Optimization and Stability Evaluation of SimuLating Milk Fat GlobuLe Membrane Delivery Systems for DHA-rich Algal Oil
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摘要: 目的：以提高功能性物质生物利用度以及再加工产品的稳定性为目标，研究藻油不同形式的产品开发以及类乳脂球膜包埋体系在食品研发中的应用。方法：以二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量不低于74%的藻油为主要包埋成分，通过单因素实验设计和响应面法优化了藻油的两种类乳脂球膜乳化体系，并通过平均粒径、澄清指数和过氧化值等指标对其物理稳定性以及氧化稳定性进行评价。最后通过体外模拟消化评价样品消化特性。结果：最佳配方工艺为：藻油10%、维生素E 0.04%、大豆卵磷脂1.10%、浓缩乳清蛋白1.32%，将油相缓慢加入水相并10000 r/min剪切5 min，62000 kPa均质5次，所制备的乳液平均粒径为241.3 nm。121 ℃高温高压灭菌12 min和4 ℃低温保存显著提升了乳液的物理稳定性以及氧化稳定性（P<0.05）。使用单一壁材抗性淀粉包埋DHA藻油，通过喷雾干燥法在壁芯比1.5:1.0，进风温度180 ℃下制备的抗消化藻油粉末包埋率达到56.74%。体外模拟消化发现藻油乳液和藻油粉末的平均粒径受消化环境的影响呈现先增大后减小的趋势。通过各阶段消化液粒径分布发现乳化和微胶囊化均能减少藻油在胃部的分解消化，使更多的DHA到达小肠。通过检测各组样品在小肠消化阶段的游离脂肪酸释放率发现，乳化以及微囊化能够有效延缓油脂在小肠阶段的释放，藻油粉末的缓释效果最佳。结论：研究表明通过模拟乳脂球膜构建藻油乳化包埋体系具备可行性，能够提升DHA藻油生物可及性。不同形式的产品类型有助于进一步提高藻油在海产品深加工、营养补充剂和保健食品等领域的应用。Abstract: Objective: To enhance the bioavailability of functional substances and the stability of reprocessed products, the development of different algal oil product forms and the application of simulated milk fat globule membrane (MFGM) embedding systems in food research and development were investigated. Methods: Algal oil containing no less than 74% docosahexaenoic acid (DHA) was utilized as the main embedding component. Two types of simulated MFGM emulsification systems for algal oil were optimized through single-factor experimental design and response surface methodology. The physical and oxidative stability of these systems were evaluated using indicators including mean particle size, clarification index, and peroxide value. In vitro simulated digestion was subsequently conducted to assess sample digestion characteristics. Results: The optimal formulation process was determined to involve 10% algal oil, 0.04% vitamin E, 1.10% soybean lecithin, and 1.32% concentrated whey protein. Through sequential addition of the oil phase to the aqueous phase followed by 10,000 r/min shearing for 5 minutes and 62,000 kPa homogenization (5 passes), an emulsion with mean particle size of 241.3 nm was obtained. Significant improvements in physical and oxidative stability were achieved through 121 ℃ high-temperature pressure sterilization (12 minutes) and 4 ℃ low-temperature storage. When resistant starch was employed as the single wall material for DHA algal oil microencapsulation under spray-drying conditions (wall-to-core ratio 1.5:1.0, inlet air temperature 180 ℃), an encapsulation efficiency of 56.74% was attained for the digestion-resistant algal oil powder. In vitro digestion simulations revealed that the mean particle size of both algal oil emulsion and powder initially increased then decreased under digestive conditions. Particle size distribution analysis at different digestive stages indicated that emulsification and microencapsulation could effectively reduce gastric breakdown and digestion of algal oil, thereby facilitating increased DHA delivery to the small intestine. Free fatty acid release rate analysis during intestinal