Effects of Ganoderma lingzhi Polysaccharides Combined with Aerobic Exercise on Lipid-lowering and Antioxidant Levels in Hyperlipidemia Mice
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摘要: 探究灵芝子实体多糖联合有氧运动对高脂小鼠的降脂和抗氧化水平的影响。采用水提醇沉提法提取灵芝子实体粗多糖，然后通过去蛋白、分离纯化得到灵芝多糖纯品（Ganodema lingzhi polysaccharide，GLP），经电镜扫描和傅里叶红外光谱法分析GLP的结构特征，通过高脂饲料饲喂构建高脂小鼠模型，分别设置正常喂养组（Control group，CG）、高脂喂养组（High-fat diet group，HD）、灵芝多糖组（Ganodema lingzhi polysaccharide group，GLP）、有氧运动组（Aerobic exercise control group，AE）和灵芝多糖结合有氧运动组组（GLP/AE），GLP组和GLP/AE组进行灵芝多糖灌胃，剂量为2.0 g/kg/d，其余组灌胃相同量的生理盐水，AE组和GLP/AE组进行有氧跑台运动，1 h/d，每周5 d。经过为期8周的有氧跑台训练后，分别测定各组小鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度，同时测定血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物歧化酶（glutathione peroxide dismutase，GSH-Px）的活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，并对各组小鼠肝脏组织进行病理学观察。结果表明，灵芝多糖呈现不规则的片状结构，表面不光滑，有斑点状凸起和凹陷，其异头碳为β构型。8周的高脂饲料饲喂后，HD组小鼠的体重较CG组增加了32.95%，肝脏重量增加了40.19%，TG、TC以及LDL-C皆出现显著性升高，而内源性抗氧化酶系活力则显著降低，说明脂质过氧化引发的氧化压力对小鼠造成了损伤，HD组小鼠动脉粥样硬化指数较CG组显著升高（P＜0.05）；GLP、AE和GLP/AE组其小鼠血清内TC、TG、LDL-C都出现明显降低，而HDL-C含量则均增加，其中有氧运动联合灵芝多糖干预能够显著降低血脂，使得TG、TC和LDL-C含量分别降低55.79%，22.54%及62.52%；另外，与HD组相比，灵芝多糖组、有氧运动组、灵芝多糖结合有氧运动组均能够重塑内源性抗氧化酶系活力，清除MDA，进而减少肝脏细胞中脂滴数量，从而减轻脂肪变性程度。由此可见，有氧运动联合补充灵芝多糖对小鼠有明显的降血脂作用，同时还能增强小鼠对脂质过氧化引发的氧化损伤的抵御能力。灵芝多糖有望作为一种减肥降脂的产品开发，灵芝多糖联合有氧运动干预则是预防及辅助治疗高血脂症的潜在途径。Abstract: To explore the effects of Ganoderma lingzhi fruiting body polysaccharide combined with aerobic exercise on the lipid-lowering and antioxidant levels of high-fat mice. The crude polysaccharide of Ganoderma lingzhi fruit body was extracted by water extraction and alcohol precipitation, and then purified by deproteinization, separation and purification to obtain pure Ganoderma lingzhi polysaccharide (GLP). The structural characteristics of GLP were analyzed by scanning electron microscope and Fourier infrared spectroscopy. A high-fat mouse model was constructed by feeding high-fat diets, including normal feeding group (CG), high-fat diet group (HD), Ganoderma lingzhi polysaccharide group (GLP), Aerobic exercise control group (AE) and Ganoderma lingzhi polysaccharide and aerobic exercise combined group (GLP/AE), GLP group and GLP/AE group were given Ganoderma lingzhi polysaccharide gavage at a dose of 2.0 g/kg/d, and the rest groups were given the same amount of normal saline, and the AE group and GLP/AE group were given aerobic treadmill exercise, 1 h/d, 5 d a week. After 8 weeks of aerobic treadmill training, the concentrations of triglyceride (TG), total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in the serum of each group of mice were measured. