Structural Analysis and Immunomodulatory Effects of Pectic Polysaccharides Separated from Jasminum sambac Flower Waste
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摘要: 为探究茉莉花渣中果胶型多糖的结构特征与免疫调节作用，本研究通过水提醇沉、蛋白脱除、阴离子交换柱层析和凝胶柱层析分离得到两种多糖JSP-3和JSP-4。通过相对重均分子量测定、单糖组成测定、部分酸水解液-质联用测定以及核磁共振波谱分析了两种多糖结构特征，最后以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为模型，通过探究其对小鼠巨噬细胞的增殖率、吞噬率、ROS产生量以及NO、TNF-α、IL-6分泌量的影响来研究免疫调节作用。结果表明，JSP-3和JSP-4为两种均一多糖，相对重均分子量分别为15.48 kDa和 44.75 kDa，主要由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，存在不同比例的半乳糖醛酸聚糖结构域（JSP-3：32.87%±3.53%；JSP-4：68.64%±0.67%）与鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构域（JSP-3：61.12%±3.37%；JSP-4：28.28%±0.46%），说明两者均为果胶型多糖。与对照组相比，JSP-3和JSP-4在12.5~100 μg/mL的浓度范围内无细胞毒性，在一定浓度下能够通过促进小鼠巨噬细胞的吞噬作用，显著增加ROS产生量以及NO、TNF-α和IL-6的分泌量（P<0.05）。在相同浓度下，JSP-4比JSP-3能够刺激细胞分泌更多的NO、TNF-α和IL-6，说明JSP-4具有更强的免疫调节作用，这可能与其更高的半乳糖醛酸结构域比例和相对重均分子量有关。上述研究成果初步证明了茉莉花渣果胶型多糖的免疫调节作用，为其在免疫调节剂方面的应用提供了初步依据。Abstract: In order to explore the structural characteristics and immunomodulatory effects of pectic polysaccharides in Jasminum sambac flower waste, two polysaccharides, JSP-3 and JSP-4, were separated by water extraction, alcohol precipitation, deproteinization, anion exchange chromatography and gel chromatography. Its structural characteristics were analyzed with relative weight average molecular weight, monosaccharide composition, partial acid hydrolysis-LC-MS and NMR. Finally, the immunomodulatory effects of two polysaccharides were studied by using murine macrophage RAW 264.7 as a model, and measuring the effects on proliferation, phagocytosis, ROS production and secretion of NO, TNF-α and IL-6. The results showed that JSP-3 and JSP-4 were two homogeneous polysaccharides with relative molecular weights of 15.48 kDa and 44.75 kDa, respectively, mainly composed of galacturonic acid, rhamnose, galactose and arabinose, with different proportions of galacturonan domain (JSP-3: 32.87%±3.53%, JSP-4: 68.64%±0.67%) and rhamnogalacturonan domain (JSP-3: 61.12%±3.37%, JSP-4: 28.28%±0.46%), indicating that both are pectic polysaccharides. Compared with the control group, JSP-3 and JSP-4 have no cytotoxic effect within 12.5~100 μg/mL. At a certain concentration, it increased the production of ROS and the secretion of NO, TNF-α and IL-6, also promoted the phagocytosis of mouse macrophages significantly (P<0.05). At the same concentration, JSP-4 could stimulate cells to secrete more NO, TNF-α and IL-6 than JSP-3, indicating that JSP-4 had a stronger immunoregulatory effect, which might be associated with its higher proportion of galacturonan domain and relative molecular weight. The above research results preliminarily proved the immunomodulatory effect of pectic polysaccharide from Jasminum sambac flower waste, and would provide a basis for its potential application in immunomodulators.
