Safety and Probiotic Evaluation of Lactiplantibacillus plantarum CHEN1 and Its Metabolic Analysis of Soymilk Oligosaccharides
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摘要: 植物乳植杆菌是重要的益生菌资源，本研究旨在评估植物乳植杆菌CHEN1的安全性、益生性及其碳水化合物活性酶的代谢潜能。通过基因组测序和功能注释分析菌株的遗传特性，结合表型实验（溶血活性测定、有害代谢物检测、药敏性评价、耐受性实验、疏水率和自聚集率）评估其安全性和益生潜力，并解析其对豆乳低聚糖的代谢机制。结果表明，该菌基因组中不含硝基还原酶、胰蛋白酶等有害代谢相关基因，溶血实验和有害代谢物检测均为阴性。药敏实验显示其对β-内酰胺类和氯霉素类抗生素敏感，耐药基因可转移性较低，具有较高的安全性。菌株在pH2.0孵育2 h的存活率为22.47%，在0.3%胆盐条件的存活率为33.80%，胃肠液模拟实验存活率达73.32%，疏水率为41.83%，自聚集率为13.47%，表现出良好的益生特性。基因组功能注释揭示菌株具有完整的棉子糖和水苏糖代谢途径，进一步通过豆乳发酵实验进行验证。发酵后豆乳中水苏糖含量由1043.83 mg/L降至536.01 mg/L，棉子糖含量由270.69 mg/L降至134.69 mg/L，表明CHEN1对两种糖具有较强的代谢能力，具有降解豆乳中胀气因子、改善消化性的潜力。综上，CHEN1菌株具有潜在的安全性和益生性，可作为功能性菌株应用于植物基食品的发酵。Abstract: Lactiplantibacillus plantarum was an important source of probiotics. This study aimed to evaluate the safety, probiotic properties, and metabolic potential of carbohydrate-active enzymes of Lactiplantibacillus plantarum CHEN1. The genetic characteristics of the strain were analyzed through genome sequencing and functional annotation. Phenotypic experiments, including hemolytic activity assays, detection of harmful metabolites, antibiotic susceptibility testing, tolerance experiments, hydrophobicity, and autoaggregation assays were conducted to evaluate its safety and probiotic potential. Furthermore, its metabolic mechanism for soymilk oligosaccharides was elucidated. The results showed that the strain's genome lacked genes associated with harmful metabolism, such as nitroreductase and trypsin. Hemolysis tests and harmful metabolite detection were negative. Antibiotic susceptibility testing showed sensitivity to β-lactam and chloramphenicol antibiotics, with low transferability of resistance genes, indicating high safety. The strain exhibited a survival rate of 22.47% after incubation at pH2.0 for 2 hours, 33.80% in 0.3% bile salts, and 73.32% in simulated gastrointestinal fluid. The hydrophobicity and autoaggregation rates were 41.83% and 13.47%, respectively, demonstrating good probiotic characteristics. Genome functional annotation revealed that the strain possessed complete metabolic pathways for raffinose and stachyose. This was further validated through soymilk fermentation experiments. After fermentation, the stachyose content in soymilk decreased from 1043.83 mg/L to 536.01 mg/L, and the raffinose content decreased from 270.69 mg/L to 134.69 mg/L, indicating that CHEN1 has a strong metabolic capacity for these two sugars and the potential to degrade flatulence-inducing factors in soymilk and improve digestibility. In conclusion, L. plantarum CHEN1 exhibits potential safety and probiotic properties and can be used as a functional strain for the fermentation of plant-based foods.
