值。
1.3 数据处理
试验设计3次平行，数据以平均值±标准偏差（Mean±SD）表示，差异的显著性采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）结合SPSS 25.0软件的Tukey's检验进行评估，P<0.05为有显著性差异。采用Origin 2019软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 多糖提取率及多糖含量的测定
经过热水浸提得到菊芋多糖的提取率为25.41%。根据葡萄糖标准曲线测得菊芋多糖中多糖含量为84.54%。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 菊芋多糖与硫酸锌质量比对螯合率的影响
由图1可知，菊芋多糖与硫酸锌质量比在20:1~30:1范围内，螯合率显著增加（P<0.05）；当质量比为30:1时，螯合率达到最大值为73.95%；当质量比超过30:1时，螯合率不再发生显著变化。推测原因为在一定范围内，随着多糖与硫酸锌质量比增加，多糖分子与锌离子接触并发生配位反应的机会增加，使得螯合率上升[44]。随着质量比的增加，溶液黏稠度增大，结合位点暴露减少，多糖与锌离子结合基本稳定[45]。因此，菊芋多糖与硫酸锌质量比选择为30:1。
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2.2.2 反应时间对螯合率的影响
由图2可知，当反应时间为60 min时，螯合率达到最大值为60.00%；当反应时间超过60 min时，随着反应时间的增加，螯合率缓慢下降，推测原因为随着时间的延长，体系稳定性降低，出现缓慢解离现象，导致螯合率下降[34]。因此，反应时间选择为60 min。
2.2.3 反应温度对螯合率的影响
由图3可知，反应温度在30~50 ℃范围内，螯合率显著增加（P<0.05）；在50 ℃时，螯合率达到最大值为46.59%；当反应温度高于50 ℃时，螯合率下降，推测原因为反应温度在一定范围内升高会增加菊芋多糖分子的平均动能，促进分子运动，有利于菊芋多糖分子与锌离子结合，螯合率升高。但高温易破坏菊芋多糖的结构，分子热运动过于激烈，多糖与锌离子结合速度低于解离速度，导致螯合率下降[46]。因此，反应温度选择为50 ℃。
2.2.4 反应pH对螯合率的影响
由图4可知，反应pH在5~8范围内，螯合率显著增加（P<0.05）；当pH为8时，螯合率达到最大值为80.42%。推测原因为偏酸性条件下，H+会与锌离子发生竞争关系，减少了锌离子和多糖的接触机会[47]；在过碱条件下，锌离子容易生成沉淀，使锌离子损失，导致螯合率下降[33]。因此，反应pH选择为8。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 回归方程的建立与方差分析
由Design Expert 8.0.6.1软件对实验数据进行回归分析，得到的响应面分析结果如表2所示，建立菊芋多糖与硫酸锌质量比（A）、反应时间（B）、反应温度（C）、反应pH（D）四个因素与响应值螯合率（Y）的回归方程为：Y=84.86+5.54A+2.17B−2.59C+6.73D−3.31AB+5.95AC−2.86AD+2.06BC−3.12BD+3.60CD−6.43A2−6.67B2−8.81C2−5.70D2。为验证该回归方程的有效性，对其进行方差分析。
表 2 响应面试验结果Table 2. Response surface test results实验号 A质量比 B时间（min） C温度（℃） D pH 螯合率（%） 1 30:1 60 50 8 83.65 2 35:1 60 50 9 83.36 3 30:1 60 50 8 84.00 4 35:1 60 50 7 76.70 5 30:1 30 40 8 69.82 6 30:1 60 40 7 72.17 7 25:1 60 60 8 55.93 8 30:1 60 50 8 87.94 9 25:1 60 50 7 57.65 10 35:1 60 40 8 69.25 11 25:1 90 50 8 71.78 12 30:1 90 50 7 68.82 13 25:1 60 50 9 75.75 14 30:1 30 50 9 80.25 15 35:1 60 60 8 78.21 16 30:1 90 40 8 73.65 17 35:1 30 50 8 79.25 18 25:1 30 50 8 63.12 19 30:1 60 50 8 85.48 20 35:1 90 50 8 74.67 21 30:1 90 50 9 77.02 22 30:1 30 50 7 59.57 23 30:1 60 60 7 55.88 24 30:1 60 60 9 76.62 25 30:1 30 60 8 62.23 26 30:1 90 60 8 74.30 27 30:1 60 50 8 83.23 28 30:1 60 40 9 78.52 29 25:1 60 40 8 70.78 如表3所示，对回归模型进行方差分析，该模型差异性显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），决定系数R2为0.9640，校正后决定系数R2Adj为0.9281，说明该回归方程拟合度和可信度均较高，可利用此模型对螯合率进行预测。
