不同金属盐离子对乳清分离蛋白纤维聚合物形成的影响

董世鹏; 刘美艳; 邹霈怡; 刘丹; 陈鑫; 李然红

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2024120147

不同金属盐离子对乳清分离蛋白纤维聚合物形成的影响

牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江 157011

基金项目: 黑龙江省教育厅基本科研项目（1452MSYYB005；1453ZD024）。

详细信息

作者简介:
董世鹏（1983−），男，硕士研究生，实验师，研究方向：中草药和食品开发利用，E-mail：swxdsp@126.com

中图分类号: TS254.1
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出版历程
- 收稿日期: 2024-12-15
- 网络出版日期: 2025-04-06

Effects of Different Metal Ions on the Formation of Fibril Aggregates of Whey Protein Isolate

College of Life Science and Technology, Mudanjiang Normal University, Mudanjiang 157011, China

摘要

摘要: 本研究旨在探究不同金属离子（NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃）对乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）纤维聚合物聚合动力学、形态和结构的影响。结果表明，不同金属离子影响了WPI纤维聚合物的最终结构和特征。NaCl、KCl和CaCl₂对WPI的聚集影响较小，增加了溶液pH电导率，而AlCl₃和FeCl₃加速了WPI的聚集，降低了溶液pH，增加了溶液电导率；与原始WPI纤维聚合物硫黄素T（Th T）荧光强度（388.92）相比，NaCl、KCl和CaCl₂增加Th T荧光强度分别至465.39、433.37和486.83，增加了WPI纤维聚合物的生成量，AlCl₃和FeCl₃降低Th T荧光强度分别至228.81和90.24，降低了WPI纤维聚合物的生成量；不同金属离子均改变了WPI聚合动力学，降低了(df/dt)_max值，并改变了滞后时间；NaCl、KCl和CaCl₂对WPI纤维聚合物的形态影响较小，AlCl₃和FeCl₃使WPI纤维聚合物更团簇、粗而杂乱；傅里叶红外光谱结果表明，NaCl、KCl和CaCl₂促进β-折叠结构生成，而AlCl₃和FeCl₃抑制了β-折叠生成，不同金属离子的加入均改变了纤维中β-链间的特征距离。这些结果为利用WPI制备不同聚集形态的纤维聚合物提供了科学依据。
- 乳清分离蛋白 /
- 聚合动力学 /
- 金属离子 /
- 纤维聚合物 /
- 电导率 /
- 硫黄素T
Abstract: In this study, the effects of different metal ions (NaCl, KCl, CaCl₂, AlCl₃, and FeCl₃) on the polymerization kinetics, morphology and structure of the fibril aggregates formed from whey protein isolate (WPI) were investigated. The results indicated that the final structure and characteristics of WPI fibril aggregates were affected by the different metal ions. The pH and the conductivity of the final WPI fibril aggregate solutions were increased by NaCl, KCl, and CaCl₂. While the aggregation of WPI was accelerated, the pH of the solution was reduced, and the conductivity of the solution was increased by AlCl₃ and FeCl₃. Compared with the thioflavin T (Th T) fluorescence intensity (388.92) of the native WPI fibril aggregates, the Th T fluorescence intensity increased to 465.39, 433.37, and 486.83 in response to the addition of NaCl, KCl, and CaCl₂, respectively, indicating an increase in the production of WPI fibril aggregates. In contrast, the Th T fluorescence intensity was reduced to 228.81 and 90.24 following the addition of AlCl₃ and FeCl₃, respectively, thereby indicating a reduction in the amounts of fibril aggregates generated. In addition, different metal ions altered the polymerization kinetics of WPI, reduced the (df/dt) _max value, and shortened or prolonged the period of hysteresis. The presence of AlCl₃ and FeCl₃ was found to be conducive to the clustering of WPI fibril aggregates, which became coarser and more disordered. Moreover, the Fourier transform infrared spectroscopy results indicated that NaCl, KCl, and CaCl₂ promoted the formation of β-sheet structures, whereas AlCl₃ and FeCl₃ inhibited the formation of these structures, and it was also found that addition of different metal ions altered the characteristic distances between β-chains within the fibril aggregates. These findings will provide a scientific basis for the preparation of fibril aggregates characterized by different aggregation forms using WPI.
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- metal ions /
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- conductivity /
- thioflavin T

