Study on the Improvement of Exercise Ability and Liver Protection in Oxidative Stress-Induced Mice by Lactiplantibacillus plantarum CQPC03
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摘要: 本研究关注一种新近发现的乳酸菌（Lactiplantibacillus plantarum CQPC03，LP-CQPC03）对于氧化应激小鼠运动能力的增强作用及其机制。利用D-半乳糖诱导小鼠氧化应激模型，通过小鼠跑步时间、游泳耐力、血液生化指标、组织病理变化、腓肠肌和肝组织相关基因mRNA表达以及小鼠肠道内容物微生物组成变化，以探讨LP-CQPC03改善氧化应激损伤小鼠运动能力及肝脏保护作用。结果表明在给予LP-CQPC03（剂量为1.5×109 CFU/b.w. kg灌胃）后，氧化应激小鼠的跑步时间和游泳耐力显著（P<0.05）延长，血清乳酸、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）浓度显著（P<0.05）降低，肌糖原（muscle glycogen，MG）和肝糖原（hepatic glycogen，HG）水平显著（P<0.05）提高。组织病理学的结果显示，LP-CQPC03能够减轻小鼠肝脏的氧化应激伤害。进一步的分析表明，相比模型组，LP-CQPC03能够显著（P<0.05）上调氧化应激小鼠肝脏和腓肠肌内可激活腺苷酸激活蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1-α，PGC-1α）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）和谷胱甘肽过氧化酶1（glutathione peroxidase 1，GPx1）mRNA的表达。此外，LP-CQPC03还提高了氧化应激小鼠肠道内厚壁菌门、乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度，同时减少了拟杆菌门的表达。综上所述，LP-CQPC03不仅能改善小鼠的氧化应激状态，还能显著增强其运动能力，且效果优于维生素C（150 mg/kg BW灌胃）。Abstract: This study investigates the effects of a newly discovered lactic acid bacterium, Lactiplantibacillus plantarum CQPC03 (LP-CQPC03), on enhancing the exercise capacity of mice under oxidative stress and elucidates the underlying mechanisms. The oxidative stress model of mice was induced by D-galactose. Through running time, swimming endurance, blood biochemical indexes, histopathological changes, mRNA expression of gastritis muscle and liver tissue, and microbial composition of intestinal contents of mice, LP-CQPC03 was used to explore the improvement of exercise ability and liver protection of mice damaged by oxidative stress. The results showed that after administration of LP-CQPC03 (dose 1.5×109 CFU/ b.w.kg), the running time and swimming endurance of mice with oxidative stress were significantly extended (P<0.05), and serum lactic acid, blood urea nitrogen(BUN) and creatine kinase (CK) concentrations decrease significantly (P<0.05), while muscle glycogen (MG) and hepatic glycogen (HG) levels increase significantly (P<0.05). Histopathological analysis indicated that LP-CQPC03 mitigated oxidative stress damage in the liver tissues of the mice. urther analysis showed that compared with model group, LP-CQPC03 could significantly (P<0.05) up-regulate adenylate activated protein kinase in liver and gastrocnemius muscle of oxidative stress mice(AMPK), peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1-α, peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1-α, mRNA expression of PGC-1α, superoxide dismutase 2 (SOD2) and glutathione peroxidase 1 (GPx1). In addition, LP-CQPC03 also increased the abundance of Firmicutes, Lactobacillus and Bifidobacteria in the intestinal tract of mice under oxidative stress, while decreasing the expression of bacteroidetes. In summary, LP-CQPC03 can not only improve the oxidative stress state of mice, but also significantly enhance their exercise ability, and the effect is better than that of vitamin C (150 mg/kg BW).
