Preparation and Activity of Hypolipidemic Peptides from Mengku-dayecha Protein by Enzymatic Hydrolysis
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摘要: 以碱提酸沉法提取的勐库大叶茶蛋白为研究对象，以牛磺胆酸钠结合能力为考察指标，通过单因素实验和响应面分析法优化勐库大叶茶蛋白降血脂肽的制备工艺，并对最优工艺条件下的酶解物进行降血脂活性评价和氨基酸组成分析。结果表明，勐库大叶茶蛋白降血脂肽的最佳制备条件为胃蛋白酶酶解3 h、pH2.1、底物浓度2.7%、酶底比0.3%、温度37 ℃，此条件下酶解物的牛磺胆酸钠结合率为（70.92%±0.12%）。活性评价结果表明，茶叶蛋白酶解物在牛磺胆酸钠结合能力（EC50=6.466 mg/mL）、胰脂肪酶抑制作用（IC50=0.310 mg/mL）和胆固醇酯酶抑制作用（IC50=1.557 mg/mL）三个体外降血脂活性评价指标方面均表现出良好的活性。氨基酸分析表明，所得勐库大叶茶蛋白降血脂肽含有丰富的必需氨基酸（34.35%）、疏水性氨基酸（31.94%）和酸性氨基酸（41.06%）。Abstract: Taking the Mengku-dayecha protein extracted by alkaline extraction and acid precipitation method as the research object, taking the binding capacity of sodium taurocholate as the inspection index, the preparation process of Mengku-dayecha protein hypolipidemic peptides was optimized through single factor experiment and response surface analysis, and the optimal technology was determined. Under the conditions, the enzymatic hydrolysate was evaluated for lipid-lowering activity and amino acid composition analysis. The results showed that the best preparation conditions for Mengku-dayecha protein hypolipidemic peptides were pepsin hydrolysis for 3 h, pH2.1, substrate concentration 2.7%, enzyme substrate ratio 0.3%, and temperature 37 ℃. Under these conditions, the binding capacity of sodium taurocholate was (70.92%±0.12%). The activity evaluation results showed that the tea protein hydrolysate showed good activity in three in vitro evaluation indicators of lipid-lowering activity: The binding capacity of sodium taurocholate (EC50=6.466 mg/mL), the inhibition of pancreatic lipase (IC50=0.310 mg/mL) and the inhibition of cholesterol esterase (IC50=1.557 mg/mL). Amino acid analysis showed that the obtained Mengku-dayecha protein hypolipidemic peptides was rich in essential amino acids (34.35%), hydrophobic amino acids (31.94%) and acidic amino acids (41.06%).
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高脂血症，尤其是高胆固醇血症是心脏病和缺血性心脏病最主要的危险因素之一[1]。高脂血症是由于体内脂质代谢或转运异常导致的一种慢性疾病，主要表现为体内甘油三酯或胆固醇水平过高[2]。近年来，随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，高脂血症患者比例急剧上升，中国成人血脂异常总体患病率高达41.90%[3]，已经成为现代社会高发病率之一的疾病[4-5]。传统的降血脂药物如他汀类[6]、贝特类等，价格昂贵、服用周期长，且往往具有一定的临床副作用[7]。从天然产物中开发出安全有效的降血脂活性成分成为当下的研究热点[8]，如火麻籽降脂肽[9]，驼乳蛋白降脂肽[10]和可可种子蛋白降脂肽[11]等。
