Preparation and Properties of Walnut Protein Isolate-Chitosan Nanoparticles Stabilized Pickering Emulsion
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摘要: 为实现核桃中蛋白资源的高值化利用，本研究以核桃分离蛋白（Walnut protein isolate，WPI）和壳聚糖（Chitosan，CS）为原料，利用静电相互作用制备WPI-CS纳米颗粒，并用于稳定Pickering乳液。通过纳米粒度仪及 Zeta电位仪、傅里叶变换红外光谱仪、差示扫描量热仪对WPI-CS进行表征，探究WPI与CS质量比对WPI-CS颗粒特性的影响；分析不同颗粒浓度（0.5%～2.5%）和油相体积分数（20%～60%）对Pickering微观结构、流变特性和贮藏稳定性的影响。结果表明：当WPI:CS为5:3时，WPI-CS的粒径和Zeta电位分别为846.43 nm和56.633 mV，具有良好的乳化性和稳定性，熔融温度达到80.16 ℃；复合改变了WPI的结构，二者通过氢键和静电相互作用结合，形成了紧密的网络结构。当WPI:CS为5:3，油相体积分数为40%，WPI-CS颗粒浓度为1.5%时，Pickering乳液液滴尺寸最小，仅为18.05 μm，液滴分布均匀，形状为规则的球形；贮藏15 d后乳液仍未发生分层，表现出良好的稳定性；乳液内部形成了弹性为主的凝胶网络结构，随着频率的增加，弹性凝胶网络结构被破坏。
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关键词:
- 核桃分离蛋白 /
- 壳聚糖 /
- 纳米颗粒 /
- Pickering乳液 /
- 稳定性
Abstract: Using electrostatic interactions, walnut protein isolate (WPI) and chitosan (CS) were converted into WPI-CS nanoparticles, which were then employed to stabilize Pickering emulsions and attain high value utilization of protein resources in walnuts. Using differential scanning calorimetry, fourier transform infrared spectroscopy, nanoparticle size and Zeta potential, and other techniques, the effect of the mass ratio of WPI to CS was examined. The microstructure, rheological characteristics, and storage stability of Pickering emulsions were used to determine the effects of nanoparticle concentration (0.5%~2.5%) and oil phase volume fractions (20%~60%). Results demonstrated that at a WPI:CS ratio of 5:3, the melting temperature reached 80.16 ℃ and the nanoparticle size and zeta potential of WPI-CS were 846.43 nm and 56.633 mV, respectively, with good emulsification and stability. A tight network structure was formed by hydrogen bonding and electrostatic interactions between the modified WPI and the WPI were composited by CS. The lowest droplet size of Pickering emulsion was only 18.05 μm when WPI:CS was 5:3, the volume percentage of the oil phase was 40%, and the nanoparticle concentration of WPI-CS was 1.5%. After storing the emulsion for 15 days, the droplets remained equally distributed and retained a regular sphere shape. Within the emulsion, an elasticity-dominated gel network structure emerged, which degraded as the frequency increased.-
Keywords:
- walnut isolate protein /
- chitosan /
- nanoparticles /
- pickering emulsion /