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxide dismutase (GSH-Px) and malondialdehyde (MDA) contents, and pathological observations were made on the liver tissues of mice in each group. The result showed Ganoderma lingzhi polysaccharide presented an irregular sheet structure, the surface was not smooth, there were spot-like protrusions and depressions, and its anomeric carbon was in the β configuration. After 8 weeks of high-fat diet, the weight of the HD group increased by 32.95% and the liver weight increased by 40.19% compared with the CG group. TG, TC, and LDL-C all increased significantly, while the endogenous resistance The activity of the oxidase system was significantly reduced, indicating that the oxidative stress caused by lipid peroxidation caused damage to the mice. The atherosclerosis index of the HD group was significantly higher than that of the CG group (P<0.05); GLP, AE and GLP/AE group, the serum levels of TC, TG, and LDL-C in mice were significantly reduced, while the content of HDL-C increased. Among them, aerobic exercise combined with Ganoderma lingzhi polysaccharide intervention could significantly reduce blood lipids, reducing the content of TG, TC and LDL-C by 55.79%, 22.54% and 62.52%, respectively. In addition, compared with the HD group, the Ganoderma lingzhi polysaccharide group, aerobic exercise group, and Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise group could reshape the activity of endogenous antioxidant enzymes, clear MDA, and reduce lipid droplets in liver cells and the degree of fatty degeneration. It could be seen that the combination of aerobic exercise and supplementation of Ganoderma lingzhi polysaccharides had a significant effect on lowering blood lipids in mice, and at the same time can enhance the resistance of mice to oxidative damage caused by lipid peroxidation. Ganoderma lingzhi polysaccharide was expected to be developed as a weight loss and lipid-lowering product. Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise intervention was a potential way to prevent and assist the treatment of hyperlipidemia.