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茉莉（Jasminum sambac）是木犀科素馨属植物，其花朵含有丰富的挥发性香气成分[1]与非挥发性多糖类、黄酮类成分[2]，茉莉花渣产生于茉莉花茶窨制后的分选过程，废弃量较高[3]，经过窨制后绝大多数非挥发性化合物未得到有效利用[4]，如多糖类、黄酮类化合物等。作为主要活性成分，茉莉花渣多糖具有抗氧化[5-6]、降血糖[5,7]、免疫增强[8]等生物活性。然而有关茉莉花渣多糖的研究多集中在粗多糖的提取工艺[2-3,6]和活性评价[6-8]上，结构解析、构-效关系等进一步的理论研究偏少，为茉莉花资源利用带来局限性。
果胶或果胶型多糖是一类常见的植物来源杂多糖，是植物细胞壁的重要结构组成部分之一，主链通常由1,4位连接的半乳糖醛酸和1,2位连接的鼠李糖构成[9]，并连有半乳糖、阿拉伯糖等构成的支链，其具有较强的免疫调节作用[10-11]。小鼠巨噬细胞RAW264.7在体外培养过程中，受到抗原刺激后将增强其免疫相关吞噬作用和细胞因子分泌能力，是免疫调节作用研究中常用的模型细胞[12]。
在本研究中，通过热水提取、透析、柱层析等方法获得到均一的茉莉花渣果胶型多糖，并分析了其分子量、结构单元组成、连接方式等结构特征，还通过小鼠巨噬细胞模型探究了其免疫调节作用，以及结构特征与活性之间的关联，以期为茉莉花渣的开发利用提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
茉莉花渣 由昆明诺发生物技术有限公司提供；乙腈（色谱纯级）、葡聚糖T系列（分子量：5、12、50、150、270、670 kDa）和单糖标准品、3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）、脂多糖（LPS）和青霉素/链霉素 德国默克（Merck Sigma-Aldrich）公司；RAW264.7细胞 来自中国科学院典型培养物保藏中心；胎牛血清（FBS） 上海吉泰依科赛公司；NO检测试剂盒 江苏碧云天公司；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒 加拿大Anogen公司；DEAE Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 HR层析填料和DMEM培养基 美国思拓凡（Cytiva）公司；其他化学试剂 均为分析纯。
RE52AA型旋转蒸发仪、FD80AD型冷冻干燥机 上海比朗仪器公司；SBS-100型自动部分收集器、HL-2型恒流泵 上海青浦沪西仪器厂；UV-1800型紫外-可见光分光光度计、QP2010GC-MS型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；1260Infinity型高效液相色谱仪、1290Infinity-6530 Q-TOF型超高效液相色谱-四极杆串联飞行质谱联用仪 美国安捷伦科技公司；SpectraMax M4型多功能酶标仪 美国美谷分子仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 果胶型多糖提取与纯化
提取方法参照邹瑶等[6]的方法稍加改进。将茉莉花渣粉碎，置于60 ℃下烘干。以1:20为料液比，在60 ℃下用60%乙醇提取2次，每次2 h，过滤，取滤渣烘干，然后在料液比为1:20，90 ℃下用去离子水提取2次，每次2 h。过滤，合并滤液，浓缩后用Sevage法脱除游离蛋白。然后加入乙醇至80%（v/v）在4 ℃低温下过夜沉淀，取沉淀复溶，用3500 Da截留量的透析袋处理24 h。最后将透析袋中的溶液浓缩冻干，得到茉莉花渣多糖（JSP）。
将多糖水溶液上样至DEAE Sepharose FF层析柱（2.6 cm×80 cm），分别用水、0.2、0.4、0.6 mol/L 乙酸铵洗脱，其中0.4和0.6 mol/L 乙酸铵洗脱产物分别用Sephacyl S-200HR层析柱（1.6 cm×100 cm）纯化，馏分用自动收集器接收，并经尺寸排阻色谱检测后合并馏分和冷冻干燥。
1.2.2 多糖结构表征
1.2.2.1 相对重均分子量测定
茉莉花渣多糖的相对重均分子量测定基于Chen等[13]的方法改进而来，通过尺寸排阻色谱串联蒸发光散射检测器（SEC-ELSD）进行测定，其色谱条件为：色谱柱Tosoh TSKgel G5000PW；流动相：50 mmol/L乙酸铵溶液；流速0.6 mL/min；柱温：35 ℃；进样10 μL。蒸发光散射检测器条件：雾化室：45 ℃；蒸发室：50℃；氮气流速：1.8 SLM。茉莉花渣多糖的相对重均分子量可通过葡聚糖标准品校正曲线算得，标准品的重均分子量包括5、12、50、150、270、670 kDa。
1.2.2.2 化学组成测定
茉莉花渣多糖的中性糖含量、糖醛酸含量和总蛋白含量分别通过苯酚-硫酸法[14]、咔唑-硫酸法[15]和考马斯亮蓝法[16]测定，其中D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸和牛血清白蛋白分别作为各方法的标准品。
