Optimization of the Fermentation Enrichment Method for Oat Non-starch Polysaccharides and Study of Their Immunostimulatory Activity
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摘要: 为提高燕麦非淀粉多糖（ONSP）的产率，优化ONSP的提取工艺并探究其免疫活性。本研究采用微生物发酵辅助提取，并利用单因素实验、响应面试验优化了微生物发酵辅助提取燕麦非淀粉多糖（ONSP1）的提取工艺。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定ONSP的结构，同时对ONSP的免疫活性进行探究，并与传统热水浸提法提取出的燕麦非淀粉多糖（ONSP2）进行比较。结果表明：ONSP1的最佳提取工艺为接菌量5%，发酵温度34 ℃，发酵时间26 h，此时ONSP1的产率为8.60%±0.04%。ONSP1和ONSP2均由葡萄糖、阿拉伯糖和木糖组成，而ONSP1的阿拉伯糖和木糖含量显著高于ONSP2（P<0.05）。检测发现，虽然ONSP1的分子量（47.2 kDa）显著低于ONSP2的分子量（53.2 kDa），但是ONSP1的β-葡聚糖含量显著高于ONSP2（P<0.05）。并且ONSP1和ONSP2均能促进RAW264.7细胞增殖，ONSP1表现出更强的免疫刺激活性。综上所述，微生物发酵富集法得到的燕麦非淀粉多糖中β-葡聚糖含量更高，免疫刺激活性更强。本研究为进一步探究燕麦非淀粉多糖的结构特征、免疫刺激活性及其构效关系提供新的见解。Abstract: In order to enhance the yield of oat non-starch polysaccharide (ONSP), the extraction process was optimized and its immunological activity was investigated. This study employed microbial fermentation-assisted extraction, optimizing the process for oat non-starch polysaccharide (ONSP1) using a one-way response surface methodology. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were employed to determine the structural characteristics of ONSP. Additionally, the immunological activity of ONSP was investigated and compared with that of oat non-starch polysaccharide (ONSP2) extracted through the conventional hot water method. The results demonstrated that the optimal extraction process for ONSP1 was achieved with a 5% of the inoculum and fermentation at 34 ℃ for 26 h, resulting in a yield of ONSP1 at 8.60%±0.04%. Both ONSP1 and ONSP2 were composed of glucose, arabinose, and xylose, with the content of arabinose and xylose varying. The results demonstrated that the β-glucan content of ONSP1 was significantly higher than that of ONSP2. Despite the lower molecular weight of ONSP1 (47.2 kDa) compared to ONSP2 (53.2 kDa), ONSP1 had a significantly higher β-glucan content. Furthermore, both ONSP1 and ONSP2 demonstrated the capacity to promote the proliferation of RAW264.7 cells, with ONSP1 exhibiting a more pronounced immune-stimulating activity. In conclusion, microbial fermentation enrichment resulted in oat non-starch polysaccharides with a higher β-glucan content and stronger immunostimulatory activity. This study provides new insights for further investigation into the bioimmunological activities and structural relationships of oat non-starch polysaccharides.