表 3 回归模型方差分析Table 3. Analysis of variance of regression model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 差异值 模型 2205.13 14 157.51 26.81 <0.0001 显著 A 367.75 1 367.75 62.61 <0.0001 ** B 56.33 1 56.33 9.59 0.0079 ** C 80.19 1 80.19 13.65 0.0024 ** D 543.11 1 543.11 92.46 <0.0001 ** AB 43.82 1 43.82 7.46 0.0162 * AC 141.73 1 141.73 24.13 0.0002 ** AD 32.72 1 32.72 5.57 0.0333 * BC 16.97 1 16.97 2.89 0.1112 BD 38.94 1 38.94 6.63 0.0220 * CD 51.77 1 51.77 8.81 0.0102 * A2 268.01 1 268.01 45.63 <0.0001 ** B2 288.94 1 288.94 49.19 <0.0001 ** C2 503.93 1 503.93 85.79 <0.0001 ** D2 210.41 1 210.41 35.82 <0.0001 ** 残差 82.24 14 5.87 失拟项 67.50 10 6.75 1.83 0.2935 不显著 绝对误差 14.73 4 3.68 总和 2287.37 28 注：**P<0.01，差异极显著；*P<0.05，差异显著。 由表3可知，一次项A、B、C、D，交互项AC，二次项A2、B2、C2、D2，对螯合率的影响极显著（P<0.01），交互项AB、AD、BD、CD对螯合率影响显著（P<0.05），说明该四因素与响应值并非简单的线性关系，交互项BC对螯合率影响不显著，可将其从回归模型中删除。因此，最终确定回归模型为Y=84.86+5.54A+2.17B−2.59C+6.73D−3.31AB+5.95AC−2.86AD−3.12BD+3.60CD−6.43A2−6.67B2−8.81C2−5.70D2。
2.3.2 响应面图分析
根据应用统计分析软件拟合得到三维图可直观展示两个自变量的交互作用。反应质量比、反应时间、反应温度、反应pH四个因素两两之间交互作用对螯合率影响效果见图5。三维图均为开口向下的凸形曲面，AB、AC、AD、BD、CD图形陡峭，判断 AB、AC、AD、BD、CD 交互作用显著；在 BC 交互作用中三维图形平缓，判断BC交互作用相对不显著。表3可知，AB、AC、AD、BD、CD项的P值分别为0.0162（<0.05）、0.0002（<0.05）、0.0333（<0.05）、0.0220（<0.05）、0.0102（<0.05），三维图与P值代表的交互作用对响应值影响程度一致。
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图 5 各因素交互作用对菊芋多糖锌螯合能力影响的响应面图Figure 5. Response surface diagram of the interaction of various factors on the chelating ability of Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex2.3.3 验证实验结果
由回归模型方程计算可知，当A=31.79:1、B=58.83、C=50.79、D=8.54时，Y出现极大值，即当多糖与硫酸锌质量比为31.79:1、反应时间为58.83 min、反应温度为50.79 ℃、pH为8.54时，预测螯合率最大值为87.51%。为方便操作，选择以下参数进行验证实验：多糖与硫酸锌质量比为32:1、反应时间为60 min、反应温度为50 ℃、反应pH为8.50。在此条件下进行验证实验所得螯合率为87.06%±0.28%，与预测值相差0.45%，说明该工艺稳定可靠，可用于生产实践。根据响应面优化实验所得的最优条件制备菊芋多糖锌，并将菊芋多糖锌进行透析处理，除去游离的锌离子，然后冷冻干燥后得到菊芋多糖锌，并用于后续体外抗氧化活性评价。
2.4 体外抗氧化活性测定结果
2.4.1 DPPH自由基清除能力测定
由图6可知，在0.3~2.7 mg/mL范围内，随着菊芋多糖和菊芋多糖锌浓度的增加，菊芋多糖和菊芋多糖锌对DPPH自由基的清除能力显著增强（P<0.05），说明菊芋多糖锌不仅可以作为一种新型的锌补充剂，还具有多糖的DPPH自由基清除能力。其中，在2.7 mg/mL时，菊芋多糖和菊芋多糖锌的DPPH自由基清除率达到最大，分别为26.92%和23.42%。DPPH乙醇溶液能够提供一对孤对电子，因此易被含氢供体化合物还原，DPPH溶液被还原后，其溶液表现为紫色逐渐变浅，抗氧化剂的抗氧化活性越强吸光度就越低。菊芋多糖的DPPH自由基清除率均优于菊芋多糖锌（P<0.05），推测原因可能是锌的引入导致构象发生改变或者结合多糖上的羟基导致氢供体减少[48]。