茶叶在我国具有丰富的原料资源，饮茶以及茶文化也有数千年的历史[12]。茶叶中含有大量有益于人体健康的物质[13]，长期饮用有助于延缓衰老，降低血压血脂。近年来不断扩大的茶饮料加工过程中产生大量茶渣废弃物[14]，废弃的茶渣中还含有18%~20%的粗蛋白[15]，茶叶蛋白质有比较合理的氨基酸组成，是优质的植物蛋白[16]，作为营养和功能性成分在食品工业中有良好的应用前景[17]。但目前关于茶叶蛋白肽的深度开发和研究较少，若能对茶渣中存留的蛋白等营养物质进行高值化利用开发，将创造巨大的经济效益和社会效益[18]。勐库大叶茶是原产于云南省双江县勐库镇的有性系国家良种，是云南大叶种的代表性品种，其具有生长力强、芽叶生育力强和持嫩性强等特点，并且茶叶内含物质丰富，萌发期早、产量高，可大量采集和加工，是目前云南茶叶加工中的主要资源品种[19-20]。目前，对勐库大叶种茶的研究大多集中于茶叶加工[21]、茶叶水浸出物[22]以及茶叶中的多酚氧化酶[23]等，而对茶叶或茶渣中含量较高的蛋白资源研究较少，这在一定程度上造成了资源的浪费。茶叶中优质的植物蛋白可以进一步开发制备成功能性多肽，值得深入研究。
本研究以勐库大叶茶为原料，通过碱提酸沉获得茶叶蛋白，以胆酸盐结合率为指标，采用酶解法制备茶叶蛋白降血脂肽，并对其进行降血脂活性检测和氨基酸组成分析。本研究有助于茶叶蛋白资源的高值化利用，为相关健康食品的开发提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
勐库大叶茶冻干茶叶 云南省茶学重点实验室提供；胃蛋白酶（3×106 U/mg）、中性蛋白酶（1×105 U/g）、胰蛋白酶（2.5×105 U/g）、木瓜蛋白酶（2×105 U/g） 南宁庞博生物工程有限公司；牛磺胆酸钠（STC）、猪胰脂肪酶（90 U/mg）、对硝基苯基月桂酸酯（pNP月桂酸酯）、对硝基苯基丁酸酯（PNPB） 上海麦克林生化有限公司；胆固醇酯酶（150 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；其他化学品和试剂均为分析纯。
AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3C台式pH计 上海佑科仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 金坛市华城海龙实验仪器厂；L530台式低速自动平衡离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；2300多功能酶标仪 PerkinElmer公司；FD-1型冷冻干燥机 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DH5000BII电热恒温培养箱 天津泰斯特仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 勐库大叶茶蛋白的提取
基于碱提酸沉的原理，参考王忠英[24]的方法进行勐库大叶茶蛋白的提取。勐库大叶茶叶粉碎后过20目筛，称取一定量粉碎的茶叶，以固液比1:40（g:mL）加入0.1 mol/L的NaOH溶液，45 ℃下水浴4 h后过滤，并以4000 r/min离心20 min，收集上清液并用1 mol/L HCl调节pH至4.5，静置20 min后，再以4000 r/min离心20 min。弃去上清，收集蛋白沉淀，冷冻干燥后即得勐库大叶茶蛋白粗提物。
1.2.2 勐库大叶茶蛋白肽的制备
参考郑天芝[25]的方法进行茶叶蛋白肽的制备，将一定量的勐库大叶茶蛋白粗提物加入适量蒸馏水配成溶液，调节pH后加入一定量的酶，一定温度下恒温水浴酶解一定时间后于沸水中灭酶10 min，冷却至室温，4000 r/min离心20 min，收集上清液即为含有多肽的酶解液。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 蛋白酶的筛选
选取实验室常用的4种蛋白酶分别在其最适条件下对勐库大叶茶蛋白进行酶解，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶四种蛋白酶的pH和温度分别为8.0、37 ℃；6.5、55 ℃；1.5、37 ℃；和7.0、45 ℃。在底物浓度为3%，酶底比为0.3%的条件下，酶解3 h，灭酶，离心，取上清酶解液测定胆酸盐结合率，选择最优的蛋白酶。
1.2.3.2 酶解时间对酶解物活性的影响
在底物浓度为3%，酶底比为0.3%，pH1.5，37 ℃条件下，用胃蛋白酶进行酶解，以牛磺胆酸钠结合能力为指标，考察酶解时间（1、2、3、4、5 h），对酶解液活性的影响并确定最佳酶解时间条件。
1.2.3.3 酶解温度对酶解物活性的影响
在底物浓度为3%，酶底比为0.3%，pH1.5条件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以牛磺胆酸钠结合能力为指标，考察酶解温度（32、37、42、47、52 ℃），对酶解液活性的影响并确定最佳酶解温度条件。
1.2.3.4 pH对酶解物活性的影响
在底物浓度为3%，酶底比为0.3%，37 ℃条件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以牛磺胆酸钠结合能力为指标，考察pH（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0），对酶解液活性的影响并确定最佳pH条件。
1.2.3.5 酶底比对酶解物活性的影响
在底物浓度为3%，pH1.5，37 ℃条件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以牛磺胆酸钠结合能力为指标，考察酶底比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%），对酶解液活性的影响并确定最佳酶底比条件。
1.2.3.6 底物浓度对酶解物活性的影响
在酶底比为0.3%，pH1.5，37 ℃条件下，用胃蛋白酶酶解3 h，以牛磺胆酸钠结合能力为指标，考察底物浓度（1%、2%、3%、4%、5%），对酶解液活性的影响并确定最佳底物浓度条件。