digestion demonstrated that both techniques effectively delayed oil release, with the powder form exhibiting superior sustained-release properties. Conclusion: It was demonstrated that the construction of an algal oil emulsification embedding system through MFGM simulation is feasible for improving DHA algal oil bioavailability. The developed product forms were shown to potentially enhance algal oil applications in seafood processing, nutritional fortification, and functional food development.
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DHA是人体必需的多不饱和脂肪酸，可以促进大脑和神经发育[1]、改善脂质代谢紊乱[2]、促进视力发育[3]、增强免疫，降低患癌风险[4]等。适当补充DHA有利于人体健康，尤其是对于孕妇、婴儿[5]、肥胖者和老年人群。鱼、海鲜和藻类是DHA的主要天然来源。但日常饮食很难达到DHA的推荐摄入量，因此有必要进行额外补充。日常摄入或商业产品中的DHA主要有游离型、乙酯型、甘油三酯型和磷脂型四种形式。然而游离型DHA容易氧化，乙酯型DHA有酒精中毒的风险，而且吸收不良，大量研究表明甘油三酯型DHA与磷脂型DHA更有利于人体吸收，同时甘油三酯型DHA在自然界中更易获得。海藻是甘油三酯型DHA的重要来源之一[6]，但藻油在储藏过程中极易氧化变质，通过乳化、微胶囊化，不仅可以提高其储藏稳定性、保护功能性成分、提高附加营养价值，还可以改变藻油的生物利用度[7]，更有利于被人体吸收利用。因此以提高藻油稳定性和生物可及性为目标研究藻油的乳化和微囊化方法具有一定实际意义。
乳脂球膜（Milk Fat GlobuLe Membrane，MFGM）是天然的界面膜，可保护脂肪球免受聚结。MFGM由膜特异性蛋白和磷脂组成，两者都具有亲水亲油性。磷脂由一个含磷酸基团的亲水头部和两个疏水脂肪酸尾部组成[8]。蛋白质是具有良好乳化性能的天然表面活性剂[9]，其相互作用对于乳状液和微胶囊的稳定性至关重要。但天然型MFGM存在较少，提取工艺复杂、成本高，使用经济且容易获得的蛋白质和磷脂的混合物构建类乳脂球膜结构膜是一种潜在的替代方案。
乳清分离蛋白（Whey Protein Isolate, WPI）是一种由α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白组成的蛋白质，来自浓缩乳清蛋白[10]。这些蛋白质含有亲水性和疏水性基团，是天然乳化剂，在水包油乳液中具有高效的乳化特性[11]。大豆卵磷脂（Lecithin High Potency，SL）是大豆油精炼过程的副产品，含有MFGM中各种磷脂，包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸等[12]，与MFGM磷脂的成分含量非常接近。SL中的每一种磷脂都具有两亲性分子结构，促进了其乳化能力[13]。研究发现蛋白质和磷脂可以通过疏水相互作用结合形成复合物[14]。这种复合物可以降低水油之间的界面张力，并在油滴表面形成厚而致密的界面膜，进而提高乳剂的稳定性，并在体外胃消化过程中更好地保护亲脂化合物的生物活性。因此大豆卵磷脂与浓缩乳清蛋白的复合物有可能作为乳脂球膜的替代物，在为人体提供营养价值和构建油脂乳化递送体系方面发挥积极作用。
因此，本文选用浓缩乳清蛋白和大豆卵磷脂作为乳化剂，以藻油（甘油三酯型DHA≥74%）为芯材，研究以类乳脂球膜为核心的乳化体系组分最佳配比，同时对比了不同杀菌条件和保藏方式对乳液物理稳定性以及氧化稳定性的影响。另外，以抗性淀粉作为单一壁材，利用喷雾干燥技术研究制备藻油微胶囊粉末可行性，最后通过体外模拟消化评价上述乳化包埋体系的消化特性。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
DHA精炼微藻油（TG-DHA≥74%） 广西小藻农业科技有限公司；大豆卵磷脂（纯度≥64%） 美国嘉吉公司；耐热性浓缩乳清蛋白（有效物质含量80%） 美国Hilmar公司；维生素E 中国三生健康产业有限公司；玉米抗性淀粉 祥玉1945型 北京祥玉生物科技有限公司；胆盐 上海麦克林生化科技有限公司；唾液淀粉酶（>5 U/mg）、胃蛋白酶（>250 U/mg）、胰酶 （4×USP）、胰脂肪酶（>20000 U/mg） 美国Sigma Aldrich公司；化学品和试剂 均购自国药集团化学试剂有限公司。
D2010W型电动搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；T 25 D S25型高速分散机 德国IKA公司；HOMOLAB 2型高压均质机 意大利FBF公司；BUCHI Mini Spray Dryer B-290型小型喷雾干燥仪 瑞士步琦有限公司；S3500型激光粒度分析仪 美国麦奇克有限公司；Zetasizer Nano-ZS型高浓度交替粒度和ZETA电位分析仪 英国马尔文帕纳科仪器有限公司；LUMiSizer 611型粒子分散稳定性分析仪 德国LUM仪器公司；JEOL2100型透射电子显微镜 日本电子株式会社；Spectra Max i3型多功能读板机 美国美谷分子仪器有限公司；Phenom Pro X型台式扫描电子显微镜 荷兰Phenom-World公司；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；907自动电位滴定仪 瑞士万通中国有限公司；MuLtistirrer digital 15型水浴循环磁力搅拌器 意大利VELP公司。
1.2 实验方法
1.2.1 乳剂制备方法
参考JU等[15]制备油脂乳液的方法并进行调整。根据预实验藻油质量浓度以及维生素E质量浓度对乳液稳定性的影响，将乳剂中藻油质量浓度以及维生素E质量浓度分别固定为10%和0.04%。在常温下将大豆卵磷脂以及0.04%维生素E搅拌加入10%藻油并混匀制备为油相，去离子水加热至70℃，剪切下缓慢加入浓缩乳清蛋白至完全溶解制备为水相，油相缓慢加入剪切中的水相，混匀并定容后继续剪切5 min，最后通过高压均质机以一定压力均质若干次得到最终乳液。
1.2.2 藻油乳液制备单因素实验
乳清蛋白浓度对藻油乳稳定性的影响：在大豆卵磷脂浓度为1.0%、剪切转速为8000 r/min、均质压力为60000 kPa，均质4次时测定乳清蛋白浓度分别为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%所制备的藻油乳液的澄清指数和平均粒径。
