Isolation, Purification, Structural Characterization, and in Vitro Lipid-lowering Activity of Evodia rutaecarpa Polysaccharides
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摘要: 为探究吴茱萸多糖的结构特征及其体外降脂的潜力，通过微波辅助提取技术，在吴茱萸中提取得到吴茱萸粗多糖（WPER），利用DEAE-52纤维素离子柱和Sepharose G-100凝胶柱对WPER进行分离纯化，获得了三种多糖组分：WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a，最后对三种多糖组分开展了理化特性测定、结构表征以及体外降脂活性研究。理化性质表明三个组分多糖主要由甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）组成，WPER-2a的总糖含量和糖醛酸含量最高，分别为66.44%±0.64%、32.41%±0.99%。红外表征表明分离纯化不会改变多糖官能团，刚果红实验表明WPER-2a和WPER-3a具有三螺旋结构，三种多糖均以非定型的结晶态存在，热重实验和Zeta电位表明WPER-2a稳定性高于其他两个组分。扫描电镜（SEM）结果表明WPER-1b和WPER-3a为块状和片状，而WPER-2a表现为粗糙、碎末状。体外降脂活性的研究结果表明，WPER-3a浓度10 mg/mL时，对油脂的吸附量最高为22.96 mg/g。WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a浓度为10 mg/mL时对胰脂肪酶的抑制率分别为65%、62.33%和64.31%，WPER-2a（10 mg/mL）对胆酸和牛磺胆酸具有较好的吸附作用，分别为75.89%、72.29%，分离纯化后的吴茱萸多糖均具有一定的体外降脂活性，WPER-2a组分活性较好。研究结果为提高吴茱萸多糖的开发利用水平提供参考依据，为吴茱萸多糖在降脂方面的应用提供理论基础和思路借鉴。Abstract: To explore the structural characteristics of Evodia rutaecarpa polysaccharide and its lipid-lowering potential in vitro, Evodia rutaecarpa crude polysaccharide (WPER) was extracted by microwave-assisted extraction technique. Three fractions of WPER, including WPER-1b, WPER-2a and WPER-3a, were isolated and purified by DEAE-52 cellulose ion column and Sepharose G-100 gel column. The physicochemical properties, structure and lipid-lowering activity of the three fractions were characterized. Physicochemical properties showed that the three fractions were mainly composed of Man, Gal and Ara. The total sugar content and uronic acid content of WPER-2a were the highest, which were 66.44%±0.64% and 32.41%±0.99%, respectively. Congo red assay showed that WPER-2a and WPER-3a had a triple helix structure. XRD analysis showed that all the three polysaccharides existed in an amorphous crystalline state. TGA and Zeta potential showed that WPER-2a was more stable than the other two polysaccharides. SEM showed that WPER-1b and WPER-3a were bulk and lamellar, while WPER-2a showed a rough, porous, fragmented shape. The results of the lipid-lowering activity in vitro study showed that the highest lipid adsorption capacity of WPER-3a was 22.96 mg/g at a concentration of 10 mg/mL. When the concentration of WPER-1b, WPER-2a and WPER-3a was 10 mg/mL, the inhibition rates of pancreatic lipase were 65%, 62.33% and 64.31%, respectively. WPER-2a (10 mg/mL) had the better adsorption effect on cholic acid and taurocholate, which were 75.89% and 72.29%, respectively. All the isolated and purified polysaccharides of Evodia officinalis had certain lipid-lowering activity in vitro, and the WPER-2a fraction had the better activity. The results provide reference for improving the development and utilization level of Evodia officinalis polysaccharide, and provide theoretical basis and reference for the application of Evodia officinalis polysaccharide in lipid lowering.