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Keywords:
- Ganodema lingzhi /
- polysaccharides /
- aerobic exercise /
- hyperlipidemia /
- anti-oxidation
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进入21世纪后，我国经济呈现高速发展，居民的饮食结构也随之发生了较大变化，由低脂饮食转向高脂肪饮食[1]。高脂饮食最显著的特点之一就是其中包含大量的饱和脂肪酸，而伴随饱和脂肪酸的大量摄入，高脂血症的发病率出现了显著提升[2]。现代临床医学研究显示，高血脂症诱导的脂质代谢异常是导致动脉粥样硬化最主要的影响因素，当血脂过高时，大量脂质会沉积在机体动脉，从而导致动脉粥样硬化。动脉粥样硬化会引起血管管腔狭窄，是引起心脑血管疾病发生、发展的重要危险因素[3-5]。因此，如何科学健康的饮食，预防心脑血管疾病的发生，愈发受到相关学者的关注。
灵芝（Ganodema lingzhi）在我国栽培历史悠久，针对其药理作用的论述颇多[6-8]。大量研究表明，多糖是灵芝的主要活性物质，相关研究证实，灵芝多糖具有降血脂、免疫调节、抗氧化及防辐射等生理活性[9]。有氧运动是一种不间断且连续时间较长的中等强度的运动[10]。相关研究证实，在脂肪氧化分解的过程中，脂肪酶的活性会随着有氧运动时间的增加而上升，随之而来的效应是有氧运动可以促进脂肪代谢，减少脂肪堆积所带来的病症[11]。但是，相较于运动控食相结合，单纯依靠节食和运动在减肥降脂方面的效果则不甚理想[12]。基于以上分析，本实验采用热水浸提法提取灵芝子实体粗多糖，然后去蛋白、分离纯化得到灵芝多糖纯品。采用高脂饲料饲喂法构建高血脂症小鼠模型，通过灌胃灵芝多糖结合有氧运动，评价其对小鼠高血脂症的缓解作用。获得的实验数据能够为人工栽培灵芝的药理作用研究提供支撑，以期为灵芝多糖的降血脂作用研究及其在食品和医药领域的开发和应用利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
灵芝子实体 金华寿仙谷药业有限公司主栽灵芝品种仙芝2号的灵芝子实体，经张蕾[13]鉴定为赤灵芝（Ganodema lingzhi）。栽培模式：青冈树段木栽培（批号：20190625）；昆明小鼠60只（SPF级，雄性，4周龄），体质量14～16 g 购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011；小鼠高脂饲料（含有1.5%的胆固醇和34%的蔗糖，编号D12451）、小鼠普通饲料（编号D12450B）、玉米芯垫料（编号：D12453C） 均购自成都达硕实验动物有限公司。
DEAE纤维素DE-52柱（货号：S14024-500 g） 源叶生物；甘油三酯（TG）试剂盒（批号：A054-1-1）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号：A082-3-1）、总胆固醇（T-CHO）试剂盒（批号：A032-1-1）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（批号：A016-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：A001-3）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（批号：A007-1-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（批号：A006-2-1）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：A003-1-2） 均购自南京建成生物工程研究所；无水乙醇（CAS号：64-17-5）、甲醛溶液（CAS号：67-56-1）、磷酸盐缓冲液（PBS，货号：17202）等试剂 均购自于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；其余实验涉及试剂均为分析纯级。
FD-1B-50真空冷冻干燥机（冷凝温度−50 ℃） 上海继谱；Multiskan GO酶标仪 Thermo赛默飞；离子溅射仪 英国Quotrue;FEG 250型扫描电镜 美国Quanta；IX73倒置显微镜 日本Olympus；N1200-B旋转蒸发仪 东京理化；VOSHIN-1000W超声波清洗器 无锡沃信；XR-PT-10A型动物实验跑台（跑道长580 mm、宽85 mm、高120 mm） 上海欣软信息科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 灵芝多糖的提取
