Optimization of Extraction Process, Structural Characterization and In Vitro Bioactivity of Polysaccharides from Dendrocalamus brandisii Bamboo Shoot Shell
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摘要: 通过Box-Behnken响应面法优化勃氏甜龙竹笋壳多糖（Polysaccharides from Dendrocalamus brandisii bamboo shoot shell，PDB）的提取工艺，综合运用高效凝胶渗透色谱法、离子色谱法、紫外光谱、傅里叶红外光谱、扫描电镜、刚果红实验对经DEAE-52纤维素柱分离的PDB进行结构表征，并评价各组分的体外抗氧化、降血糖、降血脂活性。结果表明，当碳酸钠浓度为4.1 mg/mL、超声功率310 W、超声时间81 min、超声温度66 °C时，PDB的得率最高，为2.09%；PDB经DEAE-52纤维素柱分离后得到三个组分PDB-0、PDB-1和PDB-2，均主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖组成，红外光谱发现三个组分具有典型的多糖特征峰。体外生物活性实验发现三个多糖组分均表现出一定的抗氧化、降血糖和降血脂活性，其中PDB-2抗氧化活性最为突出，清除DPPH·、ABTS+·的半抑制浓度（IC50）分别0.74±0.05 mg/mL和0.64±0.01 mg/mL，当浓度为1 mg/mL时，铁还原实验吸光度值为0.331；各组分抑制α-淀粉酶活性的IC50值分别为0.78±0.05、0.82±0.04和0.94±0.02 mg/mL；在浓度达到1 mg/mL时，PDB-0、PDB-1和PDB-2结合胆酸钠、牛黄胆酸钠、甘氨胆酸钠的比率分别达到17.66%±0.12%、21.06%±0.45%和22.28%±0.51%，24.79%±0.79%、26.27%±0.78%和32.57%±0.75%，22.46%±0.79%，25.52%±0.23%和23.16%±0.78%。综上所述，PDB具有良好的体外抗氧化、降血糖和降血脂活性，在食品抗氧化剂和保健品的研发中具有较大潜力。Abstract: The extraction process of polysaccharides from Dendrocalamus brandisii bamboo shoot shell (PDB) was optimized by Box-Behnken response surface method, and high performance gel permeation chromatography, ion chromatography, ultraviolet spectroscopy, and Fourier infrared spectroscopy were comprehensively applied, Scanning electron microscopy, and Congo red assay were used to characterize the structure of PDB separated by DEAE-52 cellulose column, and to evaluate the in vitro antioxidant, hypoglycemic, and hypolipidemic activities of each component. The results showed that the highest extraction rate of PDB was 2.09% when the concentration of sodium carbonate was 4.1 mg/mL, the ultrasonic power was 310 W, the ultrasonic time was 81 min, and the ultrasonic temperature was 66 °C. PDB was separated by a DEAE-52 cellulose column to obtain the three fractions, namely PDB-0, PDB-1, and PDB-2, which were all mainly composed of arabinose, galactose, Glucose and Xylose, and the IR spectra showed that the three fractions had typical polysaccharide characteristic peaks. In vitro bioactivity experiments revealed that all three polysaccharide fractions exhibited certain antioxidant, hypoglycemic and hypolipidemic activities, among which the antioxidant activity of PDB-2 was the most prominent, with the half-inhibitory concentrations (IC50) of 0.74±0.05 mg/mL and 0.64±0.01 mg/mL, respectively, for the removal of DPPH· and ABTS+·. When the concentration was 1 mg/mL, the absorbance value of the iron reduction assay was 0.331; the IC50 values for the inhibition of α-amylase activity by each component were 0.78±0.05, 0.82±0.04 and 0.94±0.02 mg/mL, respectively, at concentrations of 1 mg/mL, the binding ratios of PDB-0, PDB-1 and PDB-2 to sodium cholate, sodium taurocholate, and sodium glycylcholate were respectively up to 17.66%±0.12%, 21.06%±0.45%, and 22.28%±0.51%; 24.79%±0.79%, 26.27%±0.78%, and 32.57%±0.75%; 22.46%±0.79%, 25.52%±0.23% and 23.16%±0.78%. In summary, PDB has good in vitro antioxidant, hypoglycemic and hypolipidemic activities and has great potential in the development of food antioxidants and nutraceuticals.