1.2.2.3 单糖组成与部分酸水解产物测定
茉莉花渣多糖的单糖组成采用Wu等[10]的方法，在三氟乙酸（TFA）作用下完全酸水解和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生后进高效液相色谱分析。而部分酸水解产物生物分析方法如下：3 mg多糖样品在1 mol/L TFA和100 ℃下水解1 h，除去多余TFA后，在碱性环境和70 ℃下用0.5 mol/L PMP甲醇溶液衍生30 min，随后除去剩余的氨与PMP，最后进液-质联用仪测定。液-质联用法具体参数为：色谱柱Agilent EclipsePlus RRHP C18 （1.8 μm, 2.1 mm×100 mm），柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，流动相A为乙腈，B为20 mmol/L乙酸铵，梯度洗脱程序：0~30 min内，A从5%升至30%，B从95%降至70%。质谱为Agilent 6530 Q-TOF，在正离子模式下采用AutoMSMS模式进行二级采集，碰撞能量35 eV。
1.2.2.4 核磁共振波谱测定
参考Wu等[10]的方法，通过D2O溶解-冻干的方法对JSP-3与JSP-4进行氢氘交换，然后取30 mg样品溶于0.5 mL D2O，用400 MHz核磁共振波谱仪测定1H和13C核磁谱图，扫描次数分别为1600和20000。
1.2.2.5 甲酯化程度测定
JSP-3和JSP-4的甲酯化程度依据Klavons等[17]建立的醇氧化酶方法测定。该方法通过KOH皂化水解样品中的甲酯，然后通过醇氧化酶将水解得到的甲醇氧化为甲醛，让其与2,4-戊二酮缩合得到有色产物3,5-二乙酰基-1,4-二氢-2,6-二甲基吡啶，从而在412 nm下测定吸光度。
1.2.3 免疫调节作用
1.2.3.1 细胞培养
小鼠巨噬细胞RAW 264.7于37 ℃，5%二氧化碳下培养，所用的完全培养液由89% DMEM培养基、10%热灭活的胎牛血清和1%青霉素/链霉素组成。细胞传代使用细胞刮刀，传代比例为1:4，周期为3 d。
1.2.3.2 细胞增殖与中性红吞噬测定
将巨噬细胞按照1×104 个/孔的密度接种至96孔板上，孵育过夜。随后用12.5、25、50、100 μg/mL JSP-3和JSP-4培养巨噬细胞24 h，完全培养基和1.0 μg/mL LPS分别作为阴性对照和阳性对照。
对于细胞增殖测定，在培养24 h后，每孔加入30 μL 5 mg/mL MTT，孵育4 h后小心地吸出上清液，加入100 μL DMSO充分溶解紫色甲臢晶体。通过酶标仪测定其吸光度，检测波长为490 nm，计算增殖率Pc，计算公式如下：
Pc=As−AcAc×100 式中，As为样品孔和阳性对照孔的吸光度；Ac为阴性对照孔的吸光度。
对于中性红吞噬测定，在培养24 h后，用PBS洗涤并加入100 μL 0.1% （w/v）中性红溶液孵育1 h。然后再用PBS洗涤3次，加入细胞裂解液（乙醇:乙酸=1:1, v/v）后避光静置2 h，最后通过酶标仪测定在540 nm下的吸光度，计算吞噬率 Pa，计算公式如下：
Pa=As−AcAc×100 式中，As为样品孔和阳性对照孔的吸光度；Ac为阴性对照孔的吸光度。
1.2.3.3 ROS产生量测定
按照1×105 个/孔的密度将巨噬细胞接种至96孔板上，孵育过夜。随后用12.5、25、50、100 μg/mL JSP-3和JSP-4培养巨噬细胞24 h，完全培养基和1.0 μg/mL LPS分别作为阴性对照和阳性对照。然后在避光条件下，将上清液替换为20 μmol/L DCFH-DA，孵育30 min。再用PBS洗涤3次，加入50 μL 0.25%胰酶消化5 min，并用150 μL PBS吹打分散细胞。最后使用多功能酶标仪测量相对荧光强度（RFUs），激发波长为485 nm，发射波长为530 nm。
1.2.3.4 NO、TNF-α和IL-6分泌量测定
细胞铺板条件同1.2.3.3。在药物处理方面，未经过或经过1 μmol/L TAK-242和20 μmol/L C29预处理1 h后，给予100 μg/mL JSP-3和JSP-4刺激24 h。所有处理结束后，取细胞上清液测定浓度，其中NO浓度采用Greiss试剂盒测定，而肿瘤坏死因子α （TNF-α）和白介素6 （IL-6） 的浓度采用相应的ELISA试剂盒进行测定。
1.3 数据处理
实验结果均通过3次重复实验计算并表示为平均值±标准偏差，数据均使用通过单因素方差分析（one-way ANOVA）计算统计学显著性，其中多重比较选择Dunnett法。
2. 结果与分析
2.1 茉莉花渣多糖的分离纯化
经过多步提取、脱除蛋白和透析处理，获得了茉莉花渣多糖JSP，其得率为10.15%±2.45%。而JSP经过DEAE Sepharose FF弱阴离子交换层析初步分离，获得3种电荷不同的多糖组分，如图1所示。而0.4和0.6 mol/L乙酸铵洗脱组分经过Sephacyl S-200HR凝胶层析纯化，得到JSP-3和JSP-4两种多糖，相对JSP的纯化得率分别为24.87%和38.99%。