1.2.4 响应面优化试验
在单因素实验基础上，以pH、底物浓度和酶底比为自变量，以胆酸盐结合率为响应值，设计三因素三水平的响应面试验。响应面实验设计见表1。
表 1 响应面试验因素与水平设计Table 1. Factors and levels of response surface experiment因素 水平 −1 0 1 A pH 1.5 2.0 2.5 B 底物浓度（%） 2 3 4 C 酶底比（%） 0.2 0.3 0.4 1.2.5 胆酸盐结合率的测定
参考李成龙[26]的方法检测体外胆酸盐结合能力，并略有修改。将1 mL待测样品转移至带塞离心管中。每管加入1 mL0.01 mol/L HCl溶液以模拟人体胃酸环境，37 ℃振荡水浴孵育1 h。之后，用0.1 mol/L NaOH溶液调pH至6.3后加入5 mL配制好的牛磺胆酸钠（STC）标准溶液（1 mmol/L），5 mL 磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH6.3）添加到空白管中。37 ℃恒温振荡1 h后，以4000 r/min离心20 min，然后将2.5 mL上清液转移至新的离心管中，加入7.5 mL 60%硫酸溶液，在70 ℃下孵育30 min后冷却至室温。最后在387 nm波长处测量每个样品的吸光度。每个样品重复分析三次，通过胆酸盐标准曲线测定数值，标准曲线由溶液浓度为1 mmol/L，体积分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的牛磺胆酸钠溶液制定。使用下式计算胆酸盐结合率：
胆酸盐结合率(%)=C0−C1C0×100 (1) 式中：C0是胆酸盐空白（不含肽）的浓度，μmol/mL；C1是添加肽后上清液中胆酸盐的浓度，μmol/mL。
1.2.6 勐库大叶茶蛋白肽降血脂活性分析
1.2.6.1 勐库大叶茶蛋白肽对胆酸盐的吸附能力
通过最优工艺条件得到的酶解液，冷冻干燥后，用磷酸缓冲溶液配制成不同浓度的样品溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL），分别测定胆酸盐结合率，并测定EC50值，即胆酸盐结合率达到50%时的多肽浓度。
1.2.6.2 勐库大叶茶蛋白肽对胰脂肪酶的抑制作用
参照万林[27]的方法并略作修改，检测勐库大叶茶蛋白酶解物对胰脂肪酶的抑制作用。Ⅱ型猪胰脂肪酶用一级水配制成5 mg/mL，取一定量的反应底物对硝基苯基月桂酸酯（pNP月桂酸酯）溶解于含1% Triton X-100的0.05 mol/L醋酸钠水溶液中，配成0.1%（w/v）的pNP月桂酸酯溶液，将配好的溶液置于热水中加速溶解，完全混匀溶解后室温冷却备用。酶解物用Tris-HCl缓冲溶液（0.1 mol/L，pH8.2）配置成浓度为0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的溶液。于离心管中加入250 μL的反应底物，100 μL样品溶液和200 μL反应缓冲液，最后加入150 μL脂肪酶溶液启动反应。置于37 ℃反应2 h后10000 r/min离心1 min，在420 nm波长下测上清液的吸光值。空白对照将样品换成缓冲溶液，样品对照将脂肪酶溶液换成反应缓冲液。计算脂肪酶抑制率，并求出IC50值，按以下公式计算：
胰脂肪酶抑制率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (2) 式中：A1为样品上清液的吸光值；A2为样品对照上清液的吸光值；A0为空白上清液的吸光值。
1.2.6.3 勐库大叶茶蛋白肽对胆固醇酯酶的抑制作用
参照苏建辉等[28]的方法并略做修改，检测勐库大叶茶蛋白酶解物对胆固醇酯酶的抑制作用。猪胰腺胆固醇酯酶用一级水配制成4.2 μg/mL，所有的反应在含有NaCl（0.1 mol/L）、对硝基苯基丁酸酯PNPB（0.2 mmol/L）和牛磺胆酸钠STC（5.16 mmol/L）的磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH7.0）中进行。于离心管中加入10 μL反应底物PNPB（0.2 mmol/L），25 μL的样品溶液和1 mL缓冲液，最后加入50 μL胆固醇酯酶溶液启动反应，25 ℃反应5 min，在405 nm处测量吸光值。空白管用一级水代替样品溶液，空白对照管用一级水代替酶液和样品溶液，背景对照管用一级水代替酶液。计算胆固醇酯酶抑制率，并求IC50值，按下式计算：
胆固醇酯酶抑制率(%)=(1−C−DA−B)×100 (3) 式中：A为空白管的吸光值；B为空白对照管的吸光值；C为样品管的吸光值；D为背景对照管的吸光值。
1.2.7 氨基酸组成测定
采用GB 5009.124－2016《食品中氨基酸的测定》，测定最优酶解物中的氨基酸组成[29]。
1.3 数据处理
所有实验至少进行三次重复。使用SPSS 21.0软件对数据进行分析，结果以平均值±标准差（SD）表示。采用Design Expert 8.0.6.1软件进行响应面优化实验设计和分析。采用单因素方差分析（ANOVA）分析样品间差异的显著性（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 蛋白酶的筛选
由于不同的蛋白酶具有不同的特异性，为了获得具有较好生物活性的蛋白质水解物和多肽，应考虑酶的选择和加工条件[30]。本研究分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶从勐库大叶茶蛋白中制备蛋白质水解物，结果如图1所示。胃蛋白酶水解物与其他蛋白酶水解物相比具有最高的胆酸盐结合能力，其结合牛磺胆酸钠的能力为（65.91%±1.21%）。可能是由于其酶切位点更有利于降血脂水解物的生成[2]，制备豆清夜肽[31]和鹰嘴豆肽[32]时，也都采用了胃蛋白酶进行酶解，可见胃蛋白酶比较适宜酶解植物蛋白。因此，后续实验将采用胃蛋白酶进行蛋白质水解物的制备。