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Keywords:
- Lactiplantibacillus plantarum /
- metabolic analysis /
- safety /
- probiotics /
- soymilk oligosaccharides
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益生菌是指活的微生物，当摄入足够浓度时可对宿主健康有益[1]。乳酸菌中乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、链球菌属和片球菌属以及酵母菌中的酵母属都可被用作人类和动物的益生菌[2]。其中，植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是世界范围内广泛使用的益生菌之一[3]，也是已知的乳酸菌中基因组最大的菌株之一，是兼性异型发酵型乳酸菌。植物乳植杆菌可以代谢多种糖，具有很强的基质适应性，如乳制品、蔬菜、葡萄酒以及人类和动物的胃肠道[4]。研究发现，植物乳植杆菌具有抗氧化活性、调节血脂、改善肠道炎症、维持肠道菌群平衡、提高机体免疫力等多种益生作用[5−7]。此外，植物乳植杆菌还可以产生多种抑菌物质，如有机酸、过氧化氢和细菌素等，对多种致病菌具有抑制作用[8]。
益生菌菌株的安全性是菌株开发利用的前提。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）在《食品中益生菌评价指南》中制定了选择益生菌的标准，包括对人类胃肠道中恶劣条件的抵抗力，如高酸水平、胆盐浓度和消化酶。此外，菌株还必须能够粘附于上皮细胞，可抑制病原菌，且必须人体安全[9]。然而，同一菌种的安全性和益生性因菌株而异，因此需要在菌株水平上进行安全性和益生性评价[10]。随着基因测序技术的发展，除表型实验外，全基因组测序可用于分析与安全性和益生性相关的生物学信息，包括耐药基因、毒力因子和耐受基因的注释等，使菌株的安全性和益生性评价更加全面。此外，通过对碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）的分析，结合京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，可以系统解析菌株对碳水化合物的代谢机制，这种方法能够为菌株在食品加工领域的应用提供更精准的理论依据与数据基础。
棉子糖家族寡糖（Raffinose family oligosaccharides，RFOs）如水苏糖和棉子糖，在大豆中具有较高的含量，但由于人体缺乏α-半乳糖苷酶，无法将其消化吸收，因而被公认为大豆中的抗营养因子[11]。RFOs被人体摄入后在肠道中会被大肠杆菌、肠球菌等细菌利用而产气，导致胃肠道胀气[12]。研究报道，部分植物乳植杆菌含有α-半乳糖苷酶活性[13]，可以降低豆乳中的棉子糖和水苏糖含量[14]，从而缓解胃肠道胀气等不适症状，提高豆乳及大豆制品的消化舒适性。植物乳植杆菌CHEN1分离自西藏灵菇，目前已完成了全基因组测序（GenBank登录号：PRJNA1014938）[15]，但其安全性以及益生特性尚不明确。本研究旨在结合全基因组和表型分析明确植物乳植杆菌CHEN1的安全性和益生性，并通过CAZymes结合KEGG数据库解析该菌株对棉子糖和水苏糖的代谢机制，为植物乳植杆菌CHEN1在豆乳发酵中的应用奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
植物乳植杆菌CHEN1 分离自西藏灵菇，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC 1.60144）；人工唾液、人工胃液、人工肠液 飞净生物科技有限公司；牛胆盐 上海源叶生物科技有限公司；鸟氨酸、酪氨酸 上海麦克林生化科技有限公司；抗菌药物药敏片 比克曼生物科技有限公司；靛基质试剂 广东环凯微生物科技有限公司；哥伦比亚血琼脂平板 生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸细菌培养基（MRS）培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、氨基酸脱羧酶实验培养基、硝酸盐培养基 按微生物国标方法配制。
JK-DSC-1020型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；LS-100HD型立式高压蒸汽灭菌锅 山东欧莱博医疗器械有限公司；SW-CJ-2F12960型超净工作台 合肥宜风空调净化工程有限公司；DC2MY型离心机 长沙维尔康湘鹰离心机有限公司；SH500-PHS-P型pH计 梅特勒-托利多国际有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；STAT-FAX2100型酶标仪 美国Awareness T66echnology公司；HZP-250型全温振荡培养箱 上海精宏实验设备有限公司；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱烘箱 上海鳌珍仪器制造有限公司；HZK-FA210S型电子天平 美国康州HZ电子有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化
在无菌条件下将甘油保藏的植物乳植杆菌CHEN1接种于无菌MRS培养基中，于37 ℃下静置培养24 h后，转接三代，备用。
1.2.2 植物乳植杆菌CHEN1的安全性评价
1.2.2.1 毒力因子与耐药基因分析
将植物乳植杆菌CHEN1的基因组序列与毒力因子数据库（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）进行比对，选择相似性大于70%且E值小于1×10−10的注释结果。将植物乳植杆菌CHEN1的基因序列与综合抗生素耐药性数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）进行比较，并使用抗性基因标识符（Resistance Gene Identifier，RGI）进行注释[16]。
1.2.2.2 有害代谢物检测