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图 1 JSP在弱阴离子交换层析上的洗脱曲线Figure 1. Elution curve of JSP on weak anion exchange chromatography2.2 茉莉花渣多糖的结构特征
2.2.1 相对重均分子量与化学组成
JSP-3和JSP-4的尺寸排阻色谱图如图2所示，两种多糖分别在15.044 min和13.995 min呈现对称、窄峰宽的色谱峰，根据葡聚糖标准曲线lg MW=10.80tR−0.4385（R2=0.9945）计算得到的相对重均分子量分别为15.48 kDa和 44.75 kDa，说明具有良好的均一性。而JSP-3与JSP-4的中性糖含量、糖醛酸含量和总蛋白含量如表1所示。可以看到，两种纯化产物的糖醛酸含量较高，分别为51.25%±2.53%和77.43%±3.12%，与中性糖含量加和总值接近100%，同时总蛋白含量较低。上述结果说明，经过多步纯化的茉莉花渣多糖JSP-3和JSP-4均为均一的酸性多糖。
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图 2 JSP-3和JSP-4的尺寸排阻色谱图（A）和葡聚糖标准曲线（B）Figure 2. SEC-ELSD chromatogram of JSP-3 and JSP-4 (A), and standards curve of dextran (B)表 1 JSP-3和JSP-4的主要化学组成Table 1. Major chemical composition of JSP-3 and JSP-4多糖名称 中性糖含量（%） 糖醛酸含量（%） 蛋白含量（%） JSP-3 33.72±1.64 51.25±2.53 0.84±0.09 JSP-4 27.14±1.52 77.43±3.12 0.89±0.08 2.2.2 单糖组成与部分酸水解分析
经过峰面积归一化法计算各单糖摩尔百分占比，两种酸性多糖的单糖组成分析结果表2所示。JSP-3和JSP-4的单糖组成相似，主要由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖构成其中半乳糖醛酸占比分别为46.83%±2.50%与74.31%±0.37%，与前一节的糖醛酸含量相一致，提示两者可能为果胶型多糖，同时也提示两种多糖极有可能存在半乳糖醛酸聚糖结构域（HG domain）。JSP-3和JSP-4还存在部分鼠李糖残基，其占比分别为13.86%±1.14%和5.56%±0.30%，提示可能存在鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构域（RG domain），这两种结构域往往构成果胶型多糖的主链结构[18]。
表 2 JSP-3和JSP-4的单糖组成摩尔比和结构域占比Table 2. Monosaccharide molecular ratio and structural domain ratio of JSP-3 and JSP-4摩尔比 （%） JSP-3 JSP-4 Man 0.53±0.02 1.29±0.16 Rha 13.86±1.14 5.56±0.30 GlcA 2.74±0.46 0.77±0.10 GalA 46.83±2.50 74.31±0.37 Gal 14.22±0.26 11.20±0.60 Xyl 2.75±0.64 0.80±0.30 Ara 18.98±1.25 6.17±0.28 HGa 32.87±3.52 68.64±0.67 RG-Ib 61.12±3.37 28.29±0.46 注：a: HG=GalA-Rha; b: RG-I=2（Rha）+Ara+Gal。 为了进一步验证，将两种多糖置于相对更温和条件下进行酸水解，并在衍生化后进液-质联用仪分析，分析结果如表3所示。从数据中可推断出聚合度为1~6的衍生化寡糖信号, 其中既有半乳糖醛酸寡糖信号，也有以鼠李糖和半乳糖醛酸为重复单元的寡糖信号。同系列寡糖的准分子离子质量数差值均符合其结构上的单糖残基质量数，例如，2PMP-（GalA）3与2PMP-（GalA）4的质量数差值为176.0328，符合半乳糖醛酸残基的中性质量数；2PMP-Rha-GalA与2PMP-（Rha-GalA）2的质量数差值为322.0429，符合鼠李糖残基和半乳糖醛酸残基的中性质量数之和。这些寡糖质谱信号证实了这两种多糖中的I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构域（RG-I domain）和半乳糖醛酸聚糖结构域（HG domain），而这正是果胶型多糖的重要特征[19-21]。
