Separation of Mori fructus Polysaccharides and Screening of Bioactive Fractions Based on Membrane Technology
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摘要: 采用了膜技术分级分离桑葚多糖（Mori fructus polysaccharide，MFP），并探究了不同分子量桑葚多糖的抗氧化、降血糖、抗过敏和体外乙醇脱氢酶活性。以桑葚为原料，通过热水浸提后采用300、50、5和1 kDa超滤膜对桑葚多糖进行分级分离，分别记为MFP300、MFP50、MFP5和MFP1。比较4种孔径的超滤膜分离的桑葚多糖组分主要成分、抗氧化活性、降血糖活性、抗过敏活性和体外乙醇脱氢酶活性的差异。结果表明，4种多糖的主要成分和生物活性表现出一定的差异。MFP1、MFP5、MFP50和MFP300的总糖含量分别为46.34%、68.45%、48.60%和66.32%，糖醛酸含量分别为3.34%、22.78%、16.11%和21.48%，还原糖含量分别为16.51%、6.03%、7.90%和6.67%。生物活性筛选表明，MFP300清除DPPH自由基和ABTS+自由基的IC50值分别为0.2235和0.2979 mg·mL−1，抑制透明质酸酶能力的IC50值为0.6634 mg·mL−1，激活体外乙醇脱氢酶能力的IC50值为10.2646 mg·mL−1，表现出最好的抗氧化、抗过敏和体外乙醇脱氢酶活性。MFP1抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶能力的IC50值分别为0.7944和4.6419 mg·mL−1，表现出最好的降血糖活性。综上所述，经膜技术分级分离得到的不同分子量范围的桑葚多糖在主要成分和生物活性方面有一定差异，为桑葚多糖分级技术的改进升级和桑葚多糖“构-效”关系研究提供理论基础。Abstract: Membrane technology was used for the graded separation of Mori fructus polysaccharides, and its antioxidant, hypoglycemic, anti-allergic and in vitro alcohol dehydrogenase activities were studied. The Mori fructus polysaccharides were carried out by hot water extraction using ultrafiltration membranes with pore sizes of 300, 50, 5 and 1 kDa, respectively, as MFP300, MFP50, MFP5 and MFP1. The differences in the main components, antioxidant activity, hypoglycemic activity, antiallergic activity and in vitro ethanol dehydrogenase activity of Mori fructus polysaccharide fractions separated by ultrafiltration membranes of four pore sizes were compared. The results showed that the major components and biological activities of the four polysaccharides showed some differences. The total sugar content of MFP1, MFP5, MFP50 and MFP300 were 46.34%, 68.45%, 48.60% and 66.32%, respectively, while the glyoxylate content were 3.34%, 22.78%, 16.11% and 21.48%, respectively, and the reducing sugar content were 16.51%, 6.03%, 7.90% and 6.67%, respectively. Bioactivity screening showed that MFP300 scavenged DPPH radicals and ABTS+ radicals with IC50 values of 0.2235 and 0.2979 mg·mL−1, respectively, inhibited hyaluronidase with IC50 values of 0.6634 mg·mL−1, and activated in vitro ethanol dehydrogenase with IC50 values of 10.2646 mg·mL−1. MFP300 was exhibited the best antioxidant, anti-allergic and in vitro ethanol dehydrogenase activities compared with the other three components. Compared with the other three components, MFP1 exhibited the best hypoglycemic activity with IC50 values of 0.7944 and 4.6419 mg·mL−1 for its ability to inhibit α-glucosidase and α-amylase, respectively. In conclusion, there were some differences in the main components and biological activities of Mori fructus polysaccharides obtained by membrane classification and separation, which could provide a theoretical basis for the improvement and upgrading of Mori fructus polysaccharide classification technology and the study of the ''structure-effect'' relationship of Mori fructus polysaccharides.
