Optimization of Extraction Process from Tortoise Shell Protein by Response Surface Methodology and Its Proliferation Activity on MC3T3-E1 Cells
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摘要: 目的：优化龟甲蛋白提取工艺，筛选龟甲促成骨细胞（MC3T3-E1）增殖活性组分。方法：以蛋白含量及对MC3T3-E1细胞增殖率为指标筛选龟甲蛋白提取方法；以料液比、提取温度、时间为自变量，龟甲蛋白含量为因变量，进行单因素提取研究，结合响应面试验设计，获得提取龟甲蛋白最佳工艺；通过超滤技术将龟甲蛋白按分子量分为5个不同组分：总提组分（组分1），Mw>10 kDa组分（组分2），Mw：3~10 kDa组分（组分3），Mw：1~3 kDa组分（组分4），Mw<1 kDa组分（组分5），CCK8法测定不同浓度龟甲蛋白（12.5、25、50、100、200 μg/mL）及其不同组分对MC3T3-E1细胞增殖率的影响。结果：磁力搅拌方法得到的龟甲蛋白含量最高，且活性最佳，龟甲蛋白最佳提取条件为料液比1：13（g/mL）、提取温度30℃、提取3 h，此条件下测得龟甲蛋白含量为15.16%；龟甲蛋白不同组分均能促进MC3T3-E1前成骨样细胞增殖，并呈浓度依赖性，在浓度为200 μg/mL时，组分1~5对细胞的增殖率分别为20.58%、25.30%、30.24%、37.89%、38.15%，分子量小于1 kDa的组分促MC3T3-E1细胞增殖活性最佳。结论：本研究为龟甲蛋白的制备工艺提供参考，并证明龟甲蛋白及其不同组分均具有较好的促成骨细胞增殖活性，其中分子量小于1 kDa组分对MC3T3-E1细胞增殖的效果最佳。Abstract: Objective:To optimize the extraction process of tortoise shell protein,screen the active constituent of tortoise shell,and explore the effect of tortoise shell on the proliferation of osteoblasts(MC3T3-E1). Methods:The contents of protein and the proliferation rate of MC3T3-E1 cells were used as the index to screen the extraction method of tortoise shell protein. The ratio of material to liquid,extraction temperature and time were used as independent variables,and the contents of tortoise shell protein was used as dependent variable to carry out single factor extraction research.According to the design of response surface test,the best extraction technology of tortoise shell protein was obtained.By ultrafiltration technology,the tortoise shell protein was divided into different constituent:Total extract(Component 1),MW>10 kDa(Component 2),MW:3~10 kDa(Component 3),MW:1~3 kDa(Component 4),MW<1 kDa(Component 5).CCK8 method was used to determine the effect of different concentrations(12.5,25,50,100,200 μg/mL)of tortoise shell protein and its different constituent on the proliferation rate of MC3T3-E1 cells. Results:The contents of tortoise shell protein peptide obtained by magnetic stirring method was the highest,and the osteogenic activity was the best.The best extraction condition of tortoise shell protein was at 30 ℃ and the ratio of material to liquid was 1:13 (g/mL)for 3 hours,under this condition,the contents of tortoise shell protein peptide was 15.16%. At the concentration of 200 μg/mL,the proliferation rate of fraction 1~5 to MC3T3-E1 cells was 20.58%,25.30%,30.24%,37.89% and 38.15%,respectively. Among them,fraction<1 kDa had the best proliferation activity.Conclusion:This study would provide a reference for the preparation of tortoise shell protein,and prove that tortoise shell protein and its different components have better proliferation promoting activity in MC3T3-E1 cells,in which the molecular weight sess than 1 kDa had the best effect on MC3T3-E1 cells proliferation.
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