Molecular Modification and Enzymatic Properties of the Novel α-Glucosidase Aga432
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摘要: 本研究旨在从类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）中克隆新型α-葡萄糖苷酶Aga432基因并通过定点突变提高α-葡萄糖苷酶Aga432的活性。从Paenibacillus sp.全基因组中获得表达α-葡萄糖苷酶的基因片段，进行序列分析，通过同源建模与分子对接并构建基因工程菌获得8株正向突变菌株，对重组Aga432和相对活性最高的正向突变体AT-2进行酶学性质研究，并探究重组α-葡萄糖苷酶Aga432、AT-2对生物膜的分散作用，评价其对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性。结果表明，Aga432比活力为45.05 U/mg，突变体AT-2比活力为84.09 U/mg。与Aga432相比，AT-2的最适反应温度、最适反应pH改变并不明显，热稳定性有较大的提高，并且在酸性条件下较为稳定。突变体AT-2的Km为Aga432的1.87倍，Vmax值为Aga432的3.19倍，Kcat值为Aga432的2.33倍，Kcat/Km值为Aga432的1.07倍。体外细胞实验表明，15.0~30.0 μg/mL的Aga432、AT-2对细胞无明显毒性作用，具有良好的细胞相容性。生物膜分散作用结果表明，10.0~50.0 μg/mL浓度的两种重组α-葡萄糖苷酶对细菌生物膜具有显著的分散作用。本研究通过分子改造提升α-葡萄糖苷酶Aga432的热稳定性，为开发新型α-葡萄糖苷酶以及后续定向改造研究提供了基础和参考依据。Abstract: This study aimed to clone the novel α-glucosidase gene Aga432 from Paenibacillus sp. and enhance its catalytic activity through site-directed mutagenesis. A gene fragment encoding α-glucosidase was successfully amplified from the genomic DNA of Paenibacillus sp., comprehensive sequence analysis was performed, and homology modeling and molecular docking were employed to construct gene-engineered strains. Eight positive mutant strains were identified, among which the enzymatic properties of recombinant Aga432 and the highest relative activity mutant AT-2 were characterized. Additionally, the dispersing effects of recombinant α-glucosidases Aga432 and AT-2 on biofilms were explored, and their toxicity to mouse embryo fibroblasts was evaluated. The results revealed that the specific activity of Aga432 was 45.05 U/mg, while the mutant AT-2 exhibited a significantly enhanced specific activity of 84.09 U/mg. Although the optimal reaction temperature and pH for AT-2 were essentially unaltered relative to Aga432, its thermal stability was significantly enhanced, and it exhibited heightened stability under acidic conditions. The Km of mutant AT-2 was 1.87 times that of Aga432, the Vmax was 3.19 times, the Kcat was 2.33 times, and the Kcat/Km was 1.07 times that of Aga432. In vitro cellular assays indicated that Aga432 and AT-2 at concentrations of 15.0-30.0 μg/mL were non-toxic and exhibited good cell compatibility. Biofilm dispersal assays demonstrated that both recombinant α-glucosidases at concentrations ranging from 10.0 to 50.0 μg/mL significantly dispersed bacterial biofilms. The thermostability of α-glucosidase Aga432 was successfully enhanced through molecular modification in this study, laying a foundation for the development of novel α-glucosidases and providing a reference for future targeted modification research.