大豆卵磷脂浓度对藻油乳稳定性的影响：在乳清蛋白浓度为1.2%、剪切转速为8000 r/min、均质压力为60000 kPa，均质4次时测定大豆卵磷脂浓度分别为0.0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%所制备的藻油乳液的澄清指数和平均粒径。
剪切转速对藻油乳稳定性的影响：在大豆卵磷脂浓度为1.0%、乳清蛋白浓度为1.2%、均质压力为60000 kPa，均质4次时测定剪切转速分别为7000、8000、9000、10000、11000 r/min所制备的藻油乳液的澄清指数和平均粒径。
均质次数对藻油乳稳定性的影响：在大豆卵磷脂浓度为1.0%、乳清蛋白浓度为1.2%、剪切转速为8000 r/min、均质压力为60000 kPa时测定均质次数分别为1、2、3、4、5、6次所制备的藻油乳液的澄清指数和平均粒径。
均质压力对藻油乳稳定性的影响：在大豆卵磷脂浓度为1.0%、乳清蛋白浓度为1.2%、剪切转速为8000 r/min、均质4次时测定均质压力分别为20000、40000、60000、80000、1000 00 kPa所制备的藻油乳液的澄清指数和平均粒径。
1.2.3 Box-Behnken响应面试验设计
如表1所示，在上述单因素实验结果的基础上，进一步参考SIROVEC等的Box-Behnken响应面法[16]并进行修改以确定制备藻油乳液的最优参数，而粒径是衡量乳液稳定性的重要指标，粒径越小乳液越稳定，故以大豆卵磷脂浓度，乳清蛋白浓度以及均质压力为自变量，乳液平均粒径为响应值，进行三因素三水平响应面试验分析。实验数据采用 Design Expert 13.05 软件分析处理。
表 1 响应面试验因素与水平Table 1. Factors and levels of response surface tests水平 因素 A大豆卵磷脂浓度（%） B乳清蛋白浓度（%） C均质压力（kPa） −1 0 0.8 40000 0 1 1.2 60000 1 2 1.6 80000 1.2.4 乳液平均粒径及粒度分布的测定
参考于有强等[17]的方法，通过S3500型激光粒度分析仪的湿法分析。将乳液逐滴加入样品槽中，使其达到仪器测试浓度范围并进行检测。
1.2.5 Zeta电位的测定
将稀释10倍后的样品通过进样器缓慢推入电位分析仪样品池，确保样品完全填充并避免气泡。将样品池放入仪器中，平衡时间为2 min，在25℃的条件下平行测定3次。
1.2.6 藻油乳液澄清指数的测定
通过LUMiSizer稳定性分析仪，取1.8 mL样品注入样品管，温度为25℃，离心速度为3000 r/min。扫描800次，每15秒记录一次传输剖面，并通过设备集成软件SEPView6对结果进行处理，得到澄清指数。根据澄清指数判断乳液稳定性，澄清指数越大，说明液体透光率高，样品在离心后均匀状态被破坏，即乳液稳定性差；反之澄清指数越低说明乳液稳定性越好。
1.2.7 藻油乳液微观结构的表征
对乳液进行适当倍数稀释后，通过透射电子显微镜在下加速电压120 kV，放大12000倍率下观察藻油乳液的微观形态。
1.2.8 藻油乳液杀菌保藏实验样品处理
将响应面优化的藻油乳进行不同杀菌方式和保藏方式结合处理实验。杀菌处理分别为无杀菌；巴氏杀菌（将乳剂加热到62~65 ℃，保持30 min）；高温高压灭菌（灭菌锅121℃，12 min）。保藏条件为室温放置（20~25 ℃），低温冷藏（4 ℃）。后续结果分析中分别将无杀菌常温保藏组、水浴杀菌常温保藏组、高温高压灭菌常温保藏组、无杀菌低温保藏组、水浴杀菌低温保藏组，高温高压灭菌低温保藏组定义为A、B、C、D、E、F组。
1.2.9 藻油乳液杀菌保藏实验表征
参考KAVRAN等[18]，CHEN等[19]的方法并在此基础上进行修改，分别在第0、1、3、7、14，21天将样品混匀后检测样品的平均粒径、澄清指数、氢过氧化物值，硫代巴比妥酸反应物值。同时将部分样品静止保存，分别在第0、1、3、7、14，21天拍照记录外观状态的变化。
取200 uL乳液与1.5 mL溶液（异辛烷和异丙醇按照3:1的体积比混合）混合，涡旋10 s并静置10 s，重复3次后在室温下5000 r/min离心3 min。吸取200 uL上层有机相与2.8 mL溶液（甲醇和正丁醇体积比为2:1）混合，依次加入0.3 g/mL硫氰酸铵15 uL，将0.132 mol/L的氯化钡和0.144 mol/L的硫酸亚铁等体积混合，在室温下5000 r/min离心2 min，所得上清液15 uL，各充分混合后孵育20 min，在波长510 nm处测量溶液的吸光度，同时采用过氧化氢标准曲线计算样品的氢过氧化物值。
样品与TBA溶液混合，在95 ℃下反应60 min，后冰浴10 min并冷却至室温。使用正丁醇沉淀MDA-TBA加合物，去除正丁醇后，在水中溶解沉淀物。最后通过酶标仪在波长 532 nm处进行比色检测，以测定产物的硫代巴比妥酸反应物值。
1.2.10 藻油粉末制备单因素实验
研究不同壁芯比对藻油粉末载油率的影响：在藻油乳水相制备阶段加入不同含量的抗性淀粉，使藻油乳壁材芯材质量比分别为0.5:1.0、1.0:1.0、1.5:1.0、2.0:1.0、2.5:1.0，之后通过喷雾干燥仪以20 r/min的进料速度，160 ℃的进风温度对藻油乳喷雾干燥为藻油粉末。研究不同进风温度对藻油粉末载油率的影响：以包埋率最大的壁芯比制备喷粉前料液，之后通过喷雾干燥仪以20 r/min的进料速度，分别以120、140、160、180、200 ℃的进风温度喷雾干燥为藻油粉末。
1.2.11 藻油粉末油脂包埋率
依据WANGKuLANGKOOL等[20]的方法以及食品安全国家标准GB 5009.168-2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》检测油脂粉末中表面油和总油的含量，进一步通过公式计算粉末的油脂包埋率。
油脂包埋率(%)=(1−表面油含量/总油含量)×100% (1) 1.2.12 藻油粉末平均粒径的检测
采用S3500型激光粒度分析仪的干法分析进行平均粒径以及粒径分布的检测。用样品勺取适量粉末均匀松散置入样品槽中进行干法分析。
1.2.13 藻油粉末微观结构的表征
使用导电胶将适量样品粘在样品台并吹去多余粉末后放入样品室，通过台式扫描电子显微镜，调整曝光焦距等参数使图像清晰，在合适焦距下截取照片以此观察油脂粉末的微观形态。
1.2.14 体外消化模型构建
参考王迎香等[21]的方法构建体外消化模型。固体样品与模拟口腔液用量是1:1（W/W），液体样品用水稀释至10 mL，使其含有400 mg以内淀粉/可消化的可利用碳水/蛋白质。样品体积与模拟胃液用量是1:1（V/V），模拟胃液与模拟肠液是1:1（V/V，10 mL+10 mL）。选用2 mol/L HCl或2 mol/L NaOH 调节模拟消化液pH。
对照组：2 g TG-DHA藻油+18 g去离子水；实验组1:20 g 藻油乳液；实验组2:6.684 g藻油粉末（含2 g 藻油）。