吲哚实验：无菌条件下，将活化后植物乳植杆菌CHEN1按1%的接种量接种于蛋白胨水培养基中，于37 ℃下静置培养24 h后，在培养基内加入5~8滴靛蓝基质试剂，轻摇试管并观察液面颜色变化。若液面为红色则为阳性，否则为阴性[17]。以未接种的蛋白胨水培养基为空白对照。
硝酸盐还原酶检测实验：在无菌条件下，将活化好的植物乳植杆菌CHEN1按1%的接种量接种到硝酸盐培养基内，于37 ℃下静置培养24 h后，先滴加10滴5%（质量分数）的KI溶液，然后滴加10滴5%（质量分数）的淀粉溶液，充分振荡混匀后观察颜色变化[17]。以大肠杆菌为阳性对照。
氨基酸脱羧酶检测实验：活化好的植物乳植杆菌CHEN1分别划线接种到含鸟氨酸、酪氨酸的改良氨基脱羧酶检测平板和不含前体氨基酸的检测平板上，37 ℃下培养24 h后观察颜色变化，颜色变紫为阳性，颜色不变化为阴性[16]。以大肠杆菌为阳性对照。
1.2.2.3 溶血活性测定
将活化后的植物乳杆CHEN1划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上，于37 ℃下倒置培养48 h后，观察菌落周围是否出现溶血透明圈。
1.2.2.4 药敏性评价
参照美国临床和实验室标准协会（Clinical laboratory standard institute，CLSI）[18]方法采取纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B法）测定青霉素、阿莫西林、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、万古霉素、四环素、氯霉素和诺氟沙星9种抗生素对菌株的抑菌圈直径，判断菌株的耐药性。
1.2.3 植物乳植杆菌CHEN1的益生性分析
1.2.3.1 益生特性相关基因分析
在KEGG数据库对菌的酸耐受性、胆盐耐受性和胃肠液耐受性等益生菌特性相关基因进行标注。
1.2.3.2 耐受性实验
酸耐受性：将活化后的植物乳植杆菌CHEN1按1%的接种量分别接种到pH为2.0和3.0的MRS培养基中，于37 ℃下静置培养。分别于1 h和2 h取样，采用平板菌落计数法测定菌液中的活菌数。以MRS培养基（pH6.8）为对照组，按照公式（1）计算存活率[19]。
存活率(%)=lgN1lgN0×100 (1) 式中：N1为处理组的活菌数，N0为对照组的活菌数。
胆盐耐受性：将活化后的植物乳植杆菌CHEN1按1%的接种量分别接种到含0.1%、0.2%、0.3%（质量分数）牛胆盐的MRS培养基中，37 ℃下静置培养3 h后，采用平板菌落计数法测定菌液中的活菌数。以不含胆盐的MRS培养基为对照组，按公式（1）计算存活率[19]。
体外消化性能：向5 mL人工唾液中加入5 mL活化后的菌液，于37 ℃、120 r/min下孵育15 min，模拟口腔消化阶段。然后，加入5 mL人工胃液，在相同条件下孵育4 h模拟胃液消化阶段。最后，加入5 mL人工肠液，在相同条件下孵育6 h，模拟肠道消化阶段。分别在特定时间段取上述消化液1 mL，采用平板菌落计数法测定活菌数。以0.85%的生理盐水及菌液混合液作对照[19]，以公式（1）计算存活率。
1.2.3.3 疏水率和自聚集率
将活化好的菌液于10000 r/min下离心5 min去上清，用0.85%的生理盐水洗涤2~3次后，加适量生理盐水调节菌悬液OD600=0.5±0.05（A0）。
疏水率测定：取3 mL上述配制好的菌悬液和3 mL二甲苯于10 mL离心管中混合，涡旋振荡30 s混匀，于37 ℃下静置30 min，小心吸取上清液，测量其在600 nm处的吸光度（A1）[20]，按公式（2）计算疏水率。
疏水率(%)=A0−A1A0×100 (2) 自凝聚率测定：取4 mL上述配制好的菌悬液于10 mL离心管中，于37 ℃下静置5 h，每隔1 h测定上清液在600 nm处的吸光度（Ai）。按照公式（3）计算自聚集率[20]。
自聚集率(%)=A0−AiA0×100 (3) 式中：Ai为不同静置时间菌悬液的OD600值。
1.2.4 植物乳植杆菌CHEN1中碳水化合物活性酶分析
通过CAZymes数据库对CAZymes进行了识别、分类和注释，并结合KEGG数据库分析菌株对豆乳中水苏糖和棉子糖的代谢途径。
1.2.5 植物乳植杆菌CHEN1对豆乳低聚糖的代谢分析
1.2.5.1 豆乳培养基的制备
筛选洗净100 g黄豆加常温水浸泡8 h后，以豆水比为1:7（g/mL）进行磨浆，分装于250 mL锥形瓶中，121 ℃下灭菌20 min，冷却至室温后备用。
1.2.5.2 发酵豆乳的制备
将活化的植物乳植杆菌CHEN1按3%的接种量接种到无菌豆乳培养基中，于37 ℃下静置培养48 h后，收集发酵豆乳，备用。
1.2.5.3 豆乳pH的测定
使用pH计分别测定发酵前和发酵后豆乳的pH。
1.2.5.4 低聚糖的检测
参考陈志娜等[21]的方法采用高效液相色谱法（HPLC）测定豆乳中低聚糖的含量。称取混合均匀的适量试样，加水定容至4 mL，超声30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱分析。色谱柱：Aglient氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为70%乙腈-30%水（蔗糖、果糖、葡萄糖），68%乙腈-32%水（棉子糖、水苏糖）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；探测器：示差折光检测器。
1.3 数据处理
数据结果以三次重复的平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0软件对结果进行统计分析，采用Duncan的multiple range test进行显著性分析，并选取P<0.05为显著性水平，使用OriginPro 8.0软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 植物乳植杆菌CHEN1的安全性评价
2.1.1 毒力因子分析和有害代谢物检测
细菌的毒力因子可以分为四大类：与宿主细胞粘附和侵袭有关、细菌分泌系统和效应物、毒素和铁离子系统[16]。VFDB数据库收录了目前已报道的大量细菌毒力因子序列，植物乳植杆菌CHEN1在VFDB数据库中的注释结果如表1所示，共注释到了5个毒力因子，其中，基因VFG016490与细胞黏附相关，在大多数乳杆菌中存在，可促使植物乳植杆菌CHEN1黏附或与其他细胞相互黏附，不会带来额外的安全性问题。未发现硝基还原酶、胰蛋白酶、氨基脱羧酶和溶菌酶相关基因，并且在VFDB和KEGG数据库中也未注释到生成腐胺、酪胺、组胺和尸胺的完整基因簇。