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燕麦因其富含蛋白质、矿物质、维生素及可溶性膳食纤维，具有很高的营养价值，并且对人体健康有益，因此被广泛应用食品领域中[1−2]。燕麦具有降低胆固醇、调节血糖、血脂水平和抗肿瘤等作用，长期食用可以缓解高血糖，预防心血管疾病[3−6]，因此在食品领域得到了广泛的应用。其中，燕麦非淀粉多糖被认为是燕麦的主要活性成分之一[7]。燕麦非淀粉多糖主要是由各种单糖成分组成，包括葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖以及通过β-1,3-键和β-1,4-键连接而成的β-葡聚糖[8]。研究表明，燕麦非淀粉多糖具有降血糖、降血脂等作用[9−10]。然而，目前燕麦非淀粉多糖的传统提取方法提取效率低，耗时长，提取出的燕麦多糖免疫活性较差，难以满足生产需求[11]。因此，迫切需要寻找一种更高效，快速且提高燕麦多糖生物活性的提取方法。
微生物发酵辅助提取法作为一种新兴的提取技术，是利用微生物在发酵过程中产生的代谢物，可以轻易从植物细胞中释放出有效成分[12]。微生物发酵辅助提取具有操作安全方便、反应条件温和、副产物无毒等优点，是提取多糖的一种高效环保的方法[13]。研究表明，与传统提取方法相比，微生物发酵辅助提取法对多糖的提取率提高了79.77%[14]。微生物发酵辅助提取在提高多糖产率的同时，还极大地提高了有效成分的功能性，以满足商业产品的要求[15]。Wang等[16]利用植物乳杆菌发酵提取五味子多糖，发现发酵提取的多糖表现出更好的肠道菌群调节能力。类似的研究发现，利用微生物发酵提取的多糖具有较好的免疫活性[17]。Wang等[18]利用植物乳杆菌发酵提取绿尖秋葵多糖，结果表明发酵提取的多糖表现出优异的免疫调节活性。但是，目前关于微生物发酵辅助提取燕麦非淀粉多糖的研究却鲜有报道。
因此，本研究采用微生物发酵辅助提取燕麦非淀粉多糖，并对关键工艺参数进行优化。然后通过红外光谱、单糖组成和甲基化分析对所得的燕麦非淀粉多糖进行结构分析及免疫特性评价，并与热水浸提法所得的燕麦非淀粉多糖进行对比，以期为开发燕麦非淀粉多糖功能性食品资源提供一种有前景的方法。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
燕麦种子 青海西宁生物科技有限公司；高活性干酵母、酿酒干酵母 安琪儿酵母有限公司；嗜热链球菌 郑州百益宝生物科技有限公司；β-葡聚糖标准品 纯度75%，美国西格玛公司；β-葡聚糖检测试剂盒 爱尔兰Megazyme公司；RAW264.7细胞 美国类型培养物保藏中心（ATCC）；RPMI-1640培养基、青霉素/链霉素和胎牛血清（FBS） 美国马里兰州沃克斯维尔龙沙公司；耐高温α-淀粉酶（40000 U/g） 上海麦克林生化科技股份有限公司；抗体 圣克鲁斯生物技术公司。
FW100型高速粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；LDZX-75L-I型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DRP-9082型恒温培养箱 上海培因实验仪器有限公司；HH-6型恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；DSH-50-10型水分测定仪 上海平轩科学仪器有限公司；WQF-530A型傅里叶红外光谱仪 北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司；TSKG 5000PW色谱分析柱 东曹（上海）生物科技有限公司；Spectrostar nano型酶标仪 德国BMG LABTECH公司；CytoFLEX型流式细胞仪 贝克曼库尔特公司；MS-H-ProT大龙LCD数控定时加热型磁力搅拌器 大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；ME104型电子分析天平 梅特勒托利多科技（中国）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 燕麦非淀粉多糖提取
1.2.1.1 燕麦预处理
将燕麦种子清洗后烘干，用高速粉碎机将其研磨至粉末状后过100目筛，供后续实验使用。
1.2.1.2 微生物发酵辅助提取法
根据Wu等[19]的研究，称取6 g燕麦粉，加入96 mL蒸馏水，混合后高压灭菌（105 ℃，20 min），并加入以5%燕麦粉质量的菌粉，在发酵温度34 ℃中发酵26 h。发酵后，将pH调至6.0，并在燕麦发酵液中加入0.06 g耐高温α-淀粉酶去除淀粉30 min（水浴温度95 ℃），直至碘检测表明燕麦发酵液中无淀粉。燕麦发酵液冷却至室温后，4000 r/min离心15 min后取上清液，加入3倍体积的95%乙醇静置沉淀12 h后收集沉淀，将沉淀物烘干（30 ℃）后的燕麦非淀粉多糖为ONSP1。
1.2.1.3 热水浸提法
采用Climova[20]描述的方法，并进行优化。将6 g燕麦粉与96 mL蒸馏水中混合后在52 ℃水浴中搅拌3 h，冷却至室温后将pH调至6.0，并在样液中加入耐高温α-淀粉酶（40000 U/g）去除淀粉30 min（水浴温度95 ℃），直至碘检测表明样液中无淀粉。然后与上述微生物发酵辅助提取法相同的步骤，得到燕麦非淀粉多糖为ONSP2。
1.2.2 微生物发酵富集提取工艺优化
1.2.2.1 选择菌种及菌种复配比
本研究以燕麦全粉为发酵底物，菌种添加量为5%（g/100 g），料液比为1:16（g/mL），发酵时间为26 h，发酵温度为34 ℃。考察高活性干酵母（HADY）、酿酒干酵母（BY）和嗜热链球菌（ST）以及HADY和ST在1:1、1:2、1:3、2:1和3:1（质量比）下的组合比例对ONSP1产率的影响，并与ONSP2产率进行对比。
1.2.2.2 单因素实验
以燕麦非淀粉多糖产率为指标，考察不同料液比（1:12、1:14、1:16、1:18和1:20 g/mL）；接菌量（3%、4%、5%、6%和7%）；发酵时间（22、24、26、28和30 h）；发酵温度（30、32、34、36和38 ℃）对燕麦非淀粉多糖产率的影响，燕麦非淀粉多糖的产率按照以下公式计算：
1.2.2.3 响应面优化
在单因素实验结果的基础上，利用响应面软件选择接菌量、发酵时间和发酵温度进行三因素三水平的的Box-Behnken Design（BBD）实验，以燕麦非淀粉多糖产率为响应值，因子和水平设计见表1。
