Optimization Purification Process of Polysaccharides from Scutellaria baicalensis Georgi by Macroporous Resins and Its Antibacterial Activity
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摘要: 为优化大孔树脂纯化黄芩粗多糖的工艺，比较不同类型树脂的静态吸附与解吸性能，确定适宜树脂型号，研究其吸附机理。通过动态吸附与洗脱试验确定最佳纯化工艺，同时利用滤纸片法考察黄芩多糖对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。结果表明，AB-8型大孔树脂对黄芩多糖的吸附过程符合Langmuir模型特征，最佳纯化工艺条件为：3 mg/mL的黄芩粗多糖溶液(pH 5.0) 60 mL，以2.0 mL/min流速上样至AB-8型树脂饱和吸附后，采用75%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱，纯化后的多糖含量从26.25%提高至77.12%。黄芩多糖对三种供试菌具有不同程度的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制活性最强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草杆菌的最小抑菌浓度分别为0.625、0.625、1.25 mg/mL。因此该纯化工艺效率较高，纯化后的黄芩多糖具有较好的抑菌活性，可为相关资源的开发提供参考。Abstract: To optimize the purification conditions of polysaccharides extract from Scutellaria baicalensis Georgi by macroporous resin, the suitable macroporous resin was selected through performance comparison of static adsorption and elution of macroporous resins of different types, and the optimum conditions were confirmed by dynamic adsorption and elution tests. Meanwhile, the resistant abilities against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Bacillus subtilis were detected by filtering paper method. The results showed that the adsorption curves that AB-8 macroporous resin adsorbed polysaccharides of Scutellaria baicalensis Georgi accorded with the Langmuir mode feature. The optimum purification conditions were as follows: 60 mL polysaccharides extract solution of concentration 3 mg/mL (pH 5.0) was made and adsorbed by AB-8 macroporous resin with loading flow rate 2.0 mL/min, and then eluted by 75% ethanol with elution flow rate 1.0 mL/min. Under these conditions, the total polysaccharides content increased from 26.25% to 77.12%. The polysaccharides of Scutellaria baicalensis Georgi had inhibitory effects varying degrees on the four tested bacteria and the strongest inhibitory activity was resistant against Escherichia coli. The minimum inhibitory concentrations of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Bacillus subtilis were 0.625, 0.625 and 1.25 mg/mL, respectively. This process had better purified efficiency, and polysaccharides after purification had better antibacterial activities, therefore it provides a reference for corresponding resource development.