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2.4.2 羟基自由基清除能力测定
由图7所示，在0.3~2.7 mg/mL范围内，菊芋多糖和菊芋多糖锌分别对羟基自由基的清除能力与质量浓度呈正比例关系，表明除补锌效果外，菊芋多糖锌还具有多糖的羟基自由基清除能力。2.7 mg/mL时，菊芋多糖和菊芋多糖锌的羟基自由基清除率达到最大，分别为14.15%和13.47%。多糖碳氢链上的氢原子能与羟基自由基结合生成水，达到清除羟基自由基的目的，菊芋多糖锌清除羟基自由基的能力下降可能与菊芋多糖锌中氢供体减少有关[48-49]。
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图 7 菊芋多糖和菊芋多糖锌对羟基自由基的清除能力Figure 7. Hydroxyl radical scavenging ability of Jerusalem artichoke polysaccharide and Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力测定
如图8所示，在0.3~2.1 mg/mL范围内，随着浓度的增加，菊芋多糖和菊芋多糖锌对超氧阴离子自由基的清除能力显著增强（P<0.05），2.1 mg/mL时菊芋多糖锌对超氧阴离子自由基的清除率最大，为29.36%；在2.7 mg/mL时，菊芋多糖对超氧阴离子自由基清除率继续增加，达到32.21%。菊芋多糖锌的清除率则下降到23.99%。结果表明菊芋多糖锌具有较好的抗氧化活性，但是同时兼具补锌效果和抗氧化效果的最佳浓度需要进一步的探究。
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图 8 菊芋多糖和菊芋多糖锌对超氧阴离子自由基的清除能力Figure 8. Superoxide anion radical scavenging ability of Jerusalem artichoke polysaccharide and Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex2.4.4 ABTS+自由基清除能力测定
由图9可知，在0.3~2.7 mg/mL范围内，菊芋多糖和菊芋多糖锌对ABTS+自由基清除能力与质量浓度呈正比例关系。2.7 mg/mL时，菊芋多糖和菊芋多糖锌对ABTS+自由基清除率达到最大，分别为14.77%和18.50%。相同浓度下，菊芋多糖锌对ABTS+自由基清除能力显著优于菊芋多糖（P<0.05），这可能是因为高浓度下的多糖能够将反应性自由基转化为稳定状态，并通过向自由基提供电子来终止自由链反应[45]。微量元素锌也是一种抗氧化剂，多糖和锌离子能够相互协同，增强对ABTS+自由基的清除作用[34]。
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图 9 菊芋多糖和菊芋多糖锌对ABTS+自由基的清除能力Figure 9. ABTS+ free radical scavenging ability of Jerusalem artichoke polysaccharide and Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex3. 结论
采用响应面法对菊芋多糖锌的制备工艺进行优化，确定最优工艺为多糖与硫酸锌质量比为32:1、反应时间60 min、反应温度50 ℃、pH8.50，螯合率为87.06%。抗氧化活性测定结果表明：菊芋多糖锌不仅可以作为一种良好的锌补充剂外，还具有良好的体外抗氧化活性。除了2.7 mg/mL浓度下，菊芋多糖锌的超氧阴离子自由基略有下降外，其他的浓度条件下，菊芋多糖和菊芋多糖锌的抗氧化活性呈剂量关系。在0.3~2.7 mg/mL浓度下，最佳的菊芋多糖锌对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基的清除能力分别为23.42%、13.47%、29.36%和18.50%。本研究为菊芋多糖、菊芋多糖锌开发功能性保健食品提供理论基础。
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图 5 各因素交互作用对菊芋多糖锌螯合能力影响的响应面图
Figure 5. Response surface diagram of the interaction of various factors on the chelating ability of Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex
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图 7 菊芋多糖和菊芋多糖锌对羟基自由基的清除能力
