Cerasus humilis Proanthocyanidins Ameliorats Insulin Resistance through PI3K-Akt-GSK-3β Signaling Pathway in HepG2 Cells
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摘要: 目的：基于网络药理学推测欧李原花青素（Cerasus humilis proanthocyanidin，CPC）调控肝胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）的潜在靶点和信号通路，运用人肝HepG2细胞构建胰岛素抵抗（IR-HepG2）模型验证并讨论。方法：首先通过TCMSP、Swiss Target Prediction等数据库筛选CPC靶点，OMIM、GeneCards等数据库获取IR关键控制点，借助Venny平台获取交集；其次用Cytoscape、STRING和生信平台对交集靶点进行拓扑分析、基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析；最后胰岛素诱导HepG2细胞建立IR-HepG2模型，考察CPC干预后细胞葡萄糖消耗量和摄取量、糖原合成以及糖酵解相关酶的活性，用抑制剂从蛋白水平确证CPC具体调控信号通路。结果：网络药理学分析筛选出AKT1、GSK-3β等66个关键靶点。主要富集在调节激酶活性、蛋白质磷酸化等GO条目，PI3K-Akt等KEGG信号通路。细胞实验结果显示，高剂量CPC（High dosage CPC，H-CPC）增加36.02%细胞葡萄糖消耗量、22.03%葡萄糖摄取量和27.99%糖原含量，提高18.89%糖酵解酶己糖激酶（Hexokinase，HK）和26.89%丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）活性并降低8.77%糖异生酶葡萄糖-6-磷酸酶（Glucose-6-phosphatase，G6Pase）含量，上调p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达（87.60%、64.14%和68.31%）。此外，PI3K抑制剂LY294002显著削弱CPC通过PI3K-Akt-GSK-3β调控HepG2细胞的葡萄糖消耗（29.09%）和糖原合成（6.07%）。结论：本研究证实CPC主要通过PI3K-Akt-GSK-3β信号通路改善肝脏IR，调节糖代谢紊乱，为欧李高值化产品开发提供理论基础。
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关键词:
- 欧李原花青素 /
- 胰岛素抵抗 /
- 网络药理学 /
- HepG2细胞 /
- PI3K-Akt-GSK-3β信号通路
Abstract: Objective: The study investigated the potential targets and signaling pathways by which Cerasus humilis proanthocyanidin (CPC) regulates hepatic insulin resistance (IR) using network pharmacology. Human HepG2 cells were used to construct an insulin resistance model (IR-HepG2) to interrogate possible mechanisms. Methods: CPC targets were screened using TCMSP and Swiss Target Prediction, and key IR control points were obtained using OMIM and GeneCards. Intersections between CPC targets and key IR control points were obtained using the Venny platform. Topological, GO, and KEGG analyses of intersection targets were carried out using Cytoscape, STRING, and the Biological Information Analysis Platform. Finally, HepG2 cells co-cultured with insulin was used to establish an IR-HepG2 model and investigate glucose consumption, glucose intake, glycogen synthesis, and glycolytic enzyme activity after CPC intervention. We confirmed the specific regulatory signaling pathway targeted by CPC at the protein level using specific inhibitors. Results: Sixty-six key targets, including AKT1 and GSK-3β, were selected by network pharmacological analysis. Targets were mainly concentrated in regulation of kinase activity, protein phosphorylation, other GO terms, PI3K-Akt, and