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多糖类物质指10个分子以上的单糖经糖苷键连接而成的高分子碳水化合物，广泛存在于植物、菌类等有机体中，其不仅可作为细胞的结构材料，同时也参与各项生命活动，如：通过调节下游抗氧化酶基因的表达，减少体内自由基和活性氧的生成，致使疾病的发生概率下降[1]；抑制外源性有害菌的生长，改善体内菌群环境，提高机体免疫能力[2]。
黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，被国家卫生部门认定为药食两用植物，常作为保健食品的主要成分[3-4]，其富含黄酮类、皂苷类、多糖类及萜类等活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等活性[5-6]。目前，国内外有关黄芩多糖的研究主要集中于对其提取及体内、外抗氧化活性和对免疫因子的影响等方面[7-9]，而对其纯化与抑菌活性的研究暂未有报道。由于黄芩多糖的提取产物仍含有较多杂质，可能影响其功效的发挥，因此本研究以黄芩为原料，采用超声法提取粗多糖后，利用大孔树脂分离纯化，探讨不同条件对其纯化效果的影响，同时通过滤纸片法研究该产物对不同有害菌的抑菌活性和最低抑菌浓度，从而为黄芩多糖的开发利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黄芩 购于白城市吉林大药房，经白城医学高等专科学校牛鹤丽老师鉴定为唇形科植物黄芩的干燥根；D-无水葡萄糖（批号：110833-201908） 中国食品药品检定研究院；无水乙醇、氯化钠、苯酚、硫酸 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水 为纯化水；大肠杆菌（CMCC（B）44102）、枯草杆菌（CMCC（B）63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003） 吉林北方微生物研究所；琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏 北京奥博星生物技术有限公司；灭菌注射用水 华润双鹤药业股份有限公司；牛肉蛋白胨琼脂培养基 自制；青霉素钠 山东鲁抗医药股份有限公司。
LYSF-500-Y型粉碎机 长沙卓成医疗器械有限公司；752N型紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；JMB1001型电子天平 绍兴景迈仪器设备有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；H1650型台式高速离心机 湖南湘仪离心机有限公司；SHA-C型恒温振荡器 国华（常州）仪器制造有限公司；AB-8、D101型大孔树脂 天津波鸿树脂科技有限公司；H 103、DM130型大孔树脂 西安蓝晓科技有限公司；DM 301、HPD 600、HPD 400型大孔树脂 北京索莱宝科技有限公司；JC-150B型恒温恒湿箱 青岛瑞明仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多糖粗提物制备
按照文献方法[10]，制备黄芩多糖粗提物具体如下：黄芩根干燥至恒重后，粉碎完全，过60目筛，准确称取5.00 g，加入150 mL水后，于750 W、60 ℃条件下，超声提取30 min减压过滤，浓缩至30 mL，加入90%乙醇70 mL，沉淀过滤后，冻干即得。
1.2.2 多糖含量测定
精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品50.0 mg，加水溶解配制成0.1 mg/mL标准溶液后，分别稀释至0.02~0.1 mg/mL，随后加入5%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，水浴加热15 min（温度：100 ℃），冷却至室温后于490 nm测定不同浓度标准溶液的吸光度[11]，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=5.212x+0.021（r=0.9995），另于相同波长下，测定样品的吸光度值，通过标准曲线方程，计算样品的多糖含量。
1.2.3 不同树脂的静态吸附-洗脱性能比较
不同类型的树脂经预处理后[12]，准确称取5.0 g置于3 mg/mL多糖提取液60 mL中，于室温下振荡吸附至饱和，测定饱和吸附后提取液中多糖浓度，过滤，树脂置于锥形瓶内，加入体积分数为75%乙醇100 mL[13-14]，于室温振荡解吸至平衡，测得不同类型树脂的饱和吸附量、吸附率、洗脱率和多糖回收率。
τe(mg/g)=(c0−ce)×V0m (1) Qe(%)=c0−cec0×100% (2) Dd(%)=cd×Vd(c0−ce)×V0×100% (3) R(%)=cd×Vdc0×V0×100% (4) 式中：c0为提取液中多糖浓度，mg/mL；ce为饱和吸附后滤液中多糖浓度，mg/mL；m为树脂干重，g；cd为洗脱液中多糖浓度，mg/mL；V0为提取液体积，mL；Vd为洗脱液体积，mL；Ʈe为饱和吸附量，mg/g；Qe为饱和吸附率，%；Dd为洗脱率，%；R为回收率，%。