表 1 植物乳植杆菌CHEN1在VFDB数据库中的注释结果Table 1. Annotation results of L. plantarum CHEN1inVFDB database基因编号 相似性比例（%） 相似长度 E值 数据库基因编号 功能子分类 功能分类 LP1000589 75.7 296 6.50×10−125 VFG005871 Hyaluronic_acid_HA_capsule Immune Evasion LP1000628 72.0 432 3.90×10−179 VFG005582 Streptococcal_enolase Enzyme LP1001214 76.8 228 3.30×10−97 VFG006826 LisR/LisK Regulation LP1001701 71.8 394 2.90×10−165 VFG016490 EF-Tu Adherence Invasion LP1003135 75.2 149 5.30×10−64 VFG005977 Capsular_polysaccharide Antiphagocytosis 植物乳植杆菌CHEN1的有害代谢产物检测结果见表2。色氨酸是一种必需氨基酸，有些细菌在增殖过程中会产生色氨酸酶，色氨酸酶会分解色氨酸，产生吲哚，导致色氨酸代谢异常。吲哚实验结果显示植物乳植杆菌CHEN1培养物上层未呈现玫瑰红色，吲哚实验为阴性，说明菌株不含色氨酸酶，不会分解色氨酸。硝酸盐可被硝酸盐还原酶还原为亚硝酸盐，食物中的胺可与亚硝酸盐发生反应，形成致癌物亚硝胺[22]。植物乳植杆菌CHEN1的硝酸盐还原酶实验呈阴性，说明不产生硝酸盐还原酶。氨基脱羧酶对氨基酸的脱羧作用可产生生物胺，而生物胺的过度积累可引起呼吸窘迫、头痛和恶心等中毒症状。氨基脱羧酶实验结果显示植物乳植杆菌CHEN1在鸟氨酸、酪氨酸的改良氨基脱羧酶检测平板中培养后均为黄色，为阴性，无氨基脱羧酶活性，不产生生物胺。
表 2 植物乳植杆菌CHEN1的有害代谢产物检测结果Table 2. Results of harmful metabolites of L. plantarum CHEN1项目 实验现象 实验结果 吲哚实验 实验组培养基上层溶液颜色为淡黄色，大肠杆菌对照组培养基上层溶液颜色变为玫瑰红色。 阴性，无色氨酸产生 硝酸盐还原酶实验 实验组培养基溶液变浑浊且颜色为土黄色，大肠杆菌对照组培养基溶液变浑浊且颜色为红色。 阴性，不产生硝酸盐还原酶 氨基酸脱羧酶实验 实验组培养基平板生长过程中无颜色变化；大肠杆菌对照组生长过程中平板颜色由黄色变为紫色。 阴性，无生物胺产生 2.1.2 溶血活性测定
有些细菌在生长和代谢过程中产生溶血毒素，使血红蛋白破裂，严重时导致败血症[23]。根据诱导绵羊血细胞溶血的能力，细菌的溶血性可分为完全溶血（β-溶血，透明或无色溶血环）、部分溶血（α-溶血，呈现草绿色的半透明溶血环）和非溶血（γ-溶血），植物乳植杆菌CHEN1在血平板上未形成溶血环（图1），说明该菌株缺乏溶血能力，属于γ-溶血，因此该菌株是安全的。
2.1.3 药敏性评价
细菌耐药的机制包括活性排斥、细胞膜通透性降低、生物膜的形成、药物作用靶点的改变以及失活酶的产生。将植物乳植杆菌CHEN1全基因组序列与耐药基因数据库CARD进行比对，共发现74个抗生素耐药基因，CARD药物分类统计如图2所示，对肽类、糖肽、喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素耐药。耐药基因中有7个基因的注释相似度大于60%（表3），其他基因均低于60%，多数低于50%。由于相似性较低，这些被注释的基因有可能不被表达。
表 3 植物乳植杆菌CHEN1基因组中预测的耐药基因Table 3. Putative antibiotic resistance genes identified in the genome of L. plantarum CHEN1基因编号 比对的相似性（%） 比对的覆盖率（%） 基因 药物分类 作用机制 LP1001701 75.83 99.49 EF-Tu 阿尔法霉素 抗生素靶点改变 LP1000845 73.74 99.28 fusA 夫西地酸 抗生素靶点改变 LP1000840 70.71 96.42 rpoB 肽、利福霉素 抗生素靶点改变、
抗生素靶点替代LP1000841 69.13 98.02 rpoC 肽 抗生素靶点改变 LP1001468 66.52 98.8 parE 喹诺酮 抗生素靶点改变 LP1000005 65.13 96.91 gyrB 安基香豆素 抗生素靶点改变 LP1000843 63.97 99.27 rpsL 氨基糖苷 抗生素靶点改变 为进一步验证植物乳植杆菌CHEN1的耐药性，采用K-B法测定植物乳植杆菌CHEN1对几种常见抗生素的敏感性，结果见表4。结果显示，植物乳植杆菌CHEN1对β-内酰胺类、氯霉素类敏感，对四环素类中介敏感，对氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素）、糖肽类（万古霉素）和喹诺酮类（诺氟沙星）不敏感，这一结果与全基因组序列预测结果（表3）一致。研究表明，植物乳植杆菌通常会对万古霉素[24]和链霉素[25−27]表现出内在抗性，但是它们的耐药基因是染色体编码的，可转移性较低，因此，这种固有耐药性通常被认为是相对安全的[28]。氨基糖苷类抗生素参与抑制蛋白质合成，其性质稳定、抗菌谱广，多用于革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌一般效果较差[29]，植物乳植杆菌CHEN1对庆大霉素耐药与植物乳植杆菌Q180的研究结果一致[28]。喹诺酮类抗菌药物可以通过抑制DNA解旋酶的作用来阻碍DNA的合成，从而导致细胞死亡[30]。植物乳植杆菌CHEN1对诺氟沙星耐药，与MASCO等[31]对双歧杆菌的研究结果一致。