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吴茱萸（Evodia rutaecarpa）为芸香科吴茱萸属植物的干燥未成熟果实，主要生长在中国广西、江西等地区，常作为中医药使用，具有补气养血、强身健体、提高免疫力等功效。吴茱萸中含有生物碱类、萜类化合物、苦味素类、多糖类等化学成分[1]。多糖是由十个及以上的单糖通过糖苷键连接而成，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和降脂等多种活性，但是目前对于吴茱萸的研究只停留在吴茱萸碱、吴茱萸次碱[2]，关于吴茱萸多糖结构和活性方面的报道较少，不利于吴茱萸的开发和利用[3]。
多糖的提取多用微波辅助提取法，但制得的粗多糖含有较多色素、蛋白质及不溶性物质，需要对其进行分离纯化[4]，纯化后的多糖纯度较高，更易进行结构解析和活性研究。分离纯化常用的方法有DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析法，具有选择性好、使用方便、经济等优点，已在生物分离和纯化领域得到广泛应用。但只通过DEAE-52纤维素并不能得到纯度较高且均一的多糖，Sephadex-G100凝胶柱层析法能够对多糖进一步分级，可达到制备均一化多糖的目的[5]。Zhu等[6]从黄瓜果皮中获得粗多糖（CMPP），通过DEAE-52纤维素离子柱得到两个组分CMPP-1和CMPP-2，经过Sephadex-G100凝胶柱进行纯化，CMPP-1和CMPP-2均为酸性多糖，且具有一定的免疫活性。迄今为止临床上使用的降脂药物主要是他汀类药物，这些药物具有导致并发症的风险，甚至器官衰竭或死亡。很多天然多糖已经被证实具有良好的降血脂作用，且副作用小，没有药物不良反应[7]。因此，研究吴茱萸多糖的分离纯化及体外降脂效果对于开发降脂药物具有重要意义。
本文从吴茱萸中提取吴茱萸粗多糖，经过DEAE-52纤维素和Sephadex-G100凝胶对其进行分离纯化；对吴茱萸多糖组分的理化性质进行检测，采用高效液相色谱法测定单糖组成；采用红外扫描、紫外扫描、刚果红实验、热重实验、扫描电镜等对其进行结构表征；并以油脂、胆酸和牛磺胆酸的吸附率及胰脂肪酶的抑制率为指标，探究其体外降脂的潜力。为提高吴茱萸多糖的开发利用水平提供参考依据，为吴茱萸多糖在降脂方面的应用提供理论基础和思路借鉴。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
中花吴茱萸 江西宜春；无水乙醇、氯化钠、硫酸、考马斯亮蓝、磷酸、氢氧化钠、苯酚、刚果红、石油醚 购自四川西陇科学有限公司；DEAE-52纤维素、Sepharose G-100、葡萄糖、牛血清白蛋白、胆酸钠、牛磺胆酸钠、胰脂肪酶（20000 U/g）、奥利司他 上海麦克林生化科技有限公司；单糖标品 色谱级，上海源叶生物科技有限公司。
UWave-2000多功能微波合成萃取仪 上海新仪微波化学科技有限公司；V-1100D型可见光光度计 上海美谱达仪器有限公司；UV-2600紫外-可见光光度计、IRAFLINITY-1S傅里叶红外光谱仪 岛津仪器（苏州）有限公司；LC-20A高效液相色谱仪 株式会社岛津制作所；K6600全波长酶标仪 北京凯奥科技发展有限公司；S-5000电镜扫描仪器（SEM） 日立有限公司；CM200型透射电子显微镜 美国飞利浦公司；Xper3 Power X-射线衍射仪 荷兰帕纳科有限公司；SDT Q600热重分析仪 美国TA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 吴茱萸粗多糖的提取
吴茱萸粗多糖的制备采用微波辅助提取法[8]，具体操作如下：首先对吴茱萸进行预处理，将吴茱萸粉碎，过40目筛，再将吴茱萸粉末与蒸馏水以1:30（W:V）的比例进行混合，置于锥形瓶内，使用多功能微波合成萃取仪提取吴茱萸多糖，微波功率480 W，微波温度70 ℃，微波时间5 min，反复提取两次，合并提取液，提取液中加入3倍无水乙醇，4 ℃醇沉48 h，醇沉溶液4000 r/min离心20 min，收集多糖沉淀，用少量的水复溶，冷干燥得到吴茱萸粗多糖粉末，命名为吴茱萸粗多糖（Water extracted polysaccharide from Evodia rutaecarpa，WPER）。
1.2.2 吴茱萸多糖DEAE-52纤维素柱层析的制备
对吴茱萸粗多糖进行分离操作，将DEAE-52纤维素色谱柱（φ8×60 cm）以30 mL/min的流速平衡两个柱体积，然后将吴茱萸粗多糖上样，上样量为3 g，洗脱流速为15 mL/min，分别以0、0.2、0.4和0.7 mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行洗脱，每管80 mL，每个浓度洗脱70管，使用苯酚硫酸法检测每管在490 nm处的吸光度值，绘制洗脱曲线，收集主要峰值的多糖溶液[9]。冷冻干燥得到四个吴茱萸多糖组分，0 mol/L NaCl洗脱的多糖命名为WPER-1，0.2 mol/L NaCl洗脱的多糖命名WPER-2，0.4 mol/L NaCl洗脱的多糖命名WPER-3，0.7 mol/L NaCl洗脱的多糖命名WPER-4。
1.2.3 吴茱萸多糖的Sepharose G-100凝胶柱层析的制备
