Impact of Solid State Fermentation Using Eurotium cristatum on Phenolic Compounds, Enzymatic Activity and Antioxidant Capacity of “Xiguahong” Sweet Potato Leaves
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摘要: 为了红薯叶的高值化利用，采用冠突散囊菌对红薯叶进行固态发酵，并对发酵过程中红薯叶中的酚类物质含量、酶活以及抗氧化活性的动态变化进行研究。结果表明，经发酵处理，红薯叶中总酚和黄酮含量显著增加(P<0.05)，并在第6 d时达到峰值，分别为12.31 mg/g和11.1 mg/g，是未发酵组薯叶的1.97倍和2.31倍。固态发酵期间，总酚含量与α-淀粉酶活性（R2=0.749）、β-葡萄糖苷酶（R2=0.844）、纤维素酶（R2=0.674）、蛋白酶（R2=0.772）及多酚氧化酶（R2=0.822）的酶活性变化呈显著正相关（P<0.05）。高效液相色谱检测结果表明发酵并未改变红薯叶多酚的主要成分，除儿茶素外，其它多酚组分含量均显著提升（P<0.05）。冠突散囊菌发酵可显著增强红薯叶提取物的ABTS+和DPPH自由基清除能力（P<0.05），且发酵6 d组的抗氧化能力最强，分别是未发酵组的2.46倍和2.19倍，主成分分析结果表明，红薯叶固态发酵过程中酚类物质含量的升高是多种酶协同作用的结果，没食子酸、槲皮素、对香豆酸等酚类物质的释放是抗氧化能力增强的主要原因。因此，冠突散囊菌固态发酵是提升红薯叶酚类物质含量和抗氧化活性的有效途径，最佳发酵时间为6 d。Abstract: To valorize agricultural waste, sweet potato leaves were subjected to the solid-state fermentation using Eurotium cristatum. The dynamic changes in phenolic compounds, enzymatic activity, and antioxidant capacity during fermentation were studied. Results indicated that the total phenolic and flavonoid contents increased significantly in the initial stage of fermentation, reaching peak values of 12.31 mg/g and 11.1 mg/g on the 6th d, respectively, which were 1.97 and 2.31 times higher than that of potato leaves in the unfermented group. Enzymatic activities of α-amylase (R2=0.749), β-glucosidase (R2=0.844), cellulase (R2=0.674), protease (R2=0.772), and polyphenol oxidase (R2=0.822) showed a positive correlation with the total phenolic content (P<0.05). HPLC analysis revealed that the phenolic profile of fermented sweet potato leaves was similar to that of unfermented leaves. Except catechin, contents of each phenolic compound was significantly increased after fermentation. Furthermore, in the DPPH and ABTS+ assays, a significant improvement (P<0.05) was observed in the free radical scavenging ability of the methanolic extracts of fermented leaves. The fermented sample on the 6th d has the greatest radical scavenging activity against ABTS+, which is 2.46 times that of the unfermented sample, and DPPH, which is 2.19 times that of the unfermented sample. Principal component analysis indicated that the increase in the phenolic content was the result of synergistic action of hydrolytic enzymes secreted by E. cristatum. The improvement in the antioxidant capacity in response to the E. cristatum fermentation was mainly attributed to the release of gallic acid, quercetin, and p-coumaric acid during fermentation. These findings suggest that solid-state fermentation with E. cristatum is an effective way to improve the phenolic content and antioxidant capacity of sweet potato leaves while the optimum period of fermentation was 6 d.
