Mechanism of Center-towards-Surface Enzymatic Hydrolysis Pattern for Sweet Potato Starch Induced by Annealing Treatment and a New Method for Porous Starch Preparation
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摘要: 以甘薯和马铃薯淀粉为原料，采用韧化及α-淀粉酶水解处理淀粉，测定不同处理淀粉的水解度、粒径分布、热力学性质、微观结构及结晶结构等性质，旨在探讨亚糊化温度下甘薯淀粉由内及外的酶水解模式的特点及其机理。结果表明，与天然甘薯淀粉由外及内的酶水解模式不同，韧化-酶水解联合处理后的甘薯淀粉酶水解模式变为由内及外。机理可能是：韧化处理使甘薯淀粉颗粒无定型区部分地溶胀，粒径增加（D50增加11.50 μm），表面出现很多孔洞和凹陷，这有利于酶分子进入淀粉颗粒内部开始酶水解，最终获得一个中空的壳层。韧化-酶水解联合处理提高甘薯淀粉相对结晶度至30.9%，糊化峰值温度升高至77.7 ℃，但未改变其A型结晶结构，α-淀粉酶主要作用在无定型区。然而马铃薯淀粉并未形成由内及外的酶水解模式，可能是因为马铃薯淀粉颗粒的B型结晶结构淀粉分子侧链长、淀粉颗粒结构稳定，α-淀粉酶对无定型区的作用弱。韧化-酶水解联合处理显著提高了甘薯淀粉的吸水、吸油能力，分别从2.01 g/g和3.05 g/g升高至3.61 g/g和3.81 g/g。这种韧化-酶水解联合处理方法有望成为食品工业制备多孔淀粉的新方法。Abstract: Sweet potato and potato starch (serving as a control) were employed as raw materials to explore the characteristics and mechanism of a Center-towards-Surface enzymatic hydrolysis pattern for sweet potato starch processed at sub-gelatinization temperatures. After modified by the combination treatment of annealing and α-amylase hydrolysis, the properties of the starch, such as hydrolysis degrees, particle size distributions, thermodynamic properties, microstructures, and crystalline structures, were determined. Results demonstrated that the enzymatic hydrolysis pattern of sweet potato starch after the combination treatment of annealing and hydrolysis was a Center-towards-Surface pattern, which differed from the Surface-toward-Center pattern of native starch. The proposed explanation is that the annealing treatment caused the partial swelling of the amorphous region of the sweet potato starch granules. This led to an increase in particle size (with D50 rising by 11.50 μm) and the formation of numerous pores and depressions on the surface. These alterations allowed the enzymes to penetrate into the granules’ interiors and trigger the hydrolysis, thereby resulting in the development of a hollow shell layer. The combination treatment increased the relative crystallinity of sweet potato starch to 30.9% and the gelatinization peak temperature to 77.7 ℃, without altering the A-type crystalline structure. The results implied that α-amylase was primarily active in the amorphous region. However, potato starch failed to exhibit an Center-towards-Surface pattern during enzymatic hydrolysis. This is likely attributed to the long side chains of the starch molecules within the B-type crystalline structure of potato starch granules, which construct a stable structure. And as a result, α-amylase has a limited impact on the amorphous zone. After the combination treatment, sweet potato starch’s water and oil absorption capacities rose considerably from 2.01 g/g and 3.05 g/g to 3.61 g/g and 3.81 g/g, respectively. This combination treatment of annealing and enzymatic hydrolysis is expected to be a novel approach for the production of porous starch in the food industry.