表 4 植物乳植杆菌CHEN1的抗生素敏感性Table 4. Antibiotics susceptibility of L. plantarum CHEN1药物种类 药物名称 规格（μg/片） 抑菌圈直径（mm） 菌株CHEN1抑菌圈直径（mm） 药敏性 S I R β-内酰胺类 青霉素 10 ≥16 13~15 ≤12 28.46±1.94a S 阿莫西林 25 ≥18 14~17 ≤13 26.94±4.98a S 氨苄西林 10 ≥16 13~15 ≤12 21.64±0.37b S 氨基糖苷类 链霉素 10 ≥15 12~14 ≤11 8.06±0.54d R 庆大霉素 10 ≥15 13~14 ≤12 7.29±1.34d R 糖肽类 万古霉素 30 ≥12 11~10 ≤9 7.05±0.95d R 四环素类 四环素 30 ≥19 15~18 ≤14 15.46±2.46c I 氯霉素类 氯霉素 30 ≥18 13~17 ≤12 28.19±2.09a S 喹诺酮类 诺氟沙星 10 ≥19 14~18 ≤13 8.56±1.59d R 注：R（Resistant）—耐药，I（Insensitive）—中介，S（Sensitivity）—敏感；同一列不同小写字母表示显著性差异（P<0.05）。 2.2 植物乳植杆菌CHEN1的益生性评价
2.2.1 耐受性
益生菌发挥功效的关键在于其能够在胃肠道中维持高的存活率，这意味着它们必须具备抵抗胃酸和胆盐等不利环境因素的能力[32]。全基因组测序结果显示植物乳植杆菌CHEN1具有编码多种应激反应蛋白的基因，这些蛋白参与了对胃酸、胆盐的抗性。植物乳植杆菌CHEN1基因组中含有8个F0F1-ATP酶编码基因（表5），这些pH耐受基因编码的F型H+/Na+-转运ATP酶亚基在维持细胞内pH平衡中起着关键作用。这些亚基通过质子泵机制，帮助细胞在酸性条件下排出多余的质子，从而保持细胞内环境的稳定。研究报道植物乳植杆菌Y44和Y42也具有相似的耐酸机制[33−34]。此外，在植物乳植杆菌CHEN1基因组中含有10个耐胆盐基因，胆盐耐受基因glf和argS编码的UDP-半乳吡喃糖变位酶和精氨酸-tRNA合成酶分别参与细胞壁的合成和蛋白质的合成，这些过程对于细菌在高浓度胆盐环境中的存活至关重要；胆盐耐受基因ppaC编码的无机焦磷酸酶在保持细胞膜完整性和对胆盐耐受性方面起着重要作用[35]。这些基因的存在表明植物乳植杆菌CHEN1具有对酸和胆盐的耐受优势，可以在胃肠道环境中生存和增殖。为了确认这些基因的功能，我们进一步做了植物乳植杆菌CHEN1的酸、胆盐和模拟胃肠道的耐受性实验。
表 5 植物乳植杆菌CHEN1胃肠道耐受相关基因Table 5. Gastrointestinal tolerance related genes of L. plantarum CHEN1基因位点 基因名称 基因功能 pH耐受基因 LP1001923 ATPF1E，atpC F-type H+-transporting ATPase subunit epsilon LP1001927 ATPF1D，atpH F-type H+-transporting ATPase subunit delta LP1001924 ATPF1B，atpD F-type H+/Na+-transporting ATPase subunit beta [EC:7.1.2.2 7.2.2.1] LP1001925 ATPF1G，atpG F-type H+-transporting ATPase subunit gamma LP1001926 ATPF1A，atpA F-type H+/Na+-transporting ATPase subunit alpha [EC:7.1.2.2 7.2.2.1] LP1001928 ATPF0B，atpF F-type H+-transporting ATPase subunit b LP1001929 ATPF0C，atpE F-type H+-transporting ATPase subunit c LP1001930 ATPF0A，atpB F-type H+-transporting ATPase subunit a 胆盐耐受基因 LP1000968 glf UDP-galactopyranose mutase [EC:5.4.99.9] LP1001107 RARS，argS arginyl-tRNA synthetase [EC:6.1.1.19] LP1001245 glnA，GLUL glutamine synthetase [EC:6.3.1.2] LP1000413 pyrG，CTPS pyrG，CTPS LP1000849 RP-L4，MRPL4，rplD large subunit ribosomal protein L4 LP1000860 RP-L5，MRPL5，rplE large subunit ribosomal protein L5 LP1000862 RP-L6，MRPL6，rplF large subunit ribosomal protein L6 LP1000854 RP-S3，rpsC small subunit ribosomal protein S3 LP1000864 RP-S5，MRPS5，rpsE small subunit ribosomal protein S5 LP1001471 ppaC manganese-dependent inorganic pyrophosphatase [EC:3.6.1.1] 益生菌必须在通过上消化道的过程中存活，上消化道的pH一般在2.5~3.5之间，并且在转移到肠道之前在胃中存活2~4 h或更长时间。植物乳植杆菌CHEN1在pH2.0和3.0条件下的存活率结果如图3所示。结果表明，植物乳植杆菌CHEN1在pH3.0下具有很高的存活率，在pH3.0的条件下孵育2 h后存活率仍能达到98.77%；在pH2.0的条件下存活率显著下降，在pH2.0条件下孵育1 h的存活率为26.05%，孵育2 h存活率下降到22.47%。WANG等[36]研究报道大部分乳杆菌在pH3.0下具有比较高的存活率，但是在pH2.0的条件下存活率较低。
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一般情况下采用0.15%~0.3%胆盐来筛选益生菌[35]，图4显示植物乳植杆菌CHEN1在0.1%~0.3%胆盐浓度下的存活率具有显著性差异，随着胆盐浓度的增加，存活率显著下降。在0.1%胆盐下的存活率为86.84%，胆盐浓度提高到0.3%时存活率为33.80%，低于植物乳植杆菌LPJZ-658的胆盐耐受性，其在0.3%胆盐中的存活率可达到90.52%。
