Extraction Process Optimization, Active Ingredient Screening and Structure Study of Dendrobium officinale Protein
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摘要: 探究对提取工艺优化后筛选的铁皮石斛蛋白对损伤的大鼠胃黏膜上皮细胞的修复作用。通过单因素考察提取时间、料液比和硫酸铵饱和度对铁皮石斛水溶性总蛋白收率的影响，以铁皮石斛水溶性总蛋白收率为响应值考察最佳提取工艺。采用蛋白纯化技术，用DEAE弱阴离子交换柱层析法分离铁皮石斛水溶性总蛋白，以大鼠胃黏膜上皮细胞（GECs-1）建立损伤模型并进行活性筛选。采用紫外扫描、红外光谱及圆二色谱进行结构表征。结果显示，铁皮石斛水溶性总蛋白最佳提取工艺为：提取时间6 h，料液比1:27 g/mL，硫酸铵饱和度80%，此条件下铁皮石斛蛋白收率可达8.65%±0.13%，与预测值接近；铁皮石斛水溶性总蛋白在优化提取工艺的基础上纯化得到三种蛋白，其中，TPSHP-2（铁皮石斛蛋白-2）在280 nm处有最大吸收峰，主要为β-折叠结构，且对乙醇损伤的大鼠胃黏膜上皮细胞的修复效果最好。优化提取工艺后纯化得到的TPSHP-2对损伤的大鼠胃黏膜上皮细胞具有修复作用。Abstract: To explore the repairing effect of Dendrobium officinale protein on the injured rat gastric mucosa epithelial cells after the extraction process was optimized. The effects of extraction time, solid-liquid ratio and ammonium sulfate saturation during extraction on the yield of water-soluble total protein of Dendrobium officinale were investigated by single factor, and the optimal extraction process was investigated with the yield of water-soluble total protein of Dendrobium officinale as the response value. Using protein purification technology, DEAE weak anion exchange column chromatography was used to separate the water-soluble total protein of Dendrobium officinale, and rat gastric mucosa epithelial cells (GECs-1) were used to establish an injury model and screen its activity. The structures were characterized by UV scanning, infrared spectroscopy and circular dichroism. The results showed that the optimal extraction process for the water-soluble total protein of Dendrobium officinale was as follows: Extraction time 6 h, solid-liquid ratio 1:27 g/mL, ammonium sulfate saturation 80%, the extraction rate of Dendrobium officinale protein could reach 8.65%±0.13% under these conditions. It was close to the predicted value. Three kinds of proteins were purified from the water-soluble total protein of Dendrobium officinale on the basis of the optimized extraction process. Among them, TPSHP-2 (Dendrobium officinale protein-2) had the maximum absorption peak at 280 nm, which was mainly β-sheet structure, and had the best repair effect on ethanol-injured rat gastric mucosa epithelial cells. The purified TPSHP-2 after the optimized extraction process has a repairing effect on the injured rat gastric mucosa epithelial cells.