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蛋白质纳米纤维聚合物不仅具有优异的机械性能，还具有良好的生物相容性，应用范围广泛，因而引起了广泛关注^[1−3]。蛋白质纤维聚合物的形成涉及到蛋白质变性、蛋白质水解成小肽、小肽成核进而自组装形成纤维聚合物等过程^[4−6]。蛋白质自组装形成纳米纤维聚合物的动力学过程称为成核-延长聚合，包括单体的活化、核的形成（滞后期）、添加单体的成长期（生长期）和纤维的成熟阶段（稳定期）^[7−8]。介质环境会影响蛋白质的变性和水解的有效进度，如利用有机溶剂，如尿素、乙醇等，可以有效激发蛋白质变性^[9]；在水介质环境下采用高温（70~90 ℃）和低pH（1.5~3.0）处理，可以使蛋白质变性和水解，变性和水解的蛋白质片段在静电力和疏水力相互作用之间的平衡驱动下，进一步自组装成蛋白纳米纤维聚合物^[10−11]。纤维聚合物的最终形态也受到制备条件的影响，如蛋白类型、蛋白浓度、温度、pH、盐离子类型、盐离子浓度等^[12−13]，通过控制制备条件可以调控蛋白质纤维化能力和生长过程。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）是食品工业生产奶酪的副产品，在高温、低pH条件下长时间加热，可以自组装形成长而细的纳米纤维聚合物，该聚合物具有清晰的形态，直径约为4 nm，长度可以高达几微米^[14−15]。金属离子会影响蛋白纤维化过程和最终纤维的形态。Li等^[16]发现Na⁺加入会影响大米中谷蛋白纤维聚合物的聚合过程和形态，而且盐离子浓度不同，影响程度会发生相应的改变；宋玉洁^[17]发现不同价位金属离子影响大米蛋白纤维化聚集行为，离子价态越高，大米蛋白纤维化效果越好；Ye等^[18]研究了不同价位金属离子对WPI形成纳米纤维水凝胶的影响，研究发现在较低的浓度下高价态离子比低价态离子更容易实现WPI纤维聚合物的凝胶化，盐离子能通过改变蛋白质之间的静电斥力而促进蛋白质的纤维化进程，不同价位的金属离子通过改变蛋白单体分子之间的相互作用和侧链基团的堆积方式调控蛋白纤维化过程和最终纤维的结构形态。虽然金属离子对WPI纤维化过程和形态进行了一定的报道，但是不同金属离子如何影响WPI的聚合动力学过程没有进行系统的研究。

本研究基于WPI在高温、低pH条件下可以形成纤维聚合物，在反应体系中添加5种不同金属盐离子（NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃、FeCl₃），比较WPI纤维聚合物浊度、pH、电导率及WPI形成纤维聚合物的动力学过程变化等，利用透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观察WPI纤维聚合物微观形态的变化，采用傅里叶红外光谱（‌fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、X射线衍射（X-ray Diffraction，XRD）观察WPI纤维聚合物的结构差异，最后从动力学角度分析不同金属离子对WPI纤维化的影响，进而揭示WPI聚合物形貌改变的原因，为WPI在食品体系的应用提供一定的理论和技术支持。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

WPI　购于美国Hilmar公司，其中蛋白质含量为93%、水分含量为4.5%、脂肪含量为1.3%、乳糖含量为0.6%、灰分含量为3.0%；硫黄素T　购于Sigma-Aldrich公司。

H-7650透射电镜　日本日立公司；F4500荧光分光光度计　美国PerkinElmer公司；Allegra64R centrifuge高速台式冷冻离心机　湖南沪康离心机有限公司；T6紫外可见分光光度计　苏州赛力威仪器有限公司；DDSJ-318T电导率仪　上海仪电科学仪器股份有限公司；FE28pH计　梅特勒托利多集团；KDN-ZL定氮仪　上海纤检仪器有限公司；KDN-08C数控消化炉　浙江托普仪器有限公司；ultima X射线衍射仪　日本理学株式会社；iS50傅里叶变换红外吸收光谱仪　赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 WPI纳米纤维聚合物的制备