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桑葚（Mori fructus）为桑树的成熟果实，属于桑科植物桑（Morus alba L.）的果穗。桑葚味甘性寒，酸甜汁多，入心、肝、肾经，为常食的水果之一，被收录于中国“药食同源”目录和《中国药典》2020版，具有补肝益肾、生津润燥、乌发明目、利尿、保健和消暑等功效[1]。现代研究表明，桑葚中含有多种维生素、蛋白质、游离氨基酸、有机酸和微量元素等营养成分和多酚类、多糖、生物碱、类胡萝卜素等多种活性成分[2-3]。桑葚多糖（Mori fructus polysaccharide，MFP）是桑葚中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、保护肝脏等多种生物活性[4]。
随着对多糖构-效关系的深入研究，多糖的生物活性受到其相对分子量、单糖组成、糖苷键类型、分子支链分支度及化学修饰等影响[5]。不同分子量对多糖的生物活性有一定的影响[6]，而筛选出活性较好的分子量范围有利于提高多糖的利用度，开发出活性更好的多糖。目前常用的多糖分级技术为柱层析法和分级醇沉法[7]，而利用膜技术对多糖进行分级，可以提高分级效率、控制多糖分子量范围，并且确保多糖的结构和纯度不受化学试剂的影响。蔡铭等[8]采用膜技术分级分离灵芝多糖，发现3种粗多糖均有一定的抗氧化能力，其中GLP100的羟自由基和DPPH自由基清除能力好于其他两种多糖，GLP1的ABTS+自由基清除能力比其他两种多糖效果更好。崔婷婷等[9]利用膜技术分级分离锁阳多糖，发现在50~100 kDa分子量范围的锁阳多糖有更好的抗氧化活性。
目前对于桑葚多糖分级常用的方法为柱层析法[10-11]和分级醇沉法[12]。暂无文献采用膜技术对桑葚多糖进行分级，且无研究表明不同分子量的桑葚多糖具有生物活性的差异。所以本实验采用膜技术对桑葚多糖进行分级，对不同分子量的桑葚多糖的主要化学成分进行测定，以及对不同分子量的桑葚多糖进行活性筛选。通过以上研究为后期桑葚多糖分级技术的改进升级和桑葚多糖生物活性的开发利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
桑葚干品 购买于贵州中医药大学第一附属医院，产品批号210702，四川博仁药业有限责任公司；葡萄糖（纯度≥98%）、葡萄糖醛酸（纯度≥96%） 上海西宝生物科技股份有限公司；苯酚、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）、焦磷酸钠 上海凛恩科技发展有限公司；牛血清蛋白、α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU）、阿卡波糖、α-淀粉酶（酶活力1 KU）、木瓜蛋白酶（酶活力100 kU/g）、可溶性淀粉、透明质酸酶、透明质酸钠、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）、乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH） 北京索莱宝科技有限公司；浓硫酸 国药集团化学试剂有限公司；水杨酸、硫酸亚铁、无水碳酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、无水乙醇 天津市致远化学试剂有限公司；抗坏血酸（Vitamin C，VC） 天津博迪化工股份有限公司；四硼酸钠 天津市永大化学试剂有限公司；考马斯亮蓝 上海蓝季生物科技发展有限公司；咔唑 上海麦克林生化科技有限公司；以上试剂 均为分析纯。
HC-GL1812-1X多功能膜分离实验系统 成都和诚过滤技术有限公司；XS105DU METTLER TOLEDO十万分之一电子天平 国际贸易（上海）有限公司电子天平；Max Plus 384光吸收酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司酶标仪；FD-80冷冻干燥机 北京博益康医院实验仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 原料预处理
取一定量的桑葚，70 ℃烘干，用粉碎机粉碎，过40目筛后得到桑葚干粉。以石油醚为溶剂，采用冷却回流法脱脂，料液比1:2 g·mL−1，脱脂2次，每次2 h，温度65 ℃，滤渣为脱脂桑葚样品，备用。
1.2.2 桑葚多糖的提取与纯化