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图 4 植物乳植杆菌CHEN1在不同胆盐浓度下的存活率Figure 4. Survival rate of L. plantarum CHEN1at different bile salt concentrations植物乳植杆菌CHEN1在消化道转运中的存活率如图5所示。结果表明，植物乳植杆菌CHEN1在模拟唾液中的存活率为99.59%，在模拟胃液中孵育4 h后的存活率为80.52%，再经模拟肠液孵育4 h后存活率仍能达到73.32%。RUIZ-RAMÍREZ等[37]对植物乳植杆菌RVG2、RVG4和UTMB1体外模拟胃肠道消化的研究结果显示，三种植物乳植杆菌经胃液消化后存活率在36.6%~48.4%，经肠液消化后存活率在91.1%~99.4%，但是在经胃液和肠液消化后存活率仅为29.1%~44.2%，由此说明植物乳植杆菌CHEN1具有较好的胃肠道消化耐受性。
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图 5 植物乳植杆菌 CHEN1在模拟口腔、胃肠道转消化中的耐受性Figure 5. Tolerance of L. plantarum CHEN1 in simulated oral and gastrointestinal transdigestion2.2.2 疏水率和自聚集率
疏水率和自聚集率等细胞表面特性是益生菌对人体肠道上皮细胞黏附能力的重要评价指标[22]。植物乳植杆菌CHEN1经二甲苯处理30 min后，其表面疏水率达到41.83%±0.07%，SHEKH等[38]测定的10株植物乳植杆菌的疏水率在10%～37%，说明植物乳植杆菌CHEN1具有较高的表面疏水率。植物乳植杆菌CHEN1在5 h时自聚集率为13.47%±0.42%（图6），而已报道的商业长双歧杆菌BB536的疏水性和自聚集率分别为16.8%±0.8%和6.8%±0.7%[39]，均低于植物乳植杆菌CHEN1。TODOROV等[40]研究指出，疏水性较高的菌株通常表现出较高的自聚集率。本研究中植物乳植杆菌CHEN1虽具有较高的疏水率，但其自聚集率却相对较低，该结果与WANG等[41]的研究一致。其原因在于，自聚集是一个多因素协同作用的复杂过程，不仅受到疏水性的影响，还与菌体表面分子的种类和数量、电荷分布及外部环境等密切相关。
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图 6 植物乳植杆菌CHEN1在1~5h内自聚集率Figure 6. Self-aggregation rate of L. plantarum CHEN1 in 1 to 5 h2.3 CAZymes分析
CAZymes参与复杂碳水化合物和糖复合物的组装和分解，按照功能可以分为糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、糖苷转移酶（glycosyl transferases，GTs）、多糖裂解酶（polysaccharidelyases，PLs）、碳水化合物脂酶（carbohydrate esterases，CEs）、碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding modules，CBMs）和具有辅助活性的酶（auxiliary activities，AAs）六大类。植物乳植杆菌CHEN1的CAZymes功能预测如图7所示。由图7可知，植物乳植杆菌CHEN1中含有121个CAZymes，其中尤以GH最多，数量为50个，所占比例为41.32%；其次是GT，为35个，所占比例为28.93%；CE、CBM和AA的数量分别为16、11、9，所占比例分别为13.22%、9.09%、13.22%；该菌中PL的数量为0。
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图 7 植物乳植杆菌CHEN1的CAZymes功能预测Figure 7. Prediction of CAZymes function of L. plantarum CHEN1在GH中，植物乳植杆菌CHEN1含有α-半乳糖苷酶EC3.2.1.22、转化酶EC3.2.1.26、α-葡萄糖酶EC3.2.1.20和低聚葡萄糖苷酶EC3.2.1.10等与棉子糖和水苏糖代谢相关的全部酶类，在发酵过程中可以将棉子糖和水苏糖彻底水解为半乳糖、葡萄糖和果糖。特别需要关注的是水苏糖和棉子糖代谢的过程中会积累大量的半乳糖，而有一部分人群不能代谢半乳糖，会导致类似于乳糖不耐症的症状。有研究报道部分植物乳植杆菌可以代谢半乳糖[42]，以降低发酵乳中的半乳糖含量来缓解人体中由于半乳糖积累而引起的不良反应。大多数细菌的半乳糖代谢是通过Leloir途径完成的，通过Leloir途径，半乳糖最终可转化为UDP-葡萄糖，随后进入糖酵解途径[43]。经过与KEGG数据库比对，发现植物乳植杆菌CHEN1具有Leroir途径的关键酶基因，可将棉子糖和水苏糖代谢产生的半乳糖最终降解为UDP-葡萄糖，再进入糖酵解途径提供能量（图8）。
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图 8 植物乳植杆菌CHEN1的棉子糖和水苏糖代谢途径Figure 8. Raffinose and stachyose metabolic pathways of L. plantarum CHEN12.4 植物乳植杆菌CHEN1对豆乳低聚糖的代谢分析
由图9可知，植物乳植杆菌CHEN1发酵48 h后豆乳的pH由6.5显著下降到4.6 （P<0.05），形成了质地均匀的凝乳。发酵前后豆乳中低聚糖含量的变化如图10所示，结果表明，未发酵豆乳中蔗糖含量最高，为1275.59 mg/L，其次为水苏糖和棉子糖，二者的总量可达1314.51 mg/L，占到总糖的49.44%，葡萄糖和果糖的含量很低，二者的总量只占总糖的2.58%。经植物乳植杆菌CHEN1发酵后，豆乳中蔗糖的含量下降到619.94 mg/L，葡萄糖的含量降为0，果糖的含量由原来的35.91 mg/L下降到9.34 mg/L。豆乳中棉子糖和水苏糖的含量也均显著下降，水苏糖由原来的1043.83 mg/L下降到536.01 mg/L（P<0.01），棉子糖由原来的270.69下降到134.69 mg/L（P<0.01），二者的总量下降到670.70 mg/L，下降了48.98%，表明植物乳植杆菌CHEN1对水苏糖和棉子糖具有很强的代谢能力，可用于豆乳发酵降低抗营养因子。