表 1 响应面因素和水平Table 1. Factors and levels of response surface test水平 因素 A发酵温度（℃） B接菌量（%） C发酵时间（h） −1 32 4 24 0 34 5 26 1 36 6 28 1.2.3 理化性质
采用DC蛋白测定试剂盒和Lowry法[21]、苯酚-硫酸法[22]测定ONSP1和ONSP2的蛋白质、总碳水化合物含量。
燕麦非淀粉多糖使用水分测定仪测定其水分含量，具体步骤为称取1.00 g燕麦非淀粉多糖，放入测定盘中，温度100 ℃干燥到恒重，记录其水分含量。
1.2.4 结构表征
1.2.4.1 红外光谱分析
取5 mg样品（ONSP1和ONSP2）与干燥溴化钾混合均匀，然后利用傅立叶变换红外光谱仪在4000~400 cm−1波数范围内扫描压片。
1.2.4.2 分子量测定
参考Pang等[23]的方法测定ONSP的分子量。ONSP1和ONSP2用蒸馏水溶解于2.0 mg/mL溶液中，利用高效尺寸筛析色谱法（HPSEC）测定分子量。色谱条件：色谱柱：TSKG 5000PW分析柱（7.5×600 mm）；流动相：0.15 mol/L NaNO3和0.02% NaN3；流速：0.4 mL/min；注射量：0.5 mL；检测器：折射率检测器（Waters，2414）。利用ASTRA 5.3软件的计算燕麦非淀粉多糖的平均分子量（Mw）和回旋半径（Rg）。
1.2.4.3 单糖组成分析
根据Galermo[24]概述的方法进行单糖测定。称取3.0 mg样品（ONSP1和ONSP2），加入0.5 mL 4 mol/L三氟乙酸，在100 ℃下水解6 h。冷却后，用N2进行吹干。随后，加入3 mg NaBD4还原12 h，并加入0.5 mL乙酸酐进行乙酰化。最后，将衍生物注入配备HP-5MS毛细管的气相色谱-质谱联用（GC-MS）系统中进行分析，GC-MS系统设定具体参数值：柱温160 ℃；进样口温度250 ℃；气相色谱柱流量1.2 mL/min；离子源参数值230；四级质量分析器参数值150；辅助加热区2的温度250 ℃。
1.2.4.4 甲基化分析
采用了Ernst[25]描述的甲基化方法并进行改进。取3.0 mg样品（ONSP1和ONSP2）溶解在0.5 mL DMSO中，再将样品溶液加入20 mg NaOH过夜处理，随后加入碘甲烷进行甲基化反应2.5 h，用氮气吹干，加入0.5 mL 4 mol/L三氟乙酸，在100 ℃下水解6 h。冷却后，用N2进行吹干。随后，在室温中加入3 mg NaBD4还原12 h，并加入0.5 mL乙酸酐进行乙酰化。最后，将部分甲基化的糖醇乙酸酯注入配备HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 µm）毛细管柱的GC-MS系统。使用氦气作为载气，GC-MS系统设定具体参数值：柱温160 ℃；进样口温度250 ℃；气相色谱柱流量1.2 mL/min；离子源参数值230；四级质量分析器参数值150；辅助加热区2的温度250 ℃。
1.2.5 免疫活性测定
1.2.5.1 细胞增殖和一氧化氮（NO）生成试验
RAW264.7巨噬细胞在含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养。然后，将100 μL RAW264.7细胞（1×106 cells/mL）接种至含有10% FBS的RPMI培养基的96孔板中进行细胞增殖实验。将不同浓度（100~300 μg/mL）的样品（ONSP1和ONSP2）或脂多糖（LPS，2 μg/mL），在5% CO2下与细胞培养24 h。然后，在孔中加入20 μL水溶性四唑盐（WST-1）溶液，延长孵育1 h。使用酶标仪在450 nm波长下测量光密度（OD），并使用下列公式计算活性：
式中：Ac为不添加燕麦非淀粉多糖组的吸光度；Ab为只含有培养基组的吸光度；As为不同浓度样品组吸光度。
使用Griess试剂盒说明书[26]，利用Griess试剂盒测定培养基中NO的产生量。以NaNO2（1~200 μmol/L）为标准，计算巨噬细胞释放NO的量。
1.2.5.2 实时聚合酶链反应分析
将1 mL RAW264.7细胞（1×106 cells/mL）接种到24孔板上，在5%的CO2下于37 ℃培养不同浓度的ONSP1与ONSP2（100、200和300 μg/mL）18 h。按照Surayot等[27]报道的方法进行。LPS处理的细胞（2 μg/mL）作为阳性对照。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并通过纳米光度计进行定量。使用oligo（dT）20引物和Superscript III RT构建cDNA。使用GoTaq Flexi DNA聚合酶。表2中列出的特定引物进行PCR扩增。
表 2 RT-PCR中使用的引物序列Table 2. Primers sequences used in RT-PCR引物 引物序列 iNOS 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3'（forward） 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3'（reverse） IL-1β 5'-ATGGCAACTATTCCTGAACTCAACT-3'（forward） 5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3'（reverse） IL-6 5'-TTCC TCTCTGCAAGAGACT-3'（forward） 5'-TGTATCTCTCTGAAGGACT-3'（reverse） IL-10 5'-TACCTGGTAGAAGTGATGCC-3'（forward） 5'-CATCATGTATGCTTCTATGC-3'（reverse） TNF-α 5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3'（forward） 5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3'（reverse） 1.2.5.3 流式细胞术分析