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勃氏甜龙竹（Dendrocalamus brandisii）是大型丛生笋材两用竹种，主要分布于热带和亚热带地区，在我国云南省临沧、保山、德宏和西双版纳等地均有种植[1]。因其生长较快，采伐周期短，是我国饮食文化中重要的食材和烹饪工具[2]，具有良好的经济效益[3]。勃氏甜龙竹竹笋肉质细嫩、口感鲜甜，营养丰富，可生食，被誉为“水果笋”，是一种广受人们喜爱的绿色健康食品，也是云南省重点发展的笋用竹种之一[4−5]。笋壳是竹笋加工产业的主要副产物，部分用作动物饲料[6]，更多被直接丢弃造成环境污染与资源浪费[7]。
研究发现，竹笋壳中含有多糖、黄酮、膳食纤维和甾醇等生物活性成分[8]，其中多糖是一种可改性强，毒副作用弱、生物相容性好的大分子[9]，是一种极具研究潜力的资源。来源于竹笋壳的膳食纤维具有良好的溶胀性和保水性，能显著降低小鼠血脂含量[10]；从竹笋壳中分离的β-吡喃多糖，对高脂饮食和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠具有降血糖活性[11]；从毛竹笋壳中提取的多糖具有良好的清除DPPH·和·OH的能力[12]；顺序提取勃氏甜龙竹笋壳中的多糖，发现碳酸钠可溶部分表现出强大的抗氧化清除活性[13]；此外，研究发现竹笋壳多糖作为一种天然的抗氧化剂在维持机体免疫机能方面有正面效果[14]。
因此，本研究拟采用超声辅助碳酸钠提取勃氏甜龙竹笋壳多糖（Polysaccharides from Dendrocalamus brandisii bamboo shoot shell，PDB），通过单因素和响应面试验对PDB的提取工艺进行优化，对经DEAE-52纤维素柱分离的三个多糖组分的结构进行表征，并评价其体外抗氧化、降血糖和降血脂活性，以期为勃氏甜龙竹笋壳的综合开发利用提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
勃氏甜龙竹笋 云南省西双版纳州，经西南林业大学竹类植物研究专家王曙光教授鉴定为勃氏甜龙竹笋（Dendrocalamus brandisii）；苯酚、抗坏血酸 广东光华科技有限公司；无水葡萄糖、氯化钠 上海源叶生物科技有限公司；浓硫酸、氢氧化钠 云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；DEAE-52纤维素、95%乙醇、1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮_双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京博奥拓科技有限公司；过硫酸钾、铁氰化钾、磷酸盐、刚果红、无水碳酸钠 天津市风船化学试剂科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
SB-400DTY超声波清洗机 宁波新芝超声设备有限公司；DNF-4K热泵干燥机 北京东南风科技有限公司；BJ-800A粉碎机 永康市速峰工贸有限公司；N−1300型旋转蒸发仪、CA−111型冷阱 上海爱朗仪器有限公司；SHZ−DIII型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；TG16-WS离心机 湖南迈克尔实验仪器有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计、ICS5000离子色谱仪 日本岛津公司；IS50傅立叶变换红外光谱仪、LC-10A高效液相色谱仪 美国赛默飞世尔公司；Regulus8100扫描电镜 日立科学仪器（北京）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 竹笋壳预处理及竹笋壳多糖提取工艺
竹笋壳洗净置于50 °C热泵中烘干，粉碎后过40目筛，称取200.00 g竹笋壳粉，常温下加入95%乙醇浸泡4 h，除去里面的色素和酚类物质，抽滤去掉乙醇后，将得到的滤渣烘干备用。称取1.00 g经处理的竹笋壳粉，按照料液比1:30（g/mL），在设定的不同碳酸钠浓度、超声功率、超声时间和超声温度下进行提取试验，得到的多糖浸提液旋蒸浓缩后加入4倍体积的95%乙醇于4 °C醇沉12 h，5000 r/min离心10 min，收集沉淀经冻干得到PDB。
1.2.2 单因素实验