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Keywords:
- Lactiplantibacillus plantarum /
- oxidative stress /
- fatigue /
- exercise /
- liver injury /
- intestinal flora
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运动性疲劳的成因主要可以归纳为四种理论：能量耗竭理论、代谢产物积累理论、中枢保护抑制理论以及自由基理论[1−2]。近年来，关于自由基造成的氧化应激损伤与运动性疲劳的关联研究受到了越来越多的关注，氧化应激在疲劳的发生机制中扮演着重要角色[3]。氧化应激与细胞能量代谢的变化能够激活腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK），从而起到调控能量代谢的作用[4]。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）通过促进与线粒体基因转录相关因子的活化来增强能量代谢酶的功能和提高骨骼肌抵抗疲劳[5]。当AMPK/PGC-1α信号通路被激活并强化后，肌肉组织中线粒体内的氧化磷酸化进程被加速，代谢副产物减少，肌肉细胞中能量生成效率提升[6]。
近年来，关于益生菌在体育运动中的应用及其作为营养补充剂的研究正在不断推进。据现有研究指出，几种特定类型的益生菌，如植物乳植杆菌PS128对铁人三项运动员赛后耐力下降和疲劳状态有改善效果[7]；干酪乳酪杆菌Shirota能够降低长跑运动员的上呼吸道感染发病率[8]；嗜酸乳杆菌SPP能够提高游泳运动员的最大摄氧量[9]；双歧杆菌SP 07/3能够增强能力补给提升运动员耐力[10]；同时多种唾液链球菌嗜热亚种被添加进运动饮品和酸奶，作为运动员的饮品使用[11]。动物实验结果从机制上阐明了益生菌提高小鼠跑步耐力的原理，进一步佐证了临床研究得到表象，这为探索如何利用益生菌来改善人类体能极限提供了新的方向[12]。已有研究显示四川泡菜中的乳酸菌具有较好的肠道定殖效果，能够起到调节肠道功能，促进机体健康的作用[13]。团队从采集到的自然发酵泡菜中分离鉴定出一株植物乳植杆菌CQPC03（Lactiplantibacillus plantarum CQPC03，LP-CQPC03），前期的研究显示LP-CQPC03也具有良好的体外抗胃酸和胆盐效果，初步具备益生菌潜质，同时进一步的研究显示LP-CQPC03具有调节肠道和减脂效果[14]。有研究通过肠道微生物菌群结构特征的DNA指纹图发现肠道菌群的稳定是运动员保持良好运动状态的因素之一，可见肠道菌群与运动机能有密切联系[15]。
规律且科学的身体锻炼是预防和治疗多种慢性疾病及其并发症的有效手段，尤其是有氧运动，能通过增强心血管功能和能量代谢显著改善生理适应性[15]。然而，快节奏的生活和工作常使人们处于高强度状态和不健康的生活习惯中，导致氧化应激和疲劳感。这种持续的疲劳和高强度工作会阻碍正常运动，进而引发身体素质下降和持续的亚健康状态[16]。因此，寻找有效的干预措施来提升身体素质、增强运动表现并改善机体氧化应激状态是非常重要的。本研究进一步针对具有调节肠道菌群平衡的LP-CQPC03对氧化应激肝损伤及小鼠运动能力下降的干预效果进行了研究，结合LP-CQPC03对肠道菌群的调控作用，初步阐明LP-CQPC03的对肝脏保护和运动机能提升的作用机制，为该菌株实际应用积累理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验用昆明小鼠 均为SPF级，年龄为6周，雌雄各占一半，购自重庆医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK （渝） 2022-0010）。该项动物实验已获儿童营养与健康发展协同创新中心动物实验伦理委员会的批准（2023080017B）；植物乳植杆菌CQPC03 重庆第二师范学院儿童营养与健康发展协同创新中心从重庆南岸区自然发酵泡菜中分离鉴定，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心完成登记保藏（CGMCC No. 14492）；DeMan, Rogosa and Sharpe（MRS）培养基 北京陆桥技术股份有限公司；4%多聚甲醛通用型组织固定液 Biosharp公司；小鼠血尿素氮（BUN）试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；小鼠肌糖原（MG）、肝糖原（HG）、肌酸激酶（CK）、ELISA试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；小鼠血乳酸测定ELISA试剂盒 上海酶澳生物科技有限公司；TRlzol试剂 赛默飞世尔科技公司；RNase-Free water、SYBR Green PCR Master Mix 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；D-半乳糖 国药集团化学试剂有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。