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Keywords:
- Dendrobium officinale /
- protein /
- response surface /
- extraction /
- yield /
- purification /
- in vitro activity
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近年来，由于人们饮食的不规律、不健康和长期酗酒及非甾体抗炎药的滥用等原因，胃黏膜损伤的概率逐渐呈上升趋势，导致胃黏膜损伤，出现出血、溃疡等症状，长期可能发展为胃炎，甚至胃癌[1-2]。铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科石斛属多年生附生草本植物，为我国传统的名贵中药材[3]。中医古籍记载其具有“厚肠胃”、“清胃热除虚热”、“健脾开胃”功效，是临床常用的“胃肠药”。铁皮石斛具有一定的药用价值，目前研究基本上都集中在其多糖、生物碱、类黄酮等对胃黏膜损伤的保护作用[4-7]。
现有研究表明，铁皮石斛多糖是发挥抗胃黏膜损伤活性的关键化合物，也有研究表明铁皮石斛蛋白对胃黏膜损伤具有修复作用[8]。胃黏膜损伤后，IL-6、TNF-α等炎症因子表达量明显上升，且为了起到修复作用，TFF2、EGF、EGFR等生长调节因子表达量升高[9-14]。铁皮石斛蛋白在治疗损伤时，可通过降低TFF、PPARgama等因子[15-18]，对AKT信号通路产生一定影响，从而调控Bax和Bcl-2等凋亡基因[19-22]，并减少TNF-α等炎症因子的释放。本课题组前期已经发现Tris-HCl冷提铁皮石斛水溶性总蛋白对损伤的大鼠胃黏膜的治疗效果优于铁皮石斛多糖。且本课题组前期研究发现，铁皮石斛鲜品功效优于干品[8,11]，并通过中医古籍记载证实了铁皮石斛鲜品效果更优。现在常用的提取铁皮石斛蛋白的方法为盐（NaCl）溶液浸提和水提醇沉两种，且收率都不高，容易出现糖和蛋白一起提出的现象[23]。相较于常用方法，Tris冷提法得到的蛋白收率较高且蛋白含量高，可作为理想的提取铁皮石斛蛋白的方法。
本文采用铁皮石斛鲜品用冷提法提取铁皮石斛水溶性总蛋白，并在单因素实验基础上，使用响应面法优化提取条件后，分离纯化铁皮石斛水溶性总蛋白，并在体外建立胃黏膜损伤模型以筛选活性蛋白，最后对其进行初步评价及结构鉴定。试验结果优化了铁皮石斛蛋白的提取方法，且进一步对铁皮石斛蛋白的活性研究奠定了基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
铁皮石斛 浙江雁荡山铁皮石斛种植基地，采集时间8月；Tris Base、CSA Sigma公司；硫酸铵、盐酸、溴化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠 北京化工厂；DEAE离子交换层析介质（90 μm） 中科森辉微球技术有限公司，货号31-0010-04；大鼠胃黏膜上皮细胞完全培养基 普诺赛，货号CM-R039；胎牛血清、1%双抗、磷酸盐缓冲液 美国BI公司；0.25%胰酶-EDTA（600 U/mL） 美国MRC公司；普通型透析袋（3000）44 mm 上海源叶公司；无水乙醇 天津市汇杭化工有限公司；P0012S-3BSA（99%）、曲拉通X-100（Triton X 100）、细胞核染色（DAPI dihydrochloride）、上皮细胞抗体（EPCAM Mouse Monoclonal Antibody）、成纤维细胞抗体（Vimentin Mouse Monoclonal Antibody）、山羊抗兔抗体 、牛血清白蛋白（BSA）、42613--33-2分散酶2（5 U/mL，Dispase2）、C8140胶原酶Ⅰ（246 units/mg solid）、四唑盐（MTT） 北京索莱宝公司；达喜 德国拜耳公司；BCA试剂盒 碧云天生物技术公司；24 h SD大鼠乳鼠 长春市亿斯实验动物技术有限责任公司（SCXK（吉）-2020-0002）。
150i细胞培养箱 美国Thermo公司；Infinite 200酶标仪 瑞士Tecan公司；XS 105DU电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Mini Protean Powerpac蛋白电泳仪 美国伯乐公司；AKTA START蛋白纯化仪 美国GE公司；FE20 pH计 美国梅特勒-托利多公司；SX-700蒸汽灭菌器 日本Tomy Digital Biology公司；CKX53iPC倒置显微镜 上海通灏光电科技有限公司；VERTEX 70傅里叶红外光谱仪 德国Bruker公司；Chirascan Plus圆二色谱仪 英国应用光物理公司；Shimadzu UV-1800分光光度计 日本岛津公司；SW-CJ-2D型双人净化工作台 苏州净化设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 铁皮石斛蛋白提取工艺流程