1.2.4 等温吸附曲线
配制1、2、3、4、5 mg/mL多糖提取液60 mL分别置于装有5 g AB-8型树脂的锥形瓶内，于不同温度下（25、35、45 ℃）振荡吸附至饱和，测得树脂的饱和吸附量，绘制等温吸附曲线，同时分别采用Langmuir和Freundlich吸附模型对其线性拟合，描述其吸附过程[15-16]。
1.2.5 树脂动态吸附-解吸条件优化
1.2.5.1 树脂吸附条件考察
根据预实验结果，以吸附率为考察指标，在内径为30 mm，高度为36 cm的树脂柱内，分别研究不同的上样液浓度、上样液pH与上样流速对AB-8型大孔树脂吸附黄芩多糖的影响，具体如下：（a）当上样液pH为5、体积为60 mL，上样流速为2 mL/min时，上样浓度分别为：1、2、3、4、5 mg/mL；（b）当上样浓度为3 mg/mL，上样流速为2 mL/min，上样液体积为60 mL时，上样液pH分别为：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；（c）当上样浓度为3 mg/mL，上样液pH为5.0时，绘制上样流速分别为1、2、3 mL/min时泄漏曲线。
1.2.5.2 树脂解吸条件考察
根据预实验结果，以洗脱率为考察指标，分别研究洗脱液乙醇的体积分数和流速对树脂的解吸效果影响，具体如下：（a）当洗脱流速为1 mL/min，洗脱液体积为180 mL时，乙醇体积分数分别为：55%、65%、75%、85%、95%；（b）当乙醇体积分数为75%时，绘制洗脱流速分别为1、2、3 mL/min时洗脱曲线。
1.2.6 抑菌活性分析
1.2.6.1 菌种活化与样品配制
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基接种（接种量5%）后，于37 ℃培养24 h，制备105 cfu/mL菌悬液，吸取2 mL涂布于平板中，制成含菌平板[17]。将黄芩多糖纯化产物用无菌水溶解后，配制成10.0 mg/mL多糖溶液，依次稀释成不同浓度（5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL），以确定最小抑菌浓度；另配制10.0 mg/mL青霉素钠溶液作为阳性对照，同时以无菌水为阴性对照[18]。
1.2.6.2 抑菌活性测定
采用滤纸片法考察黄芩多糖的抑菌活性，具体如下：直径6 mm的灭菌圆纸片分别浸泡于相同浓度（10.0 mg/mL）的黄芩多糖溶液和青霉素钠溶液及无菌水中2 h后，贴于布满菌液的培养基平板中，于37 ℃培养24 h，检测抑菌圈直径[19]，每个供试菌平行测定三次。
1.2.6.3 最小抑菌浓度测定
吸取1 mL不同浓度的黄芩多糖溶液置于19 mL液体培养基中，混匀后涂布于平板上，制成抑菌平板后，分别吸取0.1 mL三种菌液，接种于该平板上，另制备不加黄芩多糖的培养基平板作空白对照，于37 ℃培养24 h，通过肉眼观察平板中有无菌落生长，以确定黄芩多糖的最小抑菌浓度[20]。
1.3 统计学分析
每组试验平行三次，试验结果采用平均值±标准差表示，并采用SPSS 19.0进行方差分析，检验水准α=0.05，当P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 树脂类型选择
不同类型树脂的孔径、比表面积与极性差别较大，因此对多糖化合物的吸附效果不一，为此分别考察七种树脂对黄芩多糖的静态吸附与解吸效果。从表1可见，不同树脂型号对黄芩多糖的吸附具有一定的选择性，H103树脂对目标化合物的吸附率最高，达到88.4%，这归因于该树脂的比表面积（≥ 900 m2/g）与平均孔径（85~95 nm）较大，因此与多糖化合物相互作用较好，但较难解吸，而AB-8型树脂的比表面积适中，且为弱极性，相对于极性与非极性树脂更有利于多糖化合物的吸附与解吸，且其对黄芩多糖的回收率最高，达到76.5%，这与陈艳采用AB-8树脂吸附松茸多糖研究结果较为相近[21]，因此确定以AB-8型树脂纯化黄芩多糖提取物。
表 1 不同类型树脂的静态吸附-解吸结果Table 1. Static adsorption and desorption performance of macroporous resins of different types树脂型号 极性 Qe（%） Dd（%） R（%） H103 非极性 88.4 80.5 71.2 D101 非极性 83.5 86.2 72.0 AB-8 弱极性 84.2 90.9 76.5 DM 130 弱极性 81.9 88.5 72.5 HPD-400 中极性 72.6 84.7 61.5 DM 301 中极性 78.5 91.2 71.6 HPD 600 极性 66.3 88.6 58.7 2.2 等温吸附线
AB-8树脂对黄芩多糖的等温吸附线，见图1所示。相同温度下，随着上样液中黄芩多糖浓度的增大，饱和吸附量逐渐升高，但随着温度升高，饱和吸附量却不断下降，表明该吸附作用为放热过程。Langmuir与Freundlich模型对不同等温吸附线的拟合方程，见表2所示，其中Langmuir模型拟合方程的相关系数均大于0.98，表明该吸附过程更趋近于Langmuir吸附模型特征。