使用Eom等[28]的方法并稍加改动。将300 µg/mL的ONSP1和ONSP2溶液处理24 h后的RAW264.7细胞，用流式细胞术染色缓冲液洗涤，然后与抗CD40-APC（1C10）和抗CD11b（M1/70）等特异性抗体在4 ℃黑暗条件下孵育30 min。使用CytoFLEX流式细胞仪进行分析，并使用CytExpert 2.3.0.84软件分析数据。
1.3 数据处理
每个实验均一式三份，结果以平均值±标准偏差表示。使用SPSS 27.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA）评估组间的显著差异，显著性阈值设定为P<0.05。
2. 结果与分析
2.1 发酵菌种及复配比确定
从图1A可以看出，菌种发酵提取燕麦非淀粉多糖的效率显著高于传统热水浸提法（P<0.05）。这可能归因于微生物发酵过程中会分解燕麦中的大分子，从而释放更多的燕麦非淀粉多糖。其中，高活性干酵母菌（HADY）发酵得到了最高的燕麦非淀粉多糖产率（3.05%），这可能是因为HADY生长过程中消耗燕麦液中还原糖、蛋白质等营养物质进行生长，同时微生物利用本身的酶系统分解碳水化合物，进行去杂纯化[29]。因此，本研究选择HADY和嗜热链球菌（ST）进行后续实验。
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图 1 单菌发酵及混合菌株对燕麦非淀粉多糖产率的影响注：A-单菌发酵；B-混合菌株；不同小写字母代表显著性差异，P<0.05；HADY：高活性干酵母菌；BY：酿酒干酵母菌；ST：嗜热链球菌。Figure 1. Influence of various microbial strains and their respective combination ratios on the yield of ONSP不同菌种组合比例对燕麦非淀粉多糖的产率的影响不同，如图1B所示。当HADY与ST的比例为1:2时，ONSP的产率最高（5.23%）。说明在该比例下，燕麦发酵液中微生物的比例较为平衡，菌种之间不存在竞争。然而，当菌种比例较高时，燕麦非淀粉多糖的产率却有所下降，可能是由于发酵液中微生物密度过高，导致营养不足[14]。因此我们选用HADY与ST以1:2作为微生物富集燕麦非淀粉多糖的最佳组合。
2.2 微生物发酵富集工艺优化
2.2.1 单因素实验
为了提高燕麦非淀粉多糖的产率，对料液比、发酵温度、接菌量和发酵时间进行了单因素实验，结果如图2所示。
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图 2 料液比、发酵温度、接菌量及发酵时间对燕麦非淀粉多糖的影响Figure 2. Effects of feed-to-liquid ratio, fermentation temperature, bacterial inoculum and fermentation time on non-starch polysaccharides of oats不同料液比对燕麦非淀粉多糖产率的影响如图2A所示。燕麦非淀粉多糖的产率随料液比的增加呈现先升高后下降的趋势，在料液比为1:16时达到最高，为4.54%。然而料液比的变化并没有显著影响燕麦粉淀粉多糖的产率，这表明料液比并不是影响燕麦非淀粉多糖产率的主要因素，这与Ma等[30]的研究结果保持一致。因此，本研究选择燕麦非淀粉多糖产率较高的料液比（1:16）进行后续实验。
微生物需合适的温度进行繁殖，当温度过低或过高时，影响微生物的酶生成活性和新陈代谢，抑制微生物的生长。从图2B中可以看出，发酵温度的变化对燕麦非淀粉多糖的产率具有显著影响（P>0.05）。在超过34 ℃时，燕麦非淀粉多糖的产率显著下降（P>0.05）。Lin等[31]的研究表明，菌种处在最适生长温度时具有最高的存活率，进而可以保证更好的发酵质量。结果表明，高温或低温均不适合HADY与ST的发酵，因此选用34 ℃为最佳发酵温度。
燕麦非淀粉多糖的产率随着接菌量的增加呈现先升高再下降的趋势（图2C），在5%时达到最高（6.03%），这与茆鑫等[32]的研究结果保持一致。产率增加的原因可能是菌种数量增加导致微生物代谢活动增强，以及还原糖和蛋白质等营养物质的利用率提高。此外，复杂的酶系统在不消耗多糖的情况下分解碳水化合物，从而释放出更多的非淀粉多糖，最终提高了产率[15]。然而，当接菌量超过5%时，燕麦非淀粉多糖的产率会显著下降。这种下降可能是由于菌落密度增加导致微生物之间对有限养分和空间的竞争加剧所致[32]。因此，本研究的最佳接菌量为5%。
不同发酵时间对燕麦非淀粉多糖产率的影响如图2D所示。燕麦非淀粉多糖的产率随着发酵时间的延长而提高，在26 h时达到拐点。26 h后，燕麦非淀粉多糖的产率开始下降，可能是由于营养供应不足和燕麦非淀粉多糖的消耗大于产生量。因此，本研究选择发酵时间为26 h。
根据单因素实验，当料液比为1:16，接菌量为5%，在34 ℃下发酵26 h时，燕麦非淀粉多糖的产率最高。其中，发酵时间、接菌量和发酵温度对燕麦非淀粉多糖的产率有显著影响。因此，选择发酵温度（32、34和36 ℃）、接菌量（4%、5%和6%）和发酵时间（24、26和28 h）进行响应面优化。
2.2.2 响应面实验优化
在单因素实验的基础上，采用响应面试验考察接菌量、发酵时间和发酵温度对燕麦非淀粉多糖产率的影响。结果如表3所示，方差分析如表4所示。模型的F值为172.29，P<0.0001；R2=0.9955；Radj2=0.9897，说明模型具有显著性。此外，失拟项不显著（P>0.05），说明预测模型与回归方程实测值拟合较好。另外，A，C，A2，B2，C2为显著项，而B，AB，AC，BC表现出不显著。对响应面回归模型进行二次响应面回归分析，得到以下多元二次型：