参考谭西[13]的提取方法，并进行一定的修改。取200 g的脱脂桑葚样品，以水为溶剂，在热水（90 °C）中浸提2 h，料液比1:15 g·mL−1。对滤液离心（转速4000 r·min−1，10 min）和减压过滤后保存滤液，对滤渣以相同条件进行热水浸提。反复2次并合并滤液，最后用旋转蒸发仪浓缩滤液至1000 mL左右得到浓缩液。参考王倩等[14]采用三氯乙酸+木瓜蛋白酶法进行脱蛋白，并进行一定的修改。向浓缩液中加入3%三氯乙酸溶液，体积比1:1，室温放置20 min，离心收集上清液。调节上清液pH至6~7，加入3%木瓜蛋白酶，50 ℃反应45 min，离心（转速4000 r·min−1，10 min）收集上清液。此过程进行两次，最终得到桑葚多糖粗提液。
1.2.3 桑葚多糖粗提液的分级分离
取桑葚多糖粗提液，用300 kDa滤膜在0.2 MPa，5.5 L·min−1条件下超滤分级，截留液用旋转蒸发仪浓缩后按体积比1:4加入乙醇，4 °C下静置过夜。次日离心（转速4000 r·min−1，10 min）得沉淀，真空冷冻干燥得多糖，记为MFP300；取300 kDa滤过液，用50 kDa滤膜进行上述操作得多糖，记为MFP50；取50 kDa滤过液，用5 kDa滤膜进行上述操作得多糖，记为MFP5；取5 kDa滤过液，用1 kDa滤膜进行上述操作得多糖，记为MFP1。
1.2.4 桑葚多糖中总糖含量的测定
1.2.4.1 标准曲线绘制
参考论文中的苯酚-硫酸法[13]。标准溶液的配制：准确称取10.00 mg葡萄糖标准品，将浓度配制为0.1 mg·mL−1。标准曲线的绘制：吸取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mL葡萄糖标准溶液，用蒸馏水补至0.50 mL，各加入0.30 mL的5%苯酚溶液，迅速加入1.50 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴30 min，冷却至室温后，490 nm处测定吸光度A490。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到葡萄糖标准曲线回归方程为y=5.172x+0.109，R2=0.999。
1.2.4.2 总糖含量的测定
用1.2.4.1中的方法测定吸光度。桑葚多糖中总糖含量计算公式为：
W(%)=(A−0.109)×m×105.172×100 (1) 式中：W为桑葚多糖中总糖含量，%；A为样品溶液反应后在490 nm处的吸光度；m为稀释倍数。
1.2.5 桑葚多糖中蛋白质含量的测定
1.2.5.1 标准曲线的绘制
参考论文中的考马斯亮蓝G-250法[13]。标准溶液的配制：准确吸取1 mL 5 mg·mL−1牛血清蛋白，将浓度配制为0.2 mg·mL−1。标准曲线的绘制：吸取0、20、40、60、80、100、120、140 μL牛血清蛋白溶液于试管中，补蒸馏水至200 µL，摇匀，各加入1 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，避光放置10 min，595 nm处测定吸光度值A595。以牛血清蛋白溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到蛋白质标准曲线回归方程为y=0.704x+0.2221，R2=0.9928。
1.2.5.2 蛋白质含量的测定
用1.2.5.1中的方法测定吸光度。桑葚多糖中蛋白质含量计算公式为：
Y(%)=(A−0.2221)×m×100.704×100 (2) 式中：Y为桑葚多糖中蛋白质含量，%；A为样品溶液反应后在595 nm处的吸光度；m为稀释倍数。
1.2.6 桑葚多糖中糖醛酸含量的测定
1.2.6.1 标准曲线的绘制
参考咔唑-硫酸法[15]。标准溶液的配制：准确称取10.00 mg葡萄糖醛酸标准品，将浓度配制为0.1 mg·mL−1。标准曲线的绘制：准确吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖醛酸标准溶液，加蒸馏水定容至1 mL，冰水浴中加入5 mL四硼酸钠-硫酸溶液，旋涡混合器混匀，沸水浴20 min，取出后立即冷却至室温，加0.15%咔唑溶液0.2 mL，摇匀，室温反应2 h，523 nm处测定吸光度值A523。以葡萄糖醛酸溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到糖醛酸标准曲线回归方程为y=5.2456x+0.1，R2=0.9992。
1.2.6.2 糖醛酸含量的测定
用1.2.6.1中的方法测定吸光度。桑葚多糖中糖醛酸含量计算公式为：
T(%)=(A−0.1)×m×105.2456×100 (3) 式中：T为桑葚多糖中糖醛酸含量，%；A为样品溶液反应后在523 nm处的吸光度；m为稀释倍数。