WPI纳米纤维聚合物的制备参考Yang等^[8]和Ye等^[18]使用的方法，具体步骤如下。利用去离子水配制蛋白浓度为3.5%（w/v）的WPI溶液，调至2.0，12000 r/min离心20 min，收集上清液。使用凯氏定氮仪测定上清液中的蛋白含量，再用去离子水调节WPI浓度至3.0%（w/v），然后在精确调节至pH至2.0。将配制好的WPI溶液分成6份，每份100 mL，其中1份不添加金属离子，作为对照，另外5份分别添加NaCl（0.17 g）、KCl（1.22 g）、CaCl₂（0.33 g）、AlCl₃（0.40 g）和FeCl₃（0.48 g）至最终离子浓度为30 mmol/L，具体命名见表1。将6份溶液分别在90 ℃条件下加热0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h后，立即冷却，4 ℃保存，制备得到纤维聚合物。加热10 h的样品一部分保留液体样品，一部分冻干备用。

表 1 不同样品的制备

Table 1. Preparation of different samples

序号	1	2	3	4	5	6
添加物	无	NaCl	KCl	CaCl₂	AlCl₃	FeCl₃
命名	原始WPI	Na-WPI	K-WPI	Ca-WPI	Al-WPI	Fe-WPI

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1.2.2 浊度的测定

各样品在4 ℃在保存过夜后，充分混匀待测。利用紫外分光光度计测定各样品在500 nm处的吸光度，以去离子水做空白调零，测定吸光度作为浊度^[19]。

1.2.3 pH及电导率的测定

利用pH计测定样品的pH，利用电导率仪测定样品的电导率^[18]。

1.2.4 Th T荧光强度的测定

使用NaCl-磷酸缓冲液（10 mmol/L磷酸盐、20 mmol/L NaCl，pH7.0）配制0.8 mg/mL Th T溶液，0.22 μm水系过滤头过滤至棕色试剂瓶中，作为储备液，用NaCl-磷酸缓冲液将储备液稀释50倍得到工作液。取40 μL样品加入5 mL的Th T工作液，混匀，反应1 min。用荧光分光光度计测定样品的Th T荧光强度，激发波长为460 nm，发射波长为490 nm，狭缝分别为10 nm和5 nm^[20]。

1.2.5 聚合动力学的评价

利用Origin10.0软件对Th T数据进行经验曲线拟合函数拟合，拟合的公式为Morris等^[21]提出的公式（1）。其中f_t为相应时间t的荧光强度，α、β和γ是任意常数。根据Loveday等^[13,22]提出的公式（2）、（3）和（4），计算出t_lag（滞后时间）、t_{1/2 max}（荧光增加到其最大值一半的时间）和（df/dt）_max（荧光的最大增加率）。

$\rm {f_t} = \gamma {{ - }}\dfrac{{\gamma+\dfrac{\beta }{\alpha }}}{{1+\dfrac{\beta }{{\alpha \gamma }}\exp [(\beta+\alpha \gamma )]}}$

(1)

$\rm {t}_{lag}=\frac{1}{\beta+\alpha \gamma }\left[\mathrm{ln}\left(\frac{\alpha \gamma }{\beta }\right)-4\frac{\alpha \gamma }{\beta+\alpha \gamma }+2\right]$

(2)

$\rm {t_{1/2\max }} = \dfrac{{\ln \left(2+\dfrac{{\alpha \gamma }}{\beta }\right)}}{{\beta+\alpha \gamma }}$

(3)

$\rm {\left(\frac{df}{dt}\right)}_{\mathrm{max}}=\frac{\left(\dfrac{\beta }{\gamma }+\alpha \right)\left(\beta+\alpha \gamma \right)}{4}$

(4)

1.2.6 微观形态观察

使用TEM观察纤维聚合物的微观形态。用超纯水将样品稀释至3 mg/mL，取20 μL滴加至碳涂层的铜网格上吸附20 min，室温干燥60 min后上镜观察^[14]。

1.2.7 FTIR光谱的测定

各冻干样品以1:100的质量比加入KBr，研磨成粉末，压成薄片后测定。分辨率设置为4 cm⁻¹，扫描次数为32次，全波段为4000~400 cm^−1[23]。利用PeakFit 4.12分析蛋白质二级结构的变化。

1.2.8 XRD的测定

使用X射线衍射仪测定各冻干样品的XRD，操作条件为40 kV和40 mA，在Cu-Kα辐射（λ=1.54Å）下测定，测定范围为5°~90°（2θ），扫描速率为1°/s^[24]。