采用碱提酸沉法提取铁皮石斛蛋白[24]。取新鲜铁皮石斛，加20 mmol/L、pH=7.4的Tris-HCl匀浆，至于4 ℃冰箱中冷提，加入一定饱和度的硫酸铵，盐析，7000 r/min离心10 min，沉淀即为铁皮石斛粗蛋白。透析袋透析脱盐3 d，冻干，得到脱盐的铁皮石斛蛋白粗蛋白，备用。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 提取时间对铁皮石斛蛋白收率的影响
在料液比1:25 g/mL，硫酸铵饱和度80%条件下，按1.2.1中提取流程，分析提取时间3、6、9、12、15 h对铁皮石斛粗蛋白收率的影响。
1.2.2.2 料液比对铁皮石斛蛋白收率的影响
在提取时间6 h，硫酸铵饱和度80%条件下，按1.2.1中提取流程，分析料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL对铁皮石斛粗蛋白收率的影响。
1.2.2.3 硫酸铵饱和度对铁皮石斛蛋白收率的影响
在提取时间6 h，料液比1:25 g/mL条件下，按1.2.1中提取流程，分析饱和度40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸铵，探对铁皮石斛粗蛋白收率的影响。
1.2.3 响应面试验
依据单因素实验结果，选取提取时间（A）、料液比（B）、硫酸铵饱和度（C）为考察因素，以铁皮石斛粗蛋白收率为响应值，采用三因素三水平分析方法，利用Design Expert 8.0.6进行试验设计，优化铁皮石斛蛋白提取工艺，每个样品处理重复三次，并通过 Design-Expert V8.0.6 软件对数据进行多元回归拟合[25-26]。设计见表1。
表 1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1. Box-Behnken experimental design factors and levels水平 因素 A提取时间（h） B料液比（g/mL） C硫酸铵饱和度（%） −1 3 1:15 70 0 6 1:25 80 1 9 1:35 90 1.2.4 铁皮石斛蛋白收率的计算
蛋白收率（%）=冻干蛋白重量/铁皮石斛重量×100
1.2.5 铁皮石斛蛋白含量测定
采用BCA试剂盒法，配制不同浓度的标准品，绘制标准曲线。配制不同浓度的铁皮石斛蛋白，每个浓度设置3个平行样，37 ℃放置30 min，测定吸光度值。带入标准曲线得铁皮石斛粗蛋白含量。
1.2.6 铁皮石斛蛋白分离纯化及鉴定
1.2.6.1 阴离子交换柱层析法
先配制不同流动相，流动相A：20 mmol/L Tris-HCl，流动相B：20 mmol/L Tris-HCl+1 mol/L NaCl。均用双蒸水溶解，pH用HCl调节至6.5。采用DEAE弱阴离子交换柱层析法，将响应面优化条件下制备的铁皮石斛水溶性总蛋白用流动相A配制成5 mg/mL的溶液，并用微膜过滤（孔径0.45 μm），每次以100 mg的铁皮石斛水溶性总蛋白通过DEAE阴离子交换柱（粒径90 μm）[27-28]。以3 mL/min的流速用流动相A 10倍柱体积洗脱，然后逐渐增大流动相B的浓度进而通过增加盐的浓度进行梯度洗脱（即NaCl浓度范围0~0.5 mol/L），20倍柱体积洗脱，最后用流动相B 10倍柱体积洗脱，分别逐级的将蛋白依次洗脱下来。用透析袋透析脱盐2 d，冻干，备用。
1.2.6.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）
将1.2.6.1冻干后的蛋白用双蒸水配制成浓度为1 mg/mL的溶液，在分离胶浓度为12%和浓缩胶浓度为5%条件下进行电泳实验，每孔上样量为20 μL，空泳道上电极缓冲液[29]。
1.2.7 乙醇损伤大鼠原代胃黏膜上皮细胞模型建立及纯化蛋白活性筛选
1.2.7.1 大鼠原代胃黏膜上皮细胞的提取及培养