- stability
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核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，属胡桃科胡桃属植物，与扁桃、榛子、腰果并列为世界四大干果，是云南主要的林产品。核桃分离蛋白（Walnut protein isolate，WPI）是核桃的重要组分，营养价值高，应用广泛。目前，核桃加工以榨油为主，核桃粕为榨油后的副产物，其蛋白含量达50%以上，常被废弃或当饲料使用，造成了蛋白资源的严重浪费[1]，对核桃粕进行精深加工，有利于核桃加工产业的发展。Pickering乳液作为一种新型的乳液，与传统乳液相比，其环境友好、抗聚结、稳定性好，在生物活性成分的封装和保护方面有潜在价值，被广泛应用于食品工业领域[2]。目前，开发新的食品级颗粒以稳定Pickering乳液已成为食品领域的研究热点。多糖、蛋白质和脂肪类等食品级颗粒作为Pickering乳液的乳化剂，在药品、食品与化妆等领域广泛应用，其中蛋白质因无害、易消化吸收、生物相容性好等优势，被认为是潜在的食品级乳液。目前改性WPI为乳化剂稳定乳液的研究中，通过物理、化学改性可提高WPI的乳化性能。如陈思蕊等[3]采用5种蛋白酶对WPI进行低限度酶解改性，发现中性蛋白酶对WPI进行低限度酶解，乳化性及乳化稳定性良好，更适于在乳液中的应用。HUANG等[4]研究了山核桃蛋白-黄原胶复合物制备的高内相Pickering乳液并包埋槲皮素，乳液的粘弹性和稳定性高，且槲皮素的贮藏稳定性和抗氧化性增强。
壳聚糖（Chitosan，CS）是由蟹类甲壳素脱乙酰制成的一种天然多糖，无毒，具有一定的抗菌特性[5]。CS因其高生物相容性、可生物降解性和生物粘附性被用于制备复合纳米颗粒的原料[6−7]。CS含有丰富的正电荷氨基，在酸性水溶液中带阳离子电荷，能与其他相反电荷分子通过静电相互作用结合。ZHANG等[8]基于静电相互作用，利用壳聚糖改性鳕鱼蛋白，使乳液稳定性显著提高，并改善了乳液的粘弹性和触变性。唐鑫宇等[9]发现壳聚糖/阿拉伯胶质量比为1:6时，复合颗粒制备的乳液稳定性最佳。DIAO等[10]研究了壳聚糖与淀粉的干热处理制备的复合物，复合物的糊化温度、溶胀度、消化率等理化性质得到改善。目前，利用静电相互作用制备WPI-CS纳米颗粒，并以其为乳化剂稳定Pickering乳液的研究鲜有报道。
基于此，本研究以WPI和CS为原料，利用静电相互作用制备WPI-CS纳米颗粒，分析颗粒性质；以WPI-CS纳米颗粒稳定Pickering乳液，探究颗粒浓度和油相体积分数对乳液性能的影响，以期为核桃粕的高值化利用和Pickering乳液的开发提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
WPI（采用碱溶酸沉法自制，蛋白质80.17%，水7.83%，灰分2.22%，脂肪0.87%）；CS 上海源叶生物科技有限公司；玉米油 益海嘉里食品营销有限公司。冰乙酸、盐酸、氢氧化钠 分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。
LA-960V2型激光粒度仪 日本Horiba公司；FJ200-SH型数显高速分散均质机 上海沪析实业有限公司；IRPrestige-21型傅里叶变换红外光谱仪 日本Shimadzu公司；Nano-ZS型纳米粒度及Zeta电位仪 英国Malvern仪器有限公司；3500Sirius型差示扫描量热仪 德国Netzsch公司；HR 20 Discovery混合型流变仪 美国TA公司；SK2009光学显微镜 深圳赛克电子科技有限公司；Sigma 300场发射扫描电子显微镜 德国Carl Zeiss公司。
1.2 实验方法
1.2.1 WPI-CS的制备
参照刘月香[11]的方法，利用静电相互作用制备WPI-CS纳米颗粒。分别配制2%的WPI溶液和2%的CS溶液（WPI溶于去离子水，CS溶于1%冰醋酸），室温搅拌4 h（500 r/min），4 ℃过夜，得WPI原液和CS原液。分别以WPI:CS质量比5:1、5:2、5:3、5:4、5:5（w/w）制备混合溶液，调pH至6.0，室温搅拌4 h（500 r/min），8000 r/min离心15 min，取上清液。真空冷冻干燥72 h，得WPI-CS纳米颗粒。用上述方法制备单独的WPI为对照组。本研究将不同质量比的WPI和CS纳米颗粒样品分别命名为WPI-CS5:1、WPI-CS5:2、WPI-CS5:3、WPI-CS5:4、WPI-CS5:5。
1.2.2 WPI-CS纳米颗粒性质
1.2.2.1 粒径和Zeta电位
采用激光粒度仪测定样品的粒径和Zeta电位。分散剂为去离子水，折射率1.33，温度25 ℃。
1.2.2.2 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析
采用溴化钾压片法，扫描范围4000～400 cm −1，扫描32次，分辨率4 cm −1。
1.2.2.3 热稳定性分析
采用差示扫描量热仪（Differential scanning calorimetry，DSC）分析热稳定性。取1.5 mg 样品于坩埚中，空坩埚为对照，温度30～200 ℃测其热变性温度。升温速率10 ℃/min，氮气流速20 mL/min。
1.2.2.4 微观结构观察