固定条件为碳酸钠浓度3 mg/mL、超声功率240 W、超声时间75 min、超声温度55 °C，考察了碳酸钠浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）、超声功率（160、200、240、280、320 W）、超声时间（35、55、75、95、115 min）、超声温度（35、45、55、65、75 °C）对多糖得率的影响。
1.2.3 响应面试验
基于单因素实验结果，开展Box-Behnken响应面试验优化超声辅助碳酸钠提取PDB的条件，实验设计见表1。
表 1 Box-Behnken试验设计Table 1. Box-Behnken experimental design因素 水平 −1 0 1 A碳酸钠浓度（mg/mL） 3 4 5 B超声功率（W） 240 280 320 C超声时间（min） 55 75 95 D超声温度（°C） 55 65 75 1.2.4 多糖得率计算
1.2.4.1 标准曲线的绘制
采用苯酚-硫酸法[15]测定多糖含量，取1 mL提取液，加入1 mL苯酚溶液（5 mg/mL），加入5 mL浓硫酸，涡旋混匀，室温下反应30 min后在490 nm波长下测吸光度值。葡萄糖标准溶液的线性回归方程为：y=9.7867x+0.0434，R2=0.9998（y为多糖浓度，x为所测吸光度值）。
1.2.4.2 得率的计算
PDB得率Y（%）计算如公式（1）：
Y(%)=C×V×Fm×1000×100 (1) 式中，C为提取液多糖浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；F为稀释系数；m为勃氏甜龙竹笋壳粉质量，g。
1.2.5 PDB的分离纯化
蒸馏水溶解PDB，5000 r/min离心10 min后取上清液加入DEAE-52纤维素层析柱中，分别用不同浓度的NaCl溶液（0、0.1、0.3、0.5 mol/L）以1 mL/min的流速洗脱2个柱体积，用试管收集，每管5 mL[16]。利用苯酚-硫酸法测吸光度值，以管数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线的峰形对洗脱的PDB收集合并后，透析（3500 Da）去除溶液中的NaCl，冻干得到不同的多糖组分。将得到的各组分复溶，分别测定多糖纯度Y（%），计算如公式（2）：
Y(%)=C×Vm×100 (2) 式中，C为复溶多糖浓度，mg/mL；V为多糖溶液体积，mL；m为多糖样品质量，mg
1.2.6 竹笋壳多糖的结构表征
1.2.6.1 分子量测定、单糖组成分析
参考Zeng等[17]的方法，采用高效凝胶渗透色谱法，分别称取5.00 mg的多糖样品和标准品溶于1 mL流动相中，12000 r/min离心10 min，吸取上清液，用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤，以保留时间为横坐标，分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线，得到lgMw-RT校正曲线方程为：y=−0.1973x+11.738，R2=0.9956；lgMn-RT校正曲线方程为：y=−0.1964x+11.7，R2=0.9955。色谱条件：流动相：0.05 mol/L NaCl溶液；色谱柱：BRT105-103-101（8×300 mm）；流速：0.7 mL/min；柱温：40 °C；进样量：25 μL；检测器：示差检测器RID-20A；分析时间：60 min。
参考Yu等[18]的方法，采用离子色谱法来测定单糖组成，精密称量5.00 mg样品，加入3 mol/L三氯乙酸2 mL，120 °C水解3 h。利用氮吹仪吹干，加入5 mL水，涡旋混匀后吸取70 µL加入930 µL去离子水，12000 r/min离心5 min，取上清过0.22 μm水系滤膜进IC分析。色谱柱：Dionex CarbopacTM PA20（3×150 mm）；流动相：A：H2O；B：0.15 mol/L NaOH；C：0.15 mol/L NaOH和1 mol/L NaAc；流速：0.3 mL/min；进样量：25 µL；柱温：30 °C。
1.2.6.2 傅里叶红外光谱、紫外光谱分析
参考Yang等[19]的方法，将200.00 mg KBr与2.00 mg多糖充分混合，挤压形成薄片，用红外光谱仪在4000~400 cm−1扫描。采用分光光度计对1 mg/mL多糖水溶液进行紫外可见光谱扫描，扫描波长为200~400 nm。