Nano-300微量分光光度计、AMR-100全自动酶标分析仪 杭州奥盛仪器有限公司；BI-I50A低温生化培养箱 施都凯仪器设备（上海）有限公司；ZH-PT八通道实验动物跑台 安徽正华生物仪器设备有限公司；A200基因扩增仪 杭州朗基科学仪器有限公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 赛默飞世尔科技公司；OLYMPUS-BX43正置显微镜 奥林巴斯仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验菌悬液准备
将以脱脂乳粉为基质的LP-CQPC03冻干菌粉加入灭菌的MRS液体培养基中（1:20，w/w），然后置于37 ℃的低温生化培养箱中培养48 h，然后在4000 r/min转速下离心10 min，最后收集沉淀的菌体。然后按菌体质量5倍加入生理盐水，再使用血球计数板在显微镜下直接计数菌液中的菌体数，计算菌液浓度。最后将菌液浓度调整为3×108 CFU/mL备用，动物实验前根据小鼠体重稀释菌液进行灌胃。
1.2.2 动物实验
将100只小鼠在温度保持在（20±1） ℃，湿度为30%~40%的环境中适应性饲养7 h，随后将小鼠随机分为5组，分别是正常组、模型组、维生素C灌胃组（VC组），以及两个不同剂量水平下给予LP-CQPC03灌胃的小组（LP-CQPC03-L组和LP-CQPC03-H组），每组20只，每组小鼠分别被标记为1~20号，其中1~5号和11~15号为雌性，6~10号和16~20号为雄性。参考《中国居民膳食指南科学研究报告（2021）》中推荐的人类每日安全摄入量为1000 mg/d的维生素C标准，本研究设定实验动物每天每公斤体重所需补充的维生素C量为150 mg。此外，依据GB/T 21732-2008《含乳饮料》标准要求，即产品出厂时活菌型饮品需保证每毫升至少含有107个活性微生物，并结合市场上的益生菌饮品建议日服用量，推算出适合实验用小鼠的日均益生菌摄入量应调整为1.5×109 CFU/kg体重。实验期间，除正常组外的所有其他组别小鼠都将连续6周每天通过腹腔注射方式接受浓度为5%（w/v）的D-半乳糖溶液，用量为100 mg/kg BW；而正常组则以等体积生理盐水替代。结束D-半乳糖溶液诱导后自第7周开始，VC组按150 mg/kg BW每日灌胃维生素C溶液；模型组和正常组每日灌胃2 mL蒸馏水（安慰剂）；LP-CQPC03-L组和LP-CQPC03-H组每日分别灌胃0.75×109 CFU/kg和1.50×109 CFU/kg的LP-CQPC03菌悬液，各组灌胃样品持续4周[16]。灌胃样品结束后第2 d所有参与实验的小鼠都将接受体力测试，首先进行力竭跑步实验，间隔6 h后进行力竭游泳试验，最后利用颈椎脱位法实施安乐死，最终收集肝脏组织用于进一步分析。
1.2.3 力竭跑步运动实验
使用8通道小鼠跑步机进行力竭跑步测试，设置坡度为10°，并逐步提高跑步机的速度。具体步骤为：以10 m/min的速度持续5 min，然后分别以16、21、26、31、36、41和46 m/min的速度各进行10 min，直到小鼠表现出力竭为止。力竭的判定标准为电击次数达到10次，或小鼠无法继续持续跑步超过10 s。记录小鼠跑步力竭所用的时间[17]。
1.2.4 力竭游泳运动实验
在进行小鼠力竭游泳测试之前，首先进行了10 min的负重游泳适应性训练（水温保持在28±1 ℃，水深约40 cm）。在训练过程中，小鼠尾部负重约其体重5%的铅丝。训练结束后，立即用毛巾擦干小鼠的皮毛，并使用热风吹干至完全干燥。适应性训练结束的第二天进行正式的力竭游泳实验。实验条件与适应性训练相同，确保小鼠四肢持续运动。力竭的判定标准为小鼠的鼻孔完全浸入水中7 s且无法浮出水面，记录小鼠游泳至力竭所需的时间。
1.2.5 小鼠血清中CK、BUN和乳酸水平的测定
实施灌胃结束2 h后通过毛细血管采血法从1~20号小鼠眼眶抽取血液样本；第2 d力竭游泳试验结束5 min后通过毛细血管采血法从1~10号小鼠眼眶抽取血液样本；力竭游泳试验结束30 min后通过毛细血管采血法从11~20号小鼠眼眶抽取血液样本，将采集到的小鼠血液在4 ℃下进行离心处理（1500 r/min，持续10 min），分离出上层血清，依据检测试剂盒提供的说明，测定1~10号小鼠2次采血样的血清乳酸水平和测定11~20号小鼠血清中CK、BUN、乳酸水平。