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α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20, alpha-glucosidase，缩写为AGs），也称α-1,4-糖苷键水解酶，属于糖苷水解酶类（GHs），负责水解特定的α-糖苷键，能从底物非还原端释放α-葡萄糖[1]。AGs在细菌、真菌、植物和动物中广泛分布，根据序列相似性，可以被分成两个GH家族，GH13和GH31[2]。一般来说，GH13家族的酶（通常由细菌、酵母和昆虫合成）对异质底物具有更高的活性[3]；而GH31家族（由植物、霉菌和动物合成）更专一作用于均质底物（麦芽低聚糖）而不是异质底物。GH13家族的AGs被预测属于α-淀粉酶家族（GH-H家族），具有共同的（β/α）8桶折叠（TIM桶）催化结构域A和另外两个结构域B、C[4−5]。作为负责水解特定α-糖苷键的外切碳水化合物酶，AGs除了从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1,4-葡萄糖苷键之外，还能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中催化转糖苷反应[6]。AGs催化的底物具有多样性和特异性[7]，包括具有α-葡萄糖苷键的寡糖、α-葡聚糖、合成α-葡萄糖苷、可溶性淀粉和糖原等。鉴于在食品领域的开发和应用都具有良好的经济和社会效益，α-葡萄糖苷酶的研究多年来一直受到重视[8]。
由于α-葡萄糖苷酶能够降低液化和糊化过程中淀粉浆的黏度，并提高产糖量，因而常应用于麦芽糊精生产、烘焙工业和饮料的生产过程中[9]。如Wei等[10]利用α-葡萄糖苷酶和环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的协同作用，合成一种具有高溶解性、低粘度和抗消化酶活性的新型水溶性慢消化糊精。然而，对于能在特定极端条件下发挥作用的α-葡萄糖苷酶的开发还远远不够。在淀粉转化行业，极高的温度限制了野生型α-葡萄糖苷酶的使用[11]。因此寻找和开发热稳定性优良的α-葡萄糖苷酶仍是目前国内外学者研究的热点。点突变作为一种有效的分子生物学工具，可以精确改变酶分子的氨基酸序列，从而影响其结构和功能。通过定点突变，探究特定氨基酸残基对酶活性、热稳定性、底物特异性等性质的影响[12]，这对于开发具有特定应用价值的酶变体具有重要意义。生物膜是由微生物在各类基质构建的复杂结构[13]。生物膜除了为微生物提供了一个嵌入的基质环境外，还为微生物繁殖提供充足的营养物质，加速微生物的增殖速度，对食品生产造成二次污染[14]。这不仅会缩短产品的保质期；还可能导致食源性疾病爆发[15]。而酶制剂作为一种绿色安全的生物膜清除方法，可以通过减少食品加工设备表面的微生物污染，提高食品安全性，大幅度提高食品加工的效率和经济效益[16]，研究表明，通过使用α-葡萄糖苷酶和纤维素酶分别靶向细菌胞外多糖的α-1,4-糖苷键和β-1,4-糖苷键，能够引起生物膜的有效分散[17−18]。
由于α-葡萄糖苷酶在改善食品质地，生产具有益生元效应的低聚麦芽糖[19]，制备膳食纤维[20]等食品领域的多种用途而引起了全球学者的广泛关注。但对于能在极端条件下有效工作的酶蛋白，仍然存在需求缺口。因此，本研究通过计算机辅助设计定向进化技术，对新型α-葡萄糖苷酶进行分子改造。运用同源建模与分子对接技术分析α-葡萄糖苷酶Aga432与底物对硝基苯-D-α-葡萄糖苷（pNPG）之间的相互作用模式，识别关键的氨基酸突变位置。随后，利用全质粒PCR扩增技术实施定向突变，进而筛选出性能提升的突变体，并对正向突变体的酶活性质进行研究。本次研究为最终获得适合食品工业与医药实际应用的α-葡萄糖苷酶以及后续定向改造研究提供了基础和参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、载体 pMD-18T、载体pET-28a、鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3、耐药金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐药铜绿假单胞菌（Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA） 均由本实验室保存；DNA凝胶快速纯化试剂盒、QuickCutTM Dpn Ⅰ消化酶、TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 北京全式金生物技术有限公司；Ni-NTA琼脂糖纯化树脂预装柱 上海生工生物工程有限公司；Premix Taq 2.0 plus dye 宝日医生物技术（北京）有限公司；对硝基苯-D-α-葡萄糖苷 上海麦克林生化科技有限公司；细胞培养基 DMEM培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。
DYY-8C型核酸电泳仪 北京六一生物科技有限公司；Universal Hood II凝胶成像仪 Bio-Rad；SimpliAmp™ Thermal Cycler PCR仪 Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems；ST 16R高速冷冻离心机 Thermo Fisher SCIENTIFIC；Sorvall Legend Micro 17微量高速离心机 Thermo Fisher SCIENTIFIC。