1.2.7 桑葚多糖中还原糖含量的测定
1.2.7.1 标准曲线的绘制
参考文献[16]DNS法。标准溶液的配制：准确称取100.00 mg葡萄糖标准品，将浓度配制为1 mg·mL−1。标准曲线的绘制：精确吸取葡萄糖标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，分别置于25 mL试管中，不足1 mL的用蒸馏水补充至1 mL，再加入DNS溶液2 mL，混合均匀后，沸水浴5 min，迅速流水冷却，加水至刻度线，550 nm测定吸光度值A550。空白调零，以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。得到还原糖标准曲线回归方程为y=0.3529x+0.0913，R2=0.9993。
1.2.7.2 还原糖含量的测定
用1.2.7.1中的方法测定吸光度。桑葚多糖中还原糖含量计算公式为：
D(%)=(A−0.0913)×m×10.3529×100 (4) 式中：D为桑葚多糖中还原糖含量，%；A为样品溶液反应后在550 nm处的吸光度；m为稀释倍数。
1.2.8 不同分子量桑葚多糖的抗氧化活性测定
1.2.8.1 DPPH自由基清除活性测定
DPPH自由基清除活性测定选参考Zhang等[17]的方法，并稍作修改。取3 mL 0.2 mg·mL−1的DPPH乙醇溶液，与2 mL MFP溶液充分混匀，避光静置20 min后，以无水乙醇作空白调零，517 nm波长测吸光度A517，以蒸馏水代替多糖溶液作阴性对照，VC作阳性对照，DPPH自由基清除率计算公式如下所示。
清除率 (%)=(1−A1−A2A0)×100 (5) 式中：A1为样品溶液的吸光度；A0为空白溶液吸光度；A2为不含DPPH的样品溶液吸光度。
1.2.8.2 ABTS+自由基清除活性测定
ABTS+自由基清除活性测定参考田义敏[18]的方法。精密称取38.90 mg ABTS和15.16 mg过硫酸钾溶液混合，分别用蒸馏水定容至10 mL，按1:1混合后置于4 ℃冰箱中避光反应12~16 h，形成ABTS储备液。使用前用水稀释成工作液，使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02。将MFP溶液和ABTS储备液溶液按1:1体积加入96孔板中，在室温黑暗条件下反应15 min，以蒸馏水代替多糖溶液作为空白，测定在734 nm下的吸光度A734，VC做阳性对照，ABTS+自由基清除率计算公式如下所示。
清除率 (%)=(1−A1−A2A0)×100 (6) 式中：A1为样品溶液的吸光度；A0为空白溶液吸光度；A2为不含ABTS的样品溶液吸光度。
1.2.9 不同分子量桑葚多糖的降血糖活性测定
1.2.9.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
α-葡萄糖苷酶抑制活性测定参考龙晓珊[19]的方法，并稍作修改。α-葡萄糖苷酶溶液（0.1 U·mL−1）由PBS缓冲溶液（0.1 mol·L−1，pH6.9）配制。将50 μL MFP溶液和25 μL α-葡萄糖苷酶溶液混合，37 ℃反应10 min，之后加入25 μL对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（1.5 mmol·L−1）。充分混匀后于37 ℃反应30 min，反应结束后加入100 μL碳酸钠（0.2 mol·L−1）停止反应，在405 nm下测定其吸光度A405，以阿卡波糖作为阳性对照，计算α-葡萄糖苷酶抑制率，抑制率公式如下所示。
抑制率 (%)=(1−A1−A2A0)×100 (7) 式中：A1为样品溶液得吸光度；A2为不含α-葡萄糖苷酶的样品溶液吸光度；A0为空白溶液的吸光度。
1.2.9.2 α-淀粉酶抑制活性测定
α-淀粉酶抑制活性测定参考Chen等[20]方法，并稍作修改。α-淀粉酶溶液（0.5 mg·mL−1）由PBS缓冲溶液（0.1 mol·L−1，pH6.9）配制。将100 μL MFP和100 μL α-淀粉酶溶液混合，37 ℃水浴10 min，加入200 μL 1%可溶性淀粉溶液，37 ℃反应10 min，沸水浴中反应10 min。沸水浴结束后加入200 μL DNS试剂，在沸水浴显色反应10 min。反应结束后，反应物冷却至室温并加入4 mL蒸馏水稀释，在540 nm处测定吸光度A540，抑制率公式如下所示。
抑制率 (\text{%}) =(1−A1−A2A3−A4)×100 (8) 式中：A1为多糖溶液及α-淀粉酶溶液正常反应的吸光度；A2为用缓冲液代替α-淀粉酶溶液时的吸光度；A3为用缓冲液代替多糖溶液时的吸光度；A4为用缓冲液代替多糖溶液及α-淀粉酶溶液时的吸光度。