表 3 部分酸水解后的JSP-3和JSP-4 的LC-MS解析结果Table 3. The LC-MS identification results of partial acid hydrolyzed JSP-3 and JSP-4JSP-3 JSP-4 推测结构 保留时间（min） [M+H]+ 保留时间（min） [M+H]+ 1 20.037 525.2003 19.546 525.1996 2PMP-GalA 2 15.568 701.2308 15.161 701.2302 2PMP-（GalA）2 3 12.870 877.2643 12.463 877.2612 2PMP-（GalA）3 4 11.689 1053.2943 11.451 1053.2940 2PMP-（GalA）4 5 10.762 1229.3329 10.523 1229.326 2PMP-（GalA）5 6 10.087 1405.3508 9.848 1405.351 2PMP-（GalA）6 7 18.857 495.2248 18.366 495.2213 2PMP-Rha 8 19.953 671.2520 19.462 671.2561 2PMP-Rha-GalA 9 17.092 817.3171 nd nd 2PMP-Rha-GalA-Rha 10 14.725 993.3444 nd nd 2PMP-（Rha-GalA）2 11 12.207 1315.4335 nd nd 2PMP-（Rha-GalA）3 注：nd: 未检出。 因此，JSP-3与JSP-4兼具有一型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构域和半乳糖醛酸聚糖结构域，而在比例上有所不同，JSP-3具有更高的RG-I比例（61.12%±3.37%），JSP-4具有更高的HG比例（68.64%±0.67%）。综上所述，JSP-3和JSP-4是两种具有差异性主链结构域的果胶型多糖。
2.2.3 核磁共振波谱
通过13C和1H核磁共振扫描，JSP-3和JSP-4的结构得到了初步鉴定。如图3所示，两者的一维核磁谱图比较相似，说明两种多糖的糖残基与连接方法比较相似。在13C NMR谱图中，δC 173.91和δC 174.21可分别归属于JSP-3和JSP-4未酯化的半乳糖醛酸残基的C-6[21]；而δC 171.11和δC 171.03则分别归属于酯化的半乳糖醛酸残基的C-6[22]。δC 99~101之间的高强度异头碳区信号可归属于酯化与未酯化半乳糖醛酸残基的C-1，以及鼠李糖残基的C-1[20]。δC 52.77和δC 54.09可分别归属于JSP-3和JSP-4的甲酯化半乳糖醛酸残基上的甲基碳[23]。而在高场区，仅有JSP-3的13C NMR谱图存在δC 16.70信号，可归属于鼠李糖残基的C-6[24]。
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图 3 JSP-3和JSP-4的核磁共振氢谱（A, C）和核磁共振碳谱（B,D）Figure 3. 1H NMR spectra of JSP-3(A) and JSP-4(C) and 13C NMR spectra of JSP-3(B) and JSP-4(D)1H NMR谱中出现的信号峰宽且重叠严重，对于峰归属有较强干扰。一般而言，在异头氢区域，α构型的异头氢信号通常大于5.0，而β构型的异头氢信号则通常小于5.0[20]。在JSP-3和JSP-4的1H NMR谱图中，δH 5.08和δH 5.07可归属于α型半乳糖醛酸残基的异头氢[22]，而δH 3.80和δH 3.81的尖峰则可归属于甲酯基上的氢[25]。另外，δH 1.26和δH 1.27可归属于鼠李糖残基的H-6[25]。
综合来看，1H和13C核磁共振谱图能够较好地证实两种果胶型多糖里具有特殊化学位移值的糖残基，如半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基。而果胶常常伴随着不同水平的甲酯化，利用核磁共振谱也可以较好地确认，但甲酯化程度仍需通过其他方法进一步研究。
2.2.4 甲酯化程度
在核磁共振谱图中，JSP-3和JSP-4存在部分半乳糖醛酸残基被甲酯化的信号，因此，醇氧化酶方法被用于甲酯化程度的分析。结果为：JSP-3的甲酯化程度为80.90%±4.03%，JSP-4的甲酯化程度为50.03%±3.71%，均大于50%，可归属于高酯果胶型多糖[25]。
2.3 茉莉花渣多糖的免疫调节作用
2.3.1 对小鼠巨噬细胞增殖率与吞噬作用的影响
如图4A所示，相比于对照组（Control），两种果胶型多糖JSP-3在12.5、25、50 μg/mL和JSP-4在12.5 μg/mL下对小鼠巨噬细胞的增殖率无显著影响（P>0.05），而在其余浓度下的细胞增殖率显著性提高（P<0.05），说明在12.5~100 μg/mL这一范围内两种多糖无明显细胞毒性，可以用于后续实验。