为了得到纯度较高的吴茱萸多糖组分，采用Sepharose G-100凝胶柱层析对上述四个多糖组分进行纯化[10]。首先将Sepharose G-100凝胶柱（φ2.6×60 cm）进行平衡，平衡流速为1.0 mL/min，然后将WPER-1、WPER-2和WPER-3分别称取300 mg，溶于20 mL蒸馏水，采用Sepharose G-100凝胶柱进行洗脱，蒸馏水作为洗脱液，洗脱流速为0.5 mL/min，每10 mL为1管，每个样品洗脱60管，使用苯酚硫酸法检测每管在490 nm处的吸光度值，绘制洗脱曲线，并收集主要峰值的多糖溶液，得到纯化后的吴茱萸多糖组分WPER-1a、WPER-1b、WPER-1c、WPER-2a、WPER-2b和WPER-3a。
1.2.4 吴茱萸多糖组分理化性质及单糖组成的测定
采用苯酚-硫酸法对吴茱萸多糖各组分进行总糖含量测定[11]。参考先前的研究，采用间羟基联苯法检测糖醛酸含量[12]。考马斯亮蓝法是检测多糖蛋白质含量的常用方法，本文采用此方法进行蛋白质含量的检测[13]。采用HPLC测定WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的单糖组成，对三种多糖组分进行酸水解和衍生化[14]，称取5 mg多糖样品加入0.5 mL PMP和0.5 mL 0.3 mol/L NaOH的混合物液中，搅拌均匀，70 ℃水浴30 min，使其充分反应。向反应瓶中加入0.5 mL HCl溶液（0.3 mol/L）和0.5 mL超纯水，然后加入1 mL氯仿去除PMP。获得水层，并通过0.22 μm滤膜进行过滤，色谱条件：采用UltimateXB-C18色谱柱；流动相：A为0.05 mol/L的KH2PO4（pH6.7）；B为乙腈；A:B=82:18；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；波长：250 nm。
1.2.5 吴茱萸多糖组分结构表征
1.2.5.1 紫外-可见光谱扫描分析
准确称取4 mg吴茱萸多糖组分，溶于2 mL蒸馏水，在200~400 nm波长处使用紫外-可见光光度计扫描，绘制扫描曲线。
1.2.5.2 傅里叶红外光谱扫描
将1 mg样品与100 mg KBr进行研磨压片，于4000~500 cm−1波数下进行傅里叶红外光谱分析[15]。
1.2.5.3 刚果红实验
具体步骤如下，配制1 mg/mL的多糖溶液，将多糖溶液和刚果红溶液（80 μmol/L）按照1:1的比例各1 mL进行混匀，加入2 mL不同浓度的NaOH（0~1 mol/L），使得最后反应液中的NaOH浓度为0~0.5 mol/L，避光环境下反应10 min后，在400~600 nm波长下测定最大吸收波长（λmax）。
1.2.5.4 X射线衍射（XRD）检测
用载玻片将样品压平，采用X’Pert3 Powerd型多功能X-射线衍射仪（荷兰帕纳科公司，Cu靶，λ=1.54056 Å）分析样品的晶体结构，测试扫描的步长为0.02626°，扫描速度为0.6565°/s，扫描范围为5°~90°。
1.2.5.5 热重实验
在坩埚中称取10 mg样品，放入热重分析仪的炉腔内，从25 ℃升温至400 ℃，升温速率为20 ℃/min。高纯氩气（99%）作为保护气（20 mL/min），反应气（50 mL/min）。通过多糖的质量损失率来研究温度对多糖的影响。
1.2.5.6 Zeta电位
配制浓度为1 mg/mL的多糖水溶液，并用0.22 μm膜过滤上机检测。
1.2.5.7 扫描电镜（SEM）测试
取适量样品放置于导电胶上，使用洗耳球吹去多余样品，喷金30 s，采用SU 5000扫描电子显微镜进行检测，加速电压为5 kV，放大倍率为100倍和1000倍，观察多糖样品的外貌形态。
1.2.6 吴茱萸多糖体外降脂研究活性研究
1.2.6.1 多糖对油脂的吸附作用
吴茱萸多糖对油脂的吸附作用参考文献[16−17]方法。操作如下：在离心管中称取多糖样品20 mg，溶于2.0 mL去蒸馏水中，加入1 g花生油，于37 ℃，孵育2 h，4000 r/min离心20 min，去除上清液。以石油醚为萃取剂，重复萃取三次（2:1混合萃取），振荡5 min，合并萃取液，将萃取液在70 ℃干燥，直至石油醚完全挥发，称取剩余脂肪，得到多糖的吸附油的质量。以蒸馏水作为空白对照，奥利司他为阳性对照，吴茱萸多糖对油脂吸附能力以每克多糖的吸附脂肪毫克数（mg/g）表示。
1.2.6.2 多糖对胆汁酸的吸附作用
多糖胆汁酸实验方法：模拟胃液消化液：称取1.24 g NaCl、0.45 g KCl、0.06 g CaCl2及0.24 g NaHCO3溶于400 mL蒸馏水中，2 mol盐酸调节pH2±0.5。后加入47.2 mg，3 mL酶活为10 U/mL的胃蛋白酶和1 mL CH3COONa（1 mol，pH5），调节pH2±0.5，得到模拟胃液消化液。每个样品不同质量（2、4、6、8、10 mg）用1 mL 0.01 mol/L HCl模拟正常人体温度胃液消化1 h，然后，每个样品加入0.1 mmol/L胆酸盐4 mL和猪胰酶（10 mg/mL）5 mL，37 ℃连续振荡孵育1 h，离心4000 r/min，40 min后收集上清液用于测定未吸附胆汁酸[18]。