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图 9 植物乳植杆菌CHEN1发酵前后豆乳的pH变化注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01），图10同。Figure 9. Change of pH of soybean milk before and after fermentation by L. plantarum CHEN1![]()
图 10 植物乳植杆菌CHEN1发酵前后豆乳中低聚糖含量的变化Figure 10. Changes of oligosaccharide content in soybean milk before and after fermentation by L. plantarum CHEN13. 结论
植物乳植杆菌CHEN1不产生有害代谢物，无溶血活性，除对氨基糖苷类、糖肽类和喹诺酮类药物耐药外，对大多数抗生素敏感，具有潜在安全性。该菌含有多种pH和胆盐耐受基因，在酸性、高胆盐和胃肠道环境下均表现出良好的存活能力，具有较高的疏水率和相对较低的自聚集率，总体具有较好的益生性。此外，该菌可代谢水苏糖和棉子糖，并能通过Leloir途径将代谢产物半乳糖最终降解为UDP-葡萄糖，表现出良好的功能代谢能力。上述研究结果为植物乳植杆菌CHEN1安全性和益生性的深入研究提供了关键性的理论依据和研究基础。经过基因水平的预测和体外实验的验证，植物乳植杆菌CHEN1显示出作为安全有效的益生菌菌株的巨大潜力，并具有低聚糖代谢的额外优势。进一步地，将通过动物模型继续深入探讨CHEN1菌株在体内的存活、定植和对肠道菌群的影响，更加全面地阐明其益生机制。另一方面，可进一步探索其在食品、医药或保健领域的潜在应用，包括：a.作为益生菌或发酵剂，改善食品营养和功能特性；b.开发调节肠道菌群失调、改善消化道健康的药物或辅助治疗手段；c.制成益生菌补充剂、功能性食品等，从而为微生物多样性利用、改善人体或动物的肠道健康、促进健康食品开发等提供了更多可能性和发展空间。
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图 4 植物乳植杆菌CHEN1在不同胆盐浓度下的存活率
Figure 4. Survival rate of L. plantarum CHEN1at different bile salt concentrations
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图 5 植物乳植杆菌 CHEN1在模拟口腔、胃肠道转消化中的耐受性
Figure 5. Tolerance of L. plantarum CHEN1 in simulated oral and gastrointestinal transdigestion
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图 6 植物乳植杆菌CHEN1在1~5h内自聚集率
Figure 6. Self-aggregation rate of L. plantarum CHEN1 in 1 to 5 h
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图 7 植物乳植杆菌CHEN1的CAZymes功能预测
Figure 7. Prediction of CAZymes function of L. plantarum CHEN1
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图 8 植物乳植杆菌CHEN1的棉子糖和水苏糖代谢途径
Figure 8. Raffinose and stachyose metabolic pathways of L. plantarum CHEN1
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图 9 植物乳植杆菌CHEN1发酵前后豆乳的pH变化
注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01），图10同。
Figure 9. Change of pH of soybean milk before and after fermentation by L. plantarum CHEN1
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图 10 植物乳植杆菌CHEN1发酵前后豆乳中低聚糖含量的变化
Figure 10. Changes of oligosaccharide content in soybean milk before and after fermentation by L. plantarum CHEN1
表 1 植物乳植杆菌CHEN1在VFDB数据库中的注释结果
Table 1 Annotation results of L. plantarum CHEN1inVFDB database
基因编号 相似性比例（%） 相似长度 E值 数据库基因编号 功能子分类 功能分类 LP1000589 75.7 296 6.50×10−125 VFG005871 Hyaluronic_acid_HA_capsule Immune Evasion LP1000628 72.0 432 3.90×10−179 VFG005582 Streptococcal_enolase Enzyme LP1001214 76.8 228 3.30×10−97 VFG006826 LisR/LisK Regulation LP1001701 71.8 394 2.90×10−165 VFG016490 EF-Tu Adherence Invasion LP1003135 75.2 149 5.30×10−64 VFG005977 Capsular_polysaccharide Antiphagocytosis 
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表 2 植物乳植杆菌CHEN1的有害代谢产物检测结果