other KEGG signaling pathways. High-dose CPC (H-CPC) increased cellular glucose consumption by 36.02%, glucose intake by 22.03%, glycogen content by 27.99%, enhanced hexokinase (HK) activity by 18.89% and pyruvate kinase (PK) activity by 26.89%, and decreased gluconeogenic enzyme glucose-6-phosphatase (G6Pase) content by 8.77%. H-CPC up-regulated protein expression of p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt, and p-GSK-3β/GSK-3β (87.60%, 64.14%, and 68.31%, respectively). The PI3K inhibitor LY294002 significantly weakened CPC-mediated up-regulation of glucose consumption (29.09%) and glycogen synthesis (6.07%) in HepG2 cells via PI3K-Akt-GSK-3β. Conclusions: In this study, CPC was confirmed to ameliorate liver IR and regulate glucose metabolism disorders mainly through the PI3K-Akt-GSK-3β signaling pathway, providing a theoretical basis for the development of Cerasus humilis as a high-value producer of CPC. -
近年来，糖代谢紊乱及其并发症Ⅱ型糖尿病发病率持续增加，已成为全球面临的一大公共健康问题[1]。胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是糖代谢紊乱的主要病理特征之一，表现为机体组织对胰岛素反应减弱，导致血糖调控失衡，尤其在肝脏中表现为糖原合成减少和糖异生增加，从而加剧高血糖的发生[2]。天然小分子化合物，如黄酮类和酚酸类，已被证实能通过抑制α-葡萄糖苷酶活性来减缓糖分吸收，通过促进肝糖原合成降低血糖含量，从而减轻胰岛素抵抗并预防糖尿病及其并发症[3−4]。这些天然活性成分因其低毒性和高效性而被视为糖代谢调节药物的潜在来源。
欧李（Cerasus humilis）属蔷薇科樱桃属，为我国特色小灌木，主要生长在我国北方地区。因其耐受性强，欧李在过去20年中被作为优秀的防风固沙灌木品种广泛种植，估计总面积约为20000公顷[5]。欧李果实呈红色或紫红色，具有独特的风味，但因其口味酸涩高值化开发利用较少。欧李果富含多酚1899 mg/100 g FM，其中原花青素占57%，约1082 mg/100 g FM[6]。本实验室前期研究发现，欧李原花青素（Cerasus humilis proanthocyanidin，CPC）是由黄烷-3-醇构成的低聚原花青素，在避光、低温且酸性的条件下CPC较为稳定，能有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性[7]。CPC能否通过减轻胰岛素抵抗从而改善肝脏糖代谢紊乱还鲜有报道。
本研究首先通过文献研究和各类数据库搜索，整理CPC具体的化学成分及其针对IR的潜在靶点；其次利用网络药理学工具，构建成分-靶点-疾病的交互网络，并通过基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析等生物信息学分析，预测CPC调控肝胰岛素抵抗的关键信号通路；最后构建肝胰岛素抵抗细胞模型，验证并讨论筛选信号通路在CPC调控肝胰岛素抵抗中的实际作用。本研究不仅明确CPC改善胰岛素抵抗的详细机制，还为欧李果高值化开发利用提供了科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
CPC 为本实验室前期优化的超声辅助低共熔溶剂法提取、AB-8大孔树脂纯化所得[7]，纯度为（87.41±2.54）%；HepG2细胞 上海富衡生物科技有限公司；人重组胰岛素、DMEM培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜、己糖激酶（Hexokinase，HK）活性检测试剂盒、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）活性检测试剂盒、糖原含量检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清 北京全式金生物技术有限公司；RIPA裂解液、PBS缓冲液、磷酸化酶抑制剂、Western封闭液、CCK8试剂盒 北京赛文创新生物科技有限公司；NcmECL Ultra苏州新赛美生物科技有限公司；人葡萄糖-6-磷酸酶（Glucose-6-phosphatase，G6Pase）Elisa试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；葡萄糖检测试剂盒（GOD-POD微板法） 北京雷根生物技术有限公司；一抗（PI3K、p-PI3K、β-actin） 美国Cell Signaling Technology公司；一抗（Akt、p-Akt）、二抗（鼠抗、兔抗） 武汉三鹰生物技术有限公司；一抗（p-GSK-3β、GSK-3β） 江苏亲科生物研究中心有限公司；PI3K抑制剂LY294002 美国MedChemExpress公司。