1.3 数据处理

试验数据用Statix8.0进行分析，采用Origin10.0软件进行作图，每组试验设3次重复。

2. 结果与分析

2.1 不同金属离子对WPI纤维聚合物浊度的影响

基于蛋白质聚集体增加散射入射光的原理，可利用可见分光区吸光值的改变监测蛋白质聚集体的变化^[19]。在500 nm下测定添加不同价位金属离子的WPI纤维化过程中的吸光值，以表示浊度，结果见图1A，原始WPI浊度的变化呈现先降低后增加的趋势，先从0.711（0 h）降低至0.70（1 h），再增加至0.94（10 h）。水解是蛋白质形成纤维聚合物的必要过程之一，最初WPI先水解成小分子物质，然后再聚集成较大的聚集体^[25−26]，因而其浊度呈现先降低再升高的趋势；添加NaCl、KCl、CaCl₂后，浊度均呈现直接增加的趋势，分别增加至0.99、1.01和0.97（10 h），与原始WPI相比，变化幅度较小，说明WPI形成纤维的过程较为平稳；添加AlCl₃后，浊度呈现先降低后增加的趋势，从0.72（0 h）降低至0.711（1 h），然后增加至1.95（10 h），添加FeCl₃后，浊度变化规律性不强，整体呈现上升的趋势，从0.863（0 h）最终增加至1.57（10 h），纤维聚合物的形成是一个缓慢的过程，聚集体形成的过快不利于纤维聚合物的形成^[26]，而添加AlCl₃和FeCl₃后，溶液颜色改变明显（图1B），说明二者加速了WPI聚集体的形成，对WPI纤维化过程的影响较大。

图 1 不同样品的浊度（A）和直观图（B）

Figure 1. Turbidity (A) and visual chart (B) for different samples

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2.2 不同金属离子对WPI纤维化过程中pH和电导率的影响

图2A显示了不同样品WPI纤维化过程中pH的变化。WPI纤维化过程中，pH整体呈现上升趋势。不同价位的金属离子的添加对WPI纤维化过程中pH的改变存在不同。原始WPI纤维化过程中pH变化从最初的2.0增加至2.32；添加NaCl、KCl、CaCl₂未改变WPI溶液最初的pH，在加热10 h后，pH分别增加至2.37、2.48和2.32；添加AlCl₃后，WPI溶液的pH从最初的1.81增加至2.09；添加FeCl₃降低了WPI溶液的最初pH（1.55），当加热10 h时，pH增加至1.67。随着加热时间的增加，所有溶液pH的增加是由于WPI纳米纤维聚合物的形成和蛋白质中肽键的水解^[1]。在WPI形成纤维的过程中，蛋白质分子之间会发生聚集和自组装，游离的酸性基团减少，从而使溶液的pH上升；同

图 2 不同金属离子对WPI纤维化过程中溶液pH和电导率的影响

Figure 2. Effects of different metal ions on the pH and conductivity of the solution during the fibrosis of WPI

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时，蛋白质水解过程会释放出游离氨基，导致溶液pH的增加^[16,20]。Ye等^[18]研究也发现随着加热时间的延长，pH呈现上升的趋势。添加不同金属离子后，WPI溶液pH的改变是因为金属离子在溶液中呈现不同的酸性，酸性大小取决于酸度系数（pKa值），pKa值越低其酸性越强，K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Fe³⁺的pKa值分别为14.5、14.2、12.7、5和2.2^[9]，因此，不同价位金属离子的添加能不同程度地改变WPI原溶液的pH。

原始WPI和分别添加不同金属离子的WPI在90 ℃加热10 h过程中的电导率变化如图2B所示。各样品WPI溶液在纤维化过程中电导率均呈现下降趋势，添加不同价位盐离子后，WPI溶液的电导率明显增加。原始WPI溶液在纤维化过程中，电导率由最初的4.80 ms/cm降低至3.83 ms/cm，降低幅度为20.44%；添加NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃后，WPI溶液的电导率分别从最初的6.86、7.39、7.69、7.78和7.48 ms/cm降低至最终的6.05、6.14、6.41、6.52和6.35 ms/cm，降低幅度分别为11.80%、16.91%、16.64%、16.19%和15.10%。这些结果均表明不同金属离子对WPI纤维化过程的影响程度存在差异。