参考熊川等[14]的方法提取灵芝子实体多糖。将灵芝子实体置于37 ℃烘箱中恒温鼓风干燥12 h，干燥后的灵芝子实体切片，用中药材粉碎机粉碎，过60目塞（孔径0.25 mm）。称取1000 g灵芝子实体粉末，加入20 L 95%的乙醇浸泡过夜脱脂，离心除去浸泡液，粉末自然风干。已脱脂的灵芝子实体粉末中加入蒸馏水（料液比为1:30），95 ℃水浴8 h，5000 r·min−1离心后收集上清液，重复操作3次，获得足量上清液后减压蒸馏浓缩。浓缩产物中加入无水乙醇醇沉（料液比1:9），醇沉12 h。5000 r·min−1离心收集醇沉产物并用适量蒸馏水溶解，进一步通过Savage法除蛋白。配制Savage试剂（氯仿:正丁醇=4:1，V/V）并加入到粗多糖溶液中，振荡后静置分层，收集上层液体，重复操作直至蛋白除尽，除蛋白后的产物减压蒸馏浓缩，经7500 Da分子量透析袋流水透析，去除小分子杂质，截留透析液并冷冻干燥得到灵芝粗多糖。
1.2.2 灵芝多糖分离纯化
称取方法1.2.1冷冻干燥后得到的灵芝粗多糖样品25 g，加入无菌蒸馏水250 mL，充分溶解后，4000 r·min−1条件下离心5 min，去掉下层沉淀，将上清液再经0.45 μm膜过滤，随之加入到柱层析DEAE纤维素DE-52柱中分离，洗脱液为0.5 mol·L−1 NaCl，洗脱速度为1.5 mL/min，多管收集，每管10 mL，在45 ℃条件下将收集的洗脱液通过旋转蒸发浓缩，浓缩至50 mL，再将浓缩液在冷冻干燥机上进行冷冻干燥，得到多糖样品备用。称取冷冻干燥后的样品，溶解于无菌蒸馏水中，配制成25 mg·mL−1的多糖溶液，再将溶液上样到Sephad凝胶柱（2.6 cm×100 cm）进行分离，洗脱液为0.1 mol·L−1 NaCl，流速为0.5 mL·min−1，分管连续收集30管，每管收集10 mL，苯酚硫酸法在490 nm处测定吸光值检测样品多糖含量[15]，45 ℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得到多糖纯品。
1.2.3 多糖形貌观察
取质量为1 mg的灵芝多糖置于附有铜胶带的样品台，通过离子溅射仪在多糖样品表面镀上一层导电金粉，然后置于扫描电镜下观察。样品在20.0 kV加速电压下进行检查[16]，选择清晰的视野100倍拍照。
1.2.4 多糖红外光谱分析
参考彭天祥等[17]使用傅立叶红外光谱仪对灵芝纯化多糖的功能基团进行分析，扫描参数：扫描范围4000~500 cm−1，扫描32次，分辨率为4 cm−1。
1.2.5 小鼠饲喂与处理
将60只昆明小鼠用普通饲料适应性饲养1周，1周后再分为5组，每组12只。依次设定为正常喂养组（Control group，CG）、高脂喂养组（High-fat diet group，HD）、灵芝多糖组（Gan-odema lingzhi polysaccharide group，GLP）、有氧运动组（Aerobic exercise control group，AE）和灵芝多糖与有氧运动联合组（Ganodema lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise control group，GLP/AE）。其中CG组饲喂普通饲料，其余4组饲喂高脂饲料，持续饲喂3周建模。依据预实验的结果，从第4周开始进行多糖灌胃和有氧运动，其中GLP和GLP/AE组进行灵芝多糖灌胃，剂量为2.0 g/kg/d，用无菌蒸馏水配制，灌胃体积1 mL，其余组灌胃相同量的生理盐水。另外，AE组和GLP/AE组进行跑台运动，每天持续运动1 h，速度10 m/min，跑台坡度0°，每周5 d，周一至周五上午10点开始，实验进行8周，在此期间所有小鼠自由饮水和进食。
1.2.6 样品收集与指标检测
实验处理结束后，小鼠禁食12 h（正常饮水），腹部注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，采用引颈法处死小鼠，摘取眼球并及时取血，血液常温存放2 h，后于4 ℃下，3000 r·min−1离心15 min，分离血清，将血清转移至新EP管中并于−80 ℃条件下保存，备用；解剖摘取小鼠肝脏组织，用生理盐水漂洗3次，用吸水纸吸干表面水分，置于−80 ℃下保存，备用。测定小鼠肝脏的重量及肝脏系数（Liver index，LI）。
LI(%)=MM0×100 式中，M为小鼠肝脏组织重量，单位为g，M0为小鼠最终体重，单位为g。
取小鼠血清，测定血清中抗氧化酶系活力，包括SOD、CAT、GSH-Px，同时测定MDA的浓度；血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的浓度，在此基础上，计算动脉粥样硬化指数（Atherosclerosis index，AI）。
AI=CTC−CHDL−CCTC 式中，CTC为血清中TC浓度，单位为mmol·L−1；CHDL-C为血清中HDL-C浓度，单位为mmol·L−1。
1.2.7 肝脏组织病理学观察
参考曹智[18]的方法进行肝脏组织染色制片。配制苏木精染液、伊红染液及1%的盐酸乙醇分化液。选定肝脏组织，在同一位置上切取组织块，修整成合适大小，流水冲洗12 h，依次进行脱水透明，包埋修块，脱蜡复水、染色封片后，于光学显微镜下观察。