取大鼠乳鼠的胃，将胃剪开，用含有青链双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，转移至用含有0.21%牛血清白蛋白（BSA）、0.17%分散酶2（Dispase2）和0.12%胶原酶Ⅰ的磷酸盐缓冲液（PBS）配制的消化酶中，乳鼠胃的个数与消化酶毫升数为1:3。于37 ℃，160 r/min的摇床中消化1 h。用吹管反复吹打后置于37 ℃恒温培养箱中孵育15 min。将胃组织取出，于4 ℃，1050 r/min将消化液离心5 min。弃上清，用培养基重悬，过0.22 μm的细胞筛网，4 ℃，1050 r/min，离心5 min。弃上清，用培养基重悬，转移到T25细胞培养瓶中，及时查看情况并换液。当原代细胞铺满瓶底，细胞融合达80%以上时，可进行传代。传代前先用PBS清洗细胞1次，加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA对细胞进行消化，在倒置显微镜下观察，当细胞间隙变大，细胞变圆时，吸弃胰酶，加入2 mL培养基终止消化，并充分吹打，使细胞脱落。将细胞转入1.5 mL EP管中以1100 r/min进行离心，吸弃上层培养基，加入新培养基将细胞重悬，按照1:3的比例接种于T25细胞培养瓶中继续培养。
1.2.7.2 大鼠原代胃黏膜上皮细胞免疫荧光鉴定
在细胞传代时，将多余细胞转至细胞培养皿中，培养1~2 d直至细胞融合达80%，吸弃培养基，用PBS清洗3次。用4%多聚甲醛于室温下固定细胞15 min，再用PBS清洗3次，加入0.5% 曲拉通X 100（Triton X 100，用PBS配制），室温下孵育30 min，吸弃0.5% Triton X 100，加入上皮细胞抗体（EPCAM）或成纤维细胞抗体（VIM）于4 ℃孵育过夜。吸弃抗体，PBS清洗3次，加入山羊抗兔抗体，37 ℃避光孵育1 h。加入细胞核染色（DIPA）染细胞核15 min。倒置显微镜下观察。
1.2.7.3 乙醇损伤大鼠原代胃黏膜上皮细胞模型建立及纯化蛋白活性筛选
取对数生长期的大鼠胃黏膜上皮细胞（GECs-1）细胞，按接种密度5×104 个/mL均匀接种于96孔板中，至于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养24 h。设置空培养基无细胞的空白组、0%无水乙醇的对照组和1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%乙醇模型组，每组设置6个平行样孔，损伤3 h，更换为完全培养基培养24 h后，每孔加入四唑盐（MTT）溶液20 μL，37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养4 h后，吸弃培养基，每孔加入150 μL DMSO溶液，用酶标仪振摇180 s，于490 nm波长下检测吸光度值。细胞存活率（%）=（实验组OD−空白组OD）/（对照组OD−空白组OD）×100。
对纯化后的三种蛋白做体外活性试验。同上述方法接种96孔板并培养24 h后，除空白组外，用上述方法对大鼠胃黏膜上皮细胞进行损伤造模，损伤3 h后，吸弃培养基，空白组和模型组加完全培养基，阳性药组加用培养基配制的终浓度为0.05 mg/mL的达喜，其他各组加入纯化后用培养基配制的终浓度为0.005 mg/mL的不同蛋白（TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3）。培养24 h后，用MTT法测得各组的存活率。配制终浓度为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007 mg/mL的TPSHP-2用于乙醇损伤3 h后的细胞，培养24 h后，再用MTT法测得各组的存活率。
1.2.8 铁皮石斛蛋白结构表征
1.2.8.1 紫外吸收光谱检测
取冻干后的TPSHP-2用双蒸水配制成1 mg/mL溶液，用分光光度计在室温下测量溶液在200~600 nm范围内的紫外光谱[30]。
1.2.8.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测
将冻干后的TPSHP-2与KBr按质量比1:100研磨混合，压片后以VERTEX 70傅里叶红外光谱仪于4000~400 cm−1波数范围下扫描[31]，获得红外光谱图。
1.2.8.3 圆二色谱（CD）检测
取冻干后的TPSHP-2用20 mmol/L PB配制成0.2 mg/mL分散液，采集分散液在180~340 nm波长间的远近紫外吸收，采集分散液在190~260 nm波长间的远紫外吸收[32]，获得圆二色谱图。
1.3 数据处理
数据处理采用Prism 9、Origin 9.0软件作图，Image-J软件对图进行分析。数据用SPSS17.0软件进行分析，结果用“平均值±标准差”表示，数据用ANOVA方法作差异分析（P<0.05）。实验均做3次平行。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 提取时间对铁皮石斛蛋白收率的影响