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图 1 蛋白酶种类对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响注：不同字母表示差异显著，P<0.05；图2~图6、图8~图10同。Figure 1. Effect of protease types on the binding rate of sodium taurocholate2.1.2 酶解时间对酶解物活性的影响
不同酶解时间对酶解物活性的影响如图2所示。从图中可以看出，勐库大叶茶蛋白水解物结合牛磺胆酸钠的能力随着酶解时间的延长出现先升后降趋势，酶解3 h得到的酶解液活性最强，牛磺胆酸钠结合率为（66.46%±0.29%）。这可能是因为随着反应的进行，酶解逐渐彻底，多肽含量增加，多肽与蛋白质出现竞争性抑制作用，而酶活力可能随着体系的改变而降低[31]。4 h酶解物的牛磺胆酸钠结合能力与3 h接近，但无显著性差异（P>0.05），考虑到酶解时间过长会增加能耗，因此，确定最佳酶解时间为3 h。
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图 2 酶解时间对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响Figure 2. Effect of enzymatic hydrolysis time on the binding rate of sodium taurocholate2.1.3 酶解温度对酶解物活性的影响
如图3所示，当温度达到37 ℃时，酶解物结合牛磺胆酸钠的能力达到最高值（68.10%±0.36%），随后逐渐下降。这可能是由于受到酶活力的影响，胃蛋白酶的最适水解温度为35~45 ℃，在此范围内的酶活力最高。此外，温度的升高可以使分子的热运动加快，溶剂的溶解能力也会随之增大，从而达到良好的溶质扩散和溶剂渗透效果，产出高活性的酶解物。但温度过高也会导致酶活力下降甚至失活，影响酶解效果[2,33]。因此，确定最佳酶解温度为37 ℃。
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图 3 酶解温度对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响Figure 3. Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the binding rate of sodium taurocholate2.1.4 pH对酶解物活性的影响
如图4所示，不同pH对应的酶解效果有显著差异（P<0.05）。酶解物的牛磺胆酸钠结合能力随着pH升高，先增大后减小，在pH2.0时酶解效果最好，牛磺胆酸钠结合率达到（70.06%±0.32%）。pH也是影响酶活力的重要因素之一，胃蛋白酶在pH1.0~2.0之间，酶活力较高，而过酸过碱都会影响酶活力，从而降低酶解效果[34]。因此，确定最佳pH为2.0。
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图 4 pH对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响Figure 4. Effect of pH on the binding rate of sodium taurocholate2.1.5 酶底比对酶解物活性的影响
如图5所示，随着酶底比的增加，酶解物结合牛磺胆酸钠的能力呈现先增大后减小的趋势，在酶底比0.3%时，酶解物活性最好，结合能力达到（67.09%±1.23%）。酶的添加量较低时，可能会导致酶与底物的结合能力变差，而较高的酶比例又会使蛋白过度水解，生成活性较差的酶解物，导致与牛磺胆酸钠的结合能力下降，且过高的加酶量也会造成资源浪费[35]。因此，确定适宜的酶底比为0.3%。
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图 5 酶底比对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响Figure 5. Effect of enzyme to substrate ratio on the binding rate of sodium taurocholate2.1.6 底物浓度对酶解物活性的影响
由图6可知，底物浓度为3%时，酶解物结合牛磺胆酸钠的能力达到最高，结合率为（67.01%±0.41%），而增大底物浓度，酶解物的活性却反而下降，这一现象可能是因为过高的底物浓度影响了底物与酶的接触面积，从而影响酶解效果，使酶解物与牛磺胆酸钠的结合能力减小[36]。因此，确定适宜的底物浓度为3%。
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图 6 底物浓度对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响Figure 6. Effect of substrate concentration on the binding rate of sodium taurocholate2.2 响应面优化试验
基于单因素实验，以pH（A）、底物浓度（B）和酶底比（C）三个因素为自变量，以牛磺胆酸钠结合率为活性指标，设计并进行三因素三水平试验。响应面试验结果如表2所示。