1.2.10 不同分子量桑葚多糖的透明质酸酶抑制活性测定
透明质酸酶抑制活性采用CTAB浊度法进行测定，参考易晓敏[21]的方法，并稍作修改。以pH6.0，0.2 mol·L−1乙酸-乙酸钠溶液为缓冲液，用缓冲液配制0.5 mg·mL−1透明质酸酶的溶液及3.44 mg·mL−1透明质酸钠溶液。取100 μL MFP溶液于10 mL试管中，加入100 μL透明质酸酶溶液，再用缓冲液补充定容至0.9 mL，振荡均匀后，置于37 ℃的恒温水浴中，预热15 min后加入100 μL透明质酸钠溶液，并开始计时，准确计时10 min，迅速加入4 mL CTAB溶液（以2% NaOH溶液为溶剂配制的2.5% CTAB溶液）终止反应，混合均匀，常温静置10 min后测定反应液在405 nm波长下的吸光度A405，抑制率公式如下所示。
抑制率 (\text{%}) =(1−A1−A2A3−A4)×100 (9) 式中：A1为多糖溶液及透明质酸酶溶液正常反应的吸光度；A2为用缓冲液代替透明质酸酶溶液时的吸光度；A3为用缓冲液代替多糖溶液时的吸光度；A4为用缓冲液代替多糖溶液及透明质酸酶时的吸光度。
1.2.11 不同分子量桑葚多糖体外乙醇脱氢酶活性测定
乙醇脱氢酶活性采用瓦勒-霍赫法测定，参考了邓青芳[22]的方法。在酶标板中依次加入100 μL焦磷酸钠缓冲液（pH8.8）、70 μL 2 mmol·L−1 NAD+、35 μL 2 mol·L−1乙醇及20 μL MFP溶液，混匀后，35 ℃下密封温育5 min，时间到后立即向酶标板中加入20 μL 0.1 U·mL−1 ADH，摇匀后立即用酶标仪测定其340 nm处的吸光度A340，每隔10 s读取1次吸光度值，连续测定5 min，并记录数据，空白组则是以20 μL蒸馏水代替样品溶液，其余步骤不变，最后根据公式（10）计算ADH活性、公式（11）计算ADH的抑制（激活）率。
E(U⋅mL−1)=ΔA340×反应总体积酶量×1066.2×103 (10) 抑制(激活)率(%)=E0−E1E0×100 (11) 式中：E为ADH酶活性，U·mL−1；E1为样品组酶活性，U·mL−1；E0为空白组酶活性，U·mL−1；ΔA340为反应最初线性部分340 nm波长处吸光度每1 min的增值；6.2为NAD+在340 nm处的摩尔消光系数。
1.3 数据处理
本文所有实验数据均重复3次，使用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据处理，P<0.05表示显著差异，P<0.01表示极显著差异。采用GraphPad Prism 8软件作图，实验结果采用平均值±标准偏差来表示。
2. 结果与分析
2.1 不同分子量的桑葚多糖的主要成分分析
采用水提醇沉法从桑葚中提取多糖，并使用多功能膜分离设备对提取液进行分级得到MFP1、MFP5、MFP50和MFP300。四个组分颜色变化由浅到深，MFP1颜色最浅，为紫红色；MFP300颜色最深，为深紫色。四个组分的主要成分如表1所示。结果表明，MFP5中总糖和糖醛酸含量最高，为68.45%±1.53%和22.78%±2.32%；其次是MFP300，为66.32%±0.70%和21.48%±1.24%；MFP1两者含量最低，为46.34%±0.73%和3.34%±1.57%。MFP5中还原糖含量最低，为6.03%±3.92%；MFP1中还原糖含量最高，为16.51%±0.83%。蛋白质含量普遍偏低，MFP300含量最高，为3.67%±0.18%，MFP1含量最低，为0.10%±0.08%。桑葚多糖的主要成分含量不是按照分子量大小顺序依次降低，且多糖主要集中在MFP5和MFP300两个组分。四个组分中蛋白质含量较低，说明纯化效果较好，蛋白质对活性影响可以忽略。
表 1 不同分子量桑葚多糖的主要成分含量Table 1. Contents of main components of MFP with different molecular weightsMFP组分 总糖（%） 蛋白质（%） 还原糖（%） 糖醛酸（%） MFP1 46.34±0.73a 0.10±0.08a 16.51±0.83b 3.34±1.57a MFP5 68.45±1.53b 1.94±0.1c 6.03±3.92a 22.78±2.32c MFP50 48.60±1.75a 0.89±0.21b 7.90±2.46a 16.11±2.49b MFP300 66.32±0.70b 3.67±0.18d 6.67±0.48a 21.48±1.24c 注：同一列不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。 2.2 不同分子量桑葚多糖的抗氧化活性