SPX-250B型生化培养箱 上海鑫骉腾达仪器设备有限公司；T25细胞培养瓶 广州BIOFIL生物科技有限公司；ECLIPSE Ti2-U型倒置显微镜 日本尼康公司；1500-823型全波长扫描酶标仪 Thermo Scientific公司；318R型低温（0~4 ℃）高速离心机 湖南恒诺仪器有限公司；JY600E电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；JY-SCZ2+型垂直电泳槽 北京君意东方电泳设备有限公司；Tanon4600SF全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统 上海天能科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CPC和IR靶点筛选
通过TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、UniProt（https://www.uniprot.org/id-mapping）、Pub Chem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、CTD（https://ctdbase.org/）和Superpred（https://prediction.charite.de/）数据库[8−9]，所有预测数据去除重复得到CPC活性成分靶点。
以“Insulin Resistance”为关键词，在OMIM（https://omim.Org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）和TTD（https://db.idrblab.net/ttd/）数据库检索IR相关靶点[8]。
1.2.2 交集靶点Venn图和PPI网络图的构建与分析及关键靶点的筛选
将CPC靶点及IR靶点导入Venny2.1.0在线平台[10]，得到Venn图和交集靶点，即CPC治疗胰岛素抵抗的潜在靶点。将CPC和IR共同交集靶点导入STRING（https://string-db.org/）数据库[10]，其中蛋白质类型设置为“智人”，最低相互作用阈值设置为0.4，隐藏游离靶标，得到PPI网络文件。随后，将得到的PPI网络数据导入Cystoscap可视化，使用Network Analyzer工具进行拓扑分析，最后利用Centiscape 2.2 Menu筛选出关键基因。
1.2.3 GO和KEGG分析
将1.2.2项下预测得到的关键靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行GO功能注释和KEGG富集分析，种属设为“智人”，以P<0.05作为条件筛选[9]，P值从小到大排序，选取GO功能注释中生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）的各前10位GO条目和KEGG通路富集中前20位通路通过生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn）构建气泡图可视化分析。
1.2.4 细胞培养
细胞培养严格遵循以往实验方法[9]。冻存细胞从液氮迅速转移至37 ℃水浴中解冻，在超净台中重悬于完全培养基中，并在观察至80%汇合后进行传代，后续培养在37 ℃、5% CO2条件下进行。为确保细胞的生长活性和稳定性，本研究采用25~40代的HepG2细胞。
1.2.5 CCK-8法测定细胞活力
采用CCK-8法检测CPC和PI3K抑制剂LY294002[11]的细胞毒性。HepG2细胞消化后以1×105 cells/mL的密度接种于96孔板中，24 h贴壁后弃去培养液。加入100 μL含不同浓度的CPC（1、2、4、8、10、20、40、80 μg/mL）和LY294002（1、2、4、8、10、20、40、80 μmol/L）培养液培养24 h，每组设置6个复孔。培养结束后吸弃培养液，每孔加入100 μL CCK-8溶液（CCK-8试剂与DMEM培养基以1:10的比例混合），37 ℃孵育1 h，测定450 nm处各孔的吸光度值，分别获得最大无作用剂量。
1.2.6 IR-HepG2模型的建立和细胞分组
HepG2细胞消化后接种于96孔板中，接种密度为1×105 cells/mL，24 h贴壁后弃去培养液。将只含有100 μL的DMEM高糖培养基（不含细胞）作为空白对照组，对照组只含培养基，实验组加不同浓度胰岛素（10−9、10−8、10−7、10−6、10−5 mol/L）培养24 h。采用CCK-8法测定胰岛素对细胞的毒性，并按照1.2.7中的方法测定细胞上清液中葡萄糖含量。选择对细胞活力没有显著影响且葡萄糖消耗量最低的胰岛素浓度建立IR-HepG2模型[12]。
细胞分组：将无胰岛素处理组设为对照组；胰岛素处理组设为模型组；根据1.2.5中确定的CPC对HepG2最大无作用剂量，按照低、中、高剂量设为L-CPC、M-CPC和H-CPC 处理组。在机制讨论试验中，根据LY294002的添加与否探讨CPC对PI3K的调控作用。
HepG2细胞分组如表1所示：
表 1 细胞分组方式Table 1. Methods of cell grouping分组 空白对照组 对照组 模型组 L-CPC M-CPC H-CPC LY294002 CPC＋LY294002 HegG2细胞 − + + + + + + + 胰岛素 − − + + + + + + CPC − − − 低剂量 中剂量 高剂量 − 高剂量 LY294002 − − − − − − + + 注：+：添加；−：不添加。 1.2.7 葡萄糖消耗量的测定