测定方法如下：取2.5 mL上清于试管中，加入7.5 mL 60% H2SO4，70 ℃水浴25 min，使其充分反应，冷却至室温后，在387 nm处测量吸光度，以缓冲溶液为空白对照，奥利司他作为阳性对照。根据公式计算各胆汁酸的吸附率。
式中：A0为对照组（磷酸缓冲液代替胆酸盐溶液）；A1为样品组；A盐为空白组（磷酸缓冲溶液代替样品溶液）。
1.2.6.3 多糖对胰脂肪酶的抑制作用
多糖的质量浓度为2、4、6、8、10 mg/mL，分别取50 μL的50 mmol/L磷酸缓冲液（pH8.0）和10 mg/mL胰脂肪酶溶液50 μL依次加入到5 mL不同质量浓度的多糖溶液中，加入底物0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯50 μL，混匀后37 ℃孵育20 min[19]。测量405 nm的OD值。以奥利司他作为阳性对照，按照下面公式计算抑制率。
式中：A1为空白组（缓冲溶液代替样品）；A2空白背景组（缓冲溶液代替样品、PBS代替胰脂肪酶）；A3为样品组；A4样品背景组（PBS代替胰脂肪酶）。
1.3 数据处理
数据用Excel 2019进行整理，结果以平均值±标准偏差（X±SD）的形式表示。采用Origin8.0等软件进行数据处理并绘制图像，采用SPSS Statistics 27.0软件单因素ANOVA检验中邓肯检验（Duncan's text）对数据间的差异显著性进行分析（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 吴茱萸多糖DEAE离子柱层析洗脱
WPER的初步分离洗脱曲线如图1所示。以0、0.2、0.4和0.7 mol/L NaCl溶液作为洗脱液对吴茱萸粗多糖WPER进行洗脱，得到四个主要洗脱峰，0 mol/L NaCl溶液洗脱组分为WPER-1，0.2 mol/L NaCl溶液洗脱组分为WPER-2，0.4 mol/LNaCl溶液洗脱组分为WPER-3和0.7 mol/L NaCl洗脱组分为WPER-4，由图1可知，WPER-2为主要组分，WPER-4的组分含量最少。吴茱萸多糖经DEAE-52纤维素分离组分的得率如表1所示，WPER-1、WPER-2、WPER-3和WPER-4的得率分别9.07%±2.57%、68.50%±6.32%、8.26%±2.40%、5.44%±0.16%。其中WPER-2的得率最高，WPER-4的得率最低，不同洗脱组分的得率之间具有显著性差异（P<0.05）。带正电荷的纤维素离子吸附并结合到样品中的负电荷基团上，而多糖的中性基团不能被吸附，用蒸馏水可以洗脱下来，当用NaCl溶液洗脱多糖时，带负电荷的氯离子把多糖交换下来，使多糖被洗脱。
表 1 多糖的DEAE-52纤维素柱层析得率Table 1. Yield of polysaccharide on DEAE-52 cellulose column chromatography2.2 吴茱萸多糖Sepharose G-100凝胶柱洗脱
Sepharose G-100凝胶柱洗脱曲线如图2所示，图2(A)为WPER-1的洗脱曲线，共有3个峰值，分别收集3个峰值作为WPER-1a、WPER-1b、WPER-1c。图2(B)为WPER-2的洗脱曲线，共出现2个峰值，分别收集两个峰的峰值，命名WPER-2a、WPER-2b。图2(C)为WPER-3的洗脱曲线，只有一个峰值，说明主要由1个组分组成，收集后命名为WPER-3a。WPER-1b和WPER-2a的峰型具有对称性，表示这两种多糖具有均一性[20]。由表1可知，WPER-4多糖组分分离得率过低，则不再进行Sepharose G-100凝胶柱洗脱研究。对WPER-1、WPER-2、WPER-3三个多糖组分进行纯化，根据洗脱曲线收集其主要峰值作为研究对象，有助于获得更高纯度的多糖样品，也有益于结构鉴定及生物学活性测定的准确性。富集的三个多糖样品WPER-1b，WPER-2a和WPER-3a得率如表2所示，分别为39.34%±6.62%、57.10%±10.84%、52.51%±12.95%，不同得率之间具有显著性差异（P<0.05），WPER-2a具有最高的得率，在多糖的凝胶柱制备过程中，部分样品形成沉淀，导致多糖损失。在洗脱过程中，多糖、色素和蛋白质等非糖类物质附着在凝胶柱上，没有被洗脱下来，多糖的纯度提高[21]。
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图 2 WPER-1、WPER-2和PER-3的Sepharose G-100凝胶柱洗脱曲线注：（A）：WPER-1；（B）：WPER-2；（C）：WPER-3。Figure 2. Sepharose G-100 gel column elution curves of WPER-1, WPER-2 and WPER-3表 2 多糖的 Sepharose G-100 凝胶柱层析的得率Table 2. Yield of polysaccharides on Sepharose G-100 gel column chromatography样品 WPER-1b WPER-2a WPER-3a 得率（%） 39.34±6.62c 57.10±10.84a 52.51±12.95b 2.3 吴茱萸多糖组分理化性质的测定