1.2 实验方法
1.2.1 序列分析与重组蛋白Aga432的同源建模
以实验室保存的类芽孢杆菌Paenibacillus sp.全基因组DNA为模板PCR扩增淀粉酶Aga432的序列，上下游引物序列分别为43A2 f1（ATGGAACCGAAGCAATGGTGGAAA）和43A2 r1（TTAAGTTTCCATAAGGTACATTCTGGCTTCG），PCR扩增条件为：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s 30个循环，72 ℃ 3 min，72 ℃ 10 min。将扩增片段的测序结果上传至NCBI网站进行Nucleotide BLAST比对，分析基因序列与已表征淀粉酶的同源性。同时将Aga432氨基酸序列上传至在线网站SWISS-model（http://swissmodel.expasy.or），并获取相似蛋白模型，下载蛋白质模型的pdb格式用于分子对接。
1.2.2 突变体的构建
从PubChem网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载底物pNPG的.pdb格式文件，作为分子对接的配体。使用AutoDockTools-1.5.7软件对蛋白质和配体进行分子对接。将配体和蛋白质进行AutoDock半柔性对接。对接结束后对结合能量最低的构象进行分析，同时导出pdbqt格式并转换为pdb格式。使用Pymol软件对对接结果进行可视化分析，确定催化活性口袋的关键氨基酸残基并模拟突变后的构象改变[21]。选择与活性中心对接的亲水氨基酸突变为疏水氨基酸残基（甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等）；将活性中心附近残基较大的氨基酸突变为残基较小的氨基酸。设计突变引物（表1），进行全质粒PCR扩增构建突变质粒，PCR扩增条件为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s 30个循环，72 ℃ 3 min，72 ℃ 3 min。PCR产物需使用Dpn I消化模板质粒。取5 µL消化后产物电泳验证，将条带位置正确的产物与扩增产物Aga432同时转化至E. coli DH5α，涂布于氨苄抗性平板挑取转化子送至生物公司测序，并与相应序列进行比对。
表 1 定点突变引物Table 1. Primers for site-directed mutagenesis引物 序列（5'→3'） 长度（bp） E2K f ATCCATGaaaCCGAAGCAATGGTGGAAAGAGA 32 E2K r GCTTCGGtttCATGGATCCGCGACCCATTTGC 32 P3A f CCATGGAAgcaAAGCAATGGTGGAAAGAGACGG 33 P3A r TTGCTTtgcTTCCATGGATCCGCGACCCATTT 32 Q301V f AAGTGGgtaACCGAGCTTAAAGGAGAGGCATG 32 Q301V r AGCTCGGTtacCCACTTGGACAGTACCGTTTTCA 34 T302G f TGGCAGggaGAGCTTAAAGGAGAGGCATGGAA 32 T302G r TTAAGCTCtccCTGCCACTTGGACAGTACCGTT 33 E303K f GTGGCAGACCaaaCTTAAAGGAGAGGCATGGAACAG 36 E303K r TAAGtttGGTCTGCCACTTGGACAGTACCGTT 32 K305D f ACCGAGCTTgacGGAGAGGCATGGAACAGTCTGT 34 K305D r TCTCCgtcAAGCTCGGTCTGCCACTTGGACAG 32 G306D f GCTTAAAgacGAGGCATGGAACAGTCTGTTCTG 33 G306D r ATGCCTCgtcTTTAAGCTCGGTCTGCCACTTG 32 A308P f AGGAGAGccaTGGAACAGTCTGTTCTGGAATAACC 35 A308P r TGTTCCAtggCTCTCCTTTAAGCTCGGTCTGC 32 W309L f AGAGGCActaAACAGTCTGTTCTGGAATAACCACG 35 W309L r GACTGTTtagTGCCTCTCCTTTAAGCTCGGTC 32 Y466P f CATTGTTccaGGCGATTATACATTGATTTTCCC 33 Y466P r AATCGCCtggAACAATGACTTCATAATCTTTTCTGAGC 38 Y469P f TGGCGATccaACATTGATTTTCCCGGAACATC 32 Y469P r TCAATGTtggATCGCCATAAACAATGACTTCATAA 35 注：小写部分为拟定点突变的碱基。 1.2.3 重组α-葡萄糖苷酶的诱导表达与纯化