1.2.6 小鼠腓肠肌组织MG和肝脏组织HG水平的测定
取适量小鼠组织按1:9加入生理盐水后匀浆，依据检测试剂盒提供的说明，测定11~20号小鼠腓肠肌组织MG和肝脏组织HG水平。
1.2.7 小鼠肝脏H&E染色及病理切片
解剖11~20号小鼠肝脏组织后，先以生理盐水进行3次冲洗，随后立即将其置于10%（v/v）福尔马林溶液中固定。经过48 h的4 ℃低温脱水处理之后，使用石蜡对这些样本进行包埋。之后，将包埋好的组织切割成5~10 µm厚的切片，并采用H&E染色法对其进行着色，最终在光学显微镜下检查其病理学特征变化。
1.2.8 小鼠组织mRNA的表达测定
为检测小鼠肝脏与腓肠肌中AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1 mRNA表达，首先精确称量0.2 g的11~20号小鼠组织样本，并利用生理盐水对其进行清洗。随后，将这些组织剪碎，向其中添加1.0 mL的TRlzol试剂。接着，通过测量所得RNA溶液在260 nm和280 nm波长下的吸光度值来确定其纯度，并据此调整RNA浓度至1 μg/μL。完成上述步骤后，进行了反转录过程以生成cDNA。在此基础上，构建用于荧光定量PCR分析的反应体系，该体系由1 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix、各1 μL自行设计特异性引物（见表1）及7 μL无菌蒸馏水组成。将配制好的反应液置于实时荧光定量PCR仪器内，按照预设条件执行扩增循环：初始95 ℃加热60 s；之后是40个周期的变性阶段（95 ℃, 15 s）、退火延伸阶段（55 ℃, 30 s）以及最终合成阶段（72 ℃, 35 s）。此外，设置熔解曲线分析步骤（95 ℃, 30 s；55 ℃, 35 s），以便验证产物特异性。在整个实验过程中，GAPDH基因被选作内参照标准，而目标基因的相对表达水平则是依据2−ΔΔCt方法计算得出[18]。
表 1 动物实验中组织测定所使用引物的序列Table 1. Sequence of primers used for tissue determination in animal experiments引物名 引物序列（5’-3’） GAPDH F: TGACCTCAACTACATGGTCTACA
R: CTTCCCATTCTCGGCCTTGAMPK F: GTCAAAGCCGACCCAATGATA
R: CGTACACGCAAATAATAGGGGTTPGC-1α F: TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT
R: CCACTTCAATCCACCCAGAAAGSOD2 F: CAGACCTGCCTTACGACTATGG
R: CTCGGTGGCGTTGAGATTGTTGPx1 F: GTGCAATCAGTTCGGACACCA
R: CACCAGGTCGGACGTACTTG1.2.9 肠道内容物中微生物相对含量的测定
对11~20号小鼠实施解剖后，从其大肠中收集内容物0.2 g样本。随后，依据1.2.8节所述的方法，针对这些肠道样本进行总菌、厚壁菌门菌、拟杆菌门菌、乳酸杆菌和双歧杆菌mRNA水平的测定（见表2），以此来探究该小鼠肠道微生物群落的具体组成情况。
表 2 动物实验中大肠内容物中微生物测定所使用引物的序列[18]Table 2. Sequence of primers used for microbial determination in large intestine contents in animal experiments[18]引物名 引物序列（5’-3’） 厚壁菌门 F: GCGTGAGTGAAGAAGT
R: CTACGCTCCCTTTACAC拟杆菌门 F: ACGCTAGCTACAGGCTTAACA
R: ACGCTACTTGGCTGGTTCA乳酸杆菌 F: CACCGCTACACATGGAG
R: AGCAGTAGGGAATCTTCCA双歧杆菌 F: TCGCGTCYGGTGTGAAAG
R: CCACATCCAGCRTCCAC总菌 F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
R: ATTACCGCGGCTGCTGGC1.3 数据处理
对参与实验的小鼠进行了详细的测量，并将所得数据以平均值±标准差的形式予以展示。此外，用SPSS 22.0软件执行单因素方差分析，以此评估在P<0.05显著性水平下各组间是否存在统计学意义上的差异。
2. 结果与分析
2.1 LP-CQPC03对氧化应激小鼠运动状态的影响