1.2.15 体外消化指标检测
消化样品平均粒径和粒度分布的测定同1.2.4液体平均粒径和粒度分布的检测方法。
消化样品小肠阶段游离脂肪酸释放率的测定：通过pH-stat法[22]测定小肠消化阶段的游离脂肪酸释放量。在模拟消化小肠阶段通过自动电位滴定仪实时监测记录使体系pH值保持在7时所消耗的NaOH体积，以此观察各组样品在小肠消化阶段的游离脂肪酸率。
1.3 数据处理
所有实验均重复三次，数据以平均值±标准差（SD）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，采用 Design Expert 13.05 软件设计分析响应面试验，使用 SPSS 软件（27.0 版本）进行邓肯事后检验。显著性差异设为P<0.05表示差异显著， P<0.01表示差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
如图1A可知，乳液的粒径和澄清指数均随着浓缩乳清蛋白浓度的增加而降低，在蛋白浓度由0.4% 增加至1.2% 时平均粒径和澄清指数显著降低（P<0.05），之后随着蛋白浓度的增加变化不显著（P>0.05）。蛋白质具有良好的乳化和成膜性能，在乳化液形成过程中，蛋白质分子在新形成的油水界面上被迅速吸附，由此形成的立体稳定层阻止了油滴的聚结，并为乳化液提供了物理稳定性。ZHAO等[23]使用不同浓度的大豆分离蛋白作为单一乳化剂制备中链甘油三酯（MCT）纳米乳液同样发现，乳液粒径随着蛋白浓度的增加先减小后增大。是因为适量增加SPI浓度有利于SPI分子吸附在油水界面进而减小液滴尺寸。但高浓度的SPI可能会使水相中过多的游离蛋白相互聚集，形成亚胶束导致乳液粒径增大。因此选定 1.2%为乳清蛋白用量的响应面试验中心点。
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图 1 不同条件对藻油乳液平均粒径和稳定性的影响注：A-蛋白质量浓度；B-卵磷脂质量浓度；C-剪切转速；D-均质次数；E-均质压力。Figure 1. Effect of different conditions on average particle size and stability of algal oil emuLsion如图1B所示，添加大豆卵磷脂后，乳液的平均粒径和澄清指数均出现先下降后上升的趋势，澄清指数在磷脂浓度超过1.0%后逐渐变大。这是由于在乳化过程中，低浓度的卵磷脂小分子进入乳清蛋白分子之间的缝隙，与蛋白质之间通过疏水作用在 O/W 界面形成粘弹性吸附层，改变了界面膜的流变学特性，使界面膜在膨胀和形变的影响下也能发挥自己的性能，这有利于 O/W 液滴结构的完整性。此外，卵磷脂的加入也影响了界面蛋白与蛋白之间的相互作用及蛋白吸附层表面的电荷分布，防止因油滴合并而导致的破乳[24]。而在高大豆卵磷脂含量下，乳液的黏度会随之增加，乳滴有聚集和融合的趋势，导致乳液粒径增加[25]，澄清指数变大，稳定性降低。PAN等[8]以不同质量比的WPI - SL配合物作为乳化剂，研究了对溶于MCT油的姜黄素乳化效果，发现随着大豆卵磷脂浓度的不断增加，姜黄素乳液的尺寸先减小后开始增大，与本文趋势一致。是因为过量SL的加入超过了SL与WPI疏水区的最大结合程度。未结合的SL随后吸附在界面上取代WPI，降低了姜黄素乳液的稳定性。因此选择大豆卵磷脂浓度1%作为响应面设计实验中心点。
图1C为剪切转速对制备乳液的影响，在一定转速范围内，粒径和澄清指数会随着转速的增加而降低，是因为高速的剪切有利于油相水相的相互融合，变小的乳滴提高了乳化体系的稳定性。但当乳化剪切力超过 10000 r/min 其澄清指数显著升高（P<0.05），乳液粒径变大，是因为过度剪切导致乳液的局部区域发生颗粒聚集，导致絮凝产生，从而使稳定性下降。CHEN等[26]研究了剪切速率及时间对椰子球蛋白和单宁酸稳定高内相皮克林乳剂的影响，发现剪切速率小、时间短时油相水相不能均匀化，导致乳滴尺寸较大。适当的剪切作用，如10000 r/min剪切1 min，可使α-螺旋含量降低至38%，液滴尺寸减小。但过度剪切会破坏颗粒之间的氢键，导致颗粒尺寸增加。因此选择最佳乳化剪切力为 10000 r/min。
图1D表明，乳液的平均粒径随着均质次数的增加在不断下降，但超过5次后不再显著变化；澄清指数在分别在均质4次和5次后显著下降（P<0.05），低于3次或高于5次均质的乳液澄清指数变化不明显（P>0.05）。因为乳液颗粒间的相互作用力随着乳液平均粒径的减小而减小，从而降低了颗粒聚集和沉降的可能性，澄清指数随之减小。因此均质次数选择5次效果最佳。
从图1E可以看出随着均质压力的增加，乳液平均粒径和澄清指数先逐渐降低，但均质压力超过60000 kPa 后乳液平均粒径上升，均质压力超过80000 kPa 后乳液澄清指数升高。可能是因为过大的均质压力会导致部分脂肪球破裂，或蛋白质发生变性，进而使乳液稳定性下降。吕沛宣等[27]研究了均质压力对制备大豆多肽纳米乳液的影响，同样发现乳液粒径均随均质压力升高而先减小后增大。因此选择最佳均质压力 60000 kPa作为响应面设计实验中心点。
2.2 响应面优化试验
2.2.1 响应面试验结果与分析
根据单因素实验结果中大豆卵磷脂浓度、乳清蛋白浓度、剪切转速、均质次数和均质压力对藻油乳液的平均粒径和澄清指数的影响程度的大小，最终选取对藻油乳液稳定性影响较大的3个因素大豆卵磷脂添加量（A）、乳清蛋白添加量（B）、均质压力（C）作为自变量，藻油乳液的平均粒径（Y）为响应值，对藻油乳液的制备工艺进行3因素3水平响应面优化（表1），试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。利用响应面软件Design-Expert 13.05对表2试验结果进行多元二次回归拟合，得到藻油乳模糊综合评判值的回归方程：Y=253.40−28.42×A−110.08×B−38.17×C+8.67×AB+0.6667×AC+6.00×BC+142.97×A2+175.97×B2+175.13×C2。由表3可知，该模型的P<0.0001，极显著，具有统计学意义，失拟项的P值为0.1283，不显著（P>0.05），说明回归模型与实际情况较吻合。模型的决定系数R2和校正决定系数R2Adj分别为0.9917，0.9811，变异系数为5.03%，信噪比为26.956，表明实际值与预测值的拟合程度好，该模型以及预测值的可信度高。由F值可知，各因素对TG-DHA乳液平均粒径的影响程度为 B（乳清蛋白添加量）>C（均质压力）>A（大豆卵磷脂添加量）。由P值可知，一次项A对结果影响显著（P<0.05）；一次项B、C，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P<0.01）；其他项对结果影响不显著（P>0.05）。