2.3 不同金属离子对WPI纤维化过程中Th T荧光强度的影响

Th T是一种荧光染料，与蛋白质淀粉样纤维分子间的β-折叠结合时，荧光强度会明显增强，荧光强度越大，说明淀粉样纤维聚合物生成量越高^[27]，因此，可用Th T荧光强度的变化反映不同价位金属离子对WPI纤维聚合物形成的影响。从Th T荧光强度的变化可见，不同价位金属离子的加入干扰了WPI淀粉样纤维聚合物的形成（图3）。原始WPI形成纤维聚合物的过程中，Th T荧光强度变化呈现先平稳上升，然后迅速上升，之后缓慢上升的过程，Th T荧光强度从最初的28.58升高至388.92。添加NaCl、KCl和CaCl₂后，Th T荧光强度也是呈现先缓慢升高，然后迅速升高，之后继续上升的变化趋势，但Th T荧光强度均大于原始WPI的Th T荧光强度，最终荧光强度分别为465.39、433.37和486.83，说明NaCl、KCl和CaCl₂的加入增加了样品中β-折叠结构的形成。添加AlCl₃后，Th T荧光强度呈现阶梯式的增加，从34.13增加至228.81；添加FeCl₃后，Th T荧光强度缓慢增加，从24.37增加至90.24，说明AlCl₃和FeCl₃的抑制或者破坏了β-折叠结构的形成，对WPI纤维聚合物的形成起到消极影响。为进一步比较添加不同价位金属离子对WPI形成纤维聚合物的Th T荧光强度的影响，将添加不同价位金属离子的Th T荧光强度与原始WPI的Th T荧光强度相减做差。不同价位金属离子对Th T荧光强度的改变程度存在差异。加热10 h时，与原始WPI相比，添加NaCl、KCl和CaCl₂的荧光强度分别增加了76.47、44.44和97.91，添加AlCl₃和FeCl₃后，荧光强度降低了160.10和298.67，说明NaCl、KCl、CaCl₂的添加促进了WPI纤维聚合物的形成，而AlCl₃和FeCl₃的添加抑制了WPI纤维聚合物的形成。NaCl、KCl和CaCl₂能降低蛋白质在形成纤维初始阶段蛋白质之间的静电斥力，并促进水合氢离子的产生，并且，Na⁺、K⁺和Ca²⁺可以与芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）周围的离域p电子相互作用，即“阳离子-π相互作用”，从而促进WPI纤维聚合物的形成^[28]，而AlCl₃和FeCl₃溶液具有更高的酸性，导致蛋白质过快水解，进而阻碍WPI的纤维化，抑制WPI纤维聚合物的形成^[18]。

图 3 不同金属离子对WPI纤维化过程Th T荧光强度的影响

Figure 3. Effects of metal ions on the Th T fluorescence intensity during the fibrosis of WPI

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2.4 不同金属离子对动力学参数的影响

根据Morris等^[21]提出的经验曲线拟合函数公式（1）对Th T荧光数据进行归一化拟合，拟合曲线见图4所示。原始WPI和添加NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃的WPI的Th T荧光数据的归一化数值拟合度（R²）均较高，分别为0.995、0.999、0.982、0.995、0.972和0.944（表2），说明拟合的数据具有可靠性。从表2的结果可见，添加不同价位金属离子改变了WPI的最大荧光强度，原始WPI和添加NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃的WPI最大Th T荧光强度分别增加或者降低至388.920、465.396、433.365、486.833、236.952、90.763（P<0.05），说明金属离子的添加改变了WPI形成纤维聚合物的量。不同价位的金属离子也改变了原始WPI的t_lag、t_1/2max和（df/dt）_max值，但改变程度不同。天然WPI的t_lag、t_1/2max和（df/dt）_max值分别为3.627、6.453和0.112，添加NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃的t_lag分别为1.728、12.126、0.341、1.714和0.189；WPI形成纤维聚合物需要先经过水解，然后再成核，添加金属离子后改变了溶液的pH，进而改变了水解的速度，从而表现出t_lag的不同。添加NaCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃均缩短了t_1/2max值，而添加KCl增加了t_1/2max值；未添加和添加NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃、FeCl₃的（df/dt）_max分别为0.112、0.068、0.003、0.020、0.103、0.010，纤维核的形成可能是限制性的，一旦形成足够量的纤维核，大量的水解产物将促进原纤维的快速生长，进而表现出（df/dt）_max的改变^[7]。从动力学参数可以看出不同价位的金属离子改变了WPI的聚合物动力学参数，也改变了最大Th T荧光强。