表 2 响应面设计方案及结果Table 2. The design and results of the response surface experiment试验号 因素 牛磺胆酸钠结
合率（%）A pH B 底物浓度 C 酶底比 1 0 −1 1 65.83±0.12 2 −1 0 1 66.07±0.10 3 0 0 0 69.75±0.20 4 0 0 0 70.45±0.08 5 0 0 0 67.71±0.27 6 0 0 0 70.61±0.08 7 −1 1 0 56.32±0.25 8 −1 −1 0 63.00±0.10 9 1 1 0 59.11±0.39 10 −1 0 −1 58.40±0.47 11 1 −1 0 67.62±0.44 12 1 0 −1 65.56±0.15 13 0 1 −1 60.14±0.14 14 0 −1 −1 63.18±0.21 15 0 1 1 65.22±0.09 16 0 0 0 70.06±0.20 17 0 0 1 69.11±0.17 采用Design Expert 8.0.6.1软件对表2中的数据进行多元回归拟合，得到三个影响因素与响应值牛磺胆酸钠结合率（Y）之间的二次多项回归方程：
Y=69.72+2.20A−2.35B+2.37C−0.46AB−1.03AC+0.61BC−3.51A2−4.70B2−1.43C2
对回归模型及方程进行显著性检验，如表3所示，该模型的F值为9.54，P=0.0036<0.01，表明建立的回归模型存在极显著差异[37]，失拟项F值为4.66，P=0.0857>0.05，差异不显著说明由实验操作等偶然因素对试验结果的影响较小[38]，变异系数CV值为2.88%<10%，说明实验结果较为可靠[2]。综上，本次实验稳定性良好，建立的回归模型有较好的拟合度，可用于观察勐库大叶茶蛋白酶解产物随实验条件变化而变化的规律，分析和预测酶解物具有最高胆酸盐结合能力时的最优工艺条件[39]。
表 3 回归模型显著性检验Table 3. Analysis of variance for response surface quadratic model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值（Prob>F） 显著性 模型 301.95 9 33.55 9.54 0.0036 ** A pH 38.76 1 38.76 11.01 0.0128 * B 底物浓度 44.38 1 44.38 12.61 0.0093 ** C 酶底比 44.89 1 44.89 12.76 0.0091 ** AB 0.84 1 0.84 0.24 0.6409 AC 4.24 1 4.24 1.21 0.3084 BC 1.48 1 1.48 0.42 0.5378 A2 51.73 1 51.73 14.70 0.0064 ** B2 92.92 1 92.92 26.41 0.0013 ** C2 8.56 1 8.56 2.43 0.1628 残差 24.63 7 3.52 失拟项 19.15 3 6.38 4.66 0.0857 不显著 纯误差 5.48 4 1.37 总和 326.58 16 注：P<0.05，显著，显著性标为*；P<0.01，极显著，显著性标为**；P>0.05，不显著。 显著性检验表3中的F值、P值，可以反映出各个因素对酶解物结合胆酸盐能力的影响，F值越大，则该因素影响效果越强[40]，从表中可以看出，三个变量pH、底物浓度和酶底比对酶解物结合胆酸盐能力都有显著性影响，其中，底物浓度和酶底比呈现极显著性影响（P<0.01），据此可推测三个因素对酶解物胆酸盐结合能力的影响程度依次为：酶底比>底物浓度>pH。
两个因素之间的交互作用可以通过响应等高线图与曲面图反映出[41]。如图7所示，三个因素两两之间形成的图形，其形状都趋向椭圆，且其轴线与坐标轴之间都能形成一个明显的角度，即说明三个因素之间都存在较强的相互作用[42]。由图7可以看出，随着pH、底物浓度和酶底比的增大，胆酸盐结合率呈先上升后下降趋势，即说明具有极大值。随着底物浓度和酶底比的变化，图中响应面的陡峭程度起伏较大，说明底物浓度和酶底比对胆酸盐结合率的影响大于pH，与表3中方差分析结论一致[43]。
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图 7 pH、底物浓度、酶底比交互作用对牛磺胆酸钠结合率的影响Figure 7. Effect of the interaction of pH, substrate concentration and enzyme to substrate ratio on the binding rate of sodium taurocholate通过软件分析及预测，得出胃蛋白酶酶解勐库大叶茶蛋白制备降血脂肽的最佳工艺条件：pH2.13、底物浓度2.73%、酶底比0.33%。在此条件下，软件预测酶解物与牛磺胆酸钠的结合率为70.79%。对预测的最优条件进行实验验证，设置条件参数为pH2.1、底物浓度2.7%、酶底比0.3%、温度37 ℃，酶解时间3 h，得到的酶解产物与牛磺胆酸钠的实际结合率为（70.92%±0.12%），与软件预测值相接近，相对误差为（0.18%±0.14%）。说明该响应面模型具有可行性，软件的分析预测具有一定的准确性。
2.3 勐库大叶茶蛋白肽降血脂活性分析
2.3.1 茶叶蛋白肽对胆酸盐的吸附能力
胆汁酸是胆汁的主要成分，是胆固醇在肝脏代谢分解的产物，也是人体清除胆固醇的主要途径，而体内大部分胆汁酸是以胆酸盐的形式存在，因此，具有一定的胆酸盐结合能力的物质可被鉴定为具有一定的降脂活性[44]。胆酸盐大部分是以钠盐的形式存在，且据报道，牛磺胆酸钠（STC）是一种较难结合的共轭胆酸盐[45]。因此，以牛磺胆酸钠结合能力作为评价指标具有一定的代表性。