1.3 数据处理
所有实验重复三次，所得数据采用SPSS 26.0软件分析，采用均数±标准差（
ˉx ±s）表示，通过t检验，确认差异的显著性，以P<0.05表示差异有统计学意义。2. 结果与分析
2.1 灵芝多糖的电镜观察
冷冻干燥后的灵芝多糖得率为3.54%，纯度95.62%，灵芝多糖的表面结构如图1，从图中可以看出其呈现不规则的片状结构，表面不光滑，部分表面呈纤维丝状，部分表面有凸起斑点，推测这些凸起斑点就是多糖粒子。张军等[19]观察到灵芝多糖表面有较多的皱褶，且表面有丝带状连接结构，另外金鑫等[20]观察到灵芝多糖呈现块状，块状中部分表面出现绒毛状，这些多糖的表面结构都与研究的灵芝多糖表面结构相似。
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图 1 灵芝多糖的形貌观察Figure 1. Morphology of the polysaccharide isolated from Ganodema lingzhi2.2 灵芝多糖红外光谱分析
从图2可以看出，灵芝多糖样品的特征吸收峰主要出现在3365、2927、1656、1407、1075、876 cm−1处。相较于其他特征吸收峰值，在3365 cm−1处出现的特征吸收峰较宽，这是由O-H的伸缩振动引起，因为多糖分子内的羟基间形成的氢键从而使特征吸收峰变宽[21]；在2927 cm−1处和1407 cm−1处出现的弱吸收峰是由C-H的伸缩振动和变角振动引起，这两个特征吸收峰是典型的糖类吸收峰，表明灵芝多糖内含有-CH2和-CH3基团[22]；在1656和1075 cm−1处出现了2个较强的吸收峰，出现这两个吸收峰是由于多糖分子内C-O伸缩振动引起，一种情况是C-O-H伸缩振动，另一种情况是出现了糖环键C-O-C伸缩振动[23]；876 cm−1左右较小的吸收峰是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷键连接特征吸收峰，说明灵芝多糖含有β-吡喃糖苷键[24]。该结果表明灵芝多糖的异头碳为β构型。
2.3 各组小鼠生长状态分析
试验期间，所有动物状态良好，未出现死亡情况。各组小鼠间均未出现异常情况，饮食饮水正常。在1周普通饲料适应性喂养后，发现5组小鼠间体重差异不显著（P>0.05），不会对后续试验和数据统计造成显著性差异，见表1。在整个试验过程中，小鼠的体重逐步上升，通过高脂饲料饲喂组最先与其他各组出现显著差异（P<0.05），2周时，高脂饲料组小鼠体重为（30.13±0.35）g，与正常饲喂组相比显著升高（P<0.05）。第4周时，正常喂养组与其他处理组都出现显著性差异（P<0.05），此外，与高脂饲养组相比，灵芝多糖组、有氧运动组及联合组均出现显著差异（P<0.05）。第6周时，高脂喂养组体重为（38.41±0.41）g，较正常组增加了31.45%，灵芝多糖组和有氧运动组能够显著降低高脂小鼠的体重（P<0.05），降幅分别为12.47%和10.75%，此外，6周的灵芝多糖和有氧运动联合处理，使得小鼠体重降幅为18.87%。在第8周时，与正常喂养组比较，高脂喂养组体重增加了32.95%，灵芝多糖组体重增加了21.95%，有氧运动组体重增加了19.19%，有氧运动联合灵芝多糖组增加了4.12%；相比高脂喂养组，灵芝多糖组、有氧运动组、灵芝多糖结合有氧运动组小鼠体重降幅分别为8.27%、10.35%和21.68%。可见，灵芝多糖和有氧运动均能显著降低小鼠的体重。
表 1 灵芝多糖联合有氧运动对小鼠体重的影响Table 1. Effect of Ganodema lingzhi polysaccharides combined with aerobic exercise on body weight in mice组别 实验前（g） 实验后（g） 2周 4周 6周 8周 正常喂养组（CG） 22.23±0.21a 26.52±0.67b 28.01±0.54c 29.22±0.72d 35.17±0.79d 高脂喂养组（HD） 22.42±0.33a 30.13±0.35a 32.42±0.29a 38.41±0.41a 46.76±0.43a 灵芝多糖组（GLP） 21.76±0.19a 29.56±0.37a 30.53±0.38b 33.62±0.44b 42.89±0.42b 有氧运动组（AE） 21.67±0.24a 29.72±0.34a 30.63±0.41b 34.28±0.36b 41.92±0.39c 灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE） 22.52±0.37a 29.88±0.54a 29.98±0.35b 31.16±0.51c 36.62±0.79d 注：同列中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；表2、表3同。 2.4 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠血脂水平的影响