根据测序结果设计带BamH I和Xho Ⅰ酶切位点的引物，以质粒为模板进行PCR，再将带酶切位点的目的片段与pMD-18T进行TA克隆并转化至E. coli DH5α，随后筛选阳性重组子并测序。测序结果正确后，将相应阳性重组子质粒转化至E. coli BL21 （DE3）感受态细胞。将转化测序成功的工程菌进行三区划线培养，挑取单菌落接种发酵，至菌液OD600值达到0.6~0.8，加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG诱导表达，20 ℃、150 r/min条件下诱导12 h。离心收集细菌菌体并重悬后进行超声破碎收集上清即为粗酶液。使用Ni-NTA预装柱对粗酶液进行分离纯化，纯化前用0.22 μm滤膜将粗酶液过滤，待缓冲液平衡柱料，取5 mL粗酶液上样吸附3~5 min，用缓冲液充分洗脱后，使用20、40、80、100、200和300 mmol/L咪唑进行梯度洗脱即可得到纯酶，纯化后的酶液采用SDS-PAGE蛋白电泳分析检测重组α-葡萄糖苷酶纯度。
1.2.4 α-葡萄糖苷酶活力测定
取10 µL 10 mmol/L的pNPG和140 µL pH5.5的B-R缓冲液在40 ℃下预热5 min左右，加入适度稀释的50 µL的酶液于40 ℃下反应15 min，反应结束后立即加入600 µL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应并显色，于405 nm处测定吸光度。以煮沸20 min灭活的酶液作为空白对照，反应体系及反应条件同上。酶活定义：在一定条件下，每1 min水解生成1 µmol pNP所需的酶量为一个酶活力单位[22]。采用考马斯亮蓝法测定重组蛋白的浓度，以BSA蛋白浓度作横坐标，OD595值作纵坐标绘制BSA标准曲线。
1.2.5 重组葡萄糖苷酶的酶学性质分析
1.2.5.1 最适反应温度与热稳定性
取50 μL纯化后的酶液加入10 μL pNPG底物与140 μL预热缓冲液中，混匀后分别置于30、35、40、45、50、55、60、65、70和75 ℃下反应，精确计时15 min，迅速加入600 μL1 mol/L Na2CO3终止反应并显色，混匀后吸取上清液测定405 nm下的吸光值，以测得的最高酶活力作为100%，计算各组相对酶活力，确定最适反应温度。将酶液依次置于25、30、35、40、45和50 ℃水浴0.5~3.0 h，每0.5 h一组，最后置于最适反应条件下进行酶活力测定，以未进行水浴处理组的酶活力作为100%，计算各组剩余相对酶活力，确定其在不同温度下的稳定性。
1.2.5.2 最适反应pH与pH稳定性
在最适反应温度下，将不同pH的B-R缓冲液（pH4.0~8.0）加入反应体系中，测定重组酶的酶活，以测得的最高酶活力作为100%，计算各组相对酶活力，确定最适反应pH。将不同pH的B-R缓冲液（pH3.0~11.0）与纯化后的酶液混合均匀，4 ℃下孵育4 h，在最适反应条件下进行酶活力测定，以未经过孵育处理组的酶活力作为100%，计算孵育后的剩余相对酶活力，确定其pH稳定性。
1.2.5.3 动力学参数测定
配制不同浓度pNPG底物（0.5~12.0 mmol/L）在最适条件下测定酶活力，以双倒数作图法绘制Lineweaver-Burke图（x轴为底物浓度的倒数1/[S]，y轴为还原糖产生速率的倒数1/[V]），利用Origin 2019b软件计算重组酶的最大反应速率（Vmax）、米式常数（Km）和转化速率常数（Kcat）。
1.2.6 重组α-葡萄糖苷酶细胞毒性实验
复苏、传代培养NIH-3T3细胞后，用1%胰蛋白酶消化贴壁细胞，离心收集细胞。将NIH-3T3制备成细胞悬液，稀释后进行细胞计数得到细胞原液浓度。接种于96孔板，每孔接种100 μL，将96孔板置于37 ℃下培养24 h，除去旧培养基后加入等体积且含有不同浓度的重组淀粉酶Aga432、AT-2的新鲜培养基，以完全培养基作为对照。37 ℃恒温培养箱中继续孵育24 h后，替换为含有10% CCK-8试剂的DEME培养基，置于37 ℃培养箱中孵育40 min左右。当对照组OD450处于0.9~1.2之间时，测定450 nm下的吸光值。以对照组细胞存活率作为100%，计算实验组细胞存活率。
1.2.7 重组α-葡萄糖苷酶的生物膜分散作用
用NTA-0（pH7.4）配制浓度为10.0~50.0 μg/mL的重组淀粉酶Aga432、AT-2。取耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐药铜绿假单胞菌（CRPA）菌液进行细菌计数。在24孔板中分别接种1.0 mL/孔稀释后的MRSA和CRPA细菌悬液，置于37 ℃恒温培养箱培养48 h形成成熟生物膜。孵育后吸去上层液体，加入500 μL不同浓度的α-葡萄糖苷酶液，以加入NTA-0为空白对照组，共培养12 h。最后使用结晶紫（CV）测定法评估酶蛋白对生物膜的抑制作用[23]。
1.3 数据处理
每组实验进行三次重复，所有数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行分析和处理，数据结果以平均值标准差（SD）表示。进行统计学分析后，多组之间采用单因素方差分析方法，取*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为显著性。
2. 结果与分析
2.1 同源建模及分子对接分析
2.1.1 序列分析与同源建模
如图1所示，以Paenibacillus sp.基因组为模板设计特异性引物，扩增得到Aga432的序列全长为1629 bp，通过NCBI进行Nucleotide BLAST分析序列同源性，未比对到已公开表征的淀粉酶基因序列，说明Aga432为全新的淀粉酶基因序列，将Aga432基因序列全长上传至NCBI数据库命名为Aga432，获得登录号（GenBank：PQ411010）。琼脂糖核酸电泳结果显示，Aga432条带大小符合预期值。