2.2.1 DPPH自由基清除活性
四个组分的DPPH自由基清除活性如图1a所示，4种多糖均有较好的DPPH自由基清除活性，其中，MFP300在0.1、0.6和1.2 mg·mL−1浓度下清除率最高，且与其他三组多糖相比有极显著差异（P<0.01），所以选择MFP300研究其“量-效”关系，如图1b所示。MFP300的DPPH自由基清除能力随浓度的升高而增强。当MFP300浓度为1.2 mg·mL−1时，清除率最大为97.09%±0.14%，与同等浓度下VC对DPPH自由基的清除率无显著差异（P>0.05）。MFP300的IC50值为0.2235 mg·mL−1，VC的IC50值为0.005276 mg·mL−1，与钱燕芳等[23]通过超声提取得到的桑葚多糖相比，MFP300的IC50值较小，表现出较好的DPPH自由基清除活性。
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2.2.2 ABTS+自由基清除活性
四个组分的ABTS+自由基清除活性如图2a所示，当浓度为0.6 mg·mL−1时，4种多糖的清除率均大于50%，其中MFP300活性最好，在浓度为1.2 mg·mL−1时，MFP300的ABTS+自由基清除率为98.23%±0.54%，与MFP1和MFP5相比有极显著差异（P<0.01），与MFP50相比有显著差异（P<0.05），所以选择MFP300研究其“量-效”关系，如图2b所示。MFP300的IC50值为0.2979 mg·mL−1，VC的IC50值为0.02981 mg·mL−1；在测定范围内，MFP300对ABTS+自由基的清除率随浓度先升高后趋于平缓，在1.2 mg·mL−1时与同浓度下的VC无显著差异（P>0.05），与Deng等[24]采用酶辅助提取的桑葚多糖相比，MFP300的IC50值更小，表明MFP300有较好的ABTS+自由基清除能力。
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图 2 不同分子量桑葚多糖对ABTS+自由基的清除能力注：a：不同分子量桑葚多糖的ABTS+自由基清除能力的筛选；b：MFP300的ABTS+自由基清除能力的“量-效”曲线。Figure 2. Scavenging ability of MFPs of different molecular weight against ABTS+ free radicals多糖是天然高分子多聚物，分子量高低会影响其生物活性。一般而言，低分子量多糖更容易进入生物体内，活性更好；但多糖并非分子量越低活性越好，因为分子量过低，无法形成多糖产生活性的聚合结构[25]。Su等[26]发现木耳多糖的DPPH、ABTS+和羟自由基清除活性与其分子量呈显著正相关；李小蓉等[27]发现海带中高分子量的岩藻多糖具有较好的抗衰老活性。与其他组分相比，MFP300分子量较大，可形成较多产生活性的聚合结构，进而表现出较好的DPPH和ABTS+自由基清除能力。
2.3 不同分子量桑葚多糖的降血糖活性
2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性
α-葡萄糖苷酶抑制剂可降低食物中葡萄糖的消化速率，抑制餐后血糖的升高，是防治糖尿病的有效手段之一[28]。如图3a所示，不同分子量的桑葚多糖对α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用，且有随着浓度升高抑制率增强的趋势。在同等浓度对比下，MFP1与阿卡波糖相比均无显著差异（P>0.05）；1 mg·mL−1时，MFP1抑制率已超过50%，为63.02%±4.99%，与其他组多糖相比有显著差异（P<0.05），故选取MFP1绘制其“量-效”关系曲线，如图3b所示。MFP1的IC50值为0.7944 mg·mL−1，阿卡波糖的IC50值为0.4050 mg·mL−1，表明阿卡波糖的抑制效果要优于MFP1，但与文献报道的相比[29]，MFP1的IC50更小。综上所述，MFP1有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