采用葡萄糖检测试剂盒（GOD-POD微板法）测定各组细胞上清液中葡萄糖的含量[13]。HepG2细胞以1×105 cells/mL密度接种于96孔板，按照表1分组处理24 h后，取上清培养液加入GOD-POD工作液，酶标仪用双蒸水调零后测定505 nm处吸光度值，按公式（1）计算葡萄糖消耗量。
葡萄糖含量(mmol/L)=(A空白对照组−A测定)×5A标准 (1) 上式中，A空白对照组—空白对照组的吸光度值；A测定—测定样品吸光度值；A标准—5 mmol/L葡萄糖吸光度值。
1.2.8 糖原含量的测定
采用糖原检测试剂盒测定各组HepG2细胞内糖原的含量[13]。HepG2细胞以5×105 cells/mL密度接种于6孔板，按照表1分组处理24 h后，每孔细胞分别收集到离心管内；加入0.75 mL强碱性提取液，用超声波（功率200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30 次）破碎细胞提取糖原；沸水浴20 min后冷却，蒸馏水定容至5 mL，8000×g 25 ℃离心后取上清液；用蒽酮显色剂于620 nm处测定吸光度值，用BCA法检测样本蛋白质浓度，按公式（2）计算细胞糖原含量。
糖原(mg/mgprot)=0.045×A测定−A空白A标准−A空白÷Cpr×F (2) 上式中，A测定—样品吸光度值；A标准—试剂盒标准品吸光度值；A空白—蒸馏水吸光度值；Cpr—样本蛋白质浓度，mg/mL；F—样本稀释倍数。
1.2.9 葡萄糖摄取的测定
采用2-NBDG荧光法测定细胞葡萄糖摄取量[12]。将HepG2细胞以1×105 cells/mL密度接种在黑壁透明底的96孔板中，按表1的分组处理后，弃去上清液后加入无酚红无糖DMEM培养液，孵育4 h后，加入100 μmol/L的2-NBDG培养液在细胞培养箱中避光孵育30 min，用PBS轻轻洗涤细胞2次终止反应。使用荧光显微镜在Ex/Em=470/545 nm条件下观察并拍摄2-NBDG在细胞内的特异性积累。酶标仪在Ex/Em=470/545 nm处定量细胞的荧光强度。
1.2.10 HK、PK和G6Pase酶活性测定
HepG2细胞以5×105 cells/mL密度接种于6孔板，24 h贴壁后弃去培养液。按照表1分组处理，24 h培养结束后收集细胞，分别按照己糖激酶（HK）活性检测试剂盒说明书、丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒说明书和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）ELISA试剂盒说明书具体步骤检测HK、PK和G6Pase酶活性[14]。
1.2.11 蛋白质样品提取及Western blotting测定
按照表1培养的HepG2细胞加入RIPA裂解后在4 ℃条件离心获得蛋白上清。用BCA法测定蛋白质含量，取剩余上清以4:1的比例加入蛋白上样缓冲溶液，100 ℃变性。首先制备分离和浓缩胶，接着进行电泳分离蛋白，随后使用湿转法将蛋白从凝胶转移到PVDF膜上。转膜后，膜被封闭以防止非特异性结合，并在4 ℃下用一抗p-PI3K（1:1000）、PI3K（1:1000）、p-Akt（1:10000）、Akt（1:5000）、p-GSK-3β（1:1000）、GSK-3β（1:1000）、β-actin（1:5000）孵育过夜，随后用二抗鼠抗或兔抗（1:1000）37 ℃孵育1 h。最后，使用ECL发光液进行显影，并通过Image J软件对蛋白条带进行定量分析以β-actin作为内参。
1.3 数据处理
采用SPSS26软件进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析和Duncan多重比较对数据进行显著性差异的统计学分析。采用Origin 2018软件进行统计学分析。
2. 结果与分析
2.1 CPC、IR潜在靶点的筛选、PPI网络构建与分析
前期UHPLC-MS研究结果显示，CPC主要由儿茶素、表儿茶素、（-）-没食子儿茶素、表没食子儿茶素、原花青素A1、原花青素B1、原花青素B2、原花青素A5、原花青素C1、肉桂鞣质B1、原花青素三聚体、原花青素四聚体组成[7]。基于此，通过TCMSP、Swiss Target Prediction、CTD（Inference Score>50[15]）和Superpred数据库筛选CPC靶点，选择人类物种，最终得到820个CPC潜在靶点。通过OMIM、GeneCards（Relevance score≥10[9]）和TTD数据库筛选IR靶点。如图1A所示，整合去重后获得1175个IR相关靶点，与CPC靶点交叉分析得261个交集靶点。
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图 1 CPC潜在作用靶点与IR靶点的Venn图和核心靶点PPI网络图注：A：Venn图；B：PPI网络图。Figure 1. Venn diagram of CPC potential targets and IR targets, and the PPI network diagram of key targets使用Cytoscape 3.10.0软件中的Centiscape组件对PPI网络的节点度进行拓扑分析，以大于度、紧密中心值和介数中心值的中位数为阈值[9]，筛选出关键靶点。如图1B所示，最终筛选出66个关键靶点，包括AKT1、ACTB、TP53、IL6、TNF、ALB等，说明CPC有望通过多靶点干预IR，调节糖代谢紊乱。
2.2 GO和KEGG富集分析
GO富集共得到623个条目，包含BP方面503个、CC方面47个、MF方面73个。选取BP、CC、MF排名前10的富集条目进行可视化分析。如图2A所示，CPC干预IR的BP方面涉及miRNA转录、细胞群增殖和PI3K/PKB信号传导等；CC方面包含细胞质、含蛋白质的复合体和核质等；MF方面涉及蛋白质激酶结合、蛋白质结合和转录调节因子结合等，说明CPC干预IR可能通过调控激酶活性和蛋白质磷酸化实现。