采用扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）分析颗粒微观结构。将样品均匀分散在导电胶表面，喷金40 s，3 kV加速电压，放大1000倍。
1.2.3 Pickering乳液的制备
取一定质量的WPI-CS纳米颗粒，加入去离子水，室温搅拌4 h，4 ℃过夜，12000 r/min高速分散2 min，缓慢加入一定体积分数玉米油，继续12000 r/min高速分散3 min，得Pickering乳液。
1.2.3.1 WPI和CS复配比例对Pickering乳液的影响
分别以WPI和CS质量比5:1、5:2、5:3、5:4、5:5的WPI-CS纳米颗粒为乳化剂，颗粒浓度1.5%，油相体积分数40%，分析复配比例对乳液稳定性的影响。
1.2.3.2 颗粒浓度对Pickering乳液的影响
以WPI-CS5:3为乳化剂，颗粒浓度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，油相体积分数40%，分析颗粒浓度对乳液稳定性的影响。
1.2.3.3 油相体积分数对Pickering乳液的影响
以WPI-CS5:3为乳化剂，油相体积分数20%、30%、40%、50%、60%，颗粒浓度1.5%，分析油相体积分数对乳液稳定性的影响。
1.2.4 Pickering乳液性质
1.2.4.1 乳液粒径
采用激光粒度仪分析乳液液滴大小，测定温度25 ℃。
1.2.4.2 微观结构
取新鲜制备的乳液约20 μL滴于载玻片，光学显微镜40倍观察。
1.2.4.3 流变特性
静态流变：采用混合流变仪测定乳液的流变性，温度25 ℃，剪切速率由0.1～1000 s−1，记录乳液黏度和应力的变化趋势。 动态流变：温度25 ℃，振荡频率0.01～100 Hz，记录乳液储能模量（G'）和损耗模量（G"）的变化趋势，分析Pickering乳液的动态黏弹性。
1.2.4.4 贮藏稳定性
取新鲜乳液于小玻璃瓶中，4 ℃贮藏1、5、10和15 d测定乳析指数（CI）。
CI=H/H0×100% 式中：H表示为清液高度，cm；H0为乳液总高度，cm。
1.3 数据处理
图表中数据为3次实验平均值，采用SPSS 26.0软件处理分析数据，P<0.05表示数据差异显著，采用Origin 2021软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 WPI-CS颗粒特性
2.1.1 粒径和Zeta电位分析
图1A可见，WPI与CS不同比例的WPI-CS纳米颗粒粒径不同。pH 6时，WPI的pH大于其等电点，带负电荷，CS是天然阳离子多糖，在酸性溶液中带正电荷，两者发生静电相互作用[12]。随着CS比例的升高，WPI-CS纳米颗粒的平均粒径呈先增大后减小的趋势，WPI-CS5:3的平均粒径最大，为846.43 nm，证明WPI-CS5:3附近复合效果最好，形成了具有较大颗粒的复合物。继续增大CS的浓度，CS携带的大量正电荷与WPI结合，颗粒粒径逐渐增大，当CS持续增加时，过量的正电荷影响了复合物的组装，导致复合物分散在溶液中，粒径减小。周增超[13]探究燕麦蛋白和壳聚糖的质量比（1:10、1:5、1:1）对平均粒径的影响，发现当比例为1:5时，两者间静电作用最强。与WPI相比，WPI-CS5:2、WPI-CS5:3、WPI-CS5:4的平均粒径均大于WPI颗粒，再一次证明在WPI-CS5:3附近复合效果最好。
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Zeta电位值反映了颗粒的稳定性及颗粒间的相互作用，绝对值越大，越稳定[14]。图1B表明，WPI:CS从5:1变化至5:5，复合颗粒的Zeta电位先增大后减小，但5:1～5:3三组样品间没有显著差异。质量比5:1至5:4时，Zeta电位值均大于50 mV，具有良好的稳定性。WPI-CS5:5的电位值降至29.33 mV，可能是因为添加CS的浓度过高，抑制了复合物的形成，导致Zeta电位值降低，复合颗粒的稳定性变差。加入CS之后的复合颗粒与单一的WPI颗粒相比，Zeta电位绝对值显著增大，且均为正值。原因为pH 6时，WPI带负电荷，与带正电荷的CS之间产生静电相互作用，形成复合物，CS与WPI静电吸附聚集，复合颗粒变为正值[15]。
2.1.2 FTIR分析
图2的WPI的FTIR图谱在1668、1541和1425 cm−1附近分别对应蛋白酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动、酰胺Ⅱ带N-H弯曲振动和酰胺Ⅲ带N-H变形振动和C-N伸缩振动[16]。CS的FTIR图谱中，1653、1583和1082 cm−1附近分别对应CS骨架侧链酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动、酰胺Ⅱ带N-H变形振动和C-O收缩振动[17]。WPI-CS在3400 cm−1（O-H伸缩振动）附近处出现了较宽的峰，表明WPI与CS之间存在氢键相互作用[18]。与WPI相比，比例5:1～5:5在3360 cm−1峰发生偏移（3445～3406 cm−1），酰胺Ⅰ带（1658～1645 cm−1）和酰胺Ⅱ带（1558～1552 cm−1）有轻微偏移，说明WPI的羧基与CS的氨基之间产生了静电相互作用。