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淀粉是谷物、根茎类作物等很多植物都能生产的一种重要的碳水化合物，它廉价、安全、生物可降解，在食品工业或非食品工业中应用广泛。但天然淀粉比表面积小、孔隙小，在包封生物活性成分方面，不适合作为输运载体使用[1]。因此，很多人开始关注多孔淀粉的制备。多孔淀粉的比表面积大，整个淀粉颗粒有大量的微孔，吸附性能好[2]。多孔淀粉经济而又可降解，被广泛用作吸附剂和包封材料，用以保护食品、药品、化妆品中的精油（essential oil）、岩藻黄素（fucoxanthin）、叶黄素（lutein）等敏感成分[2−3]。
多孔淀粉的制备有物理法、化学法、生物法，使用α-淀粉酶控制淀粉水解过程的生物法是一种有效的制备方法[4]。然而，天然淀粉呈颗粒结构，使用酶直接水解比较困难[1]。为提高淀粉的酶水解效率及多孔淀粉的产率，通常在酶水解前先对淀粉进行预处理，如冻融处理、高静压处理、湿热处理等[4−5]。Uthumporn等[6]报道，酶水解前对天然淀粉进行50 ℃、30 min的热处理，酶水解后的葡萄糖当量明显提高；Zhao等[1]处理普通玉米淀粉时发现，与单一的冻融处理，或与单一的酶水解处理相比，冻融-酶水解联合处理能在玉米淀粉表面形成更多的孔洞，从而提高淀粉对水或油的吸附能力；Xie等[5]发现，重复湿热-酶水解联合处理能在天然小麦淀粉表面形成更多的孔洞，使小麦淀粉的糊化温度和结晶度更高，糊化焓更低。
通常，酶会侵蚀淀粉颗粒的整个表面，或者从表面的某一点开始，逐渐向淀粉颗粒内部侵蚀[7]，表现为由外及内的酶水解模式。Uthumporn等[8]发现，α-淀粉酶会在淀粉颗粒表面形成单一深孔；Das等[9]认为酶只能侵蚀淀粉颗粒表面，从而形成更小的淀粉颗粒；Kong等[10]发现热处理能增加淀粉颗粒表面凹陷和孔洞的数量及尺寸，这有利于吸附酶并加速酶的渗透。本团队之前的研究发现，韧化处理能在淀粉颗粒表面形成很多小孔和裂缝，这可能会增加淀粉颗粒吸附酶的位点[11]。因此本研究提出一个假设：酶可以穿过淀粉颗粒表面的孔洞，进入淀粉颗粒内部并从内部开始侵蚀，从而形成由内及外的酶水解模式。
对多孔淀粉的制备，人们较多地关注酶的不同种类或淀粉的不同来源等[12]，很少关注或并未涉及淀粉颗粒这种由内及外的酶水解模式。本文对比分析了韧化处理对甘薯和马铃薯淀粉水解度的影响，使用扫描电镜、X射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪、差示扫描量热仪、动态光散射仪，观测并分析水解过程中淀粉颗粒的形态变化、结晶结构、热力学性质、粒径尺寸分布，以及所制备多孔淀粉的吸油吸水性，揭示韧化-酶水解联合处理甘薯淀粉这种由内及外酶水解模式的内在机制，有望提供一种高吸油吸水性多孔淀粉的制备新方法。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
甘薯淀粉（sweet potato starch，SPS） 直链淀粉质量分数22.12%，水分含量6.53%，购于山东金城股份有限公司；马铃薯淀粉（potato starch，PS） 直链淀粉质量分数26.08%，水分含量10.31%，购于甘肃丰收农业科技有限公司；α-淀粉酶 1.3×104 U/g，购于北京索莱宝科技有限公司；马铃薯直链淀粉 购于上海源叶生物科技有限公司；所有化学试剂均为分析纯。
UV-2000紫外-可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；DSC-1型差示扫描量热仪 瑞士Mettler-Toledo公司；S-3400扫描电镜（SEM） 日本Hitachi公司；S3500激光粒径分析仪（laser particle-size analyzer） 美国Microtrac公司；KQ-500TDE超声处理器 昆山市超声仪器有限公司；D8-ADVANCE X射线衍射仪 德国Bruker AXS公司；iS10型傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermal Fisher Nicolet公司，配OMNIC软件 美国Thermo Nicolet公司。
1.2 实验方法
1.2.1 韧化淀粉制备
根据王雨生等[13]的方法并稍作修改，制备韧化淀粉。淀粉与水按质量比1:4制备淀粉悬浮液，添加适量甲苯作为防腐剂，于一定温度的水浴环境中加热。水浴温度低于淀粉糊化温度5 ℃，即甘薯淀粉的水浴温度为59 ℃，马铃薯淀粉的水浴温度为53 ℃。加热48 h后取悬浮液，离心并弃上清，用无水乙醇清洗沉淀2次，室温干燥并过100目筛，筛下物分别标记为韧化甘薯淀粉（annealed sweet potato starch，ASPS）和韧化马铃薯淀粉（annealed potato starch，APS）。
1.2.2 酶水解淀粉制备
根据Zhao等[1]的方法并稍作修改，制备酶水解淀粉。取25 g淀粉样品，按每1 g淀粉添加100 U的比例添加α-淀粉酶，并分散于125 mL磷酸缓冲液（pH6.0）中，置于水浴环境中水解反应12 h，其中水浴温度根据1.2节方法设置。在反应液中加入2倍体积的无水乙醇灭酶，取悬浮液，10000 r/min离心10 min，所得沉淀用2倍体积的无水乙醇清洗3次后，室温晾干，过100目筛，筛下物分别标记为酶水解甘薯淀粉（enzymatically hydrolyzed sweet potato starch，ESPS）、酶水解马铃薯淀粉（enzymatically hydrolyzed potato starch，EPS）、韧化-酶水解甘薯淀粉（annealed and enzymatically hydrolyzed sweet potato starch，AESPS）和韧化-酶水解马铃薯淀粉（annealed and enzymatically hydrolyzed potato starch，AEPS）。
1.2.3 水解度测定