灵芝多糖和有氧运动干预8周后，高脂小鼠的血脂水平如图3所示。高脂饲料组（HD）的小鼠，其TC、TG及LDL-C的含量显著高于普通饲喂组（CG组）（P<0.05），而HDL-C则显著低于CG组。灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE）对TC、TG及LDL-C具有最好的清除作用，相较于HD组，其含量分别降低55.79%，22.54%及62.52%，而HDL-C含量则增加了21.23%。
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图 3 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠血脂水平的影响注：图中不同小写字母表示差异显著，P<0.05，图4同。Figure 3. Effect of Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise on the blood lipid level in hyperlipidemic mice本实验中，高脂喂养将小鼠的动脉粥样硬化指数显著提升（表2），相较于正常喂养组，增加了近1倍。相较于高脂喂养组，灵芝多糖和有氧运动都能够显著降低动脉粥样硬化指数（P<0.05），联合干预组则具有最好的降低效果。
表 2 小鼠动脉粥样硬化指数Table 2. The atherosclerosis index (AI) in mice组别 动脉粥样硬化指数 正常喂养组（CG） 0.44±0.05d 高脂喂养组（HD） 0.84±0.11a 灵芝多糖组（GLP） 0.72±0.08b 有氧运动组（AE） 0.63±0.07b 灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE） 0.56±0.04c 2.5 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠内源性抗氧化酶系活力的影响
高脂饲料的喂养引发小鼠的高血脂症，高血脂症的发生会对小鼠内源性抗氧化酶系的活力造成损伤。从图4中可以看出，相较于普通饲料的喂养（CG组），8周的高脂饲料处理，使得小鼠体内的SOD、CAT和GSH-Px的活力依次降低为对照组的52.23%±2.47%、43.75%±1.88%和50.56%±3.02%，而MDA的含量则显著上升（P<0.05），为对照组的262.68%±7.09%。灵芝多糖（GLP组）、有氧运动（AE组）及联合处理组（GLP/AE组）都能重塑内源性抗氧化酶系的活力，其中，灵芝多糖（GLP组）和联合处理（GLP/AE组）效果较好。此外，有氧运动（AE组）及联合处理组（GLP/AE组）对MDA含量的降低效果较好。
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图 4 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠内源性抗氧化酶系活力的影响Figure 4. Effect of Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise on the activity of endogenous antioxidant enzymes in hyperlipidemic mice2.6 灵芝多糖结合有氧运动对高脂小鼠肝脏重量及肝脏系数的影响
处理8周后的小鼠的肝脏重量和肝脏系数如表3所示。高脂喂养组小鼠肝脏重量和肝脏系数皆显著高于正常组（P<0.05），肝脏重量增加了40.19%。灵芝多糖组小鼠肝脏重量也显著高于正常喂养组（P<0.05），但显著低于高脂喂养组（P<0.05），但灵芝多糖对高脂小鼠的肝脏系数未见明显影响。有氧运动组、灵芝多糖结合有氧运动组肝脏重量和肝脏系数均显著低于高脂喂养组（P<0.05），表明高脂喂养组小鼠肝脏受到损伤，出现了充血或水肿的情况，灵芝多糖组、有氧运动组和联合组的肝系数分别较高脂喂养组降低了1.40%、2.68%和4.80%，其中有氧运动组和联合组与高脂喂养组出现了显著差异（P<0.05），表明灵芝多糖和有氧运动对高脂小鼠肝充血和肝肿胀具有明显改善作用。
表 3 小鼠肝脏重量与肝脏系数Table 3. Liver weight and liver index in mice组别 肝脏重量
（g）肝脏系数
（%）正常喂养组（CG） 1.02±0.05c 38.82±1.23c 高脂喂养组（HD） 1.43±0.10a 41.02±1.01a 灵芝多糖组（GLP） 1.31±0.11b 40.45±0.92ab 有氧运动组（AE） 1.10±0.08c 39.92±0.87b 灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE） 1.15±0.09bc 39.05±1.04b 2.7 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠肝脏组织细胞病理切片的影响