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红薯是世界上需求量最大的粮食作物之一，中国在2021年的红薯产量约为8.9千万吨，占世界产量的53.32%[1]。豫西地区地理位置优越，红薯产业是当地农业的重要组成部分，普薯32号（西瓜红）因其营养成分高、易加工、适应广、抗逆性强等特点，被当地农民称为“致富薯”，自20世纪90年代由农技推广部门引入豫西后开始大面积种植，目前已成为豫西地区乡村振兴的重要产业[2]。红薯叶是红薯的地上部分，产量与红薯相当，但由于目前缺乏红薯叶类产品相应深加工技术及设备，除少量用作食物和动物饲料外大部分被作为废料丢弃[1]。随着人们消费观念的提升，对绿色有机食品的需求日益增大。红薯叶中富含多种功能性成分，如咖啡酰奎宁酸类衍生物、儿茶素、槲皮素等，具有预防心血管疾病、抗突变、抗肿瘤，抗氧化、降血糖、抑菌等功效[3]，在功能性食品开发等领域具有一定的研究价值。
冠突散囊菌隶属于散囊菌目曲霉菌属，俗称“金花”菌[4]。冠突散囊菌在生长过程中会分泌多种胞外酶，如纤维素酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，促进发酵基质中功能性成分的转化与释放，改善其生物活性[5]。Chen等[4]研究表明，大豆在发酵过程中，冠突散囊菌分泌的β-葡萄糖苷酶能促进大豆纤维素水解，也可将糖基异黄酮转化黄酮苷元[6]，并提高其酚类化合物的释放。Zhao等[7]研究表明，冠突散囊菌发酵过程中产生的胞外酶能够促进桑叶中酚类物质的转化与释放，经冠突散囊菌发酵后桑叶醇提物的抗氧化活性有着显著提升。
基于冠突散囊菌固态发酵能有效促进发酵基质中酚类物质的释放，因此，本研究将冠突散囊菌首次应用于红薯叶的固态发酵中，通过研究发酵过程中薯叶各种酚类物质的含量变化，探究不同发酵时间对酚类物质含量的影响，并筛选出最适宜的发酵时间。此外，通过研究冠突散囊菌在红薯叶发酵过程中的纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶的活性变化，探究发酵过程中酶活性变化与酚类物质之间的相互联系，并通过主成分分析，筛选薯叶抗氧化活性的主要影响因子，以期为促进薯叶的高值化利用提供有效的工艺途径和理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
红薯叶 普薯32号（西瓜红），采摘于河南省洛阳市伊川县薯乡薯业科创园；冠突散囊菌（Eurotium cristatum BNCC146563） 北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心；马铃薯葡萄糖琼脂培养基 青岛海博生物科技技术有限公司；绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、对香豆酸、阿魏酸、儿茶素、咖啡酸、没食子酸、槲皮素、山奈酚和芦丁 上海源叶生物科技有限公司，均为色谱纯；其余试剂均为国产分析纯。
MJ-250-I霉菌培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；LGJ-10D型真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；UV-2600型紫外可见分光光度计 龙尼柯（上海）仪器有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；R-1001VN旋转蒸发仪 郑州长城科贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 红薯叶发酵样品的制备
新鲜红薯叶用清水漂洗，在−25 ℃下预冻12 h后冷冻干燥48 h，置于121 ℃高压灭菌20 min，冷却至室温后，调节薯叶水含量至40%。取部分薯叶作为对照组，其它按接种量4%接入预先制备好的浓度为1.0×107 CFU/mL的菌悬液[8]，而后放置于28 ℃的恒温培养箱中发酵12 d，并于发酵2、4、6、8、10、12 d取样，冷冻干燥后粉碎过60目筛，在4 ℃避光条件下保存待测。对照组也放置于相同条件的培养箱中12 d，干燥粉碎后待测。
1.2.2 红薯叶中多酚样品的提取
称取1 g干燥样品粉末，加入20 mL 80%（v/v）甲醇溶液，4 ℃混合反应30 min后离心15 min（10000 r/min），取上清液于旋转蒸发仪中，在30 ℃下蒸发至干，用80%色谱级甲醇定容至5 mL得到红薯叶多酚提取物，在−20 ℃下保存备用。
1.2.3 总酚含量的测定
红薯叶中总酚含量采用FoLin-Ciocalteu比色法[9]进行测定，在760 nm处测定其吸光值，以没食子酸为标品绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.0008x+0.0013，R2=0.9919，以没食子酸当量（mg/g）来表示红薯叶中总酚含量。
1.2.4 黄酮含量的测定