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图 2 GO、KEGG富集分析和CPC-成分-靶点-通路-IR网络图注：A：GO富集分析；B：KEGG富集分析；C：CPC-成分-靶点-通路-IR网络图。Figure 2. GO, KEGG enrichment analysis and CPC-component-target-pathway-IR network diagramKEGG通路分析得到169条信号通路，以Count≥2，P-value<0.05[9]筛选排名前20条通路进行可视化分析（图2B），构建“CPC-成分-靶点-通路-IR”网络图。结果显示CPC干预IR主要涉及内分泌系统、炎症反应和氧化应激等途径，包括PI3K-Akt、IR、糖尿病并发症中的AGE-RAGE、肝炎和内分泌抵抗等信号通路。经分析，PI3K-Akt、乙型肝炎和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路在P-value值和富集的目标基因数量上占优势，PI3K-AKT信号通路能被AGE-RAGE所激活[10]。PI3K-Akt信号通路涉及23个靶点蛋白，如AKT1、GSK-3β、FOXO3、IL-6和IRS1等，说明CPC主要通过调控葡萄糖代谢以及调节相关蛋白质，改善肝脏糖脂代谢、氧化应激反应及炎症反应，从而减轻IR症状。PI3K-AKT-GSK-3β在胰岛素信号传导和葡萄糖代谢中发挥重要作用，参与Ⅱ型糖尿病的发展[16]。PI3K是关键脂质激酶[17]，活化的PI3K催化生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇，触发AKT的磷酸化和激活[18]。AKT磷酸化FoxO1抑制糖异生，稳定血糖[19]；同时，AKT通过磷酸化GSK-3β的Ser9抑制其活性，激活糖原合酶，促进糖原合成[20−21]。因此，PI3K-Akt-GSK-3β通路在糖原合成及糖代谢调节中至关重要。
表 2 KEGG 通路富集分析相关基因Table 2. Related genes for KEGG pathway enrichment analysis通路名称 P值 相关基因 基因数 FoxO signaling pathway 5.25×10−23 SIRT1，STAT3，SLC2A4，AKT1，SOD2，IL6，IL10，CCND1，MAPK3，EGF，EGFR，TGFB1，IRS1，FOXO1，MAPK1，IGF1，FOXO3 17 Endocrine resistance 2.09×10−21 PRKACA，MMP9，AKT1，ESR1，CCND1，MAPK3，TP53，ERBB2，EGFR，MTOR，JUN，SRC，BCL2，MAPK1，FOS，IGF1 16 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 3.20×10−21 CCL2，NFKB1，IL1B，STAT3，AKT1，TNF，IL6，CCND1，MAPK3，CASP3，FN1，JUN，BCL2，TGFB1，FOXO1，MAPK1，CXCL8，AGT 18 Hepatitis B 8.00×10−21 NFKB1，STAT3，MMP9，TLR4，AKT1，TNF，IL6，MAPK3，TP53，CYCS，CASP3，JUN，SRC，BCL2，MYC，TGFB1，MAPK1，FOS，CXCL8，CREB1 20 HIF-1 signaling pathway 1.62×10−20 NFKB1，IFNG，STAT3，TLR4，AKT1，IL6，MAPK3，EGF，ERBB2，EGFR，MTOR，BCL2，HIF1A，MAPK1，HMOX1，IGF1 16 PI3K-Akt signaling pathway 2.27×10−20 NFKB1，TLR4，AKT1，IL6，CCND1，MAPK3，EGF，TP53，ERBB2，EGFR，GSK3B，FN1，MTOR，BCL2，BRCA1，MYC，FGF2，IRS1，MAPK1，BDNF，IGF1，CREB1，FOXO3 23 Insulin resistance 4.52×10−19 NFKB1，STAT3，PPARGC1A，SLC2A4，SREBF1，AKT1，TNF，IL6，GSK3B，MTOR，IRS1，FOXO1，AGT，CREB1 14 Hepatitis C 2.00×10−18 NFKB1，IFNG，STAT3，AKT1，TNF，CCND1，MAPK3，EGF，TP53，EGFR，CYCS，CASP3，GSK3B，MYC，CTNNB1，MAPK1 16 AMPK signaling pathway 4.18×10−18 SIRT1，PPARGC1A，PPARG，LEP，SLC2A4，SREBF1，ADIPOQ，AKT1，CCND1，MTOR，IRS1，FOXO1，IGF1，CREB1，FOXO3 15 2.3 CPC对IR-HepG2细胞糖代谢的调节作用
肝脏在维持全身血糖水平中起着关键作用，通过葡萄糖摄取、糖原合成与分解和糖异生等多种机制调节葡萄糖的生产与储存[11−12]，因此考察CPC对肝脏IR的影响。不同浓度的CPC（0~80 μg/mL）对HepG2细胞存活率的影响如图3A所示，20 μg/mL的CPC显著降低细胞存活率（P<0.01），10 μg/mL为最大无毒作用剂量，因此选择≤10 μg/mL CPC（2、5、10 μg/mL）进行后续实验。图3B显示，10−5~10−9 mol/L胰岛素对细胞活力无显著影响，但10−7 mol/L胰岛素显著降低了HepG2细胞的葡萄糖消耗量（P<0.01），证明成功建立IR-HepG2模型，故选用10−7 mol/L胰岛素作为造模浓度。