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Design and resuLts of response surface test实验号 A B C 平均粒径（nm） 1 2 1.2 80000 511.0 2 1 1.2 60000 268.3 3 1 1.2 60000 263.3 4 1 1.6 80000 478.7 5 2 1.6 60000 420.7 6 1 1.6 40000 548.3 7 1 1.2 60000 240.3 8 1 0.8 80000 648.7 9 0 0.8 60000 741.3 10 0 1.2 80000 561.0 11 2 0.8 60000 661.7 12 1 1.2 60000 264.7 13 0 1.6 60000 465.7 14 1 1.2 60000 230.3 15 1 0.8 40000 742.3 16 2 1.2 40000 580.7 17 0 1.2 40000 633.3 表 3 回归模型的方差分析Table 3. Analysis of variance of regression model变异源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 5.012E+05 9 55693.77 93.22 < 0.0001 ** A-大豆卵磷脂浓度 6460.06 1 6460.06 10.81 0.0133 * B-乳清蛋白浓度 96946.72 1 96946.72 162.27 < 0.0001 ** C-均质压力 11653.56 1 11653.56 19.51 0.0031 ** AB 300.44 1 300.44 0.5029 0.5012 AC 1.78 1 1.78 0.0030 0.9580 BC 144.00 1 144.00 0.2410 0.6385 A² 86060.92 1 86060.92 144.05 < 0.0001 ** B² 1.304E+05 1 1.304E+05 218.22 < 0.0001 ** C² 1.291E+05 1 1.291E+05 216.16 < 0.0001 ** 残差 4182.20 7 597.46 失拟项 3030.78 3 1010.26 3.51 0.1283 纯误差 1151.42 4 287.86 总和 5.054E+05 16 注：* 表示差异显著（P<0.05），** 表示差异极显著（P<0.01）。 2.2.2 两因素间的交互效应
采用Design-Expert 13.05软件绘制各因素间交互作用对藻油乳粒径影响的响应面及等高线。由图2可知，3个因素两两之间的交互作用对平均粒径的影响不显著（P>0.05），这与方差分析所得的结果一致。可能是因为这三个因素在乳化过程中可能并没有直接地相互作用。
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图 2 各因素间交互作用对乳液平均粒径影响的响应面及等高线Figure 2. Response surface and contour line of influence of interaction among factors on average particle size of emuLsion2.2.3 验证性实验
分析响应面法试验数据可知最优条件为大豆卵磷脂1.09%，乳清蛋白1.324%，均质压力62068 kPa，预测最小粒径为 233.151 nm。根据实际试验条件，将最终配方工艺调整为依次加入藻油10%、维生素E 0.04%，大豆卵磷脂1.10%制备为油相，乳清蛋白1.32%溶于70℃的超纯水成为水相；将油相缓慢加入水相并10000 r/min剪切5 min，之后62000 kPa均质5次。所制备的乳液平均粒径为241.3±3.2 nm，与预测值接近。
2.2.4 最佳配方工艺乳剂表征
对优化后的配方工艺所制乳液进行电位检测，测得Zeta电位值为-35.663 mV，相对较高，说明稳定性较好[28]。通过透射电子显微镜观察乳液微观形态（图3）可以看出，乳滴大小较为均一，油相呈圆形或椭圆形均匀分布在水相中，说明该乳液乳化效果较好。
2.3 藻油乳液杀菌保藏实验
2.3.1 不同杀菌保藏处理后乳液的平均粒径
通过图4发现无杀菌处理常温保藏组（A组）放置1天后粒径增加至3.2 μm，在第3天和第7天急剧增加至7.5 μm和23.4 μm，之后缓慢增加至25.6 μm。表明乳滴发生大量聚集，乳液稳定性变差。水浴杀菌常温保藏组（B组）放置1天后粒径未发生明显变化，在第3天增加至 14.7 μm，在第7天后不再明显增长。说明水浴处理能在较短时间内使乳液保持稳定。A，B组均在7天后状态彻底发生变化，因此在第14，21天平均粒径不再显著增加。除A组，D组外其余组在第0天平均粒径变大，表明高温处理会使乳液粒径发生部分增加。王鑫[29]研究了不同杀菌方式对燕麦乳平均粒径的影响，发现加热温度在65 ℃至121 ℃的燕麦乳的平均粒径均高于25 ℃加热的乳液。可能是因为蛋白质由于高温形成新的键和疏水相互作用，进而形成更大的聚集体导致粒径增加。C组粒径在第1天和第7天发生小范围波动，但最终与E，F组无显著差异（P>0.05）。C、D、E，F组在21天内粒径变化不明显，表明高温高压灭菌或低温冷藏保存均能很好地抑制乳滴聚集。刘梦梦等[30]分别对卵磷脂和吐温85制备的乳液各在25 ℃和4 ℃下保存1个月发现，吐温85制备的纳米乳液在4 ℃贮藏下粒径随着时间逐渐略有增加，而两种乳化剂制备的乳液在25 ℃下均粒径变大，稳定性变差，与本文实验结果一致。
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图 4 各组乳液21天内平均粒径的变化Figure 4. Changes of average particle size of emuLsion in each group within 21 d2.3.2 不同杀菌保藏处理后乳液的澄清指数
图5表明无杀菌处理常温保藏组（A组）放置1天后澄清指数由0.06增加至0.13，在第3天和第7天均发生显著增加（P<0.05），之后缓慢增加，表明无杀菌处理常温放置不利于乳液保存，稳定性持续变差。水浴杀菌常温保藏组（B组）放置1天后澄清指数发生较小幅度变大，在第3天突然增加至0.48，变化趋势明显（P>0.05），说明水浴处理在24 h内有利于乳液稳定，但之后反而会加剧乳液向不稳定状态转变。 可能是因为水浴处理和高温高压处理并常温保藏加剧了乳滴间的碰撞频率，使乳滴更容易发生聚结，降低了乳液的稳定性。甄灵慧[31]探讨了不同乳化剂制备的脂肪球膜乳液在巴氏杀菌后各组乳液的稳定性变化发现，各组乳液稳定性指数均随着时间的增加而增加，即稳定性变差。其余组在21天内澄清指数均没有明显变化（P>0.05），表明高温高压灭菌或低温冷保存均能很好地保持乳液稳定性。
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图 5 各组乳液21天内澄清指数的变化Figure 5. Changes in clarification index of emuLsions in each group within 21 d2.3.3 不同杀菌保藏处理后乳液的过氧化值