如图8所示，勐库大叶茶蛋白肽结合牛磺胆酸钠的能力，随着浓度升高而增大，即胆酸盐吸附能力与肽浓度呈依赖关系。在样品浓度为4 mg/mL时，牛磺胆酸钠的结合率达到了（45.15%±1.64%），活性高于汉麻降脂肽[46]（100 mg/mL时为28.1%）和卵形鲳鲹蛋白水解物[30]（100 mg/mL时为30.07%）。通过SPSS软件计算得到此条件下勐库大叶茶蛋白肽吸附胆酸盐能力的EC50，如表4所示为6.466 mg/mL。由此可见，勐库大叶茶蛋白肽具有显著的胆酸盐结合能力，其原因可能和胆酸盐与活性肽之间的结合力以及氨基酸的疏水性等因素相关[47]，具体活性关系还需后续进一步分离纯化后进行深入研究。
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图 8 不同样品浓度的牛磺胆酸钠结合率Figure 8. Binding rate of sodium taurocholate at different sample concentrations表 4 勐库大叶茶蛋白肽降血脂活性评价Table 4. Evaluation of lipid-lowering activity of peptide from Mengku-dayecha protein活性指标 EC50/IC50（mg/mL） 牛磺胆酸钠结合能力 6.466 胰脂肪酶抑制作用 0.310 胆固醇酯酶抑制作用 1.557 2.3.2 茶叶蛋白肽对胰脂肪酶的抑制作用
胰腺腺泡细胞产生的胰脂肪酶（PL），负责将膳食三酰甘油水解为二酰甘油、单酰甘油、甘油和脂肪酸阴离子[48]，抑制胰腺脂肪酶的活性可以有效降低小肠对脂肪的吸收效率，从而达到降脂的目的[49]。勐库大叶茶蛋白肽抑制胰脂肪酶的能力如图9所示。在0.5 mg/mL时，胰脂肪酶抑制率已超过50%，当浓度为4 mg/mL时，抑制率达到（74.33%±1.45%），通过软件计算得样品抑制胰脂肪酶活性的IC50，如表4所示为0.310 mg/mL，活性优于猴头菇多肽[50]（IC50：2.750 mg/mL）和驼乳蛋白水解物[51]（IC50：20.465 mg/mL）。可以看出，勐库大叶茶蛋白肽具有较强的抑制胰脂肪酶作用，其原因可能是茶叶蛋白肽能够阻止胰脂肪酶电子分布的改变，使酶的催化中心无法暴露，不能与底物结合，从而达到抑制酶活性的作用[52]。
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图 9 不同样品浓度的胰脂肪酶抑制作用Figure 9. Inhibition of pancreatic lipase at different sample concentrations2.3.3 茶叶蛋白肽对胆固醇酯酶的抑制作用
胰腺胆固醇酯酶是α/β水解酶家族中的一员，是一种胆盐激活的脂肪酶，它能催化膳食胆固醇酯在小肠的管腔内水解成游离胆固醇[53]。抑制胰胆固醇酯酶的活性可以使饮食中的血清胆固醇水平以合理的速度下降。因此，它被认为是治疗胆固醇相关疾病的重要靶点[54]。如图10所示，勐库大叶茶蛋白肽抑制胰胆固醇酯酶的能力与样品浓度呈剂量依赖关系，其抑制胆固醇酯酶活性的IC50如表4所示为1.557 mg/mL，远低于六堡茶茶褐素[55]（IC50：57.20 mg/mL）和亚麻籽肽[56]（IC50：4.57 mg/mL）。这可能是勐库大叶茶蛋白肽中的酸性氨基酸与酶形成了相互作用[57]。综上所述，酶解制备的勐库大叶茶蛋白肽展现出了潜在的降血脂能力，后续将通过进一步分离纯化得到降血脂活性更强的单体。
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图 10 不同样品浓度的胰胆固醇酯酶抑制作用Figure 10. Inhibition of pancreatic cholesterol esterase at different sample concentrations2.4 氨基酸组成分析
勐库大叶茶蛋白肽的氨基酸组成如表5所示，必需氨基酸的含量占总氨基酸的34.35%，疏水性氨基酸的比例高达31.94%，酸性氨基酸的含量很高，达到了41.06%。许多研究表明，疏水性氨基酸在降低胆固醇的活性中起重要作用，尤其是影响胆酸盐的结合能力[58]，疏水性氨基酸和胆汁酸之间的相互作用，会形成不溶性复合物，并以粪便形式排出体外，这是人体清除胆固醇的主要途径[59]。本研究中酶解物活性肽展现出了良好的胆酸盐结合能力，丰富的疏水性氨基酸可能发挥了重要作用。研究表明，酸性氨基酸的存在也有助于降血脂作用的发挥[60]，本研究中酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的含量占比最大，分别达到了11.50%和29.56%。另外，低比例的Met/Gly也会对降低胆固醇作用产生影响[59]，本研究中Met/Gly的比值约为1:5，这可能也对茶叶蛋白肽的降血脂作用起到了积极作用。综上，本研究中的勐库大叶茶蛋白酶解物活性肽在多个方面都展现出了具有潜在的降血脂作用，其具体的多肽组成和氨基酸序列分析有待进一步深入研究。
表 5 勐库大叶茶蛋白酶解物的氨基酸组成Table 5. Amino acid composition of hydrolysate from Mengku-dayecha protein氨基酸 含量（%） 天冬氨酸（Asp） 11.50 苏氨酸（Thr）* 4.21 丝氨酸（Ser） 4.82 谷氨酸（Glu） 29.56 甘氨酸（Gly）# 4.42 丙氨酸（Ala）# 4.60 半胱氨酸（Cys） 1.02 缬氨酸（Val）*# 5.98 蛋氨酸（Met）*# 0.91 异亮氨酸（Ile）*# 3.53 亮氨酸（Leu）*# 5.95 酪氨酸（Tyr） 3.05 苯丙氨酸（Phe）*# 3.46 组氨酸（His）* 3.83 赖氨酸（Lys）* 6.49 精氨酸（Arg） 3.57 脯氨酸（Pro）# 3.08 必需氨基酸（EAA） 34.35 疏水性氨基酸（HAA） 31.94 酸性氨基酸（AAA） 41.06 注：*EAA：必需氨基酸 （Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, Lys, His）；