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图 1 淀粉酶基因序列扩增注：泳道M：Marker， 1：Aga432。Figure 1. Amplification of α-amylase gene sequence通过Swiss-Model进行建模，获取Aga432相似蛋白模型4aie.1.A（PDB DOI: https://doi.org/10.2210/pdb4AIE/pdb）。图2（A）为Aga432的建模结构示意图，图2（B）为Aga432与pNPG进行分子对接的模型示意图。在Aga432活性口袋位点中心的氨基酸残基为：Lys4、Lys8、Leu304、Gln348与Asp468。在确定蛋白活性口袋位点的基础上，选择对接中心周围6Å范围内的氨基酸残基Q301、T302、W309、Y466和Y469这五个位点进行定向突变以实现扩大底物结合空间、增大活性中心疏水性的目的。其次，考虑到侧链基团的大小对活性位点与底物结合状态的重要性，P3和A308位点也被选择了进行相应的突变，同时还对酸碱性位点E2、E303、K305和G306进行了必要的突变以优化其功能。
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图 2 Aga432的分子结构注：（A）Aga432的模拟蛋白结构图；（B）Aga432与pNPG分子对接结果。Figure 2. Molecular structure of Aga4322.1.2 突变体的构建
如图3所示，通过全质粒扩增PCR获得8个突变基因：E2K、P3A、Q301V、T302G、K305D、G306D、A308P、Y469P，其余3个突变体未构建成功。
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图 3 pET28a-Aga432全质粒PCR扩增产物注：泳道M：Marker；泳道1：E2K；泳道2：P3A；泳道3：Q301V；泳道4：T302G；泳道5：K305D；泳道6：G306D；泳道7：A308P；泳道8：Y469P。Figure 3. pET28a-Aga432 full plasmid PCR amplification product2.1.3 Aga432和突变体的分离纯化及酶活力测定
SDS PAGE结果表明，重组蛋白经纯化后得到单一的蛋白条带，大小约为63 kDa，符合预测结果。纯化后，使用上述方法测重组酶Aga432及突变体的酶活力，Aga432的比活力为45.05 U/mg。以Aga432的酶活力为100%，对所得突变体进行酶活力测定（图5）。结果显示，突变体酶活均高于Aga432。其中，P3A的比活力为84.09 U/mg，比Aga432提高了1.87倍。后续重点研究突变酶活最高的P3A（命名为AT-2）。
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图 5 Aga432和各突变体酶活力检测和BSA标准曲线注：（A）酶活力；（B）BSA标准曲线。Figure 5. Aga432 and various mutant enzyme activity detection and BSA standard curve![]()
图 4 Aga432和各突变体SDS-PAGE注：（A）泳道M：Marker；泳道1：未纯化Aga432；泳道2：纯化Aga432；泳道3：未纯化E2K；泳道4：纯化E2K；泳道5：未纯化P3A；泳道6：纯化P3A；泳道7：未纯化Q301V；泳道8：纯化Q301V；泳道9：未纯化T302G；泳道10：纯化T302G；（B）泳道M：Marker；泳道1：未纯化K305D；泳道2：纯化K305D；泳道3：未纯化G306D；泳道4：纯化G306D；泳道5：未纯化A308P；泳道6：纯化A308P；泳道7：未纯化Y469P；泳道8：纯化Y469P。Figure 4. SDS-PAGE of Aga432 and various mutants2.2 Aga432和AT-2酶学性质分析
2.2.1 最适温度和热稳定性
温度对酶活性的影响表明（图6），Aga432与突变体AT-2在45 ℃时均表现出最高酶活力；热稳定性研究表明（图7），Aga432在35 ℃孵育3 h后，相对酶活性能够保持在60%左右，但在50 ℃处理1 h后基本丧失酶活；而突变体AT-2在50 ℃环境下孵育3 h还能保持50%以上的活性，属于中温酶，但整体稳定性高于Aga432。童星等[24]分别从Thermomonospora curvata与Bacillus licheniformis中获取了编码α-葡萄糖苷酶基因Tcur-1739、AmyS。Tcur-1739最适温度为50 ℃、耐热性一般，属于中温酶；AmyS最适温度为80 ℃、耐热性较强，属于嗜热酶。靳燕等[25]通过对嗜热杜邦菌来源的α-淀粉酶Td-amy进行分子改造，以提高其耐热性和产酶水平。结果表明，L194A突变体中，Arg的长侧链增加了空间位阻，干扰α-螺旋的正常排列和包装，从而破坏α-螺旋结构的稳定性和蛋白质的整体构象，导致突变体酶活显著下降[26]，而突变体A122V在底物结合区域引入了额外的疏水相互作用，这有助于稳定底物结合区的空间结构，有利于底物的结合，从而实现了酶活性和热稳定性的双重提升[27]。赵海燕等[28]在对Laceyella sp.来源的α-淀粉酶AmyL进行位点特异性突变研究中，发现当第361位的组氨酸（His）被酪氨酸（Tyr）所取代时，突变引入的Tyr361残基与Thr365残基之间的新氢键相互作用，使得该位点的氢键数量从4个增加到5个，蛋白质三维结构中关键区域的稳定性增强，从而提高了酶的热稳定性。