表 3 Box-Behnken试验设计与结果Table 3. Box-Behnken experimental design and results编号 A发酵温度（℃） B接菌量（%） C发酵时间（h） 燕麦非淀粉多糖产率（%） 1 −1 −1 0 7.39 2 1 −1 0 7.37 3 −1 1 0 7.21 4 1 1 0 7.35 5 −1 0 −1 7.11 6 1 0 −1 7.38 7 −1 0 1 7.37 8 1 0 1 7.43 9 0 −1 −1 7.32 10 0 1 −1 7.15 11 0 −1 1 7.34 12 0 1 1 7.41 13 0 0 0 8.59 14 0 0 0 8.71 15 0 0 0 8.63 16 0 0 0 8.52 17 0 0 0 8.66 表 4 响应面二次回归方程模型的方差分析Table 4. Analysis of variance of response surface quadratic regression equation models变异来源 平方和 自由度 F值 P值 R2 Radj2 显著性 回归模型 6.10 9 172.29 <0.0001 0.9955 0.9897 ** A 0.0253 1 6.43 0.0389 * B 0.0113 1 2.86 0.1348 NS C 0.0435 1 11.05 0.0127 * AB 0.0064 1 1.63 0.2430 NS AC 0.0110 1 2.80 0.1381 NS BC 0.0144 1 3.66 0.0974 NS A2 1.71 1 434.36 <0.0001 ** B2 1.81 1 458.55 <0.0001 ** C2 1.85 1 469.11 <0.0001 ** 残差 0.0276 7 失拟项 0.0069 3 0.4433 0.7351 NS 误差项 0.0207 4 总和 6.13 16 注：表中“**”代表极显著性差异，P<0.01；“*”代表显著性差异，P<0.05；“NS”代表无显著性差异，P>0.05。 Y=8.62+0.06A−0.04B+0.07C+0.04AB−0.05AC+0.06BC−0.64A2−0.66B2−0.66C2。
利用Design-Expert软件可以得出，燕麦非淀粉多糖的最佳提取工艺为接菌量为5.05%、在34.08 ℃下发酵25.92 h，此时预测燕麦非淀粉多糖的产率为8.60%。根据实际操作进行修整，在接菌量5.00%，34.00 ℃下发酵26.00 h，实际测定的燕麦非淀粉多糖的产率为8.60%±0.04%。
2.3 理化性质结果分析
燕麦非淀粉多糖主要由碳水化合物、蛋白质和水组成。ONSP1和ONSP2的总碳水化合物、蛋白质和含水量见表5。据报道，多糖中的游离蛋白可能会干扰其结构和免疫刺激活性。使用微生物发酵富集后的ONSP1蛋白质含量显著降低（P<0.05），说明微生物发酵辅助提取法对蛋白质的去除能力更强，微生物发酵后ONSP1的蛋白质含量也证明了微生物发酵辅助提取法的纯化效果。此外，ONSP1和ONSP2中蛋白质含量的差异也对免疫刺激活性产生了影响，这与Cao等[33]的研究结果一致，脱蛋白后的藜麦非淀粉多糖表现出更好的免疫刺激活性。
表 5 ONSP1和ONSP2的产率和化学成分Table 5. Extraction yield and chemical composition of ONSP1 and ONSP2化学成分 ONSP1 ONSP2 显著性 产率（%） 8.60±0.04 1.83±0.05 **** β-葡聚糖含量（%） 53.81±1.14 47.26±1.27 *** 总碳水化合物含量（%） 76.90±2.38 83.17±4.26 * 蛋白质含量（%） 3.98±0.15 7.40±0.06 *** 水分含量（%） 10.34±0.89 9.00±0.06 NS 注：表中“****”代表P<0.0001；“***”代表P<0.001；“**”代表P<0.01；“*”代表P<0.05；“NS”代表P>0.05，表6同。 2.4 结构表征
2.4.1 红外光谱分析
如图3所示，红外光谱分析深入阐明了ONSP1和ONSP2中存在的官能团。光谱显示了表明多糖结构中各种官能团特征的独特吸收带。
值得注意的是，在3500~3100 cm−1范围内的3434.22 cm−1和3392.69 cm−1处观察到了宽而强的吸光带，表明多糖结构中存在羟基，这是多糖具有广泛氢键能力的标志[34]。此外，位于3000~2800 cm−1区域的2893.01 cm−1和2928.76 cm−1处的吸收峰分别归因于甲基和亚甲基的C-H伸展振动[35]。在更具体的1644~1658 cm−1区域，1650.78 cm−1和1654.24 cm−1处的微弱吸收带表明，β-D-葡聚糖样品中蛋白质含量较少，表明存在酰胺连接[36]。跨度为1350~1000 cm−1的区域有1158.64 cm−1、1154.31 cm−1、1080.13 cm−1、1030.68 cm−1和1026.27 cm−1的吸收带，这些吸收带通常与C-H弯曲振动有关，进一步支持了燕麦非淀粉多糖结构[37]。值得注意的是，1000~1074 cm−1区域突出显示了1030.68 cm−1和1026.27 cm−1处的吸收，证实了ONSP1和ONSP2中存在葡聚糖部分[38]。此外，还在895.98 cm−1处发现了β-葡萄糖苷键的特征信号，从而证实了多糖中β-吡喃葡萄糖结构。
2.4.2 单糖组成和分子量
ONSP1和ONSP2的单糖组成如图4A~图4C和表6所示。可以看出，ONSP1和ONSP2均由葡萄糖、阿拉伯糖和木糖组成。经过发酵的ONSP1中阿拉伯糖和木糖的含量有所提高，葡萄糖含量略微下降。同时也有研究表明，木糖与阿拉伯糖占比较高的多糖对RAW264.7细胞具有更强的免疫刺激活性[39]。