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图 4 JSP-3和JSP-4对RAW 264.7的细胞增殖率（A）和吞噬作用（B）的影响注：与对照相比，ns：不显著；*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01；图5同。Figure 4. Effects of JSP-3 and JSP-4 on RAW 264.7 cell viability(A) and phagocytos(B)对于病原体等外来物，吞噬作用是巨噬细胞的主要免疫反应之一[26]，巨噬细胞吞噬能力的增强对于提高先天免疫十分重要[27]。经过12.5~100 μg/mL的JSP-3和JSP-4处理后，RAW 264.7巨噬细胞的吞噬能力通过中性红吞噬实验来测定。如图4B所示，与对照组相比，JSP-3（25~100 μg/mL）和JSP-4（12.5~100 μg/mL）的吞噬率均具有统计学显著性差异（P<0.05），随给药浓度的增加而提高，且呈剂量依赖性。JSP-3和JSP-4都在100 μg/mL时达到其最大吞噬率，分别为132.0%±4.0%和148.5%±8.9%，接近于LPS组的133.2%±8.3%。
2.3.2 对小鼠巨噬细胞ROS、NO、TNF-α和IL-6分泌量的影响
2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）被用于检测巨噬细胞内的活性氧（ROS），其在进入细胞后迅速地被细胞酯酶水解，然后与活性氧物种反应后生成强荧光物质2’,7’-二氯荧光素（DCF）。如图5（A）所示，经过JSP-3与JSP-4的处理和DCFH-DA探针孵育后，巨噬细胞的相对荧光强度（RFUs）显著上升（P<0.05），呈剂量依赖性，其最大值分别为对照组的1.43倍和1.58倍。而与LPS组相比，JSP-3和JSP-4实验组的相对荧光强度（RFUs）明显偏低。当巨噬细胞受到多糖刺激时，将产生活性氧活化巨噬细胞，影响MAPK和NF-κB信号通路，从而调控多种促炎细胞因子的分泌来参与免疫反应[28]。然而，过量的活性氧将加剧细胞氧化损伤，进而发展至各类炎症[29]。因此，相较于LPS，两种果胶型多糖JSP-3和JSP-4可能是更安全的免疫调节剂。
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图 5 JSP-3和JSP-4对RAW 264.7的ROS产生量（A）、NO分泌量（B）、TNF-α分泌量（C）和IL-6分泌量（D）的影响Figure 5. Effects of JSP-3 and JSP-4 on ROS production（A）, NO（B）, TNF-α（C） and IL-6（D） secretions of RAW 264.7 macrophages在受到外界刺激后，巨噬细胞将分泌多种炎性细胞因子和炎性介质，如NO、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6等参与免疫反应并起到重要作用[30]。如图5（B）~（D），经过12.5、25、50、100 μg/mL JSP-3和JSP-4的刺激后，巨噬细胞的NO、TNF-α和IL-6分泌量得到测定。与对照相比，25、50和100 μg/mL JSP-3显著刺激了巨噬细胞的NO和TNF-α分泌量，呈现剂量依赖性，而50和100 μg/mL JSP-3显著刺激了IL-6分泌量（P<0.05）。对于JSP-4，其浓度在12.5、25、50和100 μg/mL时显著增加了NO和TNF-α分泌量（P<0.05）；而25、50和100 μg/mL JSP-4显著增加了IL-6分泌量，并呈剂量依赖性。而在同一浓度下对比，JSP-4比JSP-3能够刺激巨噬细胞分泌更多的NO、TNF-α和IL-6，JSP-4的免疫调节作用强于JSP-3。
相比于JSP-3，JSP-4能够在相同浓度下刺激巨噬细胞产生相近或更多的炎性细胞因子和介质，并且在最大给药浓度的作用下达到与LPS阳性对照组相似的炎性介质和细胞因子水平，说明JSP-4具有更强的免疫调节作用。多项相关研究表明，果胶型多糖具有较强的免疫调节作用，并且其能力会因其理化性质与结构特征而不同。例如，Wu等[10]从苦水玫瑰花渣中分离得到两种组成相近但相对分子量不同的（56.8 kDa 和23.9 kDa）果胶型多糖，其中相对重均分子量更高的多糖能够让小鼠巨噬细胞具有更高的吞噬率和细胞因子或炎性介质的分泌量。而对于免疫调节相关炎性反应，Popov等[31]、Huang等[32]和Zhang等[33]认为由1,4连接的半乳糖醛酸残基组成的半乳糖醛酸聚糖结构域十分重要，若通过酶解消除该结构域后，其炎性反应将消失。在前文结构解析中，发现JSP-4比JSP-3具有更高的相对重均分子量；并且 JSP-3具有更高的RG-I结构域占比，以及JSP-4具有更高的HG结构域占比。因此，JSP-4可能因其更高的相对重均分子量和半乳糖糖醛酸聚糖（HG）结构域占比而具有更强的免疫调节作用。
2.3.3 多糖相关细胞质膜受体