根据Chen等[14]的方法，使用3,5-二硝基水杨酸测定葡萄糖当量。在水解反应开始的24 h内，间隔一定时间分别从反应液中取1 mL样品，加入9 mL无水乙醇灭酶，离心并取1 mL上清液，与2 mL 3,5-二硝基水杨酸混合于试管中，沸水浴加热5 min后冷却至室温，再加入12 mL蒸馏水并涡旋1 min。使用紫外-可见光分光光度计在波长540 nm处测吸光度，并根据绘制的葡萄糖标准曲线，计算葡萄糖当量。葡萄糖当量定义为葡萄糖与淀粉基质的质量比，用以及时反映淀粉水解度程度。以未加淀粉样品的处理为对照。
1.2.4 差示扫描量热试验
根据Zhang等[11]的方法，使用DSC-1型差示扫描量热仪测定淀粉样品的热力学性质。取3 mg淀粉样品（干基）和9 μL蒸馏水于铝坩埚中，密封并于室温下平衡12 h。以密封的空铝坩埚为参比，用氮气保护，加热温度以10 ℃/min的升温速率从25 ℃升至120 ℃，使用STARe Evaluation软件记录糊化参数，包括糊化起始温度（onset temperature，To）、峰值温度（peak temperature，Tp）、终止温度（conclusion temperature，Tc）。糊化转变温度定义为Tc−To，糊化焓（gelatinization enthalpy，ΔH，J/g）用吸热峰面积表示。
1.2.5 扫描电镜观察
先对淀粉样品进行溅射喷金，并用双面碳胶带固定，设置加速电压10 kV，放大倍数1000，使用扫描电镜观察淀粉样品的微观表面形貌。
1.2.6 粒径分布测试
以蒸馏水为分散剂，使用激光粒径分析仪在25 ℃测定淀粉样品的粒径分布情况。测试前，样品先使用超声处理器处理1 min。样品和分散剂的折射率分别为1.53和1.33，样品粒径使用D10、D50、D90、MV、MA（分别对应粒度累积分布达到10%、50%、90%时的粒径及体积平均径、表面积平均径）来描述。
1.2.7 X射线衍射测试
使用X射线衍射仪进行测试，2θ扫描范围为4°～40°，扫描速度为0.1（°）/s，加速电压为40 kV，电流为40 mA。根据Shang等[15]的方法，使用Jade 6.0软件，计算相对结晶度（relative crystallinity，RC），记为测试曲线下结晶区面积与总面积之比。
1.2.8 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR）分析
淀粉样品与KBr按质量比1:100混匀、压片，放在iS10型傅里叶变换红外光谱仪（Thermal Fisher Nicolet Co. Ltd., USA）中，设置扫描波数范围为4000～650 cm−1，扫描分辨率为4 cm−1，扫描64次。使用OMNIC软件计算波数1047 cm‒1和1022 cm‒1处吸光度之比R1047/1022。
1.2.9 直链淀粉含量测定
根据Shariffa等[16]的方法并稍作修改，测定淀粉样品的直链淀粉含量。以纯马铃薯直链淀粉、支链淀粉为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中直链淀粉含量。具体步骤如下：准确称取0.1 g（干基）淀粉溶于二甲基亚砜溶液中，85 ℃搅拌30 min，然后用去离子水定容至25 mL；取1 mL该溶液，用50 mL去离子水稀释后，加入5 mL鲁氏碘液（碘2.5 mmol/L，碘化钾6.5 mmol/L）混匀，黑暗中静置15 min后，使用紫外-可见光分光光度计测量波长600 nm处吸光值。
1.2.10 油、水吸附能力测定
根据Benavent-Gil等[12]的方法并稍作修改，测定淀粉样品对水和大豆油的吸附能力。室温下，称取淀粉样品0.1 g，与1 mL水或大豆油混合30 min，于3 500 r/min离心机中离心10 min，使用滤纸过滤沉淀，至没有水或大豆油透过滤纸时，测量湿沉淀质量。吸附能力记为湿沉淀质量与淀粉样品质量之比。
1.3 数据处理
所有试验重复至少3次，数据表示为平均值±标准差的形式。使用SPSS v17.0软件进行邓肯多重方差分析（ANOVA），显著性检验水平为5%，用P<0.05表示差异显著。
2. 结果与讨论
2.1 韧化处理对淀粉水解度的影响
葡萄糖当量可以及时反映淀粉水解过程中的水解程度[8]。天然甘薯淀粉、天然马铃薯淀粉及它们的韧化处理淀粉酶水解曲线如图1所示。酶水解12 h时，韧化甘薯淀粉和韧化马铃薯淀粉，葡萄糖当量已经分别达到23%和12%；酶水解24 h时，4种淀粉相比较，葡萄糖当量最高的是韧化甘薯淀粉（24%），其次是天然甘薯淀粉（18%），然后是韧化马铃薯淀粉（13%）、天然马铃薯淀粉（9%）。显然，酶水解前先对淀粉进行韧化处理，可以显著提高葡萄糖当量。Das等[9]发现，淀粉在酶水解的前8 h内，葡萄糖当量迅速上升，之后变得缓慢，酶水解12 h后，葡萄糖当量基本保持恒定。Kong等[10]发现，50～65 ℃的预热处理可以显著增强α-淀粉酶对玉米淀粉的水解性能。Shariffa等[16]得出，木薯淀粉和甘薯淀粉经韧化处理后，葡萄糖当量显著升高。这可能是因为预热处理改变了淀粉颗粒的内部结构，从而使淀粉颗粒更易于接受酶的作用[10]。Shariffa等[16]还指出，韧化处理能破坏淀粉分子间的氢键，从而弱化淀粉颗粒的结构，导致淀粉颗粒膨胀。而马铃薯淀粉含有大量的双螺旋链结构，这使马铃薯淀粉在酶水解时表现出比甘薯淀粉更强的抵抗作用[6]。
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图 1 韧化前和韧化后的甘薯淀粉、马铃薯淀粉酶水解曲线Figure 1. Hydrolysis profiles of sweet potato starch and potato starch before and after annealing treatment2.2 韧化和酶水解处理对淀粉热力学性质的影响