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图 4 燕麦非淀粉多糖的分子量、单糖组成和链接模式注：A：燕麦非淀粉多糖标准品单糖组成；B：ONSP1单糖组成；C：ONSP2单糖组成；D：ONSP1分子量；E：ONSP2分子量；F：ONSP1连接方式；G：ONSP2连接方式。Figure 4. Molecular weight, monosaccharide composition, and linkage pattern of ONSP表 6 ONSP1和ONSP2的单糖分析、分子量、回旋半径Table 6. Monosaccharide analysis, average molecular weight, radius of gyration for gyration of ONSP1 and ONSP2ONSP1 ONSP2 显著性 阿拉伯糖（%） 4.43±0.35 3.15±0.25 NS 木糖（%） 2.23±0.25 1.34±0.21 NS 葡萄糖（%） 93.34±0.73 95.52±0.45 NS 分子量（kDa） 47.20±1.7 53.20±2.50 ** 回旋半径（cm3/g） 66.60±1.20 71.60±1.80 ** 多糖的分子量是影响多糖生物活性的重要因素[40]。采用多角度激光散射技术的高效粒径排除色谱（HPSEC）对传统热水浸提法和微生物发酵辅助提取法提取的ONSP的分子量分布进行了测定。ONSP的分子量如图5D~图5E和表6所示。ONSP1和ONSP2的分子量分别为47.2 kDa和53.2 kDa，这种差异可能因为ONSP的提取方法不同[41]。同时，本研究表明，低分子量的ONSP1对RAW264.7细胞具有更强的免疫刺激活性，这与Yang等[42]的研究一致。此外，我们还计算了光谱回旋半径。ONSP1的回旋半径值为66.60±1.20 cm3/g，ONSP2的回旋半径值为71.60±1.80 cm3/g，由此可见，提取方式的改变会影响燕麦非淀粉多糖的分子量，进而影响其免疫刺激活性。
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图 5 ONSP1和ONSP2的细胞增殖和一氧化氮（NO）产生注：A：细胞增殖；B：NO产生量；字母a和b表示样本处理间的显著差异（P<0.05），字母x和y表示不同样品浓度之间显著性差异（P<0.05），图6同。Figure 5. Cell proliferation and nitric oxide production (NO) of ONSP1 and ONSP2.2.4.3 甲基化分析
ONSP的甲基化分析结果如表7和图5F~图5G所示。ONSP1具有多种糖苷键，包括1→Glcp、1→3Glcp、1→4Glcp、1→6Glcp、1→3,4Glcp、1→4,6Glcp、1→3,6Glcp和1→3,4,6Glcp，而与ONSP1相比，ONSP2缺少1,3,4,6→Glcp连接。研究表明，支链较多的多糖具有更强的免疫刺激活性[43]。本研究的后续实验中也发现支链相对较多的ONSP1免疫活性强于ONSP2。
表 7 ONSP1和ONSP2的甲基化分析和糖苷键Table 7. Methylation analysis and deduced glycosidic linkages of ONSP1 and ONSP2洗脱时间（min） 糖苷键 ONSP1峰面积（%） ONSP2峰面积（%） 8.30 1→Glcp 22.52 23.32 9.85 1→3Glcp 1.87 1.69 10.15 1→4Glcp 61.85 64.26 10.37 1→6Glcp 0.84 0.36 11.14 1→3,4Glcp 2.84 0.43 11.93 1→4,6Glcp 8.94 9.31 12.50 1→3,6Glcp 0.42 0.63 13.09 1→3,4,6Glcp 0.73 - 2.5 免疫活性
2.5.1 细胞增殖和一氧化氮（NO）生成试验
植物多糖可能通过促炎因子分泌、NO分泌、NF-κB信号通路、免疫系统等路径调节机体炎症[44]。巨噬细胞通常被认为是抵御宿主包括癌症在内的病原体的重要免疫细胞[45]。本研究测定了ONSP1和ONSP2对小鼠RAW264.7巨噬细胞的免疫刺激作用。用不同浓度的ONSP1和ONSP2处理RAW264.7细胞24 h，然后使用WST-1试验评估细胞增殖活性，并与RPMI进行比较，RAW264.7细胞的增殖水平强于RPMI处理组。当浓度增加时，添加了ONSP1的细胞增殖活性呈上升趋势，而ONSP2呈下降趋势（图5A）。此外，还测量了RAW264.7细胞在不同浓度的ONSP1和ONSP2处理过程中产生的一氧化氮。一氧化氮（NO）是受刺激的巨噬细胞产生的一种分子，它对病原体和癌细胞具有强大的细胞毒性作用，是参与调节各种生理过程的细胞内信使[46]。本研究结果显示，ONSP1的NO量与剂量呈正相关，到300 μg/mL时NO产生量为42.63 μmol/L。ONSP2仅在300 μg/mL时有NO产生，表明ONSP1更有效增强RAW264.7细胞的刺激，且在测试浓度下对细胞无毒性影响。与ONSP2相比，用ONSP1处理RAW264.7细胞会产生更多的NO，这表明ONSP1具有更强的免疫刺激活性（图5B）。
2.5.2 iNOS和细胞因子的表达
在巨噬细胞介导的免疫反应领域，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在一氧化氮（NO）的生物合成中发挥着关键作用，而NO是宿主防御机制中的一种关键效应分子[47]。iNOS的基因表达与各种细胞因子一样，是巨噬细胞活化和炎症反应的证明[48]。本研究利用实时PCR分析，定量评估了用ONSP1和ONSP2处理RAW264.7细胞后iNOS和一系列细胞因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）的mRNA表达水平。结果显示，在浓度为300 µg/mL的ONSP1处理组中，iNOS的表达显著上调，超过了在ONSP2处理组中观察到的水平（P<0.05）。iNOS基因表达的增强与观察到的NO生成的增加相一致，从而确立了iNOS活性与受刺激的RAW264.7细胞中NO合成之间的直接相关性[49]。此外，用300 µg/mL ONSP1处理后，促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和抗炎细胞因子（IL-10）的mRNA表达明显升高，这表明促炎反应很强，同时还有一种内在的调节机制来抑制炎症（图6A~图6E）。促炎细胞因子的大量诱导强调了这些分子在协调抵御传染性病原体和异常细胞方面的重要作用。相反，IL-10的上调则表明反调节途径被激活，旨在减轻未受控制的炎症反应可能造成的组织损伤[50]。总之，这些研究结果证明了通过菌种联用发酵提取的ONSP1在通过上调iNOS和细胞因子基因表达来增强NO的产生，从而增强RAW264.7巨噬细胞的活化方面具有较好的免疫刺激能力。ONSP1和ONSP2的差别表明提取方法对ONSP的免疫刺激活性调节特性的关键影响，可以看出，使用微生物发酵富集的ONSP1具有更强的免疫刺激活性。