图 4 不同样品硫黄素T荧光数据拟合结果

Figure 4. Fitting results of Thioflavin T fluorescence of different samples

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表 2 不同样品的聚合动力学参数

Table 2. Kinetic parameters of different samples

样品	t_lag	t_1/2max	（df/dt）_max	f_max	Adjusted R²
天然WPI	3.627	6.453	0.112	388.920±7.817^d	0.995
Na-WPI	1.728	5.200	0.068	465.396±13.044^b	0.999
K-WPI	12.126	49.710	0.003	433.365±0.330^c	0.982
Ca-WPI	0.341	5.265	0.020	486.833±5.210^a	0.995
Al-WPI	1.714	4.550	0.103	236.952±1.505^e	0.972
Fe-WPI	0.189	6.202	0.010	90.763±5.849^f	0.944
注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05），表3同。

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2.5 TEM观察结果

不同金属离子改变了WPI纤维聚合动力学，这种改变可能会带来WPI形成不同形态的纤维聚合物。原始WPI和分别添加NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃的WPI在90 ℃加热10 h后形成聚合物的微观形态的结果见图5。原始WPI形成了长而直的纤维聚合物，添加不同价位盐离子均能改变WPI纤维聚合物的形态。添加NaCl后，WPI形成的纤维聚合物细长而弯曲，这与Loveday等^[14,15]的发现一致；添加KCl后，WPI仍然可以形成细长的纤维聚合物；添加CaCl₂后，WPI形成的纤维聚合物较短而弯曲，纤维聚合物互相缠绕、聚集，形成了纤维聚合物团簇；添加AlCl₃后，WPI形成了更小、更弯曲的团簇状纤维聚合物；添加FeCl₃后，WPI形成了较粗、长的纤维聚合物，且纤维聚合物上聚集了其他无规则聚合物。可见，添加不同金属离子对纤维聚合物的结构产生了重要影响。这些形态的改变可能源于聚合动力学的改变，因为不同金属具有不同的溶剂化能力，溶剂化促进了蛋白质的更快水解，进而促进了成核，缩短了WPI的纤维聚合物^[18]。

图 5 不同金属离子对WPI纤维聚合物微观形态的影响

Figure 5. Effects of different metal ions on the micromorphology of WPI fibril aggregates

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2.6 FTIR光谱测定结果

不同形态的聚合物的结构存在不同，利用傅里叶红外光谱表征聚合物的结构差异。添加不同金属盐离子WPI加热10 h后形成的纤维聚合物的傅里叶红外光谱见图6。不同纤维聚合物在3400~3200 cm⁻¹内均存在N-H或O-H的特征吸收峰；在1700~1600 cm⁻¹范围内存在酰胺I谱带，该谱带与肽基的C=O伸缩振动有关；在1600~1500 cm⁻¹范围内存在酰胺Ⅱ谱带，该谱带与N-H键弯曲和C-N键伸缩振动有关^[29]。

图 6 不同样品加热10 h后形成WPI纤维聚合物的FTIR光谱

Figure 6. FTIR spectra of WPI fibril aggregates of different samples formed by heating for 10 hours

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不同样品酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带波段存在差异。通过酰胺I谱带可以计算不同样品的二级结构含量（表3）。β-折叠结构的增多说明蛋白质结构更加有序。β-折叠结构的含量可以充分体现纤维聚合物形成的量，原始WPI形成纤维聚合物的β-折叠结构含量为51.21%，添加NaCl、KCl和CaCl₂后，WPI形成的纤维聚合物中β-折叠结构含量分别增加至77.25%、65.61%和79.27%（P<0.05），说明这3种盐离子促进了WPI纤维聚合物的形成；而添加AlCl₃和FeCl₃后，WPI形成的纤维聚合物的β-折叠含量分别为34.95%和23.71%（P<0.05），说明这2种盐离子抑制了WPI纤维聚合物的形成。原始WPI形成纤维聚合物的α-螺旋、无规则卷曲和β-转角含量分别为13.64%、15.70%和19.44%，添加NaCl、KCl和CaCl₂后，WPI形成的纤维聚合物中α-螺旋含量分别为2.24%、3.17%和1.42%，无规则卷曲含量分别为2.97%、3.17%和5.41%，β-转角含量分别为17.56%、28.04%和13.89%；而添加AlCl₃和FeCl₃后，WPI形成的纤维聚合物的α-螺旋含量分别为11.94%和21.11%，无规则卷曲含量分别为33.53%和20.00%，β-转角含量分别为19.58%和35.18%。在蛋白质纤维形成过程中，价位较高的金属离子和蛋白质之间的相互作用影响蛋白质自身有序结构（如β-折叠）的形成^[2]，以上结果可见，AlCl₃和FeCl₃的添加降低了WPI纤维聚合物中β-折叠的含量，从而增加了WPI无序结构的形成。