油脂空气氧化过程是一个动态平衡过程，在油脂氧化生成氢过氧化物的同时，还存在着氢过氧化物分解和聚合，氢过氧化物的含量增加到一定值，分解和聚合速度都会增加[32]。油脂的过氧化值测定主要评价的是油脂中氢过氧化物的含量，在油脂氧化的初期，采用过氧化值可以合理评价油脂的氧化情况。
如图6，C、E、F组在21天内总体趋势平稳，过氧化值增加较少；无处理低温保藏组（D组）过氧化值较高，且有随着时间推移加速增大的趋势；无杀菌常温保藏组和水浴杀菌常温保藏组（A、B组）过氧化值增加最明显（P<0.05），且总体趋势一致，表明A组和B组油脂氧化程度最高，水浴杀菌以及高温高压灭菌均能在一定程度上延缓脂质氧化，高温高压灭菌处理抗氧化效果优于水浴杀菌，水浴杀菌需要结合低温保藏才能更好发挥作用。ROTTA等[33]研究了两种热处理对乳制品饮料稳定性的影响发现巴氏杀菌饮料更容易氧化。李静雯等[34]研究了辛烯基琥珀酸淀粉酯和磷脂制备的纳米乳液在4 ℃和25 ℃贮藏时的过氧化值变化情况，同样发现，4 ℃下储存4周的乳液过氧化值增加不明显，而25 ℃下添加了γ-谷维素不同质量浓度的乳液过氧化值均有不同程度的增加。
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图 6 各组乳液21天内过氧化值的变化Figure 6. Changes of peroxide value of emuLsions in each group within 21 days2.3.4 不同杀菌保藏处理后乳液的硫代巴比妥酸反应物值
丙二醛（Malondialdehyde ,MDA）是一种生物体脂质氧化的天然产物。脂质氧化时，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，此时通过检测 MDA 的水平即可检测脂质氧化的水平[35]。硫代巴比妥酸反应物（4,6-Dihydroxy-2-mercaptopyrimidine, TBARS）值的测定实质上是基于丙二醛与硫代巴比妥酸的显色反应。通过测量反应产物的吸光度，可以间接获得丙二醛的含量，进而推导出油脂酸败的程度。
如图7，高温高压灭菌常温保藏组、无灭菌处理低温保存组以及高温高压灭菌低温保存组（C、D、F组）在21天内丙二醛增加不明显；水浴杀菌低温保藏组（E组）在第7天后丙二醛增加较多（P<0.05），可能是因为水浴杀菌促进了部分油脂的氧化，同时没有消灭全部导致乳液变质的微生物，因此在冷藏保藏中的TBARS值高于其他两组；无杀菌常温保藏组和水浴杀菌常温保藏组（A、B组）丙二醛含量增长明显高于其余4组（P<0.05）。表明水浴杀菌以及无杀菌处理常温放置会显著增加乳液丙二醛含量，高温高压灭菌以及低温保藏是减少乳剂产生丙二醛的有效手段。
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图 7 各组乳液21天内硫代巴比妥酸反应物值的变化Figure 7. Changes of thiobarbituric acid reactant value of emuLsions in each group within 21 days2.3.5 不同杀菌保藏处理后乳液的外观状态
如图8，无杀菌处理常温保藏组（A组）在第3天后于容器内壁结块凝固，内部发生油相水相分离，因此在图中分层现象不及B组明显。水浴杀菌处理常温保存组（B组）在第7天开始状态发生改变，稳定性彻底被破坏，出现明显分层现象。可能是因为较高温度的水浴处理破坏了乳液的稳定性，同时在常温保藏下加剧了油脂的氧化和乳液向不稳定状态的转变。其余4组在21天内外观状态没有明显改变，始终保持均匀稳定状态，与上述的粒径、澄清指数检测结果一致。
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图 8 各组乳液21天内外观状态的变化Figure 8. Changes in appearance of emuLsions in each group within 21 d2.3.6 杀菌保藏实验
通过对不同杀菌和保藏方式处理的乳剂进行粒径、稳定性、氢过氧化物值、TBARS值的检测以及外观状态的观察发现，在常温保藏乳液中，水浴杀菌有利于乳剂短期内的稳定，但在保藏3天后物理稳定性以及氧化稳定性都发生很大改变，稳定效果不及无杀菌处理乳剂；高温高压灭菌处理能够最大程度保证乳液稳定性；低温保藏的乳剂整体稳定性都较好，水浴杀菌的不及另外两组。因此，建议选择高温高压灭菌作为灭菌方式，高温高压灭菌后的乳剂在常温以及低温保藏21天内均能保持良好的稳定性。
2.4 提升藻油粉末油脂包埋率实验
2.4.1 壁芯比对粉末载油量的影响
抗性淀粉相对于天然淀粉的晶体结构更加致密，在胃肠道消化过程中不易被降解，是肠道靶向递送系统的理想载体[36]。通过抗性淀粉包埋藻油乳液并进一步喷雾干燥为粉末，可以更好地保留藻油中功能成分的生物活性并提高DHA的利用度。藻油在喷雾干燥前预先形成水包油乳剂，有利于喷粉过程的稳定并进一步提高油脂包埋率[37]。因此在得到稳定乳剂的基础上，以提高载油量为目标探讨了使用抗性淀粉包埋藻油制备为油脂粉末的配方工艺。
图9表明，壁芯比为 1.5:1.0 时油脂包埋率最高，壁芯比过高或过低都不利于粉末油脂的包埋。这是因为比值过高，乳液的黏度增大，不利于均质和喷雾干燥[38]，导致包埋率下降；而比值过低时，油脂包埋不完全，表面油增加，使包埋效果变差[39]。因此，选定壁芯比为1.5:1.0进行后续实验。
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图 9 不同壁芯比下藻油粉末的油脂包埋率Figure 9. Oil entrapment rate of algal oil powder under different wall-to-core ratios2.4.2 进风温度对粉末载油量的影响
如图10，进风温度为 180 ℃ 时油脂包埋率最高，随着进风温度的升高，粉末油脂的包埋率随之增加，这是因为进风温度的提高可引起液滴表面水分的快速蒸发，从而加快形成半透膜以防止油滴的进一步浸出。但如果进风温度太高，水分散失速度过快，会使形成的颗粒囊壁因缺水而发生破裂，导致包埋率降低[40]；同样，过低的进风温度会导致产品成膜速度低，水分含量增加，影响粉末品质[41]。因此，选定180 ℃作为进风温度。
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图 10 不同进风温度下藻油粉末的油脂包埋率Figure 10. Oil entrapment rate of algal oil powder at different inlet air temperatures2.4.3 藻油粉末表征
最终以壁芯比为1.5:1.0，进风温度180℃得到藻油粉末。包埋率由最低7.93%提升至56.74%。平均粒径为45.73 μm，粒径大小较为均一，呈单峰分布（图11）。由图12电镜照片可以看出，藻油粉末整体呈圆球状，尺寸较为一致。部分存在囊壁破裂，包埋失败的现象。后续可通过加入其他原料提高囊壁的包裹性能。例如李闻涛等[42]以苦参碱为芯材，研究抗性淀粉微晶纤维素不同配比对微丸成形的影响，发现随着辅料微晶纤维素的用量越大，微丸成形型越好。