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图 6 ONSP1和ONSP2的细胞因子表达的差异Figure 6. Differences of expression of cytokines between ONSP1 and ONSP22.5.3 流式细胞术分析
本研究采用流式细胞术评估了ONSP1和ONSP2（300 μg/mL）处理RAW264.7巨噬细胞24 h后，巨噬细胞表面生物标志物CD11b和CD40的表达情况。之所以选择这些生物标记物，是因为它们在免疫反应调节中具有公认的作用：CD11b是巨噬细胞活化的生物标志物，广泛存在于包括粒细胞和自然杀伤细胞在内的各种免疫细胞中；CD40是一种调控分子，已知可通过T细胞活化增强IL-2和TNF-α的分泌[51]。
流式细胞分析显示了这些生物标志物的不同表达模式。具体来说，ONSP2的CD11b和CD40的表达水平分别为18.68%和66.16%。如图7所示，ONSP1的CD11b和CD40表达水平分别达到23.06%和76.27%，显著提高了这些生物标志物的表达水平（P<0.05）。ONSP1的免疫调节功效与阳性对照脂多糖（LPS）的功效相同，突出其强大的刺激能力。
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图 7 ONSP1和ONSP2处理24 h后CD40和CD11b在RAW264.7细胞中的表达水平注：A：CD11b表达；B：CD40表达。Figure 7. Expression levels of CD40 and CD11b on RAW 264.7 cells after 24 h of treatment with ONSP1 and ONSP2巨噬细胞活化伴随着CD11b和CD40表达的升高，本研究的发现证实了这一观点，即巨噬细胞活化会导致这些生物标志物的增加。之前的研究阐明，黄芪多糖能显著提高CD40的表达，并提高包括IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的一系列炎症细胞因子的表达，进一步肯定了多糖诱导的巨噬细胞活化在协调炎症反应中的关键作用[52]。通过比较ONSP1和ONSP2对CD11b和CD40影响，可以发现ONSP1的免疫刺激效果更好。
3. 结论
本研究所用高活性干酵母菌和嗜热链球菌按照1:2的比例组合发酵辅助提取燕麦非淀粉多糖的最佳参数为接菌量5.00%，发酵温度34.00 ℃，发酵时间26.00 h。与传统热水浸提法（ONSP2）相比，微生物发酵辅助提取法（ONSP1）得到的燕麦非淀粉多糖产率显著提高（P<0.05）。同时，ONSP1的分子量相对较低，且具有较低的碳水化合物和蛋白质含量、较高的阿拉伯糖和木糖含量，分支链更多。此外，我们发现ONSP1和ONSP2均能刺激RAW264.7细胞的产生NO，但ONSP1表现出更强的免疫刺激活性。然而，本研究只在体外对ONSP免疫活性进行探究，在生物体内ONSP是否具有免疫活性还有待于进一步研究，但这些发现仍为研究ONSP的结构特性和对免疫刺激活性的影响提供了有价值的见解。
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图 1 单菌发酵及混合菌株对燕麦非淀粉多糖产率的影响
注：A-单菌发酵；B-混合菌株；不同小写字母代表显著性差异，P<0.05；HADY：高活性干酵母菌；BY：酿酒干酵母菌；ST：嗜热链球菌。
Figure 1. Influence of various microbial strains and their respective combination ratios on the yield of ONSP
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图 2 料液比、发酵温度、接菌量及发酵时间对燕麦非淀粉多糖的影响
Figure 2. Effects of feed-to-liquid ratio, fermentation temperature, bacterial inoculum and fermentation time on non-starch polysaccharides of oats
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图 4 燕麦非淀粉多糖的分子量、单糖组成和链接模式
注：A：燕麦非淀粉多糖标准品单糖组成；B：ONSP1单糖组成；C：ONSP2单糖组成；D：ONSP1分子量；E：ONSP2分子量；F：ONSP1连接方式；G：ONSP2连接方式。
Figure 4. Molecular weight, monosaccharide composition, and linkage pattern of ONSP
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图 5 ONSP1和ONSP2的细胞增殖和一氧化氮（NO）产生
注：A：细胞增殖；B：NO产生量；字母a和b表示样本处理间的显著差异（P<0.05），字母x和y表示不同样品浓度之间显著性差异（P<0.05），图6同。
Figure 5. Cell proliferation and nitric oxide production (NO) of ONSP1 and ONSP2.