Table 2 Results of harmful metabolites of L. plantarum CHEN1
项目 实验现象 实验结果 吲哚实验 实验组培养基上层溶液颜色为淡黄色，大肠杆菌对照组培养基上层溶液颜色变为玫瑰红色。 阴性，无色氨酸产生 硝酸盐还原酶实验 实验组培养基溶液变浑浊且颜色为土黄色，大肠杆菌对照组培养基溶液变浑浊且颜色为红色。 阴性，不产生硝酸盐还原酶 氨基酸脱羧酶实验 实验组培养基平板生长过程中无颜色变化；大肠杆菌对照组生长过程中平板颜色由黄色变为紫色。 阴性，无生物胺产生
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表 3 植物乳植杆菌CHEN1基因组中预测的耐药基因
Table 3 Putative antibiotic resistance genes identified in the genome of L. plantarum CHEN1
基因编号 比对的相似性（%） 比对的覆盖率（%） 基因 药物分类 作用机制 LP1001701 75.83 99.49 EF-Tu 阿尔法霉素 抗生素靶点改变 LP1000845 73.74 99.28 fusA 夫西地酸 抗生素靶点改变 LP1000840 70.71 96.42 rpoB 肽、利福霉素 抗生素靶点改变、
抗生素靶点替代LP1000841 69.13 98.02 rpoC 肽 抗生素靶点改变 LP1001468 66.52 98.8 parE 喹诺酮 抗生素靶点改变 LP1000005 65.13 96.91 gyrB 安基香豆素 抗生素靶点改变 LP1000843 63.97 99.27 rpsL 氨基糖苷 抗生素靶点改变
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表 4 植物乳植杆菌CHEN1的抗生素敏感性
Table 4 Antibiotics susceptibility of L. plantarum CHEN1
药物种类 药物名称 规格（μg/片） 抑菌圈直径（mm） 菌株CHEN1抑菌圈直径（mm） 药敏性 S I R β-内酰胺类 青霉素 10 ≥16 13~15 ≤12 28.46±1.94a S 阿莫西林 25 ≥18 14~17 ≤13 26.94±4.98a S 氨苄西林 10 ≥16 13~15 ≤12 21.64±0.37b S 氨基糖苷类 链霉素 10 ≥15 12~14 ≤11 8.06±0.54d R 庆大霉素 10 ≥15 13~14 ≤12 7.29±1.34d R 糖肽类 万古霉素 30 ≥12 11~10 ≤9 7.05±0.95d R 四环素类 四环素 30 ≥19 15~18 ≤14 15.46±2.46c I 氯霉素类 氯霉素 30 ≥18 13~17 ≤12 28.19±2.09a S 喹诺酮类 诺氟沙星 10 ≥19 14~18 ≤13 8.56±1.59d R 注：R（Resistant）—耐药，I（Insensitive）—中介，S（Sensitivity）—敏感；同一列不同小写字母表示显著性差异（P<0.05）。
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表 5 植物乳植杆菌CHEN1胃肠道耐受相关基因
Table 5 Gastrointestinal tolerance related genes of L. plantarum CHEN1
基因位点 基因名称 基因功能 pH耐受基因 LP1001923 ATPF1E，atpC F-type H+-transporting ATPase subunit epsilon LP1001927 ATPF1D，atpH F-type H+-transporting ATPase subunit delta LP1001924 ATPF1B，atpD F-type H+/Na+-transporting ATPase subunit beta [EC:7.1.2.2 7.2.2.1] LP1001925 ATPF1G，atpG F-type H+-transporting ATPase subunit gamma LP1001926 ATPF1A，atpA F-type H+/Na+-transporting ATPase subunit alpha [EC:7.1.2.2 7.2.2.1] LP1001928 ATPF0B，atpF F-type H+-transporting ATPase subunit b LP1001929 ATPF0C，atpE F-type H+-transporting ATPase subunit c LP1001930 ATPF0A，atpB F-type H+-transporting ATPase subunit a 胆盐耐受基因 LP1000968 glf UDP-galactopyranose mutase [EC:5.4.99.9] LP1001107 RARS，argS arginyl-tRNA synthetase [EC:6.1.1.19] LP1001245 glnA，GLUL glutamine synthetase [EC:6.3.1.2] LP1000413 pyrG，CTPS pyrG，CTPS LP1000849 RP-L4，MRPL4，rplD large subunit ribosomal protein L4 LP1000860 RP-L5，MRPL5，rplE large subunit ribosomal protein L5 LP1000862 RP-L6，MRPL6，rplF large subunit ribosomal protein L6 LP1000854 RP-S3，rpsC small subunit ribosomal protein S3 LP1000864 RP-S5，MRPS5，rpsE small subunit ribosomal protein S5 LP1001471 ppaC manganese-dependent inorganic pyrophosphatase [EC:3.6.1.1]
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