淀粉糊化温度的改变意味着淀粉颗粒结晶结构发生了变化[11,17]，通常，淀粉颗粒的结晶度越高，糊化温度就越高[5]。糊化焓（ΔH）可以用来描述破坏淀粉双螺旋结构所需要的能量[17]。经过不同处理的甘薯淀粉、马铃薯淀粉的热力学性质参数如表1所示。韧化处理使甘薯淀粉的3个糊化温度参数To、Tp、Tc分别升高了9.1、5.2、3.0 ℃，糊化温度范围（Tc‒To）减少了6.2 ℃；类似地，韧化处理使马铃薯淀粉的To、Tp、Tc分别升高10.1、7.0和3.0 ℃，糊化温度范围减少了7.1 ℃。与相应的天然淀粉相比，韧化处理后的甘薯淀粉和马铃薯淀粉糊化焓分别升高了0.90 J/g和0.86 J/g。这些结果说明，韧化处理增强了淀粉颗粒内部结晶结构的稳定性[18−19]。这与已报道的韧化处理马铃薯淀粉[20]、韧化处理高粱淀粉[18]、韧化处理大麦淀粉[21]的变化一致。韧化处理引起To、Tp、Tc的升高，可能是因为淀粉在韧化过程中形成了新的双螺旋结构，或者韧化促进了支链淀粉的螺旋堆积[18,21]；Tc–To的减少可能是因为韧化处理优化了结晶结构，使淀粉结晶更均一[11]；糊化焓的升高则可能与韧化处理提高了淀粉双螺旋结构的有序度或结晶结构含量有关[21]。
表 1 不同处理后淀粉的热力学性质参数Table 1. Thermal parameters of starch samples after different treatment淀粉样品 To（℃） Tp（℃） Tc（℃） ΔH（J/g） Tc‒To（℃） SPS 64.51±0.04a 70.60±0.02a 76.08±0.45a 11.01±0.89a 11.57±0.41c ASPS 73.62±0.37c 75.80±0.37c 79.04±0.44b 11.91±0.15ab 5.42±0.07a ESPS 67.13±0.04b 72.02±0.01b 78.56±0.15b 12.95±0.21b 11.43±0.19c AESPS 74.24±0.00c 77.69±0.01d 81.25±0.04c 13.07±0.55b 7.01±0.04b PS 58.28±0.18b 64.40±0.46b 73.86±0.79b 16.39±0.41ab 15.58±0.61b APS 68.39±0.27c 71.44±0.10c 76.86±0.30c 17.25±0.71b 8.47±0.29a EPS 56.24±0.09a 61.83±0.37a 71.22±1.30a 14.97±0.64a 14.98±1.20b AEPS 57.63±0.07b 63.99±0.11b 72.64±0.22ab 15.53±0.23a 15.01±0.30b 注：不同小写字母表示同一淀粉不同处理间存在显著性差异（P<0.05）。 天然甘薯淀粉经酶水解处理后，To、Tp、Tc和ΔH略有升高，分别升高了2.6、1.4、2.5 ℃和1.94 J/g，这与酶水解处理能提高玉米淀粉[1]或木薯淀粉[22]的To、Tp和ΔH这一结果一致。这是因为酶水解处理能使淀粉中的无定型区减少，则结晶区相对更多，从而使淀粉的糊化温度、糊化焓更高[22]。然而对于马铃薯淀粉来说，酶水解处理对热力学性质的影响结果与此不同：天然马铃薯淀粉经酶水解处理后，To、Tp、Tc和ΔH分别降低了2.0、2.6、2.6 ℃和1.42 J/g。Jiang等[23]也发现，山药淀粉经酶水解处理后To、Tp、Tc和ΔH均降低。ΔH的降低与淀粉结晶结构、双螺旋结构被水解有关[24]，即马铃薯淀粉的结晶结构更容易被酶水解。另外，无论是甘薯淀粉还是马铃薯淀粉，经酶水解处理后，两者的Tc‒To均略有降低，O’Brien等[24]也曾发现，对大部分淀粉来说，酶水解处理并不改变Tc‒To或者略微降低Tc‒To。
与韧化处理、酶水解处理相比，甘薯淀粉经韧化-酶水解联合处理后，To、Tp、Tc和ΔH均升至最高，分别为74.2、77.7、81.3 ℃和13.07 J/g。这说明韧化和酶水解联合处理对甘薯淀粉热力学性质的影响具有协同效应，这也说明α-淀粉酶主要作用在甘薯淀粉颗粒的无定型区，从而提高了淀粉的结晶度[1]。Shariffa等[16]和O’Brien等[24]也发现，木薯淀粉、玉米淀粉经韧化-酶水解联合处理后，糊化温度和糊化焓均升至最高。但对不同处理的马铃薯淀粉来说，To、Tp、Tc和ΔH最高的均是韧化处理，其次是韧化-酶水解联合处理，以及酶水解处理。这与Jacobs等[25]的结论一致，他们也发现马铃薯淀粉经单一的韧化处理，糊化温度和糊化焓最高。
热力学性质说明，对甘薯淀粉来说，韧化处理、酶水解处理以及韧化-酶水解联合处理均能延缓淀粉的糊化，改善淀粉的有序结构，强化淀粉分子间的相互作用，其中韧化-酶水解联合处理对甘薯淀粉热力学性质的影响最大，α-淀粉酶主要作用在甘薯淀粉颗粒的无定型区。但对马铃薯淀粉热力学性质影响最大的是韧化处理，α-淀粉酶对马铃薯淀粉双螺旋结晶结构的水解作用明显。
2.3 韧化和酶水解处理对淀粉微观结构的影响
扫描电镜可以观察淀粉颗粒的表面结构性质[17]。天然甘薯淀粉及经韧化和酶水解处理淀粉的表面结构如图2所示。天然甘薯淀粉呈圆形或多边形，也有一些表面光滑、尺寸不一的断面（图2A）。这与以往研究结果一致[26]。韧化处理后，甘薯淀粉颗粒形状、表面形态发生变化，淀粉颗粒的完整性被破坏，表面出现一些孔隙（图2B）。这与Rocha等[27]和Liu等[18]的研究结果一致，他们发现，韧化处理后的蜡质玉米淀粉、苦荞麦淀粉、高粱淀粉的颗粒表面孔隙增多。这可能是韧化处理过程中内源性淀粉酶作用的结果[27]，也可能是因为韧化处理导致直链淀粉渗漏，留下了一些孔隙[26]。Das等[28]在55、60 ℃韧化处理木薯淀粉时也发现淀粉颗粒表面被侵蚀，Shariffa等[29]认为，一些块茎类植物的淀粉颗粒经过热处理后，表面形成的特殊的凹陷区域是内源性酶对淀粉颗粒薄弱区域侵蚀的结果。
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图 2 不同处理甘薯淀粉的扫描电镜照片注：A. SPS(1000×)；B. ASPS(1000×)；C. ESPS(1000×)；D. AESPS(1000×)；E. AESPS(2000×)。Figure 2. Scanning electron micrographs of sweet potato starch with different treatment酶水解处理对甘薯淀粉颗粒表面结构影响显著（图2C），在淀粉颗粒表面形成很多孔隙，尤其是在一些粒径较小的淀粉颗粒上。之前的研究也发现过类似现象：酶的侵蚀在淀粉颗粒表面形成很深的洞，但也有些淀粉颗粒表面依然光滑，或者只形成一些小凹陷[16,22]。这可能是α-淀粉酶对淀粉颗粒局部的多次攻击造成的[24]。而一些粒径较大的淀粉颗粒似乎并未受到攻击，Kong等[10]也发现了类似的不均一酶水解现象，他们提出α-淀粉酶更倾向于攻击粒径较小的淀粉颗粒，而粒径较大的淀粉颗粒几乎未被攻击。这可能是因为粒径较小的淀粉颗粒呈现出更多的酶吸附位点[10]，对酶的吸附能力更强[30]。