在力竭状态下的跑步及游泳实验中，正常组小鼠的表现时间最长，相比之下，模型组小鼠的运动持续时间最短（图1）。研究发现，与模型组相比，LP-CQPC03和VC均能显著提升氧化应激小鼠在这两项测试中的表现时长（P<0.05）。其中，LP-CQPC03-H的效果最为显著，明显优于LP-CQPC03-L和VC。过量的自由基在体内累积可能会导致器官受损及机能下降，特别是那些与运动紧密相关的组织和系统，从而引起运动表现减弱以及频繁感到疲惫[19]。适量的身体活动有助于减轻自由基对细胞膜造成的损害，支持氧化呼吸链的有效运作，并且保持线粒体结构与功能的稳定性；此外，良好的身体状况对于维持高水平的体力同样至关重要。在科学实验中，常通过测量动物的最大耐力跑或游泳距离来评估其运动能力；提高此类能力不仅直接反映了个体对抗疲劳的能力增强，也是衡量抗氧应激反应的一个重要指标[20]。现有研究指出，某些具备益生特性的乳酸菌种类展现出了优异的抗氧化性能，这可能有助于改善机体活力和增强运动能力[21]。本研究通过建立小鼠的氧化应激模型，观察乳酸菌LP-CQPC03对小鼠耐力跑步和游泳力竭的影响，进而探索该菌株是否能在面对氧化应激时提升宿主的运动潜能。与既往研究相似，运动能力在益生菌干预上提升后力竭跑步和游泳的时间都得到了提高[18]，本研究结果也显示，给予LP-CQPC03处理的小鼠相较于对照组，在两项测试中的持久性均有所增加，表明此菌可能具有促进运动耐力的作用。
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2.2 LP-CQPC03对氧化应激小鼠过度运动（游泳）后血乳酸浓度的影响
如图2所示，力竭运动（游泳）前安静时刻，各组小鼠之间血乳酸浓度无明显差异（P>0.05），总体处于较低水平。而力竭运动后5 min，各组小鼠血乳酸含量均有所上升，且各组之间差异显著（P<0.05）。其中模型组小鼠血乳酸浓度为各组中最高，其后依次是VC组、LP-CQPC03-L、LP-CQPC03-H组和正常组。力竭运动30 min后，各组小鼠血乳酸浓度均有所降低，且各组之间具有显著差异（P<0.05）。其中除正常组外，LP-CQPC03-H组最低，其次为LP-CQPC03-L组和VC组，模型组血乳酸含量最高。血乳酸是肌肉在无氧代谢过程中产生的一种代谢产物，其浓度与肌肉活动的强度和持续时间密切相关。当运动强度增加时，肌肉活动增强，导致无氧代谢加快，乳酸的产生也随之增加，从而使血乳酸浓度上升；运动导致肌肉疲劳，影响肌肉对氧气的摄取和利用，促进乳酸的合成，造成乳酸堆积，高水平的血乳酸通常表明身体在运动中消耗了更多的能量和造成机体的疲倦[22]。本研究中动物实验也支持了以上结论，力竭运动后血乳酸含量明显提升，随着运动后时间的延长，血乳酸的含量逐渐降低。在此过程中，LP-CQPC03能够更好地防止乳酸堆积，在力竭运动下保护机体。
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图 2 氧化应激小鼠过度运动后血清乳酸浓度变化注：力竭运动（游泳）前数据为1~10号小鼠第1次测定数据，力竭运动（游泳）后5 min数据为1~10号小鼠第2次测定数据，力竭运动（游泳）后30 min数据为11~20号小鼠测定数据；相同时间条件下，不同小写字母则表示两组之间存在显著差异（P<0.05）；相同组不同时间条件下，不同大写英文字母表示两组之间存在显著差异（P<0.05）。Figure 2. Changes in blood lactate concentration in mice following excessive exercise induced by oxidative stress2.3 LP-CQPC03对氧化应激小鼠腓肠肌组织MG、肝脏组织HG和血清CK、BUN的影响
如图3所示，正常组表现出最高的MG和HG水平，模型组的MG和HG水平则最低，VC和LP-CQPC03可以提升氧化应激小鼠的MG和HG水平，结果显示LP-CQPC03-H组的MG和HG水平高于LP-CQPC03-L组和VC组。模型组BUN和CK水平表现出相反的趋势，高于其余各组，其余各组由高到低为VC组、LP-CQPC03-L组、LP-CQPC03-H组和正常组。在经历氧化应激后，长时间的体力活动可能会导致碳水化合物代谢与脂质代谢出现异常，并大量消耗蛋白质和氨基酸。在进行高强度或持续的运动过程中，体内会产生大量的代谢产物，比如尿素氮（BUN）以及多种氧自由基，这些代谢物是导致运动疲劳的主要因素。代谢产物在体内的大量积聚不仅会引起内环境的代谢失衡，还可能损害器官和组织[23]。肌酸激酶（CK）是参与机体能量代谢的重要酶，主要存在于骨骼肌中。当高强度运动导致骨骼肌受损时，肌肉细胞膜的通透性会改变，CK会大量释放入血液，导致血清中CK浓度升高[24]。糖原主要储存在肝脏和肌肉中，肝糖原维持血糖稳定，肌糖原直接为肌肉供能。在长时间运动中，糖原逐步分解，维持能量供应，糖原耗尽会导致疲劳，影响运动表现，糖原的调节对机体运动代谢具有重要的意义[18,25]。通过有益微生物干预MG、HG、CK、BUN，起到提升运动机能得到证实，本研究也观察到相似的结果[22]，LP-CQPC03能够显著调节受氧化应激影响的小鼠体内MG、HG、CK、BUN指标以及血液中的乳酸含量，有效缓解了氧化应激状况，增强了其运动耐久性和效能。