表 3 各样品纤维聚合物的二级结构（%）

Table 3. Secondary structure of different samples (%)

样品	α-螺旋	β-折叠	无规则卷曲	β-转角
原始WPI	13.64±1.09^b	51.21±1.06^c	15.70±1.00^c	19.44±1.00^c
Na-WPI	2.24±0.19^cd	77.25±1.01^a	2.97±0.05^e	17.56±1.01^c
K-WPI	3.17±0.20^c	65.61±0.72^b	3.17±0.08^e	28.04±0.90^b
Ca-WPI	1.42±0.19^d	79.27±0.66^a	5.41±0.13^d	13.89±0.73^d
Al-WPI	11.94±0.12^b	34.95±0.10^d	33.53±0.61^a	19.58±0.76^c
Fe-WPI	21.11±1.00^a	23.71±0.63^e	20.00±0.51^b	35.18±1.26^a

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2.7 XRD测定结果

使用X射线衍射仪也可以检测添加不同金属离子WPI加热10 h后形成的各纤维聚合物的结构差异，结果如图7所示。所有样品的XRD图谱均显示了弥漫和宽峰，说明形成的纤维聚合物均为无定形晶体结构^[30]。原始WPI形成的纤维聚合物显示两个宽峰：2θ≈18.67°和38°。Yang等^[8]也发现WPI纳米纤维聚合物在19°左右具有吸收峰。添加NaCl后，纤维聚合物在20.54°形成一个馒头峰，在32°形成另一个峰，添加KCl后，纤维聚合物在20.11°形成一个馒头峰，另几个峰值分别在28°、38°和40°。2θ在28°、38°和40°，说明有金属K、Na和Cl的存在，说明Na⁺和K⁺充分参与到了纤维聚合物的形成；添加CaCl₂、AlCl₃、FeCl₃的纤维聚合物则分别在19.53°、21.55°和19.82°处出现宽峰。2θ≈18.67~22°代表了纤维中β-链间的特征距离信息。以上结果说明不同样品形成的纤维聚合物在结构上存在差异。这种结构的不同可能源于金属离子改变了WPI纤维聚合物的聚合动力学过程。

图 7 不同样品加热10 h后形成WPI纤维聚合物的XRD光谱

Figure 7. XRD spectra of WPI fibril aggregates of different samples formed by heating for 10 hours

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3. 结论

不同价位金属盐离子（NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃）改变了WPI纤维聚合物的结构、形成过程和纤维聚合物的最终形态。NaCl、KCl、CaCl₂增加了WPI纤维聚合物的生成量，而AlCl₃和FeCl₃降低了纤维聚合物的生成量。NaCl、KCl、CaCl₂、AlCl₃和FeCl₃缩短了滞后期的时间，而KCl延长了滞后期的生成时间。NaCl和CaCl₂使WPI形成弯曲的纤维聚合物，添加KCl后，WPI仍然可以形成细长的纤维聚合物，同时也形成了其他形态聚合物，AlCl₃导致WPI形成了更弯曲的团簇状纤维聚合物，而FeCl₃促使WPI形成了较粗、长的纤维聚合物。添加不同价位金属离子改变了WPI原溶液的pH和电导率，使WPI所处的介质环境均发生了改变，形成了更为复杂的反应介质环境，这可能是WPI聚合动力学发生变化的根本原因。本研究从介质环境的角度揭示了WPI纤维聚合物动力学和形貌改变原因，但不同纤维聚合物在食品中的功能性质的应用规律仍需进一步探索。本研究为WPI制备不同聚集形态的纤维聚合物提供理论依据和技术指导。

图 1 不同样品的浊度（A）和直观图（B）

Figure 1. Turbidity (A) and visual chart (B) for different samples

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图 2 不同金属离子对WPI纤维化过程中溶液pH和电导率的影响

Figure 2. Effects of different metal ions on the pH and conductivity of the solution during the fibrosis of WPI

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图 3 不同金属离子对WPI纤维化过程Th T荧光强度的影响