韧化-酶水解联合处理在甘薯淀粉颗粒表面形成了大量针状孔，与单一酶水解处理相比，这些针状孔更小、更密。同时，韧化-酶水解联合处理破坏了淀粉颗粒的完整性，形成一些空心的颗粒物（图2D、E）。这正如Rocha等[27]、Jacobs等[25]和Shariffa等[16]所报道的那样：韧化处理使淀粉更易于被α-淀粉酶攻击。这可能是因为韧化处理过程中，内源酶在淀粉颗粒表面形成孔隙，这些孔隙的存在使外源酶更易于接近、接触淀粉颗粒的无定型区[10]。韧化-酶水解联合处理留下的中空颗粒物，可能是因为韧化后的甘薯淀粉面对α-淀粉酶的攻击，淀粉颗粒内部无定型区域结构较松散、侵蚀较快，而表面较为致密、侵蚀较慢[24]。
由图3A可知，天然马铃薯淀粉颗粒呈球形或椭球形，不规则的淀粉颗粒很少，这与之前Jiranuntakul等[31]的研究结果一致。韧化处理对马铃薯淀粉颗粒的影响轻微（图3B）。Ji等[32]发现韧化处理并未改变蜡质大米淀粉纳米颗粒的形状。比较扫描电镜照片可以发现，酶的作用可以在天然甘薯淀粉表面形成大量孔隙，但在天然马铃薯淀粉颗粒表面未形成明显的孔隙（图2C、图3C）。这一结果与Jacobs等[25]和Karim等[30]的研究结果一致，他们发现马铃薯淀粉和绿豆淀粉能抵抗酶的水解作用。这种抗酶水解能力可能是因为马铃薯淀粉颗粒表面存在大块聚集[24]，淀粉颗粒粒径大、比表面积小[25]。相比之下，韧化处理过的马铃薯淀粉则更容易被酶攻击，形成很多随机分布的凹陷（图3D）。Jane[33]也有类似的研究结果，这可能与马铃薯淀粉的B型结晶结构有关。
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图 3 不同处理马铃薯淀粉的扫描电镜照片注：A：PS(1000×)；B：APS(1000×)；C：EPS(1000×)；D：AEPS(1000×)。Figure 3. Scanning electron micrographs of potato starch with different treatment由此可见，与相应的天然淀粉相比，韧化处理增强了酶对甘薯淀粉和马铃薯淀粉颗粒的表面攻击。
2.4 韧化和酶水解处理对淀粉颗粒粒径分布的影响
不同处理后淀粉颗粒的粒径分布情况如表2所示。天然甘薯淀粉和天然马铃薯淀粉的D50分别为15.48、29.18 μm，这与两者的粒径分别在5～25 μm之间[34]、2～76 μm之间[9]的研究结果一致。韧化处理后，两者的粒径均增大，D50分别增加11.50、8.03 μm。Zanella Pinto等[17]也发现，进行50 ℃的热处理可以显著增加蚕豆淀粉颗粒的粒径。这可能是因为热处理过程中，水分渗透进入淀粉颗粒的无定型区，引起淀粉颗粒膨胀[6]。
表 2 不同处理淀粉样品的粒径参数（μm）Table 2. Particle size parameters of starch samples after different treatment(μm)淀粉样品 D10 D50 D90 MV MA SPS 10.73±0.04b 15.48±0.11a 22.59±1.23a 16.01±0.12a 14.95±0.31b ASPS 13.39±0.01c 26.98±0.12b 66.36±1.15d 36.16±1.03c 23.76±0.07c ESPS 7.59±0.26a 12.68±0.35a 19.86±0.70a 13.41±0.47a 10.58±0.47a AESPS 10.22±0.02b 14.74±0.01a 21.76±0.11a 15.57±0.02a 14.11±0.01b PS 14.08±0.23c 29.18±1.13b 47.59±3.84b 30.55±1.87b 24.04±0.80c APS 20.59±2.24d 37.21±2.75d 56.63±3.31c 41.14±2.33d 31.88±2.78e EPS 20.55±1.45d 32.16±3.40c 47.70±5.76b 33.44±3.62b 29.79±2.77ed AEPS 19.71±0.07d 30.35±0.42bc 45.36±1.30b 31.71±0.62b 28.37±0.36d 注：同列数据不同小写字母表示数据间存在显著性差异（P＜0.05）；D10、D50、D90分别对应粒度累积分布达到10%、50%、90%时的粒径；MV、MA分别为体积平均径、表面积平均径。 酶水解处理则显著降低了天然甘薯淀粉和韧化甘薯淀粉颗粒粒径，这与普通玉米淀粉的酶水解结果一致[1]。Uthumporn等[6]也发现，热处理后的淀粉再经酶水解处理，平均粒径减小。粒径减小可能是因为酶对淀粉颗粒无定型区进行了充分水解[35]，图2扫描电镜照片中的多孔结构也可以证明这一点。粒径的减小会使淀粉颗粒具有更大的比表面积，这会提高淀粉颗粒对水、油的吸附能力。与甘薯淀粉相反，酶水解后天然马铃薯淀粉的D10和D50分别从14.08、29.18 μm升高至20.55、32.16 μm，而D90没有明显变化。这说明，酶水解处理使马铃薯淀粉中粒径较小的颗粒数量减少，即粒径较大的颗粒数量增多。这可能是因为酶水解过程中马铃薯淀粉颗粒部分糊化，受损颗粒相互粘连、粒径增大[7]。然而，韧化-酶水解联合处理可以降低韧化马铃薯淀粉或酶水解马铃薯淀粉的中值粒径，这可能是因为韧化后再进行酶水解处理，淀粉颗粒的结晶区及外部区域也会逐渐被水解[4]。
2.5 韧化和酶水解处理淀粉的X射线衍射图谱分析
X射线衍射图谱可以反映淀粉颗粒长程有序结晶情况及相对结晶度[11]。一般情况下，改性会引起淀粉颗粒结晶结构的变化[36]。图4是经过不同处理后的甘薯淀粉和马铃薯淀粉颗粒的X射线衍射图谱，可以进一步说明韧化处理和酶水解处理对淀粉结构的影响。