红薯叶中黄酮总量的测定参考Zhao等[7]的方法，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，在510 nm 处测定吸光度，以芦丁为标准品绘制建立曲线：y=0.0001x−0.018，R2=0.9986。以芦丁当量（mg/g）来表示红薯叶中黄酮含量。
1.2.5 样品酶活性的测定
粗酶液的制备是按照Bhanja等[10]的方法稍作修改，准确称取0.3 g红薯叶发酵样品，加入6 mL去离子水，放入水浴摇床中于30 ℃ 160 rpm转速下提取1 h，随后8000 g离心10 min，得到的上清液即为粗酶液，保存待测。酶活性均以每克干红薯叶中含有的酶活数（U/g）表示。
1.2.5.1 α-淀粉酶
采用3,5二硝基水杨酸（DNS）法对α-淀粉酶活性进行测定[10]，以葡萄糖为标准品建立标准曲线：y=0.2166x−0.0392，R2=0.993。α-淀粉酶活力单位（U）定义为：在50 ℃下，水解淀粉每分钟释放1 μmol葡萄糖所消耗的酶量。
1.2.5.2 β-葡萄糖苷酶
参考Chen等[11]的方法对β-葡萄糖苷酶活性进行测定。以对硝基苯酚为标准品建立标准曲线：y=0.0042x−0.0056，R2=0.999。β-葡萄糖苷酶活力单位（U）定义为：在测定条件下，β-葡萄糖苷酶催化底物每分钟释放1 μmol对硝基苯所消耗的酶量。
1.2.5.3 纤维素酶
采用3,5二硝基水杨酸（DNS）法对纤维素酶活性进行测定[10]。以葡萄糖为标准品建立标准曲线：y=0.2166x−0.0392，R2=0.993。纤维素酶活力单位（U）定义为：在测定条件下，每分钟水解纤维素生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。
1.2.5.4 蛋白酶
参照Chen等[11]的方法对蛋白酶活性进行测定，以酪氨酸为标准品绘制标准曲线：y=0.0727x+0.0004，R2=0.993。蛋白酶活力单位（U）定义为：在40 ℃下水解酪蛋白每分钟释放1 μg酪氨酸所消耗的酶量。
1.2.5.5 多酚氧化酶
参考王丽霞等[12]的方法对多酚氧化酶活性进行测定，多酚氧化酶活力（单位：U）定义为：在测定条件下，以每分钟吸光度变化0.01定义为1U。
1.2.6 红薯叶发酵前后酚类化合物的HPLC分析
参考Fu等[3]的方法，采用Agilent 1260高效液相色谱仪测量红薯叶发酵前后活性物质含量变化，本实验采用ORBA×SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30 ℃，以0.5 mL/min的流速对发酵前后红薯叶样品进行分析，固定样品进样量为10 μL，在波长为280 nm下进行检测。流动相组成为A：0.1％甲酸水溶液，B：色谱级甲醇；梯度洗脱条件为：0~15 min（0~10% B），15~20 min（10%~35% B），20~35 min（35%~80% B），35~36 min（80%~100% B），36~40 min（100% B），40~50 min（100%~10% B）。根据保留时间对所测定的酚类化合物进行定性分析，外标法根据峰面积进行定量分析。
1.2.7 抗氧化活性的测定
将1.2.2制得的红薯叶多酚提取物稀释至浓度为1~5 mg/mL，并配制浓度为10~50 μg/mL的Vc标准溶液备用。
1.2.7.1 ABTS+自由基清除能力测定
参考Shin等[13]的方法，将7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液等比例混合，在黑暗条件下室温放置12 h，然后用磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）进行稀释，使其在734 nm下的吸光值为0.70±0.02。将不同浓度的红薯叶多酚提取液分别与ABTS溶液按1:4（v/v）充分混合，遮光反应6 min，在734 nm处测定吸光值，以抗坏血酸作为阳性对照。ABTS+自由基清除能力按式（1）计算，并最终以Vc当量值表示。
(1) 式中：A1表示样品与ABTS溶液混合所测吸光度；A0表示ABTS＋工作液空白吸光度。
1.2.7.2 DPPH自由基清除能力测定
参考Chen等[4]的方法稍作改动，用无水乙醇配制浓度为0.4 mmol/L的DPPH溶液备用。将不同浓度的红薯叶多酚提取液与DPPH、无水乙醇分别等比例混合，避光反应0.5 h，在517 nm 处测定吸光度，以抗坏血酸溶液作为阳性对照。DPPH自由基清除能力按式（2）计算，并最终以Vc当量值表示。
(2) 式中：A0表示DPPH溶液和无水乙醇各1 mL混合所测吸光度；Ai表示DPPH溶液和样品溶液各1 mL混合所测吸光度；Aj表示无水乙醇和样品溶液各1 mL混合所测吸光度。
1.3 数据处理
试验数据均为3次重复试验所得的平均值，数据以均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件进行显著性和相关性分析，采用Origin 2024及SIMCA软件作图。
2. 结果与分析
2.1 冠突散囊菌发酵对红薯叶酚类物质含量的影响