三种多糖组分总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量如表3所示。总糖含量分别为59.32%±0.73%、66.44%±0.64%、57.69%±0.88%，其中WPER-2a的总糖含量最高，WPER-1b和WPER-3a的总糖含量略低于WPER-2a，三种多糖的总糖含量具有显著性差异（P<0.05）。糖醛酸含量分别为7.48%±0.89%、32.41%±0.99%、31.78%±0.96%。WPER-2a和WPER-3a的糖醛酸含量不具有显著性差异，其中WPER-1b的糖醛酸含量明显低于高极性洗脱液洗脱的多糖，说明纤维素柱水洗可以洗脱出糖醛酸含量较低的多糖。蛋白质的含量分别为2.61%±0.29%、2.33%±0.23%、2.12%±0.24%，蛋白质含量都较低，不具有显著性差异，其中WPER-3a的蛋白质含量最低。
表 3 多糖各组分的理化性质Table 3. Chemical composition of polysaccharide components多糖组分 WPER-1b WPER-2a WPER-3a 总糖含量（%） 59.32±0.73b 66.44±0.64a 57.69±0.88c 糖醛酸含量（%） 7.48±0.89b 32.41±0.99a 31.78±0.96a 蛋白质含量（%） 2.61±0.29a 2.33±0.23a 2.12±0.24a 2.4 吴茱萸多糖组分的单糖组成分析
通过高效液相（HPLC）检测多糖组分的单糖组成，如表4所示。WPER-1b主要是中性糖，WPER-1b的单糖组成Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara的摩尔比为2.25:1.29:1.11:2.81:4.29:29.56:16.81，Gal是WPER-1b的主要组成单糖。WPER-2a的单糖组成Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara的摩尔比为9.20:3.54:3.46:8.72:0.38:10.20:23.24。WPER-2a主要由Man、Gal和Ara单糖组成。WPER-3a的单糖组成Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara的摩尔比为10.79:4.75:2.63:5.44:2.75:9.19:23.71。WPER-3a主要由Man、Ara组成，并且所占比例最高。不同洗脱液分离的多糖，虽然其单糖组成的类型有一致性，但其单糖组成的摩尔比有一定差异[22]，这可能和洗脱液的离子强度不同有关，离子强度会直接影响到多糖的洗脱效率和分离效果，造成单糖组成摩尔比的变化。
表 4 多糖组分的单糖组成的摩尔比Table 4. Molar ratio of monosaccharide composition of polysaccharide component样品 WPER-1b WPER-2a WPER-3a 甘露糖（Man） 2.25 9.20 10.79 鼠李糖（Rha） 1.29 3.54 4.75 葡萄糖醛酸（GlcA） 1.11 3.46 2.63 半乳糖醛酸（GalA） 2.81 8.72 5.44 葡萄糖（Glc） 4.29 0.38 2.75 半乳糖（Gal） 29.56 10.20 9.19 阿拉伯糖（Ara） 16.81 23.24 23.71 2.5 吴茱萸多糖组分的结构表征
2.5.1 吴茱萸多糖组分的紫外和红外扫描分析
多糖的紫外扫描谱图如图3(A)所示。260 nm和280 nm分别是核酸和蛋白质的吸收峰，WPER-2a和WPER-3a两种多糖组分在260 nm和280 nm处不具有吸收峰，说明纯度较高。WPER-1b在260 nm和280 nm处有较小的吸收峰，说明高浓度洗脱液对多糖有一定的脱蛋白和核酸的作用。吴茱萸多糖组分的红外光谱图如图3(B)所示。WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a在3425、2935 cm−1附近处的吸收峰为O-H和C-H的拉伸振动[23]。三种多糖组分在1620、1470和1327 cm−1附近的振动分别表现出C=O、CH2和C-O的特征吸收峰，在1078、1077 cm−1附近的吸收峰属于C-O-C和C-O-H的伸缩振动[24]。结果表明，三个多糖组分均有相似的吸收峰，说明分离纯化并不改变多糖的官能团。
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图 3 结构表征图注：（A）：紫外扫描图；（B）：红外扫描图；（C）：刚果红实验图；（D）：XRD-衍射图。Figure 3. Structure characterization maps2.5.2 吴茱萸多糖组分的三螺旋结构分析
刚果红与多糖的结合导致了λmax的红移，因此可以确定多糖样品是否具有三螺旋结构[25]。实验结果如图3(C)所示，NaOH浓度为0~0.1 mol/L时，WPER-2a和WPER-3a可与刚果红形成配合物，λmax升高，表明WPER-2a和WPER-3a具有三螺旋结构，NaOH浓度在0.4~0.5 mol/L范围内，WPER-2a和WPER-3a的λmax值急剧下降，说明在高碱性环境下，多糖的三螺旋结构发生裂解，变成单螺旋结构或者无规则螺旋。WPER-1b与刚果红结合后，λmax一直下降，与刚果红相比呈现同样的下降趋势，表明WPER-1b不具有三螺旋结构。由此说明WPER-2a和WPER-3a具有三螺旋结构，WPER-1b不具有三螺旋结构。