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图 7 Aga432和AT-2热稳定性Figure 7. Thermal stability of Aga432 and AT-2注：（A）Aga432；（B）AT-2。2.2.2 最适pH及pH稳定性
pH对酶活性的影响表明（图8A），Aga432最适pH为6，突变体AT-2在pH为5.5时表现出最高酶活力；pH稳定性研究表明（图8B），AT-2整体pH稳定性高于Aga432，在pH3.0~7.5环境下孵育4 h后，AT-2的剩余酶活仍能保持40%以上。由上述结果可知，与Aga432相比，突变体AT-2的耐酸性显著提高。Muhammad等[29]研究了一种来源于超嗜热古细菌Pyrobaculum calidifontis的α-葡萄糖苷酶，该酶在pH6.0、7.0、8.0缓冲液中，经过90 ℃高温处理7 h，仍可保持其活性的42%、54%、62%，显示出该酶具有优良的耐酸碱性和抗高温性能。Nielsen等[30]将α-葡萄糖苷酶Ba2的第290位的苯丙氨酸（Phe）替换为丙氨酸（Ala），由于苯丙氨酸（Phe）的侧链相较于丙氨酸（Ala）具有更大的体积和不同的电荷分布，因而这种结构上的变化可能影响了酶活性中心附近的静电相互作用，进而改变了酶的pH活性分布。
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图 8 Aga432和AT-2的最适pH和pH稳定性注：（A）最适pH；（B）pH稳定性。Figure 8. Optimal pH and pH stability of Aga432 and AT-22.2.3 动力学参数测定
表2为动力学参数分析结果，AT-2对pNPG的米氏常数Km值为5.13 μmol/mL，为Aga432的1.87倍，最大反应速率Vmax值为13.28 μmol/mL·min，为Aga432的3.19倍，催化常数Kcat值为130.98 s−1，为Aga432的2.33倍，AT-2的Kcat/Km值为25.53 mL/μmol·s，为Aga432的1.07倍。综合分析结果可知AT-2对pNPG底物的亲和力有一定的降低，但最大反应速率和催化中心的催化活力均有提高。
表 2 AT-2对pNPG的动力学参数和比活力Table 2. Kinetic parameters and specific activity of AT-2 for pNPG重组α-葡萄糖
苷酶Km
（μmol/mL）Vmax
（μmol/mL·min）Kcat
（s−1）Kcat/Km
（mL/μmol·s）比活力
（U/mg）Aga432 2.35 4.16 56.13 23.89 45.05 AT-2 5.13 13.28 130.98 25.53 84.09 2.3 Aga432和AT-2的细胞毒性研究
将不同浓度的Aga432、突变体AT-2与NIH-3T3细胞进行共孵育24 h，探究Aga432和AT-2的细胞毒性，结果如图9所示。通过CCK-8法检测不同浓度的AT-2对NIH-3T3细胞生长活力的影响，15.0~30.0 μg/mL的AT-2（图9B）与NIH-3T3细胞共孵育24 h后细胞存活率维持在80%以上；而在各浓度Aga432处理下，细胞孵育24 h后都能保持较高活性。结果表明，Aga432对NIH-3T3的生长无明显毒性，具有良好的细胞相容性；突变体AT-2对NIH-3T3细胞生长的抑制作用较为明显，但在较低浓度条件下影响不大。
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图 9 Aga432和AT-2对NIH-3T3细胞生长活力的影响Figure 9. Effect of Aga432 and AT-2 on growth viability of NIH-3T3 cells2.4 Aga432和AT-2对生物膜的分散作用
常见的几种生物膜抑制策略包括常规抗生物膜药物[31]、抗菌肽[32]、噬菌体[33]、纳米粒子[34]、植物化合物和精油[35]等。在多种抗生物膜策略中，酶蛋白处理显得尤为重要，它能够通过降解胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）来削弱生物膜的物理结构，从而使细菌暴露，并辅助机械清除生物膜。通过模式生物的高度表达，可以获得高浓度的生物膜分散酶，进而将其作为外源添加物引入微生物群体中，实现生物膜的有效分解。例如α-淀粉酶能够通过降解胞外聚合物中的多糖成分，有效降解细菌生物膜并使其分散。这些胞外酶使被生物膜包裹的细菌脱落，将它们转变至浮游状态，致使细菌对抗生素类药物或宿主免疫系统的敏感性提高[36]。研究表明，来自米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、人类唾液和甘薯的α-淀粉酶对金黄色葡萄球菌（S. aureus, SA）生物膜的形成具有强烈的抑制作用，同时也能够降解已经形成的S. aureus生物膜[37]。