如图1可知，增加提取时间，铁皮石斛粗蛋白的收率总体呈现出先增大后减小的趋势，在提取时间为6 h时，铁皮石斛粗蛋白收率达到最大。当提取时间超过6 h，则出现蛋白质凝聚沉积现象，导致收率降低[33]。故选择提取时间为6 h进行后续实验。
2.1.2 料液比对铁皮石斛蛋白收率的影响
如图2可知，在提取液体积较小时，铁皮石斛药材溶解扩散不完全，从而导致蛋白收率较低。随着提取液体积逐渐增加，铁皮石斛粗蛋白收率呈上升趋势，当料液比为1:25 g/mL时，铁皮石斛中蛋白能充分析出，此时蛋白收率达到最大。当继续增大料液比时，使得溶液中蛋白质浓度较低，泡沫稳定性较差，蛋白质收率降低[34]。故选择料液比为1:25 g/mL进行后续实验。
2.1.3 硫酸铵饱和度对铁皮石斛蛋白收率的影响
如图3可知，随着硫酸铵饱和度逐渐增加，铁皮石斛蛋白收率呈上升趋势。这是因为随着盐浓度的增加，使得蛋白质表面电荷增加。当硫酸铵饱和度为80%时，铁皮石斛蛋白提取效果最好，收率最大。当硫酸铵饱和度大于80%后，由于盐含量过高而导致蛋白质表面双电层和水化层遭到破坏使得蛋白溶解度降低，导致铁皮石斛蛋白的收率呈下降趋势[34]。故选择硫酸铵饱和度为80%进行后续实验。
2.2 响应面试验
2.2.1 回归模型的建立与数据分析
从单因素实验的结果可以看出，当提取时间为6 h、料液比为1:25 g/mL、硫酸铵饱和度为80%时，分别有最佳收率。在单因素实验的基础上，以铁皮石斛粗蛋白收率为评价指标，对提取时间（A）、料液比（B）和硫酸铵饱和度（C）进行三因素三水平响应面优化设计，结果见表2。
表 2 响应面试验设计与结果Table 2. Response surface test design and results实验号 A B C 收率（%） 1 −1 0 1 6.28 2 −1 0 −1 6.45 3 0 1 1 6.48 4 −1 1 0 6.30 5 0 0 0 8.62 6 0 0 0 8.60 7 −1 −1 0 6.34 8 0 1 −1 7.03 9 0 0 0 8.61 10 0 0 0 8.63 11 1 −1 0 5.97 12 1 −1 −1 6.21 13 1 1 0 6.58 14 0 −1 −1 6.16 15 1 −1 1 6.42 16 0 0 0 8.64 17 0 −1 1 6.78 得到二次多元回归方程：Y=8.57+0.059A+0.42B+0.41C+0.54AB−0.1AC−0.27BC−1.31A2−0.76B2−1.22C2。该试验模型的显著性分析见表3。由方差分析结果可知，模型F=88.44，P<0.0001，说明该回归模型差异极显著。方程失拟项F=4.78，P>0.05，表明失拟项对纯误差影响不显著。该模型的复决定系数R2=0.9913，校正决定系数R2Adj=0.9801，说明回归模型与实验拟合度好，说明其他因素对试验结果干扰较小，根据F值可知，影响蛋白收率的三个因素大小顺序为B>C>A，即料液比>硫酸铵饱和度>提取时间，交互项AC不显著（P>0.05），交互项BC交互作用显著（P<0.05），交互项AB交互作用极显著（P<0.01）。二次项A2、B2、C2的影响极显著（P<0.01）。
表 3 响应面方差分析Table 3. Response surface variance analysis方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性 模型 22 9 2.44 88.44 <0.0001 ** A-提取时间 0.028 1 0.028 1 0.3508 B-料液比 1.42 1 1.42 51.36 0.0002 ** C-硫酸铵饱和度 1.36 1 1.36 49.25 0.0002 ** AB 1.16 1 1.16 41.81 0.0003 ** AC 0.04 1 0.04 1.45 0.2681 BC 0.29 1 0.29 10.55 0.0141 * A2 7.24 1 7.24 261.93 <0.0001 ** B2 2.41 1 2.41 87.12 <0.0001 ** C2 6.31 1 6.31 228.14 <0.0001 ** 残差 0.19 7 0.028 失拟项 0.15 3 0.05 4.78 0.0824 纯误差 0.042 4 0.011 总离差 22.19 16 注：**P<0.01 为差异极显著；*P<0.05 为差异显著。 2.2.2 响应面各因素交互作用分析