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图 3 CPC对IR-HepG2细胞葡萄糖的调节作用注：A：梯度浓度CPC对HepG2细胞的细胞毒性作用；B：不同浓度胰岛素对HepG2细胞存活率和葡萄糖消耗量的影响；C：CPC对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响；D：CPC对IR-HepG2细胞糖原含量的影响。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；n=4。Figure 3. Effect of CPC on glucose in IR-HepG2 cells测定CPC处理后细胞培养液中的葡萄糖浓度和细胞内糖原含量，评估细胞葡萄糖的消耗情况。图3C显示，模型组的葡萄糖消耗量显著降低（P<0.01），表明细胞出现IR和糖代谢紊乱。CPC干预后，葡萄糖消耗量呈剂量依赖性增加，中、高剂量组显著提高（P<0.05，P<0.01）。图3D显示，模型组糖原显著降低（P<0.01），而CPC干预后糖原含量也呈剂量依赖性升高，中、高剂量组糖原含量显著增加（P<0.05，P<0.01）。这些结果表明CPC能有效提高葡萄糖消耗量和糖原含量，缓解HepG2细胞的IR。
2-NBDG作为一种荧光物质，可被葡萄糖转运蛋白转运至细胞内部并经过HK磷酸化形成2-NBDG-6-磷酸，该产物无法进一步代谢，在细胞内积累，因此可以用来评估细胞葡萄糖摄取能力[22]。图4A显示，模型组的2-NBDG荧光强度显著降低（P<0.05），表明细胞对2-NBDG的摄取能力下降。中、高剂量CPC干预后，2-NBDG荧光强度显著增加（P<0.05，P<0.01），显示出细胞对葡萄糖的摄取能力增强。
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图 4 CPC对IR- HepG2细胞葡萄糖摄取、HK活性、PK活性和G6Pase含量的影响注：A：不同浓度CPC（L-CPC、M-CPC和H-CPC）对HepG2细胞葡萄糖摄取的荧光染色和定量结果；B~D：不同浓度CPC（L-CPC、M-CPC和H-CPC）对HepG2细胞HK活性、PK活性和G6Pase含量的影响。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；n=4。Figure 4. Effect of CPC on glucose uptake, HK activity, PK activity and G6Pase content in IR-HepG2 cells细胞摄入葡萄糖后，首先通过糖酵解生成丙酮酸。在有氧条件下，丙酮酸进一步通过三羧酸循环和氧化磷酸化产生能量[23]。糖酵解是所有生物进行葡萄糖分解的共同阶段，其主要限速酶为HK和PK，它们在肝脏中高度表达，发挥关键作用[24−25]。糖异生是将非糖类物质转化为葡萄糖的过程，G6Pase是这一过程的关键酶[25]。图4B、图4C表明，模型组HK和PK酶活性显著降低（P<0.05），而高剂量CPC能显著增强HK和PK活性。图4D显示，模型组G6Pase酶含量显著升高（P<0.05），高剂量CPC显著降低G6Pase酶含量。这表明CPC不仅增强HK、PK的活性，提高葡萄糖利用效率，还降低G6Pase活性，抑制糖异生，从而有效控制血糖升高。
2.4 CPC通过PI3K-Akt-GSK-3β信号通路调控糖代谢紊乱
结果如图5所示，与对照组相比，模型组的p-PI3K、p-Akt和p-GSK-3β显著降低，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值分别为对照组的70.16%和48.80%（P<0.05），p-GSK-3β/GSK-3β降低25.60%（P<0.05）。CPC干预后，p-PI3K、p-Akt显著升高，GSK-3β表达降低且p-GSK-3β升高，H-CPC组的比值分别上调87.60%、64.15%和68.31%（P<0.05），表明CPC激活了IR-HepG2细胞糖原合成的关键蛋白。
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图 5 CPC对IR-HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的影响注：A：不同浓度CPC（L-CPC、M-CPC和H-CPC）对HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的Western blotting结果；B：A中HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的定量结果。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；n=4。Figure 5. Effect of CPC on p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, and p-GSK-3β/GSK-3β expression in IR-HepG2 cells其次，用PI3K抑制剂LY294002讨论CPC是否调控PI3K-Akt-GSK-3β信号通路促进IR-HepG2细胞糖原合成。如图6A所示，选择40 μmol/L LY294002作为后续实验浓度。如图6B、图6C所示，模型组的葡萄糖消耗量和糖原含量显著降低（P<0.01），而CPC干预后显著提高（P<0.01）；LY294002组的葡萄糖消耗量和糖原含量也降低，CPC+LY294002组升高，但仅占CPC组的77.48%和94.28%。如图6D、图6E所示，CPC显著上调了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值（P<0.05）。与CPC组相比，LY294002组下调了这些比值（P<0.01）。CPC+LY294002组虽然上调了p-PI3K、p-Akt和p-GSK-3β的表达，但依旧比CPC组低，说明CPC激活了PI3K-Akt-GSK-3β信号通路。这一结果表明CPC可通过激活该信号通路调控IR，改善糖代谢紊乱。