小鼠肝脏组织经过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining）后采用石蜡切片观察，结果如图5所示，正常喂养组（CG）的小鼠肝脏组织结构完整（图5 A），观测发现小鼠肝细胞形态及大小正常，细胞质均匀，未观测到脂肪变性，细胞内没有出现脂滴，几乎观察不到炎性细胞及细胞中的脂肪颗粒沉淀。高脂饲料处理后，小鼠肝细胞发生肿胀，细胞核偏移，细胞内出现大量的脂滴小空泡，提示肝脏脂肪变形较为严重（图5 B）。通过灵芝多糖和有氧运动的干预，小鼠干细胞形态恢复正常，细胞内脂滴数量明显减少，脂肪变性程度减轻（图5 C~E），可见，补充灵芝多糖和有氧运动可以缓解或消除小鼠肝脏的炎症症状，并降低脂肪组织中的脂肪分解。
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图 5 小鼠肝脏组织病理学变化（100×）注：采用苏木精-伊红染色法处理；A. 正常喂养组 （CG），B. 高脂喂养组 （HD），C. 灵芝多糖组 （GLP），D. 有氧运动组 （AE），E. 灵芝多糖结合有氧运动组 （GLP/AE）；比例尺50 μm。Figure 5. Pathology changes of liver in mice (100×)3. 讨论
3.1 高脂饲料对小鼠高血脂症的影响
高脂饲料的饲喂使得小鼠的体重快速增长，第2周时的观测数据显示，所有处理组与正常喂养组皆存在显著性差异（P<0.05），而处理组之间则未见显著性差异（P>0.05），数据说明多糖或有氧运动的处理需要一定的持续时间，短期的作用并不能缓解小鼠体重的异常增长。此外，第6周时，灵芝多糖结合有氧运动组首次与多糖和运动单独处理组出现差异，第8周时，多糖组、有氧运动组及多糖结合有氧运动组首次分别出现差异，且效果逐渐增强，可以推测，有氧运动对于高脂小鼠体重异常增长的抑制作用缓慢但效果较多糖更好，二者联合处理则具有最好的效果。
饮食诱导的肥胖小鼠在一定程度上与人类单纯性肥胖的形成具有相似的发病机制，高脂饲料的喂养，会引起血脂升高及紊乱，进而诱发一系列心血管疾病。血清中TC或TG水平过高或血浆中HDL-C水平过低，极易诱导动脉内皮损伤，使得其通透性增高，加速LDL-C在血管内皮下沉积，进而加速了动脉硬化的形成[25]。已有研究证实，血清中TC及LDL-C的水平过高是导致心血管疾病的独立危险因素，临床研究确认，TC和LDL-C水平的降低能有效地预防或减少心血管疾病的发生[26]。
此外，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是人体内血浆固醇的主要载体，LDL-C含量过高，容易导致胆固醇在细胞内，包括在血管内皮细胞的堆积，这是导致动脉粥样硬化的主要原因之一[27]。AI指数是评判、衡量动脉粥样硬化风险的指标，其意义大于单项血脂指标[28]。本实验中，所设定的干预（灵芝多糖组、有氧运动组、灵芝多糖结合有氧运动组）皆能降低动脉粥样硬化指数，说明灵芝多糖和有氧运动对于高脂引发的动脉粥样硬化有一定的预防和治疗作用。
3.2 高血脂症的发生与氧化压力
生物体内源性抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，作为机体天然的抗氧化应激防御系统的核心部分而存在[29]。其中，SOD水平反映了细胞内抗氧化酶系统的负荷，可间接反映细胞内自由基的水平。由此推测，长时间高脂饲料的喂养，使得小鼠体内氧化压力升高，此时小鼠细胞内的抗氧化酶系明显超过正常负荷，通过灵芝多糖和有氧运动的处理，SOD的活性部分得到恢复，说明灵芝多糖和有氧运动能够清除自由基，缓解高脂带来的氧化压力。GSH-Px通常可作为细胞抗氧化防御的核心成分，一般情况下是活性氧（ROS）的电子供体[30]，高脂饲料显著抑制了GSH-Px的活力，而灵芝多糖及有氧运动能够部分恢复，提示灵芝多糖及有氧运动可能作为另一种解毒系统，从而影响GSH的代谢，减轻高脂引起的氧化压力对机体的损伤。MDA通常作为脂质过氧化的终产物，一方面能够灵敏地反应机体脂质过氧化的水平，另一方面，MDA会改变细胞膜的通透性，阻止细胞内外物质的流通，从而造成高脂血症病情加重[31]。实验数据反应，有氧运动组、灵芝多糖组和灵芝多糖结合有氧运动组均具有较好的MDA清除率。总体来看，灵芝多糖在重塑酶活上效果更好，而有氧运动的作用则主要体现在清除MDA上。
3.3 灵芝多糖与有氧运动对小鼠肝脏的影响
肝脏是机体能量代谢的中心器官，脂肪代谢、蛋白质代谢及糖类物质等代谢途径中均有肝脏的参与，肝脏在脂类的消化、吸收、运输、分解与合成等方面均起重要作用[32]。基于此，很多代谢性疾病的发生都可归因于肝脏的病变。结合肝脏重量和肝脏系数分析可知，高脂喂养组（HD）中的小鼠由于大量脂类物质的摄入，肝脏已经出现了脂质代谢障碍，出现肝脏脂肪沉积，继而引发肝脏脂肪性病变。从能量代谢来讲，有氧运动（AE）对MDA清除及肝脏中脂滴的减少上具有较好的作用；而灵芝多糖（GLP）更多的是调节酶活，从源头强化脂肪的代谢，这与传统中医中灵芝“扶正固本”的描述一致[33]。因此，本实验采用灵芝多糖结合有氧运动来对高脂小鼠进行降血脂的处理，实质上起到了一种标本兼治的作用，实验结果也显示，灵芝多糖结合有氧运动具有最好的降脂效果。
4. 结论
本实验提取分离纯化得到的灵芝子实体多糖，通过高脂饲料喂养构建高血脂小鼠模型，经过灵芝多糖和有氧运动干预后，验证其对小鼠的降血脂和抗氧化作用。实验结果显示灵芝多糖能够重塑小鼠内源性抗氧化酶系活力，增强小鼠对脂质过氧化引发的氧化损伤的抵御能力，而有氧运动能够清除MDA，降低血液中TC、TG和LDL-C的含量，升高HDL-C的含量，二者联合干预则能够清除血脂，降低动脉粥样硬化指数，预防由于过量脂质摄入而引发的肥胖和高血脂症等疾病。因此，灵芝多糖有望作为一种减肥降脂的产品开发，而灵芝多糖结合有氧运动干预则能成为日常生活中预防“三高”的一种健康方式。