酚类化合物被认为是食物中的天然抗氧化剂和重要的生物活性物质[4]，红薯叶中的酚类化合物主要包括黄酮和酚酸两大类[3]。图1显示，未发酵薯叶中总酚、黄酮含量分别为6.24 mg/g、4.82 mg/g。发酵初期（第2~6 d），冠突散囊菌在生长繁殖同时分泌多种胞外酶，如纤维素酶、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、苯丙氨酸解氨酶等。植物多酚多与果胶或纤维素等生物大分子共价连接，部分以难溶结合态多酚的形式存在，而这些水解酶能够破坏薯叶的细胞壁结构，从而促进各种结合态酚类物质的释放[14−15]。β-葡萄糖苷酶能够切断糖苷型异黄酮中的糖苷键，将黄酮苷类化合物转化成黄酮苷元类物质，从而促进黄酮类物质的释放[6]。发酵第6 d时，红薯叶中多酚、黄酮含量达到峰值，与未发酵组相比，分别显著增加了49.3%（P<0.05）和58.1%（P<0.05）。在冠突散囊菌发酵大豆和青稞的研究中[16−17]，发现其总酚、黄酮和黄豆苷元的含量均显著提高，青稞中的总酚含量达到未发酵组的1.5倍，黄酮含量是未发酵青稞的1.6倍，这与本研究结果一致。发酵6 d后，薯叶中总酚及黄酮含量逐渐下降，这是由于发酵基质中营养物不足，微生物产酶能力降低，且酚类物质被微生物生长消耗所致[18]。综上所述，冠突散囊菌固态发酵能显著提高薯叶中酚类物质含量（P<0.05），且在发酵第6 d时总酚、黄酮含量达到最大值。
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图 1 红薯叶发酵过程中总酚含量和总黄酮含量的变化注：不同字母表示相同指标在不同发酵时间内差异显著（P<0.05）。Figure 1. Dynamic changes in the total polyphenol content and the total flavonoid content of sweet potato leaves during fermentation2.2 红薯叶发酵过程中酶活性变化及其与总酚含量的相关性分析
研究发现，冠突散囊菌在植物基质上生长的同时会分泌多种胞外酶，经过复杂的酶促反应对植物中的生物活性成分分解、转化及结构修饰，从而提高其含量或产生新的活性物质[19]。本研究对冠突散囊菌发酵红薯叶过程中产生的5种关键酶酶活性变化进行检测，结果如图2所示。
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图 2 红薯叶发酵过程中α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶活力的变化注：不同字母表示同种酶在不同发酵时间差异显著（P<0.05）。Figure 2. Dynamic changes in the activities of α-amylase,β-glucosidase , cellulase during sweet potato leaves fermentation2.2.1 发酵过程中α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶及纤维素酶的活性变化
α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶及纤维素酶均为真菌分泌的水解酶，能够将植物基质的多糖大分子不断分解供能，同时破坏植物细胞壁，促进胞内物质溶出[20]。如图2所示，在薯叶发酵2~6 d时，随发酵时间的延长，α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶及纤维素酶活性显著升高（P<0.05），并在6 d时达到最大值，分别为114.59 U/g、117.69 U/g及305.26 U/g，而后开始下降。推测可能是在发酵初期，冠突散囊菌对自身生长繁殖的营养需求较高，因此，需要分泌大量复合酶系对基质中的营养物质进行水解，供给自身生长。至发酵后期，基质中的营养物质已被消耗，菌体的生长代谢减缓，进而导致酶分泌减少[18,21]。如图4a~c所示，线性相关分析结果表明，总酚含量与α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶及纤维素酶的决定系数R2分别为0.727、0.821及0.676，均呈显著正相关（P<0.05），这与Wang等[22]研究结果类似，番石榴叶经真菌发酵后可以产生丰富的α-淀粉酶、纤维素酶及β-葡萄糖苷酶，其活力变化与可溶性多酚的含量显著正相关（P<0.05）。
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图 4 红薯叶固态发酵过程中总酚含量变化与α-淀粉酶（a）、β-葡萄糖苷酶（b）、纤维素酶（c）、蛋白酶（d）和多酚氧化酶（e）活性的线性相关图Figure 4. Linear correlations between the total phenolic content with the activities of α -amylase (a), β -glucosidase (b), cellulase (c), protease (d) and polyphenol oxidase (e) during solid-state fermentation of sweet potato leaves2.2.2 发酵过程中蛋白酶的活性变化