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图 6 CPC通过PI3K-Akt-GSK-3β信号通路调控肝胰岛素抵抗注：A：PI3K抑制剂LY294002对HepG2细胞的细胞毒性作用；B：PI3K抑制剂LY294002对CPC调节HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响；C：PI3K抑制剂LY294002对CPC调节HepG2细胞糖原含量的影响；D：PI3K抑制剂LY294002对CPC调节HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的干预作用；E：D中HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的定量结果。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；与CPC+LY294002组相比，&P<0.05，&&P<0.01；n=4。Figure 6. CPC improved insulin resistance through PI3K-Akt-GSK-3β signaling pathway in HepG2 cells3. 结论
本文首先利用网络药理学工具筛选CPC潜在靶点和IR关键控制点，通过构建成分-靶点-疾病网络、生物信息学分析，从整体和系统的视角推断CPC通过蛋白质磷酸化、糖异生和糖原合成等多种生物过程影响IR，并预测CPC可能通过PI3K-Akt-GSK-3β促进胰岛素信号的传递，改善IR状态。为验证这一推测，本研究用HepG2细胞构建胰岛素抵抗模型，发现CPC可以增加IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量、葡萄糖摄取和糖原含量，提高糖酵解HK、PK酶活，降低糖异生G6Pase酶含量，提高p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表达。PI3K抑制剂LY294002的添加进一步证实CPC通过激活PI3K-Akt-GSK-3β信号通路增加IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量和糖原含量。本研究为CPC改善胰岛素抵抗及其功能性食品开发利用方面提供了理论依据。
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图 1 CPC潜在作用靶点与IR靶点的Venn图和核心靶点PPI网络图
注：A：Venn图；B：PPI网络图。
Figure 1. Venn diagram of CPC potential targets and IR targets, and the PPI network diagram of key targets
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图 2 GO、KEGG富集分析和CPC-成分-靶点-通路-IR网络图
注：A：GO富集分析；B：KEGG富集分析；C：CPC-成分-靶点-通路-IR网络图。
Figure 2. GO, KEGG enrichment analysis and CPC-component-target-pathway-IR network diagram
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图 3 CPC对IR-HepG2细胞葡萄糖的调节作用
注：A：梯度浓度CPC对HepG2细胞的细胞毒性作用；B：不同浓度胰岛素对HepG2细胞存活率和葡萄糖消耗量的影响；C：CPC对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响；D：CPC对IR-HepG2细胞糖原含量的影响。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；n=4。
Figure 3. Effect of CPC on glucose in IR-HepG2 cells
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图 4 CPC对IR- HepG2细胞葡萄糖摄取、HK活性、PK活性和G6Pase含量的影响
注：A：不同浓度CPC（L-CPC、M-CPC和H-CPC）对HepG2细胞葡萄糖摄取的荧光染色和定量结果；B~D：不同浓度CPC（L-CPC、M-CPC和H-CPC）对HepG2细胞HK活性、PK活性和G6Pase含量的影响。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；n=4。
Figure 4. Effect of CPC on glucose uptake, HK activity, PK activity and G6Pase content in IR-HepG2 cells
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图 5 CPC对IR-HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的影响