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图 1 灵芝多糖的形貌观察
Figure 1. Morphology of the polysaccharide isolated from Ganodema lingzhi
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图 3 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠血脂水平的影响
注：图中不同小写字母表示差异显著，P<0.05，图4同。
Figure 3. Effect of Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise on the blood lipid level in hyperlipidemic mice
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图 4 灵芝多糖联合有氧运动对高脂小鼠内源性抗氧化酶系活力的影响
Figure 4. Effect of Ganoderma lingzhi polysaccharide combined with aerobic exercise on the activity of endogenous antioxidant enzymes in hyperlipidemic mice
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图 5 小鼠肝脏组织病理学变化（100×）
注：采用苏木精-伊红染色法处理；A. 正常喂养组 （CG），B. 高脂喂养组 （HD），C. 灵芝多糖组 （GLP），D. 有氧运动组 （AE），E. 灵芝多糖结合有氧运动组 （GLP/AE）；比例尺50 μm。
Figure 5. Pathology changes of liver in mice (100×)
表 1 灵芝多糖联合有氧运动对小鼠体重的影响
Table 1 Effect of Ganodema lingzhi polysaccharides combined with aerobic exercise on body weight in mice
组别 实验前（g） 实验后（g） 2周 4周 6周 8周 正常喂养组（CG） 22.23±0.21a 26.52±0.67b 28.01±0.54c 29.22±0.72d 35.17±0.79d 高脂喂养组（HD） 22.42±0.33a 30.13±0.35a 32.42±0.29a 38.41±0.41a 46.76±0.43a 灵芝多糖组（GLP） 21.76±0.19a 29.56±0.37a 30.53±0.38b 33.62±0.44b 42.89±0.42b 有氧运动组（AE） 21.67±0.24a 29.72±0.34a 30.63±0.41b 34.28±0.36b 41.92±0.39c 灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE） 22.52±0.37a 29.88±0.54a 29.98±0.35b 31.16±0.51c 36.62±0.79d 注：同列中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；表2、表3同。 
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表 2 小鼠动脉粥样硬化指数
Table 2 The atherosclerosis index (AI) in mice
组别 动脉粥样硬化指数 正常喂养组（CG） 0.44±0.05d 高脂喂养组（HD） 0.84±0.11a 灵芝多糖组（GLP） 0.72±0.08b 有氧运动组（AE） 0.63±0.07b 灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE） 0.56±0.04c
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表 3 小鼠肝脏重量与肝脏系数
Table 3 Liver weight and liver index in mice
组别 肝脏重量
（g）肝脏系数
（%）正常喂养组（CG） 1.02±0.05c 38.82±1.23c 高脂喂养组（HD） 1.43±0.10a 41.02±1.01a 灵芝多糖组（GLP） 1.31±0.11b 40.45±0.92ab 有氧运动组（AE） 1.10±0.08c 39.92±0.87b 灵芝多糖结合有氧运动组（GLP/AE） 1.15±0.09bc 39.05±1.04b
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