2.5.3 吴茱萸多糖组分的XRD分析
利用X-射线衍射分析多糖的晶体构型，WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的XRD扫描结果如图3(D)所示。所有吴茱萸多糖样品均在20°左右有宽峰，WPER-1b的峰值强度最高，WPER-2a次之，而WPER-3a的峰值强度最低。结果表明，三种多糖均以非定型的结晶态存在[26]。
2.6 多糖稳定性分析
2.6.1 吴茱萸多糖组分的热稳定性分析
吴茱萸多糖组分的热分解实验如图4(A)~图4(C)所示，当温度达到100 ℃时，WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的质量损失比分别为10.71%、8.31%和10.97%。质量损失可能是由于自由水和束缚水的蒸发引起的[27]。当实验温度从100 ℃上升到200 ℃时，温度对多糖样品质量的损失率仍无明显影响，当温度超过200 ℃时，多糖的质量迅速降低，可能是因为多糖官能团键的断裂，使多糖质量减少[20]。当实验温度达到400 ℃时，WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的质量剩余分别为33.58%、58.81%和45.01%。结果表明，WPER-2a具有最佳的热稳定性。WPER-2a的热稳定性明显高于其他两个组分，这种热稳定性的差异可能与吴茱萸多糖经过不同极性洗脱液洗脱后多糖的单糖组成、理化性质和结构发生改变有关。
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图 4 WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的热重分析图注：（A）：WPER-1b；（B）：WPER-2a；（C）：WPER-3a，图5同。Figure 4. Thermogravimetric analysis of WPER-1b, WPER-2a and WPER-3a2.6.2 吴茱萸多糖组分的Zeta电位分析
Zeta电位是一种可用于得出溶液和粒子静电稳定性结论的测量方法，多糖溶液具有不同的电荷，即正电荷、负电荷或中性电荷。当Zeta电位值较低时，多糖颗粒较易聚集，从而使其稳定性降低。相反，Zeta电位值较高时，多糖颗粒较难聚集，具有较高稳定性[28]。图5(A)~图5(C)为WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的Zeta电位分析图。结果表明，WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a所带均为负电荷，WPER-2a的Zeta电位绝对值为29.0 mV，WPER-3a的电位绝对值次之，为21.5 mV，WPER-1b的Zeta电位绝对值为19.3 mV，由此可以看出WPER-2a稳定性最好，WPER-1b稳定性最差。稳定性可能和其活性有一定关系，一般稳定性较好的多糖更易发挥出多糖的活性作用[29]。
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图 5 WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的Zeta电位图Figure 5. Zeta potentials of WPER-1b, WPER-2a and WPER-3a2.7 扫描电镜（SEM）分析
图6为WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a的SEM扫描电镜图，多糖的表观形貌各异，不同的多糖的表观形貌会有一定的差异，如不规则平滑致密的薄膜状、多孔片状结构、不规则小球状、棒状。在100倍镜下观察吴茱萸多糖各组分，WPER-1b总体呈现片状，表面较粗糙，有较小的碎片附着在较大的多糖碎片上。WPER-2a总体的形态是碎片状和小的颗粒，WPER-3a大多为片状。在1000倍镜下观察吴茱萸多糖各组分，其微观形貌不均匀，WPER-1b和WPER-3a表面较光滑，呈现明显的片状，WPER-2a呈现和低倍镜下类似的表观形貌，主要是片状和少许的块状。
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图 6 多糖的扫描电镜图注：（A）：WPER-1b，（B）：WPER-2a，（C）：WPER-3a为100倍；（D）：WPER-1b，（E）：WPER-2a，（F）：WPER-3a为1000倍。Figure 6. Scanning electron microscope image of polysaccharide2.8 吴茱萸多糖体外降脂研究活性研究
2.8.1 多糖对油脂的吸附作用