利用Design Expert 8.0.6，根据回归方程，分析响应面各因素交互试验结果，生成等高线和响应面图，分析提取时间、料液比和硫酸铵饱和度交互作用对铁皮石斛粗蛋白收率的影响。从图4可以看出，三个因素在所选范围内存在极值，即等高线中最小椭圆的中心点。响应面坡度越陡，等高线密集形成椭圆形则表明2个因素的交互作用的影响就越大。
经软件分析优化，预测出最优条件为：提取时间6.22 h，料液比1:27.81 g/mL，硫酸铵饱和度81.35%。考虑实际情况，将该模型得到的最优条件修正为：提取时间6 h，料液比1:27 g/mL，硫酸铵饱和度80%。分析结果预测铁皮石斛粗蛋白收率为8.66%。对修正后的工艺参数进行3次验证试验，铁皮石斛粗蛋白平均收率为8.65%±0.13%，与理论值接近，说明该模型能够较好的预测出铁皮石斛粗蛋白的收率，可用于优化铁皮石斛粗蛋白过程。
2.3 蛋白纯化结果及结果分析
2.3.1 铁皮石斛蛋白含量
BCA试剂盒检测原理为碱性条件下蛋白质与二价铜离子形成蓝紫色络合物，562 nm波长下检测为最佳吸光度值，带入标准曲线y=0.7977x+0.0024（R2=0.999）。测定铁皮石斛粗蛋白中蛋白含量为11.64%。其余成分为多糖。
2.3.2 铁皮石斛蛋白分离纯化
将冻干的铁皮石斛粗蛋白经DEAE阴离子交换柱层析后，先用Buffer A洗脱10倍柱体积，然后用Buffer B梯度洗脱。当流动相pH=6.5，电导（cod）=1894，选择流速为3 mL/min时，NaCl浓度为0 mol/L出现未被结合的蛋白TPSHP-1；在梯度洗脱过程中，即随着NaCl浓度逐渐增加，出现蛋白TPSHP-2；在NaCl浓度为1 mol/L时出现蛋白TPSHP-3。如图5所示。对TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3蛋白做SDS-PAGE，配制浓度为1 mg/mL。结果显示TPSHP-2蛋白为单一蛋白，分子量大小约为12 kDa。如图6所示。
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图 6 纯化后TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3蛋白电泳Figure 6. TPSHP-1、TPSHP-2、TPAHP-3 protein electrophoresis after purification2.4 体外建模及活性筛选
2.4.1 大鼠原代胃黏膜上皮细胞免疫荧光鉴定
如图7所示，可以明显的看出，该方法提出的细胞为大鼠胃黏膜上皮细胞，用Image-J软件计算纯度为99%，即该细胞可用于后续试验。
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图 7 大鼠原代胃黏膜上皮细胞免疫荧光鉴定结果（10 ×）注：1 DAPI细胞核染色；2 EPCAM上皮细胞蛋白染色；3 DAPI细胞核、EPCAM上皮细胞蛋白合并染色；4 DAPI细胞核染色；5 VIM成纤维细胞蛋白染色；6 DAPI细胞核、VIM成纤维细胞蛋白合并染色。Figure 7. Immunofluorescence identification results of rat primary gastric mucosal epithelial cells (10 ×)2.4.2 乙醇损伤大鼠原代胃黏膜上皮细胞模型建立
如图8所示，当乙醇浓度达到5%时，细胞存活率为60%，符合实验条件。此时得到的细胞状态为理想的损伤模型。因此后续试验选择5%乙醇进行造模。
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图 8 不同乙醇浓度对GECs-1细胞存活率的影响Figure 8. Effect of different ethanol concentrations on the survival rate of GECs-1 cells2.4.3 纯化蛋白活性筛选
如图9所示，基于前期方法对细胞进行损伤，与空白组相比较，模型组细胞的存活率极显著降低（P<0.01）。当铁皮石斛蛋白给药浓度为0.005 mg/mL，阳性药给药浓度为0.05 mg/mL时（前期发现当浓度为0.005 mg/mL时没有效果），与模型组相比较，结果显示，纯化后的TPSHP-2蛋白对损伤的大鼠胃黏膜上皮细胞的修复作用最好（P<0.01）。