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图 2 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒FTIR图谱的影响Figure 2. Effect of the WPI to CS ratio on the FTIR spectra of WPI-CS nanoparticles2.1.3 热稳定性分析
图3可见，WPI:CS为5:1～5:4时，50 ℃附近均出现特征吸热峰，这是样品中水蒸发时的能量吸收所致[19]。WPI的熔融温度为78.75 ℃，WPI:CS为5:1～5:5变化时，WPI-CS纳米颗粒的熔融温度分别提高了6.45、0.12、1.41、1.07和0.21 ℃，表明WPI与CS相互作用形成了稳定的网络结构，提高了WPI-CS纳米颗粒的热稳定性。DAI等[20]在研究中发现，加入卵磷脂后，纳米复合物中不同组分之间的疏水作用和静电相互作用得到了增强，导致吸热峰温度高，从而增加了蛋白质的热稳定性。
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图 3 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒热稳定的影响Figure 3. Effect of the WPI to CS ratio on the thermal stability of WPI-CS nanoparticles2.1.4 SEM分析
图4可见，WPI与WPI-CS纳米颗粒的形貌有明显差异。WPI显示出紧实的球体状态，球表面较粗。WPI与CS比例5:1～5:4时，复合纳米颗粒表面粗糙，有明显的褶皱，球状形态消失。原因为CS与WPI间发生了静电相互作用，表观形貌发生变化。冻干时颗粒聚集在一起，形成了表面粗糙但成片状的结构。WPI-CS5:3比其他样品更光滑平整，可能是复合纳米颗粒较为稳定。WPI-CS5:5与其他比例复合颗粒的SEM图存在差异，呈分散、不均匀的无规则形状，这可能是因为CS的浓度过大抑制了复合颗粒的形成，使其形貌发生变化。
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图 4 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒微观结构的影响Figure 4. Effect of the WPI to CS ratio on the microstructure of WPI-CS nanoparticles2.1.5 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒稳定Pickering乳液粒径与稳定性的影响
图5A可见WPI与CS比例从5:1至5:5时，乳液的平均粒径呈先减小后增大的趋势，不同比例的乳液大小有明显区别。WPI-CS5:3稳定的Pickering乳液的平均液滴最小，仅为18.05 μm，可能是较大的壳聚糖复合蛋白质颗粒在界面上可能会有协同作用，增加界面膜的强度和稳定性，从而防止油滴的合并和长大，使得乳液粒径更小。液滴的大小和稳定性相互对应，液滴越小，Pickering乳液的稳定性越高[21−22]。结合不同纳米颗粒的平均粒径、Zeta电位、接触角和SEM，比例5:3时，WPI与CS形成了稳定的复合纳米颗粒，Pickering乳液的液滴最小，稳定性最好。随着CS浓度的增大，复合物的形成被抑制，Pickering乳液液滴发生聚集，絮凝，Pickering乳液的稳定性下降。
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图 5 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒稳定Pickering乳液粒径（A）与稳定性（B）的影响Figure 5. Effect of the WPI to CS ratio on the size (A) and stability (B) of Pickering emulsions stabilized by WPI-CS nanoparticles图5B可见，WPI稳定的乳液在第一天出现分层，稳定性较差；其他WPI-CS纳米颗粒稳定的Pickering乳液均未出现分层。WPI-CS5:2、WPI-CS5:3、WPI-CS5:4的乳液呈白色乳状液，贮藏15 d时，仍表现出较好的稳定性。综上，表明WPI与CS比例5:3附近复合效果最好，形成了较为稳定的纳米颗粒，与WPI-CS纳米颗粒的平均粒径结果一致。WPI-CS5:5稳定的Pickering乳液液滴发生聚集，出现絮凝现象，可能是因为CS的浓度过大，CS携带的大量正电荷抑制了复合物的形成，导致Pickering乳液的稳定性下降。
2.2 WPI-CS5:3颗粒浓度对Pickering乳液的影响
2.2.1 乳液粒径与微观结构
图6A可见，颗粒浓度的增加，乳液粒径呈先减小后增大的趋势。颗粒浓度为0.5%～1.5%时，乳液平均粒径小于100 μm；颗粒浓度为1.5%时，乳液粒径最小，仅为18.05 μm。原因为颗粒浓度的增大会使水相的黏度增加，形成致密的颗粒网络结构，液滴难以聚集，乳液的平均液滴变小[23]。当颗粒浓度大于1.5%时，液滴尺寸骤增至120 μm以上，此时颗粒浓度过大，乳液发生絮凝，乳液粒径变大[24]。