#HAA：疏水性氨基酸 （Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Pro, Met）；AAA：酸性氨基酸 （Asp, Glu）。3. 结论
本研究以勐库大叶茶蛋白为原料，以牛磺胆酸钠结合率为主要指标，通过单因素实验和响应面试验，获得酶解勐库大叶茶蛋白制备降血脂肽的最佳工艺条件。结果表明：在pH2.1、底物浓度2.7%、酶底比0.3%、温度37 ℃条件下，用胃蛋白酶酶解3 h得到的酶解物，其牛磺胆酸钠结合率为（70.92%±0.12%），与软件预测值70.79%的相对误差仅为（0.18%±0.14%），说明该模型可以较准确地描述与预测水解勐库大叶茶蛋白的最优工艺条件。
对最优酶解物活性肽进行降血脂活性评价，发现其具有较强的牛磺胆酸钠结合能力（EC50=6.466 mg/mL），有利于机体分解代谢胆固醇并排出。勐库茶叶蛋白肽同时具有较好的胰脂肪酶抑制作用（IC50=0.310 mg/mL）和胆固醇酯酶抑制作用（IC50=1.557 mg/mL），有利于抑制机体对脂肪和胆固醇的吸收利用。对茶叶蛋白肽进行氨基酸组成分析，发现其中含量丰富的必需氨基酸（34.35%）、疏水性氨基酸（31.94%）和酸性氨基酸（41.06%），都在降血脂活性中发挥着重要作用。
本研究为茶叶蛋白资源的开发利用提供了新思路，为大叶茶蛋白肽的降血脂作用研究提供了前期理论依据。后续将对茶叶蛋白降血脂肽进一步分离纯化，并在细胞及动物水平上深入探讨其具体作用机制。
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图 1 蛋白酶种类对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响
注：不同字母表示差异显著，P<0.05；图2~图6、图8~图10同。
Figure 1. Effect of protease types on the binding rate of sodium taurocholate
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图 2 酶解时间对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响
Figure 2. Effect of enzymatic hydrolysis time on the binding rate of sodium taurocholate
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图 3 酶解温度对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响
Figure 3. Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the binding rate of sodium taurocholate
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图 4 pH对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响
Figure 4. Effect of pH on the binding rate of sodium taurocholate
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图 5 酶底比对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响
Figure 5. Effect of enzyme to substrate ratio on the binding rate of sodium taurocholate
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图 6 底物浓度对酶解物牛磺胆酸钠结合率的影响
Figure 6. Effect of substrate concentration on the binding rate of sodium taurocholate
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图 7 pH、底物浓度、酶底比交互作用对牛磺胆酸钠结合率的影响
Figure 7. Effect of the interaction of pH, substrate concentration and enzyme to substrate ratio on the binding rate of sodium taurocholate
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图 8 不同样品浓度的牛磺胆酸钠结合率
Figure 8. Binding rate of sodium taurocholate at different sample concentrations
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图 9 不同样品浓度的胰脂肪酶抑制作用