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图 3 氧化应激小鼠腓肠肌组织MG、肝脏组织HG和血清CK、BUN水平Figure 3. Levels of MG in gastrocnemius muscle tissue, HG in liver tissue and serum CK and BUN in mice under oxidative stress2.4 LP-CQPC03对氧化应激小鼠肝脏组织的病理学变化的影响
通过对小鼠肝组织的显微镜观察（图4），可见正常组中，肝脏的小叶结构保持完好且边界清晰，肝细胞以放射状围绕中心静脉有序排列。相比之下，在模型组内，小鼠肝脏的小叶结构遭受了显著破坏，表现为肝细胞不再按照正常的放射状模式排列，并伴有部分细胞膜及细胞核破裂的现象，同时观察到凋亡小体的存在。通过处理，LP-CQPC03和VC能够减轻氧化应激所导致的小鼠（模型组）肝细胞损伤。LP-CQPC03-H组处理后，小鼠肝小叶结构几乎恢复正常，而LP-CQPC03-L组和VC组的小鼠则仍有部分肝细胞受损，细胞结构存在明显的破坏。在剧烈运动期间，机体的代谢需求显著增加，血液循环速度加快，肌肉组织会产生更多的代谢产物，力竭运动会加重肝脏的负担，从而造成肝脏损伤[21]。本研究的病理切片也显示力竭运动造成的肝脏的损伤，而LP-CQPC03可以有效的缓解肝脏损伤，保护肝脏，而且可能起到协助肝脏进行代谢的效果，从而调节机体保持良好的运动状态，减轻疲劳。
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图 4 氧化应激小鼠肝脏组织的病理学观察注：白色箭头为细胞膜及细胞核破裂，灰色箭头为凋亡小体。Figure 4. Pathological observation of liver tissue in mice under oxidative stress2.5 LP-CQPC03对小鼠组织中AMPK/PGC1-α通路相关因子mRNA表达水平的影响
对腓肠肌和肝组织中AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平进行了检测，结果如图5和图6所示。与模型组小鼠相比，VC、LP-CQPC03-L和LP-CQPC03-H组的AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平均显著提高（P<0.05），其中LP-CQPC03-H组的升高程度明显高于VC组和LP-CQPC03-L组。同时，正常组小鼠的AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平最高。AMPK在能量代谢调控中占据核心地位。当细胞面临诸如缺氧、缺血或体育锻炼等压力条件时，该激酶系统会被激活，进而促进葡萄糖转运与脂肪酸氧化过程的加速，同时抑制糖异生作用、蛋白质合成及脂质代谢等活动。此外，PGC-1α亦是调控脂肪酸氧化、葡萄糖利用以及线粒体生成等生理功能的关键因素之一。因此，调控AMPK/PGC-1α通路可以促进运动中的能量代谢，帮助延缓疲劳的发生并提升运动耐力[5−6]。本实验结果显示，LP-CQPC03能显著提高氧化应激小鼠组织中AMPK和PGC-1α的mRNA表达水平。过度运动会导致体内过氧化反应，并引发氧化应激损伤[26]。临床前研究表明，耐力训练能够增强骨骼肌中关键抗氧化酶的活性，例如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）[27−28]。与此结果一致，本研究也发现，接受LP-CQPC03灌胃的小鼠相比模型组表现出更高水平的SOD2和GPx1，这表明LP-CQPC03对增强小鼠体内抗氧化酶具有显著的积极作用，从而体现出与机体肝脏保护和增强运动能力相关的有益功效。
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图 5 氧化应激小鼠腓肠肌AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平Figure 5. mRNA expression levels of AMPK, PGC1-α, SOD2, and GPx1 in the gastrocnemius muscle tissue of mice under oxidative stress![]()