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图 12 藻油粉末的扫描电子显微镜图注：A-205x；B-820x；C-2050x；D-3100x。Figure 12. Scanning Electron Microscope image of algal oil powder2.5 藻油类乳脂球膜递送体系体外模拟消化实验
2.5.1 消化样品平均粒径的变化
图13为藻油乳液以及藻油粉末在不同消化阶段的平均粒径变化。乳液消化前后，平均粒径由0.256 μm增加至12.80 μm，之后下降至10.42 μm，粉末消化前为46.51 μm，在口腔和胃部小幅增长，经过小肠消化后减少至32.44 μm。样品在口腔阶段变化不明显（P>0.05），表明口腔环境对样品形状没有产生显著影响。在胃消化阶段发生明显增长（P<0.05），是因为胃部的强酸环境对包埋状态产生了破坏，液滴以及粉体不再独立存在于体系中，囊壁的破坏导致了部分单元结构发生聚集，因此平均粒径变大。经过小肠消化后的样品被彻底消化分解，经历环境体系PH的变化以及胰酶，胰脂肪酶等的作用，样品中蛋白质以及脂肪结构均发生了改变，包埋体系被进一步破坏，因此平均粒径减小。HE等[43]对比了分别由大豆油和油菜籽油制备的两种乳剂在胃肠道消化过程中的平均粒径变化，同样发现乳剂粒径随着消化时间先增大后减小，与本文实验现象一致。
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图 13 消化样品平均粒径的变化Figure 13. Changes in the average particle size of the digested sample2.5.2 消化样品粒度分布的变化
图14为藻油乳液和藻油粉末在各个阶段消化前后的粒度分布变化。乳液在口腔阶段无明显变化，呈单峰分布（图14A）。经过胃消化后，峰形未发生明显变化但整体后移，且出现较小尾峰，表明整体液滴尺寸变大并有部分液滴聚集导致出现尾峰（图14B）。在小肠消化阶段，整体峰形发生改变，尾峰也发生后移，峰高增大，说明此时液滴尺寸不再均一（图14C），乳液的水包油结构被破坏，油相暴露于小肠环境。
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图 14 消化样品粒度分布的变化注：A-乳液口腔阶段；B-乳液胃阶段；C-乳液小肠阶段；D-粉末口腔阶段；E-粉末胃阶段；F-粉末小肠阶段。Figure 14. Changes of particle size distribution of digested samples粉末消化样品相较乳液的初始粒径更大，同样也更稳定。在口腔和胃部消化阶段均未出现明显变化（图14D、14E），说明大部分粉末能够以初始形态进入小肠消化阶段。证实了抗性淀粉包埋结构的稳定性，能够保护核心成分在口腔和胃部不被分解消化。在进入小肠消化阶段后粒径峰发生左移（图14F），即壁材在小肠环境中被消化分解，微胶囊尺寸变小，芯材部分开始释放。YU等[44]研究了添加MFGM和卵磷脂的婴儿配方奶粉在模拟消化过程中乳滴颗粒大小的变化发现，乳液在胃肠消化初期呈单峰分布，在胃肠消化末期呈双峰分布。在肠道消化结束时，HM的平均粒径同样变小，分析与特殊的MFGM结构有关。
2.5.3 消化样品的游离脂肪酸释放率
图15为藻油乳液、藻油粉末以及藻油在小肠阶段的NaOH消耗体积。通过各组样品实时消耗的NaOH体积观察其游离脂肪酸释放率。藻油最先停止释放游离脂肪酸，表明藻油在小肠消化开始阶段就被完全消化。藻油乳液在小肠阶段逐步释放游离脂肪酸，在70 min左右释放完毕。说明乳化能够有效延缓藻油在小肠阶段的释放。CHEN等[45]利用体外消化模型研究了β-胡萝卜素在纳米颗粒中与脂质一起给药或脂质单独给药时的生物可及性，发现纳米乳化形式的脂质增加了亲脂营养素的生物可及性。藻油粉末的缓释效果最佳，在小肠消化30 min前游离脂肪酸释放速率较快，之后持续缓慢释放，证实了抗性淀粉的包埋能够有效抵抗小肠的分解消化，达到使核心包埋成分缓慢释放的效果。HE等[46]用魔芋葡甘露聚糖（KGM）表征分离乳清蛋白（WPI）稳定的姜黄素乳状液消化特性时检测出在WPI稳定的姜黄素乳液中加入KGM可减缓乳液滴中游离脂肪酸和姜黄素在小肠阶段的释放速度。同样表明加入抗性淀粉或膳食纤维等抗消化成分可减缓油脂在小肠的释放速度。
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图 15 消化样品在小肠消化阶段NaOH消耗体积Figure 15. NaOH consumption volume of digested samples in small intestine digestion stage3. 结论
本文首先通过单因素实验以及响应面优化获得一个平均粒径为241.3 nm，稳定性好的藻油MFGM乳化体系。同时研究了不同杀菌工艺和保藏方式相互作用下对该乳化体系稳定性的影响，发现高温高压灭菌和低温保藏下的乳液在21天内保持着良好的物理稳定性和氧化稳定性。其次，探讨了以抗性淀粉为单一壁材制备油脂粉末的可行性，发现通过控制壁芯比以及进风温度能够使油脂包埋率由最低7.93%提升至56.74%。最后通过体外模拟消化发现藻油乳液和藻油粉末在口腔，胃消化阶段较为稳定，在小肠被逐渐分解消化。通过检测游离脂肪酸在小肠的释放率发现乳化和微囊化均有利于延缓藻油释放，提高DHA的生物可及性，加入抗性淀粉的藻油粉末缓释效果更好。希望本文能够为富含DHA的藻油产品开发以及MFGM包埋功能性活性成分的应用提供一定的理论支持。
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图 1 不同条件对藻油乳液平均粒径和稳定性的影响
注：A-蛋白质量浓度；B-卵磷脂质量浓度；C-剪切转速；D-均质次数；E-均质压力。
Figure 1. Effect of different conditions on average particle size and stability of algal oil emuLsion
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图 2 各因素间交互作用对乳液平均粒径影响的响应面及等高线
Figure 2. Response surface and contour line of influence of interaction among factors on average particle size of emuLsion
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图 4 各组乳液21天内平均粒径的变化