将细菌MRSA的24孔板培养48 h后，使用结晶紫染色法测定不同浓度α-葡萄糖苷酶处理后残留的未分散生物膜量，结果如图10所示。与对照组相比，浓度为10.0~50.0 μg/mL时α-葡萄糖苷酶对MRSA生物膜的分散作用具有显著性（P<0.001）。相同浓度下，AT-2对MRSA生物膜的分散作用效果较好，Aga432的分散效果一般，且分散程度均随蛋白酶浓度的增加而增强。
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图 10 Aga432和AT-2对MRSA生物膜的分散作用注：*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001是基于对照组的ANOVA分析具有显著性差异；图11同。Figure 10. Dispersion of MRSA biofilms by Aga432 and AT-2如图11所示，与对照组相比，添加浓度为10.0~50.0 μg/mL的α-葡萄糖苷酶对CRPA生物膜具有显著的分散作用（P<0.001）。同浓度作用下，Aga432与AT-2的分散效果相差不大，整体效果与处理MRSA生物膜效果相似。Selvaraj Alagu Lakshmi等[38]发现来源于Streptomyces spp.的α-淀粉酶SGAmy对MRSA（85%，P<0.05）和CRPA（82%，P<0.05）具有抗菌作用。且两种细菌的EPS基质中总碳水化合物含量分别显著降低至71.75%（P<0.01）和74.09%（P<0.01）。
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图 11 Aga432和AT-2对CRPA生物膜的分散作用Figure 11. Dispersion of CRPA biofilms by Aga432 and AT-23. 结论
本研究从类芽孢杆菌Paenibacillus sp.中克隆出新型淀粉酶Aga432基因，通过同源建模和分子对接确定Aga432活性口袋的关键氨基酸，通过全质粒PCR扩增获得八个正向突变体，其中突变体AT-2比活力为84.09 U/mg，最适反应条件为45 ℃、pH5.5；与Aga432相比，AT-2的热稳定性有较大的提高，并且在酸性条件下较为稳定。相较于Aga432，突变体AT-2的Km值提高1.87倍，Vmax值提高3.19倍，Kcat值提高2.33倍，Kcat/Km值提高1.07倍。体外细胞实验表明，较低浓度的Aga432和AT-2具有良好的细胞相容性。生物膜清除实验表明，10.0~50.0 μg/mL浓度的Aga432和AT-2均能水解细菌胞外聚合物，对细菌生物膜表现出明显的清除作用。本研究为获得适合食品工业实际应用的α-葡萄糖苷酶以及其后续的定向改造研究提供了基础和参考依据。在未来研究中，可在单点突变基础上，对α-葡萄糖苷酶进行更深入的分子层面改造，以增强其在多样化应用场景中的适应性和效率。
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图 1 淀粉酶基因序列扩增
注：泳道M：Marker， 1：Aga432。
Figure 1. Amplification of α-amylase gene sequence
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图 2 Aga432的分子结构
注：（A）Aga432的模拟蛋白结构图；（B）Aga432与pNPG分子对接结果。
Figure 2. Molecular structure of Aga432
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图 3 pET28a-Aga432全质粒PCR扩增产物
注：泳道M：Marker；泳道1：E2K；泳道2：P3A；泳道3：Q301V；泳道4：T302G；泳道5：K305D；泳道6：G306D；泳道7：A308P；泳道8：Y469P。
Figure 3. pET28a-Aga432 full plasmid PCR amplification product
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图 5 Aga432和各突变体酶活力检测和BSA标准曲线
注：（A）酶活力；（B）BSA标准曲线。
Figure 5. Aga432 and various mutant enzyme activity detection and BSA standard curve
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图 4 Aga432和各突变体SDS-PAGE
注：（A）泳道M：Marker；泳道1：未纯化Aga432；泳道2：纯化Aga432；泳道3：未纯化E2K；泳道4：纯化E2K；泳道5：未纯化P3A；泳道6：纯化P3A；泳道7：未纯化Q301V；泳道8：纯化Q301V；泳道9：未纯化T302G；泳道10：纯化T302G；（B）泳道M：Marker；泳道1：未纯化K305D；泳道2：纯化K305D；泳道3：未纯化G306D；泳道4：纯化G306D；泳道5：未纯化A308P；泳道6：纯化A308P；泳道7：未纯化Y469P；泳道8：纯化Y469P。