图 6 氧化应激小鼠肝脏AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平Figure 6. mRNA expression levels of AMPK, PGC1-α, SOD2, and GPx1 in the liver tissue of mice under oxidative stress2.6 LP-CQPC03对氧化应激小鼠肠道内容物中微生物表达的影响
厚壁菌门和拟杆菌门细菌是人体肠道内门属上最大的两类微生物，且这两类门属微生物可以作为菌群评估的初步指标，双歧杆菌是肠道中最重要的有益微生物之一[18]，本研究灌胃的样品是乳酸菌，因此通过测定肠道内容物中各厚壁菌门菌、拟杆菌门菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的表达，并以总菌（内容物中全部微生物）为参照，检测各类菌表达的相对强度，以判断各类菌相对含量。根据图7所示的数据，正常组小鼠肠道内拟杆菌门mRNA的表达量最低（P<0.05），而厚壁菌门与双歧杆菌的表达则相对较高。这一结果表明，在正常组中，拟杆菌门微生物所占比例最小，而厚壁菌门微生物的比例最大。经过LP-CQPC03处理之后，模型组小鼠肠道内厚壁菌门和双歧杆菌的比例显著上升，与此同时，拟杆菌门的比例出现了下降。此外，LP-CQPC03摄入后，LP-CQPC03-L组和LP-CQPC03-H组的小鼠乳酸杆菌比例明显提高，甚至超过了正常组水平，并且该变化与VC组及未经处理的模型组相比具有统计学意义（P<0.05）。研究显示，人体内脏的健康状态及氧化还原平衡与肠道微生物群落之间存在着密切联系。此外，肠道微生物还对器官损伤以及炎症反应具有重要影响[29]。相关研究表明，健康的肠道菌群能够将特定食物转化为有益于身体的营养成分，进而促进代谢调节因子的生成，增强肌肉力量，并提高运动表现[30]。临床观察发现，某些特定类型的肠道细菌可以消耗掉运动过程中产生的乳酸，减少其对肌肉造成的不利影响，从而帮助提升运动员的耐力水平[31]。当机体面临氧化应激时，肠道内的微生物组成将直接影响到肠道的功能性。不平衡的肠道菌群可能会干扰正常的肠道蠕动、粘液产生以及屏障功能，导致毒素更容易进入血液循环系统中，进一步加重氧化应激的程度[32]。在氧化应激条件下，人类肠道中的厚壁菌门和拟杆菌门细菌比例会发生显著变化，其中拟杆菌门细菌的比例增加而双歧杆菌则相对减少[19]。值得注意的是，属于厚壁菌门之一的乳酸杆菌具有提高抗氧化酶活力的作用[33]。本研究的结果也证实了这一观点，LP-CQPC03能够提升小鼠腓肠肌和肝脏组织中的抗氧化酶活力。另外，在LP-CQPC03的干预下，氧化应激小鼠的厚壁菌门微生物与双歧杆菌的比例均有所增加，而拟杆菌门的比例则有所下降。此外，由于LP-CQPC03是一种乳酸杆菌，其干预下氧化应激小鼠肠道内的乳酸杆菌占比大幅度上升，达到了高于正常组小鼠的状态。实验结果表明LP-CQPC03能够有效调节小鼠肠道菌群，与临床实验中运动员的肠道菌群与运动状态相关的结果一致[15]，提示LP-CQPC03改善肠道菌群的作用也是其改善机体功能并提升运动能力的重要因素之一。
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图 7 氧化应激小鼠肠道内容物中微生物的mRNA表达水平Figure 7. mRNA expression levels of microorganisms in the intestinal contents of mice under oxidative stress3. 结论
本研究构建了小鼠氧化应激状态模型，旨在评估LP-CQPC03的抗氧化性能及其对小鼠运动机能的影响。实验数据表明，LP-CQPC03能显著减轻小鼠体内的氧化应激状况，并促进了腓肠肌的能量代谢，进而改善了受试动物抵抗疲劳及执行身体活动的能力。进一步分析发现，在遵循人体日常推荐摄入量的前提下，LP-CQPC03展现出优于维生素C的作用效果。综上所述，本研究探讨了LP-CQPC03在提升氧化应激小鼠运动能力方面的作用机制，为后续开发能够缓解由高强度工作或自然老化导致的氧化损伤与运动能力衰退的食品级抗氧化成分奠定了基础，有利于推进拥有自主知识产权的益生菌制品的研发进程。尽管如此，上述结论尚需通过更多临床试验来验证其普遍适用性，这将是未来围绕LP-CQPC03开展科学研究的一个关键点。
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图 2 氧化应激小鼠过度运动后血清乳酸浓度变化
注：力竭运动（游泳）前数据为1~10号小鼠第1次测定数据，力竭运动（游泳）后5 min数据为1~10号小鼠第2次测定数据，力竭运动（游泳）后30 min数据为11~20号小鼠测定数据；相同时间条件下，不同小写字母则表示两组之间存在显著差异（P<0.05）；相同组不同时间条件下，不同大写英文字母表示两组之间存在显著差异（P<0.05）。