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图 6 颗粒浓度对Pickering乳液粒径（A）和微观结构（B）的影响Figure 6. Effect of the nanoparticle concentration on the droplet size (A) and microstructure (B) of Pickering emulsion图6B可见，随颗粒浓度增大，乳液呈先减小后增大的趋势，与乳液粒径结果一致。所有样品稳定的Pickering乳液液滴均呈现轮廓清晰、形状规则的圆球形液滴。颗粒浓度为1.5%时，液滴分布均匀，粒径最小。此时WPI-CS5:3纳米颗粒在油水界面形成牢固有序的界面层，防止液滴发生聚集；颗粒浓度大于1.5%时，液滴尺寸逐渐增大，液滴发生聚集。
2.2.2 流变特性
图7A可见，样品在剪切速率0～200 s−1时，所有乳液的表观黏度均随剪切速率的增加而急速下降；剪切速率200～400 s−1时，乳液的表观黏度缓慢下降，表现出剪切稀化特性，属假塑性流体。原因是剪切力破坏了乳液的内部结构，减小了液滴的定向排布阻力，黏度下降[25]。剪切速率400～1000 s−1时，乳液的表观黏度基本保持不变，达到稳定，乳液呈牛顿流体特性。颗粒浓度0.5%～2.5%变化时，乳液的表观黏度增大，这可能是因为颗粒浓度的增加使得液滴间的连接更加紧密，形成了稳定的乳液结构。
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图 7 颗粒浓度对Pickering乳液流变特性的影响Figure 7. Effect of the nanoparticle concentration on rheological properties of Pickering emulsionG′和G″可分别反映Pickering乳液的弹性和黏性[26]。图7B可见，频率0.1～2 Hz的区间，所有样品稳定的Pickering乳液的G′均高于G″，说明乳液形成了以弹性为主的凝胶网络结构。除颗粒浓度为2.5%的乳液外，其余浓度Pickering乳液的G′和G″在2～100 Hz的区间内均出现了交叉点，说明弹性为主的凝胶网络被破坏，此时黏性特性支配弹性特性，乳液开始流动[27]。因此，高颗粒浓度的Pickering乳液液滴之间形成了高强度的凝胶网络结构，外力对其破坏程度小。
2.2.3 贮藏稳定性
CI值可以反应乳液的稳定性，CI值越小，乳液越稳定。颗粒浓度为0.5%的乳液在贮藏1 d时，乳液出现分层，此时CI值为8.16%；随贮藏时间的延长，分层逐渐明显，在贮藏15 d时，CI达到24.49%。颗粒浓度1%的乳液在贮藏5 d时才开始分层，CI为6.67%；在贮藏15 d后CI增至8.89%。颗粒浓度为1.5%～2.5%的乳液在贮藏15 d后仍未出现分层，表明较高颗粒浓度的Pickering乳液呈稳定的状态。
表 1 颗粒浓度对Pickering乳液CI值的影响Table 1. Effect of the nanoparticle concentration on the CI value of Pickering emulsionWPI-CS5:3
浓度（%）贮藏时间（d） 1 5 10 15 0.5 8.16±0.18Ca 23.67±0.32Ba 24.49±0.35Aa 24.49±0.35Aa 1 0Cb 6.67±0.12Bb 8.89±0.18Ab 8.89±0.18Ab 1.5 0Ab 0Ac 0Ac 0Ac 2 0Ab 0Ac 0Ac 0Ac 2.5 0Ab 0Ac 0Ac 0Ac 注：不同大写字母表示同一行差异显著（P<0.05），不同小写字母表示同一列差异显著（P<0.05），下同。 ![]()
图 8 颗粒浓度对Pickering乳液的贮藏稳定性的影响Figure 8. Effect of the nanoparticle concentration on storage stability of Pickering emulsion2.3 油相体积分数对Pickering乳液的影响
2.3.1 乳液粒径与微观结构
图9A可见，油相体积分数的增加，乳液粒径呈先减小后增大的趋势，所有的乳液均为微米级Pickering乳液。油相体积分数为20%～40%时，乳液的平均液滴从201.00 μm减小至18.05 μm。原因可能是低油相体积分数时，WPI-CS5:3纳米颗粒不能完全在油水界面形成稳定体系，乳液发生聚集，乳液粒径较大；当增加油相体积分数后，纳米颗粒能紧密覆盖于在液滴表面，乳液稳定，乳液粒径减少；油相体积分数继续增大到40%～60%时，乳液粒径增加至229.058 μm，此时纳米颗粒又呈现不足的现象，不能完全吸附支撑形成稳定的乳液体系，乳液液滴之间发生聚集，乳液粒径增大[28]。
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图 9 油相体积分数对Pickering乳液粒径（A）和微观结构（B）的影响Figure 9. Effect of the oil phase volume fraction on the droplet size (A) and microstructure (B) of Pickering emulsion图9B可见，油相体积分数20%～60%时，乳液粒径先增大后减小，与乳液粒径大小结果一致。油相体积分数20%～30%，乳液液滴尺寸较大，液滴尺寸不均匀；油相体积分数40%时，液滴尺寸最小分布均匀；油相体积分数50%～60%时，乳液液滴变大，尺寸大小不均匀。
2.3.2 流变特性