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图 9 不同蛋白同一浓度对损伤细胞的修复作用注：D：空白组；M：模型组；TPSHP-1：TPSHP-1蛋白组；TPSHP-2：TPSH-2蛋白组；TPSHP-3：TPSHP-3蛋白组；Y：阳性药组；同空白组比较，*（P<0.05），**（P<0.01）；同模型组比较，#（P<0.05），##（P<0.01）；图10同。Figure 9. The repair effect of different proteins at the same concentration on damaged cells为探究最佳给药浓度，配制不同的TPSHP-2蛋白浓度用于细胞给药，由图10可知，相较于其他浓度对损伤的大鼠胃黏膜上皮细胞的存活率结果来看，当TPSHP-2蛋白给药浓度为0.005 mg/mL时作用效果最好（P<0.01）。
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图 10 TPSHP-2蛋白不同浓度对损伤细胞修复作用Figure 10. Effects of different concentrations of TPSHP-2 protein on repairing damaged cells2.5 蛋白结构表征
2.5.1 紫外吸收光谱检测结果
OD280/OD260 >1.5，通过公式，蛋白浓度=1.45OD280−0.75OD260求得蛋白含量为0.629 mg/mL。如图11所示，TPSHP-2在280 nm处有最大吸收峰，表明存在蛋白质。
2.5.2 傅里叶变换红外吸收光谱（FTIR）检测结果
如图12所示，可以清楚地观察到三条蛋白质特征带。酰胺Ⅰ：在1638 cm−1处有强吸收峰，表明由于C=O拉伸而具有α-螺旋结构；酰胺Ⅱ：两个强吸收峰（1404、1553 cm−1）分别代表N-H弯曲和C-N拉伸；酰胺Ⅲ：1297 cm−1处有吸收峰，表明由于存在N-H弯曲而具有β-折叠结构。在598 cm−1处有强吸收峰，可能是由磷酸基团的影响而引起的[35]。红外特征吸收峰酰胺Ⅰ带进一步证明了TPSHP-2具有典型的蛋白质结构。
2.5.3 圆二色谱（CD）检测结果
如图13所示，在195 nm附近有一个强的正带，在225 nm附近有一个强的负带，表明TPSHP-2主要是α类蛋白质[36]。如表4所示，TPSHP-2的二级结构由α-螺旋（8.9%）、β-折叠（50.2%）、β-转角（15.7%）和无规则卷曲（30.0%），通过酰胺Ⅲ区（1297 cm−1）可以反映出TPSHP-2不受水分子干扰，具有疏水作用。
表 4 TPSHP-2的二级结构含量Table 4. The secondary structure content of TPSHP-2二级结构 含量（%） α-螺旋 8.9 β-折叠 50.2 β-转角 15.7 无规则卷曲 30.0 3. 结论
本研究对实验室前期铁皮石斛蛋白提取工艺进行优化，当提取时间6 h，料液比1:27（g/mL），硫酸铵饱和度80%时铁皮石斛粗蛋白收率最大为8.65%±0.13%。并对优化工艺后的铁皮石斛蛋白进行分离纯化，采用DEAE阴离子交换柱层析法，选用当流动相为pH=6.5，流速为3 mL/min时，得到TPSHP-2蛋白，对TPSHP-2蛋白做凝胶电泳后，只有单一条带，蛋白分子量大致为12 kDa。当TPSHP-2蛋白浓度为0.005 mg/mL时，对损伤的大鼠胃黏膜上皮细胞的修复作用最好，从损伤后细胞存活率结果可以看出，用TPSHP-2蛋白治疗后的细胞可以很好地修复损伤。相比较于铁皮石斛多糖对损伤的修复所需浓度0.5 mg/mL[37]，TPSHP-2蛋白所需浓度更低，从治疗效果和用量层面来看，TPSHP-2蛋白效果优于比铁皮石斛多糖。初步探究TPSHP-2是以β-折叠为主要结构的蛋白质。下一步将对TPSHP-2蛋白进行物理性质、化学性质及生物学性质的深入研究。
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图 6 纯化后TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3蛋白电泳
Figure 6. TPSHP-1、TPSHP-2、TPAHP-3 protein electrophoresis after purification
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图 7 大鼠原代胃黏膜上皮细胞免疫荧光鉴定结果（10 ×）
注：1 DAPI细胞核染色；2 EPCAM上皮细胞蛋白染色；3 DAPI细胞核、EPCAM上皮细胞蛋白合并染色；4 DAPI细胞核染色；5 VIM成纤维细胞蛋白染色；6 DAPI细胞核、VIM成纤维细胞蛋白合并染色。
Figure 7. Immunofluorescence identification results of rat primary gastric mucosal epithelial cells (10 ×)