Figure 2. Changes in blood lactate concentration in mice following excessive exercise induced by oxidative stress
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图 3 氧化应激小鼠腓肠肌组织MG、肝脏组织HG和血清CK、BUN水平
Figure 3. Levels of MG in gastrocnemius muscle tissue, HG in liver tissue and serum CK and BUN in mice under oxidative stress
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图 4 氧化应激小鼠肝脏组织的病理学观察
注：白色箭头为细胞膜及细胞核破裂，灰色箭头为凋亡小体。
Figure 4. Pathological observation of liver tissue in mice under oxidative stress
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图 5 氧化应激小鼠腓肠肌AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平
Figure 5. mRNA expression levels of AMPK, PGC1-α, SOD2, and GPx1 in the gastrocnemius muscle tissue of mice under oxidative stress
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图 6 氧化应激小鼠肝脏AMPK、PGC1-α、SOD2和GPx1的mRNA表达水平
Figure 6. mRNA expression levels of AMPK, PGC1-α, SOD2, and GPx1 in the liver tissue of mice under oxidative stress
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图 7 氧化应激小鼠肠道内容物中微生物的mRNA表达水平
Figure 7. mRNA expression levels of microorganisms in the intestinal contents of mice under oxidative stress
表 1 动物实验中组织测定所使用引物的序列
Table 1 Sequence of primers used for tissue determination in animal experiments
引物名 引物序列（5’-3’） GAPDH F: TGACCTCAACTACATGGTCTACA
R: CTTCCCATTCTCGGCCTTGAMPK F: GTCAAAGCCGACCCAATGATA
R: CGTACACGCAAATAATAGGGGTTPGC-1α F: TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT
R: CCACTTCAATCCACCCAGAAAGSOD2 F: CAGACCTGCCTTACGACTATGG
R: CTCGGTGGCGTTGAGATTGTTGPx1 F: GTGCAATCAGTTCGGACACCA
R: CACCAGGTCGGACGTACTTG
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表 2 动物实验中大肠内容物中微生物测定所使用引物的序列[18]
Table 2 Sequence of primers used for microbial determination in large intestine contents in animal experiments[18]
引物名 引物序列（5’-3’） 厚壁菌门 F: GCGTGAGTGAAGAAGT
R: CTACGCTCCCTTTACAC拟杆菌门 F: ACGCTAGCTACAGGCTTAACA
R: ACGCTACTTGGCTGGTTCA乳酸杆菌 F: CACCGCTACACATGGAG
R: AGCAGTAGGGAATCTTCCA双歧杆菌 F: TCGCGTCYGGTGTGAAAG
R: CCACATCCAGCRTCCAC总菌 F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
R: ATTACCGCGGCTGCTGGC
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