图10A可见，剪切速率0～1000 s−1时，所有Pickering乳液的表观黏度均随剪切速率的增加而下降，具有剪切稀化的特点[29]。原因为：在快速剪切作用力下，乳液中油滴聚集群的结构被破坏，油滴发生形变，粘度下降[30]。油相体积分数20%～50%时，Pickering乳液的表观黏度随油相体积分数的增大而增加，原因为油相体积分数的增加提高了乳液中油滴的堆积程度，导致乳液表观黏度增大。当油相体积分数增加至60%时，乳液表观黏度降低。HU等[31]在研究用杂化的β-环糊精/短线性葡聚糖纳米颗粒稳定的Pickering乳液时发现，在油水比大于7:3（v/v）时，其表观粘度会随着油水比的增加而减小，原因为在较高油含量下，乳液的类型会发生改变，乳液从稳定的O/W乳液转变成不稳定的W/O乳液。
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图 10 油相体积分数对Pickering乳液流变特性的影响Figure 10. Effect of the oil phase volume fraction on rheological properties of Pickering emulsion图10B可见，高油相体积分数乳液（40%～60%）的G′大于低油相体积分数乳液（20%～30%），油相体积分数对乳液的黏弹性有一定影响。频率0.1~3 Hz时所有Pickering乳液的G′明显大于G″，表明乳液形成了以弹性为主的凝胶网络结构。当频率大于3 Hz后，不同油相体积分数乳液的G′和G″出现交叉，凝胶网络结构被破坏，形成了黏性为主的液体性质。
2.3.3 贮藏稳定性
表2可见，20%～30%油相体积分数的颗粒稳定的Pickering乳液在贮藏15 d后均未发生分层。油相体积分数为60%的乳液在贮藏1 d时，乳液发生油水分离，CI值为30.12%；贮藏15 d后，CI显著增至44.17%（P<0.05），乳液不稳定，乳液油水分离明显。原因可能为过高的油相体积使液滴之间堆积太过紧密，油水界面的部分结构被破坏，乳液的稳定性下降。
表 2 油相体积分数对Pickering乳液CI值的影响Table 2. Effect of the oil phase volume fraction on the CI value of Pickering emulsion油相体积分数
（%）贮藏时间（d） 1 5 10 15 20 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 30 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 40 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 50 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 60 30.12±0.38Ca 40.23±0.41Ba 44.15±0.50Aa 44.17±0.52Aa ![]()
图 11 油相体积分数对Pickering乳液贮藏稳定性的影响Figure 11. Effect of oil phase volume fraction on storage stability of Pickering emulsion3. 结论
本研究利用静电作用制备WPI-CS纳米颗粒，以其为稳定剂制备Pickering乳液，乳化效果得到了很大提升。与WPI相比，复合后的WPI-CS纳米颗粒性质更佳，以此为稳定剂制备的Pickering乳液性能更佳。WPI-CS5:3的粒径和Zeta电位分别为846.43 nm和56.633 mV，具有良好的稳定性，熔融温度提高1.41 ℃；复合使WPI的结构被改变，WPI与CS通过氢键和静电相互作用形成紧密的网络结构。WPI-CS 5:3在颗粒浓度为1.5%、油相体积为40%时制备出的Pickering乳液液滴尺寸仅为18.05 μm，液滴为规则的球形，均匀分布；贮藏15 d后乳液仍未发生分层，稳定性良好；在频率0.1～8 Hz区间形成了弹性凝胶网络结构，频率大于8 Hz后凝胶网络结构被破坏，结果表明CS是一种理想的改善WPI的材料。研究结果可为核桃粕的高值化利用和食品级Pickering乳液的开发利用提供理论依据。今后将尝试以Pickering乳液为载体，有效包埋生物活性物质，并将其应用于食品工业。
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图 2 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒FTIR图谱的影响
Figure 2. Effect of the WPI to CS ratio on the FTIR spectra of WPI-CS nanoparticles
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图 3 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒热稳定的影响
Figure 3. Effect of the WPI to CS ratio on the thermal stability of WPI-CS nanoparticles
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图 4 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒微观结构的影响