Figure 4. SDS-PAGE of Aga432 and various mutants
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图 7 Aga432和AT-2热稳定性
Figure 7. Thermal stability of Aga432 and AT-2
注：（A）Aga432；（B）AT-2。
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图 8 Aga432和AT-2的最适pH和pH稳定性
注：（A）最适pH；（B）pH稳定性。
Figure 8. Optimal pH and pH stability of Aga432 and AT-2
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图 9 Aga432和AT-2对NIH-3T3细胞生长活力的影响
Figure 9. Effect of Aga432 and AT-2 on growth viability of NIH-3T3 cells
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图 10 Aga432和AT-2对MRSA生物膜的分散作用
注：*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001是基于对照组的ANOVA分析具有显著性差异；图11同。
Figure 10. Dispersion of MRSA biofilms by Aga432 and AT-2
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图 11 Aga432和AT-2对CRPA生物膜的分散作用
Figure 11. Dispersion of CRPA biofilms by Aga432 and AT-2
表 1 定点突变引物
Table 1 Primers for site-directed mutagenesis
引物 序列（5'→3'） 长度（bp） E2K f ATCCATGaaaCCGAAGCAATGGTGGAAAGAGA 32 E2K r GCTTCGGtttCATGGATCCGCGACCCATTTGC 32 P3A f CCATGGAAgcaAAGCAATGGTGGAAAGAGACGG 33 P3A r TTGCTTtgcTTCCATGGATCCGCGACCCATTT 32 Q301V f AAGTGGgtaACCGAGCTTAAAGGAGAGGCATG 32 Q301V r AGCTCGGTtacCCACTTGGACAGTACCGTTTTCA 34 T302G f TGGCAGggaGAGCTTAAAGGAGAGGCATGGAA 32 T302G r TTAAGCTCtccCTGCCACTTGGACAGTACCGTT 33 E303K f GTGGCAGACCaaaCTTAAAGGAGAGGCATGGAACAG 36 E303K r TAAGtttGGTCTGCCACTTGGACAGTACCGTT 32 K305D f ACCGAGCTTgacGGAGAGGCATGGAACAGTCTGT 34 K305D r TCTCCgtcAAGCTCGGTCTGCCACTTGGACAG 32 G306D f GCTTAAAgacGAGGCATGGAACAGTCTGTTCTG 33 G306D r ATGCCTCgtcTTTAAGCTCGGTCTGCCACTTG 32 A308P f AGGAGAGccaTGGAACAGTCTGTTCTGGAATAACC 35 A308P r TGTTCCAtggCTCTCCTTTAAGCTCGGTCTGC 32 W309L f AGAGGCActaAACAGTCTGTTCTGGAATAACCACG 35 W309L r GACTGTTtagTGCCTCTCCTTTAAGCTCGGTC 32 Y466P f CATTGTTccaGGCGATTATACATTGATTTTCCC 33 Y466P r AATCGCCtggAACAATGACTTCATAATCTTTTCTGAGC 38 Y469P f TGGCGATccaACATTGATTTTCCCGGAACATC 32 Y469P r TCAATGTtggATCGCCATAAACAATGACTTCATAA 35 注：小写部分为拟定点突变的碱基。 
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表 2 AT-2对pNPG的动力学参数和比活力
Table 2 Kinetic parameters and specific activity of AT-2 for pNPG
重组α-葡萄糖
苷酶Km
（μmol/mL）Vmax
（μmol/mL·min）Kcat
（s−1）Kcat/Km
（mL/μmol·s）比活力
（U/mg）Aga432 2.35 4.16 56.13 23.89 45.05 AT-2 5.13 13.28 130.98 25.53 84.09
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