Figure 7. Hydroxyl radical scavenging ability of Jerusalem artichoke polysaccharide and Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex
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图 8 菊芋多糖和菊芋多糖锌对超氧阴离子自由基的清除能力
Figure 8. Superoxide anion radical scavenging ability of Jerusalem artichoke polysaccharide and Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex
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图 9 菊芋多糖和菊芋多糖锌对ABTS+自由基的清除能力
Figure 9. ABTS+ free radical scavenging ability of Jerusalem artichoke polysaccharide and Jerusalem artichoke polysaccharide-Zn complex
表 1 响应面试验因素水平表
Table 1 Factors and Levels of response surface test
水平 因素 A多糖和硫酸锌
质量比B反应时间
（min）C反应温度
（℃）D反应pH −1 25:1 30 40 7 0 30:1 60 50 8 1 35:1 90 60 9 
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表 2 响应面试验结果
Table 2 Response surface test results
实验号 A质量比 B时间（min） C温度（℃） D pH 螯合率（%） 1 30:1 60 50 8 83.65 2 35:1 60 50 9 83.36 3 30:1 60 50 8 84.00 4 35:1 60 50 7 76.70 5 30:1 30 40 8 69.82 6 30:1 60 40 7 72.17 7 25:1 60 60 8 55.93 8 30:1 60 50 8 87.94 9 25:1 60 50 7 57.65 10 35:1 60 40 8 69.25 11 25:1 90 50 8 71.78 12 30:1 90 50 7 68.82 13 25:1 60 50 9 75.75 14 30:1 30 50 9 80.25 15 35:1 60 60 8 78.21 16 30:1 90 40 8 73.65 17 35:1 30 50 8 79.25 18 25:1 30 50 8 63.12 19 30:1 60 50 8 85.48 20 35:1 90 50 8 74.67 21 30:1 90 50 9 77.02 22 30:1 30 50 7 59.57 23 30:1 60 60 7 55.88 24 30:1 60 60 9 76.62 25 30:1 30 60 8 62.23 26 30:1 90 60 8 74.30 27 30:1 60 50 8 83.23 28 30:1 60 40 9 78.52 29 25:1 60 40 8 70.78
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表 3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 差异值 模型 2205.13 14 157.51 26.81 <0.0001 显著 A 367.75 1 367.75 62.61 <0.0001 ** B 56.33 1 56.33 9.59 0.0079 ** C 80.19 1 80.19 13.65 0.0024 ** D 543.11 1 543.11 92.46 <0.0001 ** AB 43.82 1 43.82 7.46 0.0162 * AC 141.73 1 141.73 24.13 0.0002 ** AD 32.72 1 32.72 5.57 0.0333 * BC 16.97 1 16.97 2.89 0.1112 BD 38.94 1 38.94 6.63 0.0220 * CD 51.77 1 51.77 8.81 0.0102 * A2 268.01 1 268.01 45.63 <0.0001 ** B2 288.94 1 288.94 49.19 <0.0001 ** C2 503.93 1 503.93 85.79 <0.0001 ** D2 210.41 1 210.41 35.82 <0.0001 ** 残差 82.24 14 5.87 失拟项 67.50 10 6.75 1.83 0.2935 不显著 绝对误差 14.73 4 3.68 总和 2287.37 28 注：**P<0.01，差异极显著；*P<0.05，差异显著。
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