Figure 4. Effect of the WPI to CS ratio on the microstructure of WPI-CS nanoparticles
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图 5 WPI与CS比例对WPI-CS纳米颗粒稳定Pickering乳液粒径（A）与稳定性（B）的影响
Figure 5. Effect of the WPI to CS ratio on the size (A) and stability (B) of Pickering emulsions stabilized by WPI-CS nanoparticles
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图 6 颗粒浓度对Pickering乳液粒径（A）和微观结构（B）的影响
Figure 6. Effect of the nanoparticle concentration on the droplet size (A) and microstructure (B) of Pickering emulsion
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图 7 颗粒浓度对Pickering乳液流变特性的影响
Figure 7. Effect of the nanoparticle concentration on rheological properties of Pickering emulsion
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图 8 颗粒浓度对Pickering乳液的贮藏稳定性的影响
Figure 8. Effect of the nanoparticle concentration on storage stability of Pickering emulsion
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图 9 油相体积分数对Pickering乳液粒径（A）和微观结构（B）的影响
Figure 9. Effect of the oil phase volume fraction on the droplet size (A) and microstructure (B) of Pickering emulsion
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图 10 油相体积分数对Pickering乳液流变特性的影响
Figure 10. Effect of the oil phase volume fraction on rheological properties of Pickering emulsion
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图 11 油相体积分数对Pickering乳液贮藏稳定性的影响
Figure 11. Effect of oil phase volume fraction on storage stability of Pickering emulsion
表 1 颗粒浓度对Pickering乳液CI值的影响
Table 1 Effect of the nanoparticle concentration on the CI value of Pickering emulsion
WPI-CS5:3
浓度（%）贮藏时间（d） 1 5 10 15 0.5 8.16±0.18Ca 23.67±0.32Ba 24.49±0.35Aa 24.49±0.35Aa 1 0Cb 6.67±0.12Bb 8.89±0.18Ab 8.89±0.18Ab 1.5 0Ab 0Ac 0Ac 0Ac 2 0Ab 0Ac 0Ac 0Ac 2.5 0Ab 0Ac 0Ac 0Ac 注：不同大写字母表示同一行差异显著（P<0.05），不同小写字母表示同一列差异显著（P<0.05），下同。 
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表 2 油相体积分数对Pickering乳液CI值的影响
Table 2 Effect of the oil phase volume fraction on the CI value of Pickering emulsion
油相体积分数
（%）贮藏时间（d） 1 5 10 15 20 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 30 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 40 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 50 0Ab 0Ab 0Ab 0Ab 60 30.12±0.38Ca 40.23±0.41Ba 44.15±0.50Aa 44.17±0.52Aa
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