多糖对油脂的吸附作用在抑制胆固醇、脂肪吸附以及增加粪便中胆汁酸排泄方面发挥重要作用，最终达到降脂的作用[30]。多糖样品的油脂吸附能力如图7所示。吴茱萸多糖各组分之间对油脂的吸附作用具有显著性差异（P<0.05）。WPER-1b，WPER-2a和WPER-3a的油脂吸附结果分别为5.5±0.35、7.58±0.69、14.31±0.44 mg/g，阳性对照组对油脂的吸附结果为15.02±0.76 mg/g。WPER-3a的油脂吸附量最高，可能是由于其具有较高的糖醛酸含量及其呈主要片状的外观形貌有关，片状外观形貌增大了多糖对油脂的吸附。
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图 7 多糖组分对油脂的吸附作用注：不同字母之间表示具有显著性差异（P<0.05）。Figure 7. Adsorption of polysaccharide components to oil2.8.2 多糖对胆汁酸的吸附作用
吴茱萸多糖组分对胆酸的吸附作用，如图8(A)所示，所有多糖组分对胆酸均具有一定的吸附作用浓度为10 mg/mL时，WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a和阳性对照对胆酸的吸附率分别为：71.40%、75.89%、57.13%、88.25%，在同一浓度时，不同样品对胆酸的吸附率呈现显著性差异（P<0.05）。WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a对胆酸均具有一定的吸附作用，但是和阳性对照之间有一定差异。吴茱萸多糖对牛磺胆酸的吸附作用如图8(B)所示，多糖样品对牛磺胆酸的吸附率和其浓度之间呈现正相关，在10 mg/mL时，WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a和阳性对照对牛磺胆酸的吸附率为59.53%、72.29%、67.57%、75.69%，不同样品对牛磺胆酸的吸附率呈现显著性差异（P<0.05）。在三种多糖样品中，WPER-2a对胆汁酸的吸附能力最好，和WPER-2a较高的总糖含量和糖醛酸含量有一定的关系，WPER-2a同时具有较高的稳定性，使其更易发挥活性。WPER-2a和WPER-3a均具有三螺旋结构，一般具有三螺旋结构的多糖的活性更好，这可能是WPER-2a和WPER-3a对牛磺胆酸有较好吸附作用的原因。
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图 8 多糖对胆酸（A）和牛磺胆酸（B）的吸附作用注：在同一浓度下，不同字母之间表示具有显著性差异（P<0.05），图9同。Figure 8. Adsorption of polysaccharides to cholic acid (A) and taurocholic acid (B)2.8.3 多糖对胰脂肪酶的抑制作用
许多植物提取物可以作为胰脂肪酶的抑制剂，从而达到降脂的目的。吴茱萸多糖组分对胰脂肪酶的抑制作用如图9所示，随着多糖浓度的升高，胰脂肪酶抑制率随之升高，多糖浓度10 mg/mL时，WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a和阳性对照对胰脂肪酶的抑制率分别为65%、62.33%、64.31%和89.85%，阳性对照和样品之间对胰脂肪酶的抑制率呈现显著性差异（P<0.05），三种多糖的胰脂肪酶抑制作用均较好，说明吴茱萸多糖有体外降脂的潜力。
3. 结论
以吴茱萸多糖为研究对象，对其进行分离纯化、结构表征以及体外降脂活性研究，主要结论如下：通过微波辅助提取法提取制备WPER，进行纯化可得到三个多糖组分WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a，所得得率分别为39.34%±6.62%、57.10%±10.84%、52.51%±12.95%，WPER-2a的多糖得率较高，多糖纯化得率低可能和其具有一定非糖类物质和溶解性有关。吴茱萸多糖分离纯化后得到的三个组分的核酸和蛋白质含量极低，进一步验证了多糖纯度的提高。单糖组成分析结果表明三个组分多糖主要由Man、Gal和Ara组成，WPER-2a的总糖含量和糖醛酸含量最高，分别为66.44%±0.64%、32.41%±0.99%。结构表征表明，分离纯化不会改变多糖官能团结构，WPER-3a具有三螺旋结构，并且三种多糖均以非定型的结晶态存在，其中热重实验和Zeta电位表明，WPER-2a稳定性明显高于其他两个组分。SEM表明WPER-1b和WPER-3a表现为块状和片状，而WPER-2a表现为粗糙、多孔的碎末状。体外降脂活性的研究结果表明，WPER-3a对油脂的吸附量最高为22.96 mg/g，WPER-2a对胆酸和牛磺胆酸具有较好的吸附作用分别为75.89%、72.29%，WPER-1b、WPER-2a、WPER-3a和对胰脂肪酶的抑制率分别为65%、62.33%和64.31%，以上结果表明吴茱萸纯化多糖具有一定的体外降脂活性。本研究不仅为吴茱萸资源的综合利用提供了新思路，还为其开发成天然无毒副作用的降血脂药物或保健品提供理论依据。
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图 2 WPER-1、WPER-2和PER-3的Sepharose G-100凝胶柱洗脱曲线