巨噬细胞利用多种模式识别受体（PRR）[34]来识别各种外源或内源性物质和启动信号通路，从而激发其免疫反应，其中Toll样受体（TLR）是一类重要的巨噬细胞的模式识别受体，可单独或同时分布于细胞质膜、细胞内体上，而细胞质膜上的Toll样受体常被视为多糖刺激巨噬细胞的潜在受体[35]。为了探究JSP-3和JSP-4的作用位点，TAK-242（TLR4抑制剂）和C29（TLR2抑制剂）被用于巨噬细胞预处理步骤中，通过分析抑制剂预处理对多糖刺激巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-6的影响来推导可能的多糖作用受体。如图6所示，未加抑制剂的各组分泌量相对于阴性对照组极显著性上升（P<0.01），与前文一致。经过1 μmol/L TAK-242预处理1 h后，与未加抑制剂的各组相比，LPS阳性对照组和JSP-3、JSP-4实验组的NO、TNF-α和IL-6分泌量极显著性下降（P<0.01），而20 μmol/L C29的预处理则不会影响NO、TNF-α和IL-6分泌水平。上述结果提示TLR4可能为JSP-3和JSP-4的作用受体。
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图 6 JSP-3和JSP-4对TAK-242和C29预处理后的RAW 264.7的NO分泌量（A）、TNF-α分泌量（B）和IL-6分泌量（C）的影响注：ns：不显著；与对照相比，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性 P<0.01；与每组无抑制剂数据相比，##：具有极显著性 P<0.01。Figure 6. Effects of JSP-3 and JSP-4 on NO(A), TNF-α(B) and IL-6(C) secretion pretreated by TAK-242 and C293. 结论
经过DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sephacyl S-200HR凝胶层析两步纯化，从茉莉花渣中得到两种电荷与分子量均一的多糖JSP-3与JSP-4。经尺寸排阻色谱、单糖组成分析、部分酸水解液-质联用分析和核磁共振波谱分析，两种多糖的相对重均分子量分别为15.48 kDa和 44.75 kDa，主要由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，可归属于果胶型多糖，其中JSP-3具有更高的RG-I结构域占比（61.12%±3.37%），而JSP-4则具有更高的HG结构域占比（68.64%±0.67%）。JSP-3和JSP-4均在给定浓度下无明显细胞毒性，分别在25~100 μg/mL和12.5~100 μg/mL的浓度范围内显著性增加小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬率（P<0.05），并且显著增加其炎性介质ROS和NO的产生量以及炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌量（P<0.05），说明两种多糖具有免疫调节作用。经过TLR4受体抑制剂的预处理，小鼠巨噬细胞对两种多糖的刺激响应下降，即NO、TNF-α和IL-6分泌量显著下降（P<0.05），提示多糖作用受体可能为TLR4。相比于JSP-3，JSP-4展现出更强的免疫调节作用，这可能与其更高的分子量和更高的HG结构域占比有关。上述研究成果表明，源自花茶生产中的茉莉花废弃物可能为医疗与食品行业的免疫调节剂提供了一种有希望的新来源，而茉莉果胶型多糖JSP-3和JSP-4的构-效关系和活性机制还将在未来进一步阐明。
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图 1 JSP在弱阴离子交换层析上的洗脱曲线
Figure 1. Elution curve of JSP on weak anion exchange chromatography
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图 2 JSP-3和JSP-4的尺寸排阻色谱图（A）和葡聚糖标准曲线（B）
Figure 2. SEC-ELSD chromatogram of JSP-3 and JSP-4 (A), and standards curve of dextran (B)
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图 3 JSP-3和JSP-4的核磁共振氢谱（A, C）和核磁共振碳谱（B,D）
Figure 3. 1H NMR spectra of JSP-3(A) and JSP-4(C) and 13C NMR spectra of JSP-3(B) and JSP-4(D)
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图 4 JSP-3和JSP-4对RAW 264.7的细胞增殖率（A）和吞噬作用（B）的影响