如图3所示，在薯叶固态过程发酵中，蛋白酶活性在94.66~140.64 U/g范围内变化，整体呈升高后降低的变化趋势，发酵前期，蛋白酶活性迅速升高,在第8 d时达到最高值为140.64 U/g，与未发酵组相比，显著增加了48.6%（P<0.05）。研究报道表明，利用冠突散囊菌发酵大豆、桑叶等能够产生大量的蛋白酶，可以有效的水解发酵基质中多酚与蛋白质间的共价键[4−7]。如图4d所示，线性相关分析结果表明，蛋白酶活性与总酚含量变化两者呈显著正相关（R2=0.727，P<0.05）。因此，冠突散囊菌分泌的蛋白酶能够促进薯叶中与蛋白质相结合的多酚物质的释放。
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图 3 红薯叶发酵过程中蛋白酶、多酚氧化酶活力的变化注：不同字母表示同种酶在不同发酵时间差异显著（P<0.05）。Figure 3. Dynamic changes in the activities of protease, PPO during sweet potato leaves fermentation2.2.3 发酵过程中多酚氧化酶的活性变化
在薯叶固态过程发酵中，多酚氧化酶活性的变化情况与其他四种酶相似，整体呈升高后降低的变化趋势（图3）。在发酵前期，多酚氧化酶活性大幅度增长，并在发酵6 d时酶活性达到峰值为28.12 U/g，与未发酵组相比，酶活性显著增加（P<0.05），而后开始逐渐下降。研究表明，多酚氧化酶是一类重要的氧化酶类，植物中多酚氧化酶活性与多酚含量呈正相关[23]。如图4e所示，线性相关分析可知，多酚氧化酶活性与总酚含量变化呈显著正相关（R2=0.831，P<0.05），这表明在红薯叶发酵过程中，多酚氧化酶与酚类物质的合成与转化密切相关。
综上所述，微生物发酵过程中对于多酚等活性物质的释放是多种酶系协同作用的结果，多酚氧化酶能促进多酚类物质的氧化，纤维素酶能够破坏植物细胞壁结构，α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶及蛋白酶能够切断与酚类物质相结合的共价键，将不溶性结合的酚类物质转化为可溶性的酚类物质，从而促进结合性酚类物质的释放[24−25]。
2.3 红薯叶发酵过程多酚组分的变化
经高效液相色谱法鉴定了红薯叶发酵前后11种主要酚类化合物的变化情况（图5），包括7种酚酸类分别是没食子酸（峰1）、绿原酸（峰2）、隐绿原酸（峰3）、咖啡酸（峰4）、对香豆酸（峰6）、异绿原酸A（峰7）、阿魏酸（峰9），3种黄酮类即芦丁（峰8）、槲皮素（峰10）、山奈酚（峰11）及儿茶素（峰5）。
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图 5 发酵组（6 d）与未发酵组红薯叶的多酚组分液相色谱图Figure 5. HPLC chromatograms of the polyphenol profiles in sweet potato leaves after 6 d fermentation and unfermented leaves大量研究表明，利用冠突散囊菌进行固态发酵能够显著增加发酵基质中各种酚类物质含量[4,6−7]。由图6可知，在本研究中，经冠突散囊菌固态发酵后，红薯叶的酚类化合物组成无显著变化，且与未发酵薯叶相比，酚酸类物质含量均显著（P<0.05）提升。其中，绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A和对香豆酸的含量都在发酵第4 d时达到最高，分别是未发酵薯叶的1.25倍、1.28倍、1.34倍和1.50倍，阿魏酸的含量在发酵第6 d时达到最高，与未发酵组相比也有着显著升高（P<0.05）。研究表明，绿原酸是植物体利用苯丙氨酸经莽草酸-苯丙酸途径合成，苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶作用脱氨基形成肉桂酸，而后经羟基化成对香豆酸，进一步转化为咖啡酸，再与奎宁酸缩合生成一系列绿原酸异构体，或经咖啡酸-3-O甲基转移酶的作用转化为阿魏酸[26]。冠突散囊菌发酵中会产生大量苯丙氨酸解氨酶[27]，能够促进对香豆酸的合成及绿原酸异构体的转化。此外，对香豆酸和阿魏酸在植物细胞壁中经酯键和醚键将木质素和多糖连接[28]。因此，发酵后薯叶中绿原酸异构体含量增加，可能是由于冠突散囊菌分泌的多种水解酶通过协同作用降解植物的纤维组织，破坏细胞壁结构，从而使酚酸被释放并溶出。咖啡酸的含量与未发酵薯叶相比有着显著提升（P<0.05），且最大值出现在第6 d，滞后于绿原酸异构体。研究表明，绿原酸异构体可以被脂肪酶和果胶酶降解转化为咖啡酸[29]。由此可推测，薯叶中咖啡酸含量在第4~6 d显著增加，而绿原酸异构体含量急剧减少的原因可能是冠突散囊菌分泌的果胶酶能够促进绿原酸异构体降解生成咖啡酸。没食子酸含量在发酵前期（第2~6 d）显著增加（P<0.05），其原因可能是红薯叶中含有没食子酰儿茶素[30]，而冠突散囊菌分泌的单宁酶可将其降解为没食子酸[31]。