表 2 Langmuir与Freundlich模型拟合方程Table 2. Fitting equationsof Langmuir and Freundlich model吸附温度（℃） Langmuir方程 r Freundlich方程 r 25 Ce/Ʈe=0.019Ce + 0.007 0.9961 Ʈe = 36.21Ce0.242 0.9655 35 Ce/Ʈe=0.024Ce + 0.013 0.9845 Ʈe =27.61Ce0.215 0.9421 45 Ce/Ʈe=0.036Ce + 0.008 0.9923 Ʈe=21.54 Ce0.267 0.9293 2.3 动态吸附条件考察
2.3.1 上样液质量浓度对吸附率的影响
上样液质量浓度对AB-8型树脂吸附黄芩多糖的影响，见图2所示。随着上样液质量浓度的增大，吸附率先上升后下降，当上样液质量浓度为1~3 mg/mL时，吸附率无显著性变化（P>0.05），而质量浓度超过3 mg/mL时开始下降。这可能归因于上样液质量浓度的增大，容易造成树脂内杂质的增多，竞争树脂的吸附位点，致使吸附率下降[22]，因此确定最佳上样液质量浓度为3 mg/mL。
2.3.2 上样液pH对吸附率的影响
上样液pH影响黄芩多糖的离子化程度，进而影响树脂对其的吸附作用，因此考察不同上样液pH对AB-8型树脂吸附黄芩多糖的影响，见图3所示。树脂对黄芩多糖的吸附率，随pH的升高，先增大后减小，这归因于溶液pH对多糖化合物的溶解度与化学性质影响较大，在弱酸性条件下更容易以分子态被树脂吸附[23]，因此确定最佳上样液pH为5.0。
2.3.3 树脂泄漏曲线
随着上样液体积的增多，树脂的吸附位点逐渐饱和，吸附能力开始下降。当泄漏液中多糖浓度约为10%上样液质量浓度时，则出现泄漏点[24]，因此绘制不同上样流速的树脂泄漏曲线，见图4所示。当上样流速分别为1、2、3 mL/min时，泄漏点对应的上样液体积逐渐减小，这源于大孔树脂对化学物质的吸附，本质为膜扩散与粒扩散，流速过快，其与树脂的接触时间愈短，扩散效果越差[25]，综合考虑后续实际应用效率，确定最佳上样流速为2.0 mL/min，上样液体积为60 mL。
2.4 动态解吸条件考察
2.4.1 乙醇体积分数对洗脱率影响
不同体积分数乙醇对树脂内黄芩多糖的解吸效果，如图5所示。当乙醇溶液的体积分数增大至75%后，洗脱率开始下降，这归因于黄芩多糖的极性较弱，因此易被一定极性的乙醇溶液洗脱，但乙醇的体积分数过大，使得与多糖化合物的极性相差较大，因此确定乙醇的最佳体积分数为75%。
2.4.2 树脂洗脱曲线
不同洗脱流速下树脂的洗脱曲线，如图6所示，从图6可知，随着洗脱流速加快，曲线的峰形逐渐变宽，并有明显拖尾，同时乙醇消耗量增大，而采用体积分数为75%乙醇溶液以1.0 mL/min流速洗脱时，洗脱曲线对称，拖尾不明显，同时对多糖化合物的洗脱集中，因此确定最佳洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱液体积为160 mL。
2.5 验证实验
通过上述实验结果，确定AB-8型大孔树脂纯化黄芩粗多糖的最佳工艺条件为：3 mg/mL黄芩多糖提取物溶液（pH5.0）60 mL，以2.0 mL/min流速上样至AB-8型树脂饱和吸附后，采用75%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱，产物的多糖含量由26.25%±1.82%提高至77.12%±1.51%，约为纯化前2.7倍，陈艳等[21]采用AB-8型大孔树脂纯化松茸多糖，产物纯度约为纯化前2.5倍，宫江宁等[26]采用FL-3型大孔树脂纯化龙胆草多糖，产物纯度约为纯化前2.8倍，表明该工艺分离纯化效果较高，适于黄芩多糖提取物的纯化。
2.6 黄芩多糖的抑菌试验结果
2.6.1 黄芩多糖对细菌的抑菌效果
黄芩多糖对不同细菌的抑菌效果，如表3所示。黄芩多糖对三种细菌均有一定的抑制作用，其中抑制大肠杆菌的生长最为明显，抑菌圈直径达到（13.07±1.62）mm，而对枯草杆菌的抑制效果一般。阳性对照采用的青霉素钠则对三种细菌的抑菌作用均较强，特别是对枯草杆菌，抑菌圈直径达到（15.38±1.24）mm。两种物质对大肠杆菌的抑制无显著差异（P>0.05），但对金黄色葡萄球菌有显著性差异（P<0.05），而对枯草杆菌的差异则有极显著性（P<0.01）。这与路俊仙等[27]发现不同产地的黄芩均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和绿脓杆菌均有明显抑制作用相似。
表 3 不同样品的抑菌圈直径（n = 3）Table 3. Inhibitionzone diameter of different materials（n = 3）物质 大肠杆菌（mm） 枯草杆菌（mm） 金黄色葡萄球菌（mm） 黄芩多糖 13.07 ± 1.62 9.52 ± 1.84** 10.28 ± 1.36* 阳性对照 14.22 ± 1.51 15.38 ± 1.24 12.51 ± 0.86 阴性对照 − − − 注：与阳性对照相较，*差异显著P<0.05，**差异极显著P<0.01；−表示没有抑菌效果。 2.6.2 最小抑菌浓度