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图 6 ONSP1和ONSP2的细胞因子表达的差异
Figure 6. Differences of expression of cytokines between ONSP1 and ONSP2
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图 7 ONSP1和ONSP2处理24 h后CD40和CD11b在RAW264.7细胞中的表达水平
注：A：CD11b表达；B：CD40表达。
Figure 7. Expression levels of CD40 and CD11b on RAW 264.7 cells after 24 h of treatment with ONSP1 and ONSP2
表 1 响应面因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 因素 A发酵温度（℃） B接菌量（%） C发酵时间（h） −1 32 4 24 0 34 5 26 1 36 6 28 
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表 2 RT-PCR中使用的引物序列
Table 2 Primers sequences used in RT-PCR
引物 引物序列 iNOS 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3'（forward） 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3'（reverse） IL-1β 5'-ATGGCAACTATTCCTGAACTCAACT-3'（forward） 5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3'（reverse） IL-6 5'-TTCC TCTCTGCAAGAGACT-3'（forward） 5'-TGTATCTCTCTGAAGGACT-3'（reverse） IL-10 5'-TACCTGGTAGAAGTGATGCC-3'（forward） 5'-CATCATGTATGCTTCTATGC-3'（reverse） TNF-α 5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3'（forward） 5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3'（reverse）
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表 3 Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Box-Behnken experimental design and results
编号 A发酵温度（℃） B接菌量（%） C发酵时间（h） 燕麦非淀粉多糖产率（%） 1 −1 −1 0 7.39 2 1 −1 0 7.37 3 −1 1 0 7.21 4 1 1 0 7.35 5 −1 0 −1 7.11 6 1 0 −1 7.38 7 −1 0 1 7.37 8 1 0 1 7.43 9 0 −1 −1 7.32 10 0 1 −1 7.15 11 0 −1 1 7.34 12 0 1 1 7.41 13 0 0 0 8.59 14 0 0 0 8.71 15 0 0 0 8.63 16 0 0 0 8.52 17 0 0 0 8.66
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表 4 响应面二次回归方程模型的方差分析
Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic regression equation models
变异来源 平方和 自由度 F值 P值 R2 Radj2 显著性 回归模型 6.10 9 172.29 <0.0001 0.9955 0.9897 ** A 0.0253 1 6.43 0.0389 * B 0.0113 1 2.86 0.1348 NS C 0.0435 1 11.05 0.0127 * AB 0.0064 1 1.63 0.2430 NS AC 0.0110 1 2.80 0.1381 NS BC 0.0144 1 3.66 0.0974 NS A2 1.71 1 434.36 <0.0001 ** B2 1.81 1 458.55 <0.0001 ** C2 1.85 1 469.11 <0.0001 ** 残差 0.0276 7 失拟项 0.0069 3 0.4433 0.7351 NS 误差项 0.0207 4 总和 6.13 16 注：表中“**”代表极显著性差异，P<0.01；“*”代表显著性差异，P<0.05；“NS”代表无显著性差异，P>0.05。
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表 5 ONSP1和ONSP2的产率和化学成分
Table 5 Extraction yield and chemical composition of ONSP1 and ONSP2
化学成分 ONSP1 ONSP2 显著性 产率（%） 8.60±0.04 1.83±0.05 **** β-葡聚糖含量（%） 53.81±1.14 47.26±1.27 *** 总碳水化合物含量（%） 76.90±2.38 83.17±4.26 * 蛋白质含量（%） 3.98±0.15 7.40±0.06 *** 水分含量（%） 10.34±0.89 9.00±0.06 NS 注：表中“****”代表P<0.0001；“***”代表P<0.001；“**”代表P<0.01；“*”代表P<0.05；“NS”代表P>0.05，表6同。
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表 6 ONSP1和ONSP2的单糖分析、分子量、回旋半径
Table 6 Monosaccharide analysis, average molecular weight, radius of gyration for gyration of ONSP1 and ONSP2
ONSP1 ONSP2 显著性 阿拉伯糖（%） 4.43±0.35 3.15±0.25 NS 木糖（%） 2.23±0.25 1.34±0.21 NS 葡萄糖（%） 93.34±0.73 95.52±0.45 NS 分子量（kDa） 47.20±1.7 53.20±2.50 ** 回旋半径（cm3/g） 66.60±1.20 71.60±1.80 **
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表 7 ONSP1和ONSP2的甲基化分析和糖苷键
Table 7 Methylation analysis and deduced glycosidic linkages of ONSP1 and ONSP2
洗脱时间（min） 糖苷键 ONSP1峰面积（%） ONSP2峰面积（%） 8.30 1→Glcp 22.52 23.32 9.85 1→3Glcp 1.87 1.69 10.15 1→4Glcp 61.85 64.26 10.37 1→6Glcp 0.84 0.36 11.14 1→3,4Glcp 2.84 0.43 11.93 1→4,6Glcp 8.94 9.31 12.50 1→3,6Glcp 0.42 0.63 13.09 1→3,4,6Glcp 0.73 -
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