Figure 3. Effects of metal ions on the Th T fluorescence intensity during the fibrosis of WPI

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图 4 不同样品硫黄素T荧光数据拟合结果

Figure 4. Fitting results of Thioflavin T fluorescence of different samples

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图 5 不同金属离子对WPI纤维聚合物微观形态的影响

Figure 5. Effects of different metal ions on the micromorphology of WPI fibril aggregates

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图 6 不同样品加热10 h后形成WPI纤维聚合物的FTIR光谱

Figure 6. FTIR spectra of WPI fibril aggregates of different samples formed by heating for 10 hours

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图 7 不同样品加热10 h后形成WPI纤维聚合物的XRD光谱

Figure 7. XRD spectra of WPI fibril aggregates of different samples formed by heating for 10 hours

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表 1 不同样品的制备

Table 1 Preparation of different samples

序号	1	2	3	4	5	6
添加物	无	NaCl	KCl	CaCl₂	AlCl₃	FeCl₃
命名	原始WPI	Na-WPI	K-WPI	Ca-WPI	Al-WPI	Fe-WPI

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表 2 不同样品的聚合动力学参数

Table 2 Kinetic parameters of different samples

样品	t_lag	t_1/2max	（df/dt）_max	f_max	Adjusted R²
天然WPI	3.627	6.453	0.112	388.920±7.817^d	0.995
Na-WPI	1.728	5.200	0.068	465.396±13.044^b	0.999
K-WPI	12.126	49.710	0.003	433.365±0.330^c	0.982
Ca-WPI	0.341	5.265	0.020	486.833±5.210^a	0.995
Al-WPI	1.714	4.550	0.103	236.952±1.505^e	0.972
Fe-WPI	0.189	6.202	0.010	90.763±5.849^f	0.944
注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05），表3同。

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表 3 各样品纤维聚合物的二级结构（%）

Table 3 Secondary structure of different samples (%)

样品	α-螺旋	β-折叠	无规则卷曲	β-转角
原始WPI	13.64±1.09^b	51.21±1.06^c	15.70±1.00^c	19.44±1.00^c
Na-WPI	2.24±0.19^cd	77.25±1.01^a	2.97±0.05^e	17.56±1.01^c
K-WPI	3.17±0.20^c	65.61±0.72^b	3.17±0.08^e	28.04±0.90^b
Ca-WPI	1.42±0.19^d	79.27±0.66^a	5.41±0.13^d	13.89±0.73^d
Al-WPI	11.94±0.12^b	34.95±0.10^d	33.53±0.61^a	19.58±0.76^c
Fe-WPI	21.11±1.00^a	23.71±0.63^e	20.00±0.51^b	35.18±1.26^a

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施引文献(11)

期刊类型引用(5)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 WPI纳米纤维聚合物的制备
1.2.2 浊度的测定
1.2.3 pH及电导率的测定
1.2.4 Th T荧光强度的测定
1.2.5 聚合动力学的评价
1.2.6 微观形态观察
1.2.7 FTIR光谱的测定
1.2.8 XRD的测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 不同金属离子对WPI纤维聚合物浊度的影响
2.2 不同金属离子对WPI纤维化过程中pH和电导率的影响
2.3 不同金属离子对WPI纤维化过程中Th T荧光强度的影响
2.4 不同金属离子对动力学参数的影响
2.5 TEM观察结果
2.6 FTIR光谱测定结果
2.7 XRD测定结果
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 WPI纳米纤维聚合物的制备
1.2.2 浊度的测定
1.2.3 pH及电导率的测定
1.2.4 Th T荧光强度的测定
1.2.5 聚合动力学的评价
1.2.6 微观形态观察
1.2.7 FTIR光谱的测定
1.2.8 XRD的测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 不同金属离子对WPI纤维聚合物浊度的影响
2.2 不同金属离子对WPI纤维化过程中pH和电导率的影响
2.3 不同金属离子对WPI纤维化过程中Th T荧光强度的影响
2.4 不同金属离子对动力学参数的影响
2.5 TEM观察结果
2.6 FTIR光谱测定结果
2.7 XRD测定结果
3. 结论

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不同金属盐离子对乳清分离蛋白纤维聚合物形成的影响

作者简介: 董世鹏（1983−），男，硕士研究生，实验师，研究方向：中草药和食品开发利用，E-mail：swxdsp@126.com

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