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图 6 红薯叶发酵过程中酚类化合物含量变化注：不同字母表示同种酚类物质在不同发酵时间内差异显著（P<0.05）。Figure 6. Dynamic changes in the content of phenolic compounds during sweet potato leaves fermentation发酵初期，红薯叶中的黄酮组分（山奈酚、槲皮素和芦丁）的含量均显著上升，这与冠突散囊菌发酵的甜荞、大豆等变化一致[4,27]。芦丁含量在发酵后期急剧下降，从最大值4.4 mg/g（第6 d）降至0.8 mg/g（第12 d），而山奈酚和槲皮素的降幅仅为3.64%和10.52%。推测为冠突散囊菌在代谢过程中水解黄酮苷（即芦丁）的糖苷键，并经酶促反应将其转化为黄酮醇（即槲皮素和山奈酚）的结果[4]。儿茶素含量在薯叶发酵过程中呈不规则变化，但与未发酵组相比总体呈下降趋势，其原因可能是没食子酰儿茶素的降解与多酚氧化酶催化其交联聚集的综合作用导致的[32]。
2.4 红薯叶发酵过程中体外抗氧化活性变化及不同时期发酵薯叶的差异性分析
酚类物质有较强的抗氧化活性，发酵样品自由基清除能力的的增强与多酚含量的增加密切相关[11]。如表1所示,发酵后的薯叶醇提物具有较好的抗氧化能力，在发酵过程中，红薯叶样品ABTS+和DPPH自由基清除能力均与酚类物质含量的变化情况相似，整体均呈先升高后降低的趋势。与未发酵样品相比，在发酵第6 d时，红薯叶样品ABTS+和DPPH自由基清除能力最强，分别为29.24±0.44 g Vc·100 g−1和28.09±0.87 g Vc·100 g−1，是未发酵薯叶的2.45倍和2.19倍。这与冠突散囊菌发酵后的葛根、铁观音茶等在自由基清除实验中的表现一致[33−34]。
表 1 发酵不同时间（2~12 d）的红薯叶及未发酵红薯叶的自由基清除能力Table 1. Radical scavenging ability of fermented sweet potato leaves following various fermentation periods (2~12 d) and unfermented leaves (Control)发酵时间（d） ABTS自由基清除能力
（g Vc·100 g−1）DPPH自由基清除能力
（g Vc·100 g−1）Control 11.89±0.10f 12.80±0.03f 2 20.70±0.13e 16.58±0.33e 4 26.81±0.28b 24.15±0.76b 6 29.24±0.44a 28.09±0.87a 8 25.32±0.44c 23.09±0.48c 10 23.64±0.36d 20.08±0.24d 12 21.69±0.22e 17.04±0.98e 注：不同字母代表差异显著（P<0.05） 为了探究发酵过程中薯叶酚类物质含量变化、5种酶活性变化及抗氧化活性变化之间的相互关系，采用皮尔逊相关性分析及主成分分析法对它们之间的相关性进行分析。如图7，皮尔逊相关性分析结果显示，发酵过程中，薯叶总酚和黄酮含量均与自由基清除能力呈极显著正相关（P<0.001）。除儿茶素、山奈酚外，其余酚类化合物均与ABTS+自由基清除活性呈显著正相关（P<0.05）。DPPH自由基清除活性与没食子酸、咖啡酸、阿魏酸呈极显著正相关（P<0.001），与槲皮素、山奈酚呈显著正相关（P<0.05）。5种水解酶活性与总酚、黄酮含量均呈显著正相关（P<0.05），其中，咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚与多种胞外酶均呈显著正相关（P<0.05），而儿茶素与多酚氧化酶、蛋白酶、α-淀粉酶呈极显著负相关（P<0.01）。
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图 7 发酵红薯叶的酶活力、酚类物质含量及抗氧化活性相关性分析Figure 7. Correlation analysis of enzymatic activity, phenolic compound content and antioxidant activity of fermented sweet potato leaves经Origin软件进行主成分分析（PCA），两主成分占总方差信息的84.2%，表明该方法能够较好的反映研究变量之间的关系。由PCA分析结果可知（图8a），薯叶醇提物的ABTS+和DPPH自由基清除能力与其总酚、总黄酮含量的分布相近，均位于PC1右侧位置，呈显著正相关，表明红薯叶抗氧化活性的提高主要归因于固态发酵过程中多酚及黄酮类化合物的释放。在PCA图中绿原酸、隐绿原酸及异绿原酸A这三种咖啡酰奎宁酸与对香豆酸聚拢，并与ABTS分布于同一象限且相近，表明这几种酚酸与薯叶的ABTS+自由基清除活性相关联。Xu等[35]研究发现，单咖啡酰奎宁酸（绿原酸和隐绿原酸）具有相似的自由基清除能力，而二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸A）的抗氧化性则高于单咖啡酰奎宁酸，这与图6中相关性分析结果一致。DPPH与咖啡酸、阿魏酸等分布相近，而山奈酚与DPPH及ABTS相距较远，这表明在薯叶发酵过程中咖啡酸、阿魏酸的含量变化是影响DPPH自由基清除活性的主要原因。Chen等[36]研究表明，酚酸的DPPH自由基清除能力与其苯环上的取代基相关，含丙烯酸基的羟基肉桂酸衍生物比含羧基的羟基苯甲酸衍生物的抗氧化能力更强。因此，属于羟基肉桂酸衍生物的咖啡酸和阿魏酸与DPPH自由基清除能力的相关性更强，而黄酮的抗氧化能力则受B环的羟基取代基的数量影响[37]，所以山奈酚与其它黄酮相比自由基清除率较弱，这也是山奈酚与DPPH及ABTS在PCA图中相距较远的原因。