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图 3 不同分子量桑葚多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力注：a：不同分子量桑葚多糖的α-葡萄糖苷酶抑制能力的筛选；b：MFP1的α-葡萄糖苷酶抑制能力的“量-效”曲线。Figure 3. Inhibitory activity of MFPs of different molecular weights against α-glucosidase2.3.2 α-淀粉酶抑制活性
α-淀粉酶抑制剂可降低食物中淀粉的消化速率，抑制餐后血糖的升高是防治糖尿病的有效手段之一[30]。如图4a所示，不同分子量的桑葚多糖对α-淀粉酶均有一定抑制作用，且有随着浓度升高抑制率增强的趋势。与其他三组多糖相比，MFP1表现出更强的抑制活性：5 mg·mL−1时，MFP1的抑制率超过50%，为69.51%±2.23%；10 mg·mL−1时，MFP1的抑制率极显著地高于其他三组多糖和阿卡波糖的抑制率（P<0.01），所以选取MFP1研究其“量-效”曲线如图4b所示。MFP1的IC50值为4.6419 mg·mL−1，阿卡波糖的IC50值为1.5916 mg·mL−1，表明阿卡波糖的抑制效果要优于MFP1，但与已有文献相比[29]，MFP1的IC50更小。结果表明，MFP1有较好的α-淀粉酶抑制活性。
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图 4 不同分子量桑葚多糖对α-淀粉酶的抑制能力注：a：不同分子量桑葚多糖的α-淀粉酶抑制能力筛选；b：MFP1的α-淀粉酶抑制能力的“量-效”曲线。Figure 4. Inhibitory ability of MFPs of different molecular weights on α-amylase2.4 不同分子量桑葚多糖的抗过敏活性
透明质酸酶是降解透明质酸的水解酶，是机体结缔组织细胞外基质的主要成分，与大多数由IgE介导的I型和T细胞介导的IV型过敏反应有关，因此，透明质酸酶体外抑制实验是体外快速筛选抗过敏药物的有效方法[31]。如图5a所示，不同分子量的桑葚多糖对透明质酸酶均有一定的抑制作用。其中，MFP300的抑制率随浓度增大而升高，且在1.2 mg·mL−1时，抑制率为53.9%±5.87%，与其他三组有显著差异（P<0.05），所以选取MFP300研究其“量-效”关系，如图5b所示。MFP300的透明质酸酶抑制能力的IC50值为0.6634 mg·mL−1，表明MFP300有较好的抗过敏活性。
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图 5 不同分子量桑葚多糖对透明质酸酶的抑制能力注：a：不同分子量桑葚多糖的透明质酸酶抑制能力筛选；b：MFP300的透明质酸酶抑制能力的“量-效”曲线。Figure 5. Inhibitory ability of MFPs of different molecular weight on hyaluronidase2.5 不同分子量桑葚多糖的体外乙醇脱氢酶活性
ADH是一种肝脏中重要的代谢酶，它能利用NAD+作为辅助性因子催化乙醇氧化生成还原型辅酶I（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和相应的羰基化合物，这是哺乳动物肝脏酒精代谢的限速步骤[13]。因此，通过检测ADH体外活性来评价活性物质对肝脏的保护作用具有重要意义。如图6a所示，大部分桑葚多糖在体外表现出激活ADH活性。尽管MFP300在低浓度中表现出抑制ADH活性，但其在中和高浓度表现出较好的激活ADH活性，与其他三组相比有显著差异（P<0.05），故选取MFP300研究其“量-效”关系，如图6b所示。MFP300对ADH的激活能力的IC50为10.2646 mg·mL−1，这与文献报道的不同[32]，这可能是提取和纯化工艺不同导致的。
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图 6 不同分子量桑葚多糖的乙醇脱氢酶活性注：a：不同分子量桑葚多糖的ΑDΗ活性筛选；b：MFP300的ADH活性的“量-效”曲线。Figure 6. Alcohol dehydrogenase activity of MFPs of different molecular weight3. 讨论与结论
分子量是影响多糖生物活性的一个重要因素，而不同来源的多糖产生生物活性的最佳分子量范围不同[33]。朱晓冉等[34]发现小分子量（分子量<30 ku）的黑木耳多糖的抗氧化活性更好；Xu等[35]利用H2O2对黑加仑多糖进行降解，得到DBCP-1（1.3×104 kDa）和DBCP-2（9.62×103 kDa）两种低分子量多糖，并发现降解后的多糖比未降解的多糖有更好的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性。