Figure 4. Changes of average particle size of emuLsion in each group within 21 d
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图 5 各组乳液21天内澄清指数的变化
Figure 5. Changes in clarification index of emuLsions in each group within 21 d
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图 6 各组乳液21天内过氧化值的变化
Figure 6. Changes of peroxide value of emuLsions in each group within 21 days
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图 7 各组乳液21天内硫代巴比妥酸反应物值的变化
Figure 7. Changes of thiobarbituric acid reactant value of emuLsions in each group within 21 days
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图 8 各组乳液21天内外观状态的变化
Figure 8. Changes in appearance of emuLsions in each group within 21 d
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图 9 不同壁芯比下藻油粉末的油脂包埋率
Figure 9. Oil entrapment rate of algal oil powder under different wall-to-core ratios
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图 10 不同进风温度下藻油粉末的油脂包埋率
Figure 10. Oil entrapment rate of algal oil powder at different inlet air temperatures
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图 12 藻油粉末的扫描电子显微镜图
注：A-205x；B-820x；C-2050x；D-3100x。
Figure 12. Scanning Electron Microscope image of algal oil powder
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图 13 消化样品平均粒径的变化
Figure 13. Changes in the average particle size of the digested sample
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图 14 消化样品粒度分布的变化
注：A-乳液口腔阶段；B-乳液胃阶段；C-乳液小肠阶段；D-粉末口腔阶段；E-粉末胃阶段；F-粉末小肠阶段。
Figure 14. Changes of particle size distribution of digested samples
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图 15 消化样品在小肠消化阶段NaOH消耗体积
Figure 15. NaOH consumption volume of digested samples in small intestine digestion stage
表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests
水平 因素 A大豆卵磷脂浓度（%） B乳清蛋白浓度（%） C均质压力（kPa） −1 0 0.8 40000 0 1 1.2 60000 1 2 1.6 80000 
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表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and resuLts of response surface test
实验号 A B C 平均粒径（nm） 1 2 1.2 80000 511.0 2 1 1.2 60000 268.3 3 1 1.2 60000 263.3 4 1 1.6 80000 478.7 5 2 1.6 60000 420.7 6 1 1.6 40000 548.3 7 1 1.2 60000 240.3 8 1 0.8 80000 648.7 9 0 0.8 60000 741.3 10 0 1.2 80000 561.0 11 2 0.8 60000 661.7 12 1 1.2 60000 264.7 13 0 1.6 60000 465.7 14 1 1.2 60000 230.3 15 1 0.8 40000 742.3 16 2 1.2 40000 580.7 17 0 1.2 40000 633.3
下载: 导出CSV
表 3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
变异源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 5.012E+05 9 55693.77 93.22 < 0.0001 ** A-大豆卵磷脂浓度 6460.06 1 6460.06 10.81 0.0133 * B-乳清蛋白浓度 96946.72 1 96946.72 162.27 < 0.0001 ** C-均质压力 11653.56 1 11653.56 19.51 0.0031 ** AB 300.44 1 300.44 0.5029 0.5012 AC 1.78 1 1.78 0.0030 0.9580 BC 144.00 1 144.00 0.2410 0.6385 A² 86060.92 1 86060.92 144.05 < 0.0001 ** B² 1.304E+05 1 1.304E+05 218.22 < 0.0001 ** C² 1.291E+05 1 1.291E+05 216.16 < 0.0001 ** 残差 4182.20 7 597.46 失拟项 3030.78 3 1010.26 3.51 0.1283 纯误差 1151.42 4 287.86 总和 5.054E+05 16 注：* 表示差异显著（P<0.05），** 表示差异极显著（P<0.01）。
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