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图 4 经不同处理后的甘薯淀粉（A）和马铃薯淀粉（B）颗粒X射线衍射谱图Figure 4. X-ray diffraction spectra of sweet potato starch (A) and potato starch (B) after different treatment韧化、酶水解、韧化-酶水解联合处理均没有改变甘薯淀粉的A型结晶结构，在2θ为15.2°、17.5°、18.2°、23.4°处有强衍射峰。de Oliveira等[34]发现甘薯淀粉呈A型结晶结构；Zhang等[26]发现韧化处理并不改变甘薯淀粉、木薯淀粉的结晶结构；Shariffa等[16]和Zhao等[1]认为，单一酶水解处理不改变木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉的结晶结构。这可能是因为A型结晶结构淀粉颗粒的双螺旋结晶结构在这些处理中并未发生变化[1]。
天然马铃薯淀粉在2θ为5.6°、15.5°、17.3°、22.7°、24.4°处有衍射峰，为典型的B型多晶结构，这与以往的研究结果一致[35]。韧化处理并未改变马铃薯淀粉的这种B型结晶结构[37]，Xu等[20]和Xu等[38]同样发现，无论是经过重复韧化处理，还是经过连续韧化处理，马铃薯淀粉的多晶结构均与天然马铃薯淀粉相似。但若经过酶水解处理，或者经过韧化-酶水解联合处理，2θ为5.6°、15°处的弱衍射峰消失，22°、24°处的双峰变成23°处的单峰，17°处的衍射峰强度也明显降低。这与之前的研究结果一致[34]。Xu等[38]认为，正是酶水解处理或者韧化-酶水解联合处理，使马铃薯淀粉B型结晶双螺旋结构松散、结晶结构削弱。
韧化处理后，天然甘薯淀粉和天然马铃薯淀粉的相对结晶度分别从26.5%和29.7%显著地升高至29.1%和31.1%。Cahyana等[39]和Liu等[18]在韧化处理香蕉淀粉、红小豆淀粉、苦荞麦粉时也发现相对结晶度会升高。这可能是因为韧化处理促使淀粉分子链间相互作用，形成了新的结晶[37]，提高了结晶的完美程度[20−21,26]。另外一个合理的解释是韧化处理促使淀粉颗粒内部无定型区迁移，因此结晶区进一步重组[18]。
酶水解处理使天然甘薯淀粉的相对结晶度从26.5%升高至30.9%。Chen等[22]也发现酶水解处理后淀粉颗粒衍射峰强度升高。这可能是因为酶水解时，酶对无定型区的水解先于对结晶区的水解[9,23]。然而，天然马铃薯淀粉经酶水解处理后，相对结晶度略微降低了0.8%。这与热力学性质的结果一致：酶水解削弱了马铃薯淀粉的结晶结构。Xie等[5]发现小麦淀粉酶水解后相对结晶度也降低。这可能是因为与A型结晶结构相比，B型结晶结构的淀粉分子侧链更长，可以更好地稳定淀粉颗粒的结构[40−41]，因此酶对无定型区的作用相对较弱。
韧化-酶水解联合处理后的甘薯淀粉，其相对结晶度要比单一韧化或单一酶水解处理的甘薯淀粉更高。Xie等[5]报道，与单一湿热处理小麦淀粉相比，湿热-酶水解联合处理可以进一步提高小麦淀粉的相对结晶度；Shariffa等[16]也发现，韧化处理后再进行酶水解处理木薯淀粉，可以提高淀粉的相对结晶度。这可能是因为热处理使淀粉颗粒结晶重组，从而提高了酶与淀粉无定型区接近的可能性[7]。而对于马铃薯淀粉来说，相对结晶度最高的是经过韧化处理的，其次是经过韧化-酶水解联合处理的，最后是经过酶水解处理的。这些结果说明，在提高淀粉相对结晶度方面，韧化处理可能起主要作用。
2.6 韧化和酶水解处理淀粉的傅里叶变换红外光谱分析
傅里叶变换红外光谱仪能敏感地探测到淀粉多聚物颗粒表层的结构秩序或分子链短程排布情况的变化[26]。不同处理的甘薯淀粉、马铃薯淀粉，在波数4000～650 cm−1范围内的傅里叶变换红外光谱及R1047/1022如图5所示。其中波数3600～3100 cm−1范围内的峰是由O–H拉伸振动引起的，包括自由羟基以及分子间、分子内结合的羟基[9,23]；波数2935～2920 cm−1范围内的峰由–CH2拉伸振动引起，这与环甲烷氢键有关[9]；波数995 cm−1处的峰由‒OH弯曲振动引起，与分子内C‒6位的结合羟基有关[42]；波数1159～930 cm−1范围内的峰与C–O键的拉伸有关[23]；另外，波数1159 cm−1和1081 cm−1处的峰与淀粉的有序结构有关，而波数1021 cm−1处的峰与淀粉的无定型结构有关[32]。甘薯淀粉、马铃薯淀粉经由不同处理后，上述光谱峰的位置与相应天然淀粉相似，只是峰强度有轻微变化。这说明在韧化、酶水解以及韧化-酶水解联合处理过程中，没有化学键或功能团的生成或消失，Zhang等[26]在韧化天然甘薯淀粉、Xu等[20]在韧化赤红豆淀粉时也有类似发现。
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图 5 不同处理后甘薯淀粉（A）和马铃薯淀粉（B）的FT-IR图谱Figure 5. FT-IR spectra of sweet potato starch (A) and potato starch (B) after different treatmentR1047/1022通常可以用来衡量淀粉中短程有序结晶结构的含量。甘薯淀粉和马铃薯淀粉经韧化处理后，R1047/1022均升高，说明韧化处理增强了淀粉颗粒的短程有序结构。这与图4相对结晶度升高结论一致。Zhang等[26]也发现，韧化处理后，甘薯淀粉的R1047/1022升高。这与韧化处理能够强化或完善淀粉颗粒结晶结构有关[9]。
对于甘薯淀粉来说，经韧化-酶水解联合处理的R1047/1022要比单一酶水解处理高。Zhao等[1]发现，酶水解玉米淀粉的R1047/1022要比原淀粉的高。这可能是因为与结晶区相比，淀粉颗粒的无定型区更容易被酶侵蚀[22]，而韧化处理提高了酶与淀粉无定型区接近的可能性[7]。对于马铃薯淀粉来说，经韧化-酶水解联合处理的R1047/1022要比单一韧化处理低，说明酶水解破坏了马铃薯淀粉颗粒的短程有序结晶结构。
2.7 韧化和酶水解处理对直链淀粉含量及淀粉吸油吸水性能的影响
不同处理的甘薯淀粉、马铃薯淀粉的直链淀粉含量如表3所示。对于甘薯淀粉来说，与酶水解处理相比，韧化-酶水解联合处理后，直链淀粉含量更高。直链淀粉含量的升高与α-淀粉酶对淀粉分子α-1,4键的水解有关[24]。Manelius等[43]研究发现，淀粉颗粒的无定型区更容易被酶水解，释放出直链淀粉分子，从而引起直链淀粉含量的升高。然而对于马铃薯淀粉来说，韧化-酶水解联合处理与酶水解处理两者对直链淀粉含量的影响没有明显区别，这与扫描电镜观察到的结果（图3D）相对应。Uthumporn等[6]在研究西米淀粉、绿豆淀粉时，也得到韧化处理对直链淀粉含量没有显著影响的结果。酶水解处理对马铃薯淀粉直链淀粉含量的影响较小，可能是因为马铃薯淀粉B型结晶结构形成的保护层，可以延缓酶水解对淀粉无定型区的作用[8]，这与相对结晶度的结果一致。