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图 8 不同乙醇浓度对GECs-1细胞存活率的影响
Figure 8. Effect of different ethanol concentrations on the survival rate of GECs-1 cells
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图 9 不同蛋白同一浓度对损伤细胞的修复作用
注：D：空白组；M：模型组；TPSHP-1：TPSHP-1蛋白组；TPSHP-2：TPSH-2蛋白组；TPSHP-3：TPSHP-3蛋白组；Y：阳性药组；同空白组比较，*（P<0.05），**（P<0.01）；同模型组比较，#（P<0.05），##（P<0.01）；图10同。
Figure 9. The repair effect of different proteins at the same concentration on damaged cells
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图 10 TPSHP-2蛋白不同浓度对损伤细胞修复作用
Figure 10. Effects of different concentrations of TPSHP-2 protein on repairing damaged cells
表 1 Box-Behnken 试验设计因素与水平
Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels
水平 因素 A提取时间（h） B料液比（g/mL） C硫酸铵饱和度（%） −1 3 1:15 70 0 6 1:25 80 1 9 1:35 90 
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表 2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface test design and results
实验号 A B C 收率（%） 1 −1 0 1 6.28 2 −1 0 −1 6.45 3 0 1 1 6.48 4 −1 1 0 6.30 5 0 0 0 8.62 6 0 0 0 8.60 7 −1 −1 0 6.34 8 0 1 −1 7.03 9 0 0 0 8.61 10 0 0 0 8.63 11 1 −1 0 5.97 12 1 −1 −1 6.21 13 1 1 0 6.58 14 0 −1 −1 6.16 15 1 −1 1 6.42 16 0 0 0 8.64 17 0 −1 1 6.78
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表 3 响应面方差分析
Table 3 Response surface variance analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性 模型 22 9 2.44 88.44 <0.0001 ** A-提取时间 0.028 1 0.028 1 0.3508 B-料液比 1.42 1 1.42 51.36 0.0002 ** C-硫酸铵饱和度 1.36 1 1.36 49.25 0.0002 ** AB 1.16 1 1.16 41.81 0.0003 ** AC 0.04 1 0.04 1.45 0.2681 BC 0.29 1 0.29 10.55 0.0141 * A2 7.24 1 7.24 261.93 <0.0001 ** B2 2.41 1 2.41 87.12 <0.0001 ** C2 6.31 1 6.31 228.14 <0.0001 ** 残差 0.19 7 0.028 失拟项 0.15 3 0.05 4.78 0.0824 纯误差 0.042 4 0.011 总离差 22.19 16 注：**P<0.01 为差异极显著；*P<0.05 为差异显著。
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表 4 TPSHP-2的二级结构含量
Table 4 The secondary structure content of TPSHP-2
二级结构 含量（%） α-螺旋 8.9 β-折叠 50.2 β-转角 15.7 无规则卷曲 30.0
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