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图 8 （a）：发酵红薯叶的酶活力、酚类物质含量及抗氧化活性的主成分分析图 （b）：不同发酵时期红薯叶的PCA评分图Figure 8. (a): Principal Component Analysis (PCA) score plot of enzymatic activity, phenolic compound content and antioxidant activity of fermented sweet potato leaves (b): PCA score plot of sweet potato leaves with different fermentation periods五种水解酶与总酚、总黄酮及除儿茶素外的酚类化合物均分布于PC1右侧，说明在固态发酵过程中，多酚、黄酮和大多数酚类化合物的含量变化均与冠突散囊菌产生的水解酶相关，如红薯叶中绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸缩合而成的缩酚类成分，冠突散囊菌分泌的胞外酶能够促进绿原酸水解合成咖啡酸，再经咖啡酸-3-O甲基转移酶的作用转化为阿魏酸[29]。槲皮素、山奈酚属于黄酮苷元，在发酵过程中冠突散囊菌分泌的水解酶，如β-葡萄糖苷酶、纤维素酶等，能够催化糖基异黄酮转化为黄酮苷元[4]。从PCA图可以看出，槲皮素、芦丁及总黄酮与β-葡萄糖苷酶聚集，这表明黄酮组分释放与此酶密切相关。
图8b显示了不同发酵时间红薯叶样品的差异。图中未发酵组（Control）与发酵样品显著分离，且分布在PC1的负方向，表明未发酵红薯叶的酶活力、酚类物质含量及抗氧化活性较低。发酵4、6和8 d的样品均位于PC1的正方向，且发酵6 d样品位于PC1最右侧，说明其酚类物质含量最高且抗氧化活性最强。PCA分析表明发酵时间对红薯叶样品酚类化合物含量、酶活性及抗氧化活性的变化有重要影响。
3. 结论
本研究利用冠突散囊菌对红薯叶进行固态发酵，发酵后其总酚和黄酮含量均有显著提升（P<0.05），并在第6 d时达到的峰值，分别是未发酵薯叶的1.97倍和2.31倍。此外，冠突散囊菌在发酵过程中分泌多种胞外酶，包括β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶及多酚氧化酶，这5种胞外酶活性与多酚含量呈显著正相关（P<0.05），表明酚类物质的释放是多种酶协同作用的结果。高效液相色谱检测表明，发酵并未改变多酚组分的组成，除儿茶素外的其它多酚化合物含量均显著增加（P<0.05）。抗氧化结果表明，经冠突散囊菌发酵后，薯叶ABTS+、DPPH自由基清除能力均显著提升（P<0.05）。相关性分析结果表明红薯叶样品在固态发酵过程中抗氧化活性的增强主要归因于总酚和黄酮含量的增加，其中没食子酸、槲皮素、对香豆酸等酚类物质是影响抗氧化活性的主要因子。主成分分析结果表明发酵6 d样品酚类物质含量最高且抗氧化活性最强。因此，可确定红薯叶最佳发酵时间为6 d。
综上所述，冠突散囊菌发酵可以显著提高红薯叶中酚类物质含量及抗氧化活性（P<0.05），为提升农业废料红薯叶的保健功效提供了理论依据。后续研究可聚焦在冠突散囊菌对发酵薯叶多酚释放转化及代谢的酶学机制研究以及红薯叶多酚在体内的消化代谢机制，为未来发酵型红薯叶功能食品，如发酵型薯叶茶，薯叶复合饮料，及薯叶复合面点的开发奠定理论基础。
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图 1 红薯叶发酵过程中总酚含量和总黄酮含量的变化
注：不同字母表示相同指标在不同发酵时间内差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Dynamic changes in the total polyphenol content and the total flavonoid content of sweet potato leaves during fermentation
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图 2 红薯叶发酵过程中α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶活力的变化