注：（A）：WPER-1；（B）：WPER-2；（C）：WPER-3。
Figure 2. Sepharose G-100 gel column elution curves of WPER-1, WPER-2 and WPER-3
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图 3 结构表征图
注：（A）：紫外扫描图；（B）：红外扫描图；（C）：刚果红实验图；（D）：XRD-衍射图。
Figure 3. Structure characterization maps
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图 4 WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的热重分析图
注：（A）：WPER-1b；（B）：WPER-2a；（C）：WPER-3a，图5同。
Figure 4. Thermogravimetric analysis of WPER-1b, WPER-2a and WPER-3a
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图 5 WPER-1b、WPER-2a和WPER-3a的Zeta电位图
Figure 5. Zeta potentials of WPER-1b, WPER-2a and WPER-3a
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图 6 多糖的扫描电镜图
注：（A）：WPER-1b，（B）：WPER-2a，（C）：WPER-3a为100倍；（D）：WPER-1b，（E）：WPER-2a，（F）：WPER-3a为1000倍。
Figure 6. Scanning electron microscope image of polysaccharide
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图 7 多糖组分对油脂的吸附作用
注：不同字母之间表示具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 7. Adsorption of polysaccharide components to oil
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图 8 多糖对胆酸（A）和牛磺胆酸（B）的吸附作用
注：在同一浓度下，不同字母之间表示具有显著性差异（P<0.05），图9同。
Figure 8. Adsorption of polysaccharides to cholic acid (A) and taurocholic acid (B)
表 1 多糖的DEAE-52纤维素柱层析得率
Table 1 Yield of polysaccharide on DEAE-52 cellulose column chromatography
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表 2 多糖的 Sepharose G-100 凝胶柱层析的得率
Table 2 Yield of polysaccharides on Sepharose G-100 gel column chromatography
样品 WPER-1b WPER-2a WPER-3a 得率（%） 39.34±6.62c 57.10±10.84a 52.51±12.95b
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表 3 多糖各组分的理化性质
Table 3 Chemical composition of polysaccharide components
多糖组分 WPER-1b WPER-2a WPER-3a 总糖含量（%） 59.32±0.73b 66.44±0.64a 57.69±0.88c 糖醛酸含量（%） 7.48±0.89b 32.41±0.99a 31.78±0.96a 蛋白质含量（%） 2.61±0.29a 2.33±0.23a 2.12±0.24a
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表 4 多糖组分的单糖组成的摩尔比
Table 4 Molar ratio of monosaccharide composition of polysaccharide component
样品 WPER-1b WPER-2a WPER-3a 甘露糖（Man） 2.25 9.20 10.79 鼠李糖（Rha） 1.29 3.54 4.75 葡萄糖醛酸（GlcA） 1.11 3.46 2.63 半乳糖醛酸（GalA） 2.81 8.72 5.44 葡萄糖（Glc） 4.29 0.38 2.75 半乳糖（Gal） 29.56 10.20 9.19 阿拉伯糖（Ara） 16.81 23.24 23.71
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