表 3 不同处理淀粉样品的吸油吸水性能及其直链淀粉含量Table 3. Amylose content and water or oil adsorption capacities of native and treated starches淀粉
样品吸水能力
（g/g）吸油能力
（g/g）直链淀粉
质量分数（%）SPS 2.01±0.01a 3.05±0.13a 21.12±0.33a ASPS 2.35±0.32ab 3.10±0.19a 24.68±0.57b ESPS 3.12±0.02d 3.25±0.32a 25.46±0.35c AESPS 3.61±0.09e 3.81±0.42a 25.84±0.34c PS 2.00±0.15a 2.95±0.71a 25.98±0.15c APS 2.57±0.19b 3.07±0.18a 25.96±0.04c EPS 2.62±0.07bc 3.10±0.42a 25.83±0.32c AEPS 2.96±0.09cd 3.15±0.18a 25.85±0.14c 注：同列数据不同小写字母表示数据间存在显著差异（P < 0.05）。 不同处理的甘薯淀粉、马铃薯淀粉对水和油的吸附情况如表3所示。与相应的天然淀粉相比，不同处理后的淀粉对水和油的吸附能力均升高，其中天然甘薯淀粉经韧化-酶水解联合处理后，对水和油的吸附能力分别从开始的2.01 g/g和3.05 g/g升高至3.61 g/g和3.81 g/g；对同一淀粉进行的不同处理之间相比较，韧化-酶水解联合处理过的淀粉，对水和油的吸附能力最强，其次是单一酶水解处理的淀粉和单一韧化处理的淀粉；经过同一处理的两种淀粉之间相比较，马铃薯淀粉对水和油的吸附能力相对较低。淀粉颗粒对水和油的吸附能力的升高，与淀粉颗粒表面的孔洞、凹陷及淀粉颗粒内部的中空结构有关，这些结构能够通过物理吸附作用，截留和保存水、油等液体[1]。正如扫描电镜所观察到的（图2），经韧化-酶水解联合处理的甘薯淀粉，其颗粒表面和内部均有比单一酶水解处理更多的孔洞，正是这些孔洞的大量形成提高了淀粉对水和油的吸附能力。Xie等[5]发现，小麦淀粉经过重复热处理并联合酶水解处理后，对水和油的吸附能力均比单一酶水解处理高。
2.8 甘薯淀粉由内及外酶水解模式的机理分析
本研究发现，韧化处理可以使淀粉更易于被酶水解。Kong等[10]和Shariffa等[16]发现，韧化处理过程中形成的多孔结构，有利于酶进入淀粉颗粒内部，进而实现从淀粉颗粒内部开始向淀粉颗粒表面进行的酶水解，即形成由内及外的酶水解模式。淀粉颗粒一般由无定型区和半结晶区组成，它们都是不可移动的[27]。推测韧化-酶水解联合处理甘薯淀粉的过程包括如下几步：水合与膨胀、形成多孔结构、吸附淀粉酶、催化酶水解（图6）。具体机理阐述为：韧化处理过程中，无定形区充分吸收水分并开始膨胀，逐渐变得可移动，进而带动半结晶区发生移动，而过量水分的存在可以加速无定型区对水分的吸收，进一步促使淀粉分子链运动[44]；韧化处理过程中较高的水温以及内源酶的存在，破坏了淀粉颗粒外层结晶层[12]，淀粉颗粒表面逐渐出现孔洞、缝隙和凹陷（图6B、图2B）；酶水解阶段，外源酶则通过这些孔洞和缝隙进入淀粉颗粒内部（图6C），开始侵蚀淀粉颗粒内部，并最终留下一个中空的壳层（图6D，图2D、E）。
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图 6 韧化-酶水解联合处理的甘薯淀粉呈现的由内及外的酶水解模式Figure 6. Center-towards-Surface enzymatic hydrolysis pattern for annealed sweet potato starch甘薯淀粉和马铃薯淀粉对酶水解的敏感性不同，这可能与他们不同的结晶结构类型有关。甘薯淀粉为A型结晶结构，它的无定型区比马铃薯淀粉的B型结晶结构更容易被酶水解[40]。一方面，A型结晶结构的淀粉颗粒无定型区内有一些蛇形通道，有利于酶水解，而B型结晶结构的淀粉颗粒没有；另一方面，淀粉颗粒的结晶结构与其支链淀粉的支链长度有关。Jane[33]发现，A型结晶结构的淀粉支链长度要比B型结晶结构淀粉的短，相比之下A型结晶结构不稳定，容易受到外界环境影响而发生结构重排，从而出现一些散乱的孔隙。而B型结晶结构淀粉的长支链容易形成簇状聚集，淀粉颗粒内部无定型区相对更加稳定[41]，不易被水解。
3. 结论
韧化-酶水解联合处理甘薯淀粉，呈现由内及外的酶水解模式，生成具有中空结构的壳层，这与酶水解天然甘薯淀粉呈现的由外向内的酶水解模式不同。推测机理为：韧化处理使甘薯淀粉颗粒粒径变大，表面形成大量孔洞和空隙，淀粉酶更容易进入淀粉颗粒内部，从而形成由内及外的酶水解模式。但韧化-酶水解联合处理马铃薯淀粉时，只在淀粉颗粒表面出现少量小的凹陷，并未改变酶水解模式，这与马铃薯淀粉分子长侧链形成的B型结晶具有稳定的无定型区有关。韧化-酶水解联合处理的甘薯淀粉，吸水、吸油能力明显升高。下一步可继续探索具有类似甘薯淀粉A型结晶结构的其他淀粉形成的由内及外的酶水解模式。
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图 1 韧化前和韧化后的甘薯淀粉、马铃薯淀粉酶水解曲线
Figure 1. Hydrolysis profiles of sweet potato starch and potato starch before and after annealing treatment
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图 2 不同处理甘薯淀粉的扫描电镜照片
注：A. SPS(1000×)；B. ASPS(1000×)；C. ESPS(1000×)；D. AESPS(1000×)；E. AESPS(2000×)。
Figure 2. Scanning electron micrographs of sweet potato starch with different treatment
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图 3 不同处理马铃薯淀粉的扫描电镜照片
注：A：PS(1000×)；B：APS(1000×)；C：EPS(1000×)；D：AEPS(1000×)。