不同浓度的黄芩多糖对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，见表4所示。从表4可知，黄芩多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草杆菌的最小抑菌浓度分别为0.625、0.625、1.25 mg/mL，表明低浓度的黄芩多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强。
表 4 黄芩多糖的最小抑菌浓度Table 4. Minimum inhibitory concentration of polysaccharides of Scutellaria baicalensis Georgi供试菌 5.0 mg/mL 2.5 mg/mL 1.25 mg/mL 0.625 mg/mL 0.3125 mg/mL 大肠杆菌 + + + + − 枯草杆菌 + + + − − 金黄色葡萄球菌 + + + + − 注：+表示有抑菌效果，−表示没有抑菌效果。 3. 结论
探讨了大孔树脂纯化黄芩多糖的最佳工艺条件并分析其抑菌活性。实验结果表明，3 mg/mL黄芩多糖提取物溶液（pH 5.0）60 mL，以2.0 mL/min流速上样至AB-8型树脂饱和吸附后，采用75%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱时，产物的多糖含量由26.25%±1.82%提高至77.12%±1.51%，约为纯化前2.7倍。通过体外抑菌活性试验显示，纯化后的黄芩多糖对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制作用最强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草杆菌的最小抑菌浓度分别为0.625、0.625、1.25 mg/mL可为黄芩多糖的深入开发与利用提供参考。
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表 1 不同类型树脂的静态吸附-解吸结果
Table 1 Static adsorption and desorption performance of macroporous resins of different types
树脂型号 极性 Qe（%） Dd（%） R（%） H103 非极性 88.4 80.5 71.2 D101 非极性 83.5 86.2 72.0 AB-8 弱极性 84.2 90.9 76.5 DM 130 弱极性 81.9 88.5 72.5 HPD-400 中极性 72.6 84.7 61.5 DM 301 中极性 78.5 91.2 71.6 HPD 600 极性 66.3 88.6 58.7 
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表 2 Langmuir与Freundlich模型拟合方程
Table 2 Fitting equationsof Langmuir and Freundlich model
吸附温度（℃） Langmuir方程 r Freundlich方程 r 25 Ce/Ʈe=0.019Ce + 0.007 0.9961 Ʈe = 36.21Ce0.242 0.9655 35 Ce/Ʈe=0.024Ce + 0.013 0.9845 Ʈe =27.61Ce0.215 0.9421 45 Ce/Ʈe=0.036Ce + 0.008 0.9923 Ʈe=21.54 Ce0.267 0.9293
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表 3 不同样品的抑菌圈直径（n = 3）
Table 3 Inhibitionzone diameter of different materials（n = 3）
物质 大肠杆菌（mm） 枯草杆菌（mm） 金黄色葡萄球菌（mm） 黄芩多糖 13.07 ± 1.62 9.52 ± 1.84** 10.28 ± 1.36* 阳性对照 14.22 ± 1.51 15.38 ± 1.24 12.51 ± 0.86 阴性对照 − − − 注：与阳性对照相较，*差异显著P<0.05，**差异极显著P<0.01；−表示没有抑菌效果。
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表 4 黄芩多糖的最小抑菌浓度
Table 4 Minimum inhibitory concentration of polysaccharides of Scutellaria baicalensis Georgi
供试菌 5.0 mg/mL 2.5 mg/mL 1.25 mg/mL 0.625 mg/mL 0.3125 mg/mL 大肠杆菌 + + + + − 枯草杆菌 + + + − − 金黄色葡萄球菌 + + + + − 注：+表示有抑菌效果，−表示没有抑菌效果。
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