Figure 9. Inhibition of pancreatic lipase at different sample concentrations
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图 10 不同样品浓度的胰胆固醇酯酶抑制作用
Figure 10. Inhibition of pancreatic cholesterol esterase at different sample concentrations
表 1 响应面试验因素与水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
因素 水平 −1 0 1 A pH 1.5 2.0 2.5 B 底物浓度（%） 2 3 4 C 酶底比（%） 0.2 0.3 0.4 
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表 2 响应面设计方案及结果
Table 2 The design and results of the response surface experiment
试验号 因素 牛磺胆酸钠结
合率（%）A pH B 底物浓度 C 酶底比 1 0 −1 1 65.83±0.12 2 −1 0 1 66.07±0.10 3 0 0 0 69.75±0.20 4 0 0 0 70.45±0.08 5 0 0 0 67.71±0.27 6 0 0 0 70.61±0.08 7 −1 1 0 56.32±0.25 8 −1 −1 0 63.00±0.10 9 1 1 0 59.11±0.39 10 −1 0 −1 58.40±0.47 11 1 −1 0 67.62±0.44 12 1 0 −1 65.56±0.15 13 0 1 −1 60.14±0.14 14 0 −1 −1 63.18±0.21 15 0 1 1 65.22±0.09 16 0 0 0 70.06±0.20 17 0 0 1 69.11±0.17
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表 3 回归模型显著性检验
Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值（Prob>F） 显著性 模型 301.95 9 33.55 9.54 0.0036 ** A pH 38.76 1 38.76 11.01 0.0128 * B 底物浓度 44.38 1 44.38 12.61 0.0093 ** C 酶底比 44.89 1 44.89 12.76 0.0091 ** AB 0.84 1 0.84 0.24 0.6409 AC 4.24 1 4.24 1.21 0.3084 BC 1.48 1 1.48 0.42 0.5378 A2 51.73 1 51.73 14.70 0.0064 ** B2 92.92 1 92.92 26.41 0.0013 ** C2 8.56 1 8.56 2.43 0.1628 残差 24.63 7 3.52 失拟项 19.15 3 6.38 4.66 0.0857 不显著 纯误差 5.48 4 1.37 总和 326.58 16 注：P<0.05，显著，显著性标为*；P<0.01，极显著，显著性标为**；P>0.05，不显著。
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表 4 勐库大叶茶蛋白肽降血脂活性评价
Table 4 Evaluation of lipid-lowering activity of peptide from Mengku-dayecha protein
活性指标 EC50/IC50（mg/mL） 牛磺胆酸钠结合能力 6.466 胰脂肪酶抑制作用 0.310 胆固醇酯酶抑制作用 1.557
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表 5 勐库大叶茶蛋白酶解物的氨基酸组成
Table 5 Amino acid composition of hydrolysate from Mengku-dayecha protein
氨基酸 含量（%） 天冬氨酸（Asp） 11.50 苏氨酸（Thr）* 4.21 丝氨酸（Ser） 4.82 谷氨酸（Glu） 29.56 甘氨酸（Gly）# 4.42 丙氨酸（Ala）# 4.60 半胱氨酸（Cys） 1.02 缬氨酸（Val）*# 5.98 蛋氨酸（Met）*# 0.91 异亮氨酸（Ile）*# 3.53 亮氨酸（Leu）*# 5.95 酪氨酸（Tyr） 3.05 苯丙氨酸（Phe）*# 3.46 组氨酸（His）* 3.83 赖氨酸（Lys）* 6.49 精氨酸（Arg） 3.57 脯氨酸（Pro）# 3.08 必需氨基酸（EAA） 34.35 疏水性氨基酸（HAA） 31.94 酸性氨基酸（AAA） 41.06 注：*EAA：必需氨基酸 （Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, Lys, His）；
#HAA：疏水性氨基酸 （Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Pro, Met）；AAA：酸性氨基酸 （Asp, Glu）。
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期刊类型引用(1)
1. 岳尧，张震，黄万成，侯文琦，李明原，曲敏. 二氢杨梅素对鲢鱼肌球蛋白理化性质及蛋白构象的影响. 食品安全质量检测学报. 2023(15): 78-84 . 
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