Figure 3. Scanning electron micrographs of potato starch with different treatment
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图 4 经不同处理后的甘薯淀粉（A）和马铃薯淀粉（B）颗粒X射线衍射谱图
Figure 4. X-ray diffraction spectra of sweet potato starch (A) and potato starch (B) after different treatment
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图 5 不同处理后甘薯淀粉（A）和马铃薯淀粉（B）的FT-IR图谱
Figure 5. FT-IR spectra of sweet potato starch (A) and potato starch (B) after different treatment
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图 6 韧化-酶水解联合处理的甘薯淀粉呈现的由内及外的酶水解模式
Figure 6. Center-towards-Surface enzymatic hydrolysis pattern for annealed sweet potato starch
表 1 不同处理后淀粉的热力学性质参数
Table 1 Thermal parameters of starch samples after different treatment
淀粉样品 To（℃） Tp（℃） Tc（℃） ΔH（J/g） Tc‒To（℃） SPS 64.51±0.04a 70.60±0.02a 76.08±0.45a 11.01±0.89a 11.57±0.41c ASPS 73.62±0.37c 75.80±0.37c 79.04±0.44b 11.91±0.15ab 5.42±0.07a ESPS 67.13±0.04b 72.02±0.01b 78.56±0.15b 12.95±0.21b 11.43±0.19c AESPS 74.24±0.00c 77.69±0.01d 81.25±0.04c 13.07±0.55b 7.01±0.04b PS 58.28±0.18b 64.40±0.46b 73.86±0.79b 16.39±0.41ab 15.58±0.61b APS 68.39±0.27c 71.44±0.10c 76.86±0.30c 17.25±0.71b 8.47±0.29a EPS 56.24±0.09a 61.83±0.37a 71.22±1.30a 14.97±0.64a 14.98±1.20b AEPS 57.63±0.07b 63.99±0.11b 72.64±0.22ab 15.53±0.23a 15.01±0.30b 注：不同小写字母表示同一淀粉不同处理间存在显著性差异（P<0.05）。 
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表 2 不同处理淀粉样品的粒径参数（μm）
Table 2 Particle size parameters of starch samples after different treatment(μm)
淀粉样品 D10 D50 D90 MV MA SPS 10.73±0.04b 15.48±0.11a 22.59±1.23a 16.01±0.12a 14.95±0.31b ASPS 13.39±0.01c 26.98±0.12b 66.36±1.15d 36.16±1.03c 23.76±0.07c ESPS 7.59±0.26a 12.68±0.35a 19.86±0.70a 13.41±0.47a 10.58±0.47a AESPS 10.22±0.02b 14.74±0.01a 21.76±0.11a 15.57±0.02a 14.11±0.01b PS 14.08±0.23c 29.18±1.13b 47.59±3.84b 30.55±1.87b 24.04±0.80c APS 20.59±2.24d 37.21±2.75d 56.63±3.31c 41.14±2.33d 31.88±2.78e EPS 20.55±1.45d 32.16±3.40c 47.70±5.76b 33.44±3.62b 29.79±2.77ed AEPS 19.71±0.07d 30.35±0.42bc 45.36±1.30b 31.71±0.62b 28.37±0.36d 注：同列数据不同小写字母表示数据间存在显著性差异（P＜0.05）；D10、D50、D90分别对应粒度累积分布达到10%、50%、90%时的粒径；MV、MA分别为体积平均径、表面积平均径。
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表 3 不同处理淀粉样品的吸油吸水性能及其直链淀粉含量
Table 3 Amylose content and water or oil adsorption capacities of native and treated starches
淀粉
样品吸水能力
（g/g）吸油能力
（g/g）直链淀粉
质量分数（%）SPS 2.01±0.01a 3.05±0.13a 21.12±0.33a ASPS 2.35±0.32ab 3.10±0.19a 24.68±0.57b ESPS 3.12±0.02d 3.25±0.32a 25.46±0.35c AESPS 3.61±0.09e 3.81±0.42a 25.84±0.34c PS 2.00±0.15a 2.95±0.71a 25.98±0.15c APS 2.57±0.19b 3.07±0.18a 25.96±0.04c EPS 2.62±0.07bc 3.10±0.42a 25.83±0.32c AEPS 2.96±0.09cd 3.15±0.18a 25.85±0.14c 注：同列数据不同小写字母表示数据间存在显著差异（P < 0.05）。
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