注：A：不同浓度CPC（L-CPC、M-CPC和H-CPC）对HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的Western blotting结果；B：A中HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的定量结果。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；n=4。
Figure 5. Effect of CPC on p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, and p-GSK-3β/GSK-3β expression in IR-HepG2 cells
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图 6 CPC通过PI3K-Akt-GSK-3β信号通路调控肝胰岛素抵抗
注：A：PI3K抑制剂LY294002对HepG2细胞的细胞毒性作用；B：PI3K抑制剂LY294002对CPC调节HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响；C：PI3K抑制剂LY294002对CPC调节HepG2细胞糖原含量的影响；D：PI3K抑制剂LY294002对CPC调节HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的干预作用；E：D中HepG2细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达的定量结果。与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01；与CPC+LY294002组相比，&P<0.05，&&P<0.01；n=4。
Figure 6. CPC improved insulin resistance through PI3K-Akt-GSK-3β signaling pathway in HepG2 cells
表 1 细胞分组方式
Table 1 Methods of cell grouping
分组 空白对照组 对照组 模型组 L-CPC M-CPC H-CPC LY294002 CPC＋LY294002 HegG2细胞 − + + + + + + + 胰岛素 − − + + + + + + CPC − − − 低剂量 中剂量 高剂量 − 高剂量 LY294002 − − − − − − + + 注：+：添加；−：不添加。 
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表 2 KEGG 通路富集分析相关基因
Table 2 Related genes for KEGG pathway enrichment analysis
通路名称 P值 相关基因 基因数 FoxO signaling pathway 5.25×10−23 SIRT1，STAT3，SLC2A4，AKT1，SOD2，IL6，IL10，CCND1，MAPK3，EGF，EGFR，TGFB1，IRS1，FOXO1，MAPK1，IGF1，FOXO3 17 Endocrine resistance 2.09×10−21 PRKACA，MMP9，AKT1，ESR1，CCND1，MAPK3，TP53，ERBB2，EGFR，MTOR，JUN，SRC，BCL2，MAPK1，FOS，IGF1 16 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 3.20×10−21 CCL2，NFKB1，IL1B，STAT3，AKT1，TNF，IL6，CCND1，MAPK3，CASP3，FN1，JUN，BCL2，TGFB1，FOXO1，MAPK1，CXCL8，AGT 18 Hepatitis B 8.00×10−21 NFKB1，STAT3，MMP9，TLR4，AKT1，TNF，IL6，MAPK3，TP53，CYCS，CASP3，JUN，SRC，BCL2，MYC，TGFB1，MAPK1，FOS，CXCL8，CREB1 20 HIF-1 signaling pathway 1.62×10−20 NFKB1，IFNG，STAT3，TLR4，AKT1，IL6，MAPK3，EGF，ERBB2，EGFR，MTOR，BCL2，HIF1A，MAPK1，HMOX1，IGF1 16 PI3K-Akt signaling pathway 2.27×10−20 NFKB1，TLR4，AKT1，IL6，CCND1，MAPK3，EGF，TP53，ERBB2，EGFR，GSK3B，FN1，MTOR，BCL2，BRCA1，MYC，FGF2，IRS1，MAPK1，BDNF，IGF1，CREB1，FOXO3 23 Insulin resistance 4.52×10−19 NFKB1，STAT3，PPARGC1A，SLC2A4，SREBF1，AKT1，TNF，IL6，GSK3B，MTOR，IRS1，FOXO1，AGT，CREB1 14 Hepatitis C 2.00×10−18 NFKB1，IFNG，STAT3，AKT1，TNF，CCND1，MAPK3，EGF，TP53，EGFR，CYCS，CASP3，GSK3B，MYC，CTNNB1，MAPK1 16 AMPK signaling pathway 4.18×10−18 SIRT1，PPARGC1A，PPARG，LEP，SLC2A4，SREBF1，ADIPOQ，AKT1，CCND1，MTOR，IRS1，FOXO1，IGF1，CREB1，FOXO3 15
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