注：与对照相比，ns：不显著；*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性P<0.01；图5同。
Figure 4. Effects of JSP-3 and JSP-4 on RAW 264.7 cell viability(A) and phagocytos(B)
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图 5 JSP-3和JSP-4对RAW 264.7的ROS产生量（A）、NO分泌量（B）、TNF-α分泌量（C）和IL-6分泌量（D）的影响
Figure 5. Effects of JSP-3 and JSP-4 on ROS production（A）, NO（B）, TNF-α（C） and IL-6（D） secretions of RAW 264.7 macrophages
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图 6 JSP-3和JSP-4对TAK-242和C29预处理后的RAW 264.7的NO分泌量（A）、TNF-α分泌量（B）和IL-6分泌量（C）的影响
注：ns：不显著；与对照相比，*：具有显著性P<0.05；**：具有极显著性 P<0.01；与每组无抑制剂数据相比，##：具有极显著性 P<0.01。
Figure 6. Effects of JSP-3 and JSP-4 on NO(A), TNF-α(B) and IL-6(C) secretion pretreated by TAK-242 and C29
表 1 JSP-3和JSP-4的主要化学组成
Table 1 Major chemical composition of JSP-3 and JSP-4
多糖名称 中性糖含量（%） 糖醛酸含量（%） 蛋白含量（%） JSP-3 33.72±1.64 51.25±2.53 0.84±0.09 JSP-4 27.14±1.52 77.43±3.12 0.89±0.08 
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表 2 JSP-3和JSP-4的单糖组成摩尔比和结构域占比
Table 2 Monosaccharide molecular ratio and structural domain ratio of JSP-3 and JSP-4
摩尔比 （%） JSP-3 JSP-4 Man 0.53±0.02 1.29±0.16 Rha 13.86±1.14 5.56±0.30 GlcA 2.74±0.46 0.77±0.10 GalA 46.83±2.50 74.31±0.37 Gal 14.22±0.26 11.20±0.60 Xyl 2.75±0.64 0.80±0.30 Ara 18.98±1.25 6.17±0.28 HGa 32.87±3.52 68.64±0.67 RG-Ib 61.12±3.37 28.29±0.46 注：a: HG=GalA-Rha; b: RG-I=2（Rha）+Ara+Gal。
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表 3 部分酸水解后的JSP-3和JSP-4 的LC-MS解析结果
Table 3 The LC-MS identification results of partial acid hydrolyzed JSP-3 and JSP-4
JSP-3 JSP-4 推测结构 保留时间（min） [M+H]+ 保留时间（min） [M+H]+ 1 20.037 525.2003 19.546 525.1996 2PMP-GalA 2 15.568 701.2308 15.161 701.2302 2PMP-（GalA）2 3 12.870 877.2643 12.463 877.2612 2PMP-（GalA）3 4 11.689 1053.2943 11.451 1053.2940 2PMP-（GalA）4 5 10.762 1229.3329 10.523 1229.326 2PMP-（GalA）5 6 10.087 1405.3508 9.848 1405.351 2PMP-（GalA）6 7 18.857 495.2248 18.366 495.2213 2PMP-Rha 8 19.953 671.2520 19.462 671.2561 2PMP-Rha-GalA 9 17.092 817.3171 nd nd 2PMP-Rha-GalA-Rha 10 14.725 993.3444 nd nd 2PMP-（Rha-GalA）2 11 12.207 1315.4335 nd nd 2PMP-（Rha-GalA）3 注：nd: 未检出。
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