本实验采用300、50、5和1 kDa四种不同孔径超滤膜对桑葚多糖进行分级。不同分子量段多糖的主要成分有明显的不同，MFP1、MFP5、MFP50和MFP300的总糖含量分别为46.34%、68.45%、48.60%和66.32%，糖醛酸含量分别为3.34%、22.78%、16.11%和21.48%，还原糖含量分别为16.51%、6.03%、7.90%和6.67%。此外，体外生物活性表明，MFP300的抗氧化、抗过敏和ADH活性最好，而MFP1的降血糖活性最好，这表明分子量大小会影响桑葚多糖的生物活性。综上所述，本实验利用不同孔径滤膜对桑葚提取液进行处理，多糖的主要化学成分和生物活性差异说明膜技术在桑葚多糖分级分离中的应用是有效的，为桑葚多糖的分级分离提供了一种新的思路，也为桑葚多糖的生物活性测定提供理论及实验基础。
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图 2 不同分子量桑葚多糖对ABTS+自由基的清除能力
注：a：不同分子量桑葚多糖的ABTS+自由基清除能力的筛选；b：MFP300的ABTS+自由基清除能力的“量-效”曲线。
Figure 2. Scavenging ability of MFPs of different molecular weight against ABTS+ free radicals
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图 3 不同分子量桑葚多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力
注：a：不同分子量桑葚多糖的α-葡萄糖苷酶抑制能力的筛选；b：MFP1的α-葡萄糖苷酶抑制能力的“量-效”曲线。
Figure 3. Inhibitory activity of MFPs of different molecular weights against α-glucosidase
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图 4 不同分子量桑葚多糖对α-淀粉酶的抑制能力
注：a：不同分子量桑葚多糖的α-淀粉酶抑制能力筛选；b：MFP1的α-淀粉酶抑制能力的“量-效”曲线。
Figure 4. Inhibitory ability of MFPs of different molecular weights on α-amylase
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图 5 不同分子量桑葚多糖对透明质酸酶的抑制能力
注：a：不同分子量桑葚多糖的透明质酸酶抑制能力筛选；b：MFP300的透明质酸酶抑制能力的“量-效”曲线。
Figure 5. Inhibitory ability of MFPs of different molecular weight on hyaluronidase
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图 6 不同分子量桑葚多糖的乙醇脱氢酶活性
注：a：不同分子量桑葚多糖的ΑDΗ活性筛选；b：MFP300的ADH活性的“量-效”曲线。
Figure 6. Alcohol dehydrogenase activity of MFPs of different molecular weight
表 1 不同分子量桑葚多糖的主要成分含量
Table 1 Contents of main components of MFP with different molecular weights
MFP组分 总糖（%） 蛋白质（%） 还原糖（%） 糖醛酸（%） MFP1 46.34±0.73a 0.10±0.08a 16.51±0.83b 3.34±1.57a MFP5 68.45±1.53b 1.94±0.1c 6.03±3.92a 22.78±2.32c MFP50 48.60±1.75a 0.89±0.21b 7.90±2.46a 16.11±2.49b MFP300 66.32±0.70b 3.67±0.18d 6.67±0.48a 21.48±1.24c 注：同一列不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。 
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