注：不同字母表示同种酶在不同发酵时间差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Dynamic changes in the activities of α-amylase,β-glucosidase , cellulase during sweet potato leaves fermentation
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图 4 红薯叶固态发酵过程中总酚含量变化与α-淀粉酶（a）、β-葡萄糖苷酶（b）、纤维素酶（c）、蛋白酶（d）和多酚氧化酶（e）活性的线性相关图
Figure 4. Linear correlations between the total phenolic content with the activities of α -amylase (a), β -glucosidase (b), cellulase (c), protease (d) and polyphenol oxidase (e) during solid-state fermentation of sweet potato leaves
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图 3 红薯叶发酵过程中蛋白酶、多酚氧化酶活力的变化
注：不同字母表示同种酶在不同发酵时间差异显著（P<0.05）。
Figure 3. Dynamic changes in the activities of protease, PPO during sweet potato leaves fermentation
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图 5 发酵组（6 d）与未发酵组红薯叶的多酚组分液相色谱图
Figure 5. HPLC chromatograms of the polyphenol profiles in sweet potato leaves after 6 d fermentation and unfermented leaves
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图 6 红薯叶发酵过程中酚类化合物含量变化
注：不同字母表示同种酚类物质在不同发酵时间内差异显著（P<0.05）。
Figure 6. Dynamic changes in the content of phenolic compounds during sweet potato leaves fermentation
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图 7 发酵红薯叶的酶活力、酚类物质含量及抗氧化活性相关性分析
Figure 7. Correlation analysis of enzymatic activity, phenolic compound content and antioxidant activity of fermented sweet potato leaves
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图 8 （a）：发酵红薯叶的酶活力、酚类物质含量及抗氧化活性的主成分分析图 （b）：不同发酵时期红薯叶的PCA评分图
Figure 8. (a): Principal Component Analysis (PCA) score plot of enzymatic activity, phenolic compound content and antioxidant activity of fermented sweet potato leaves (b): PCA score plot of sweet potato leaves with different fermentation periods
表 1 发酵不同时间（2~12 d）的红薯叶及未发酵红薯叶的自由基清除能力
Table 1 Radical scavenging ability of fermented sweet potato leaves following various fermentation periods (2~12 d) and unfermented leaves (Control)
发酵时间（d） ABTS自由基清除能力
（g Vc·100 g−1）DPPH自由基清除能力
（g Vc·100 g−1）Control 11.89±0.10f 12.80±0.03f 2 20.70±0.13e 16.58±0.33e 4 26.81±0.28b 24.15±0.76b 6 29.24±0.44a 28.09±0.87a 8 25.32±0.44c 23.09±0.48c 10 23.64±0.36d 20.08±0.24d 12 21.69±0.22e 17.04±0.98e 注：不同字母代表差异显著（P<0.05） 
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