1.2.6.3 刚果红分析
参考Xu等[20]的方法稍作改变，分别配置1 mg/mL多糖溶液、80 μmol/L刚果红溶液及1 mol/L的NaOH溶液。各取1 mL多糖溶液和刚果红溶液于试管，加入不同体积的NaOH溶液使NaOH浓度呈现梯度（0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）。室温下反应10 min，测定多糖溶液在200~600 nm处的最大吸收波长。
1.2.6.4 扫描电镜
参考Xiao等[21]方法，样品喷金处理后，于5.0 kV电压下对样品表面进行扫描，并进行相应的清晰度调试，直至得到理想的观察视野。
1.2.7 抗氧化活性测定
1.2.7.1 DPPH·清除活性
根据Peng等[22]方法适当调整。DPPH·的配制：称取4.00 mg试剂用乙醇溶液定容至100 mL容量瓶内。取2 mL多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于试管，加入2 mL DPPH·溶液，在37 °C下避光水浴30 min后于517 nm处测吸光度值（A1）。无水乙醇代替DPPH·为对照；蒸馏水代替多糖为空白；以Vc作阳性对照。计算如公式（3）：
DPPH⋅清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (3) 式中：A1为样品组吸光度值，A2为对照组吸光度值，A0为空白组吸光度值。
1.2.7.2 ABTS+·清除活性
根据Zhu等[23]的方法稍作修改。将7 mmol/L ABTS+·溶液与5 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1:1混匀，室温下避光放置12 h，用95%乙醇稀释混合液至吸光度值为0.7±0.02。取1 mL多糖溶液（0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL），加入3 mL的ABTS+·溶液，室温下避光静置5 min，734 nm处测吸光度值。蒸馏水代替多糖为空白；以Vc作阳性对照。计算如公式（4）：
ABTS+⋅清除率(%)=(1−A1A0)×100 (4) 式中：A1为样品组吸光度值，A0为空白组吸光度值。
1.2.7.3 铁离子还原能力测定
根据Yang等[24]的方法稍作修改：各取1 mL多糖溶液、磷酸盐缓冲液（pH=6.6）、铁氰化钾（10 mg/mL）混匀，50 °C反应20 min，加入1 mL三氯乙酸（100 mg/mL），4000 r/min离心10 min。取上清液1 mL，加入1 mL蒸馏水及1 mL氯化铁（10 mg/mL），混匀，反应10 min，在700 nm处测吸光度值，以Vc作阳性对照。
1.2.8 降血糖、降血脂活性测定
1.2.8.1 α-淀粉酶抑制活性
根据岳庆明等[25]的方法稍作修改，取250 μL多糖溶液和α-淀粉酶（1 U/mL）等体积混合，37 °C反应10 min；加入500 μL 10 mg/mL的淀粉溶液继续反应10 min；最后加入600 μL的DNS试剂，沸水浴15 min，冷却至室温后于540 nm处测吸光度值。缓冲液代替酶为对照；缓冲液代替多糖为空白；以阿卡波糖做阳性对照。计算如公式（5）：
α-淀粉酶抑制率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (5) 式中：A0为空白组吸光度值；A1为样品组吸光度值；A2为对照组吸光度值。
1.2.8.2 结合胆酸盐能力
根据Yang等[26]的方法稍作修改，取1 mL多糖溶液与4 mL的0.3 mmol/L胆酸盐（胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠）混匀，在37 °C恒温摇床中反应1 h，5000 r/min离心10 min。取上清液1 mL加入3 mL硫酸（60%，v/v）,70 °C水浴20 min，反应结束后，冰水浴5 min。在387 nm处测吸光度值。蒸馏水代替多糖为空白组，缓冲液代替胆酸盐为对照组。计算如公式（6）：
胆酸盐吸附能力(%)=A0−A1+A2A0×100 (6) 式中：A0为空白组吸光度值；A1为样品组吸光度值；A2为对照组吸光度值。
1.3 数据处理
利用软件Design-Expert 12进行试验设计与方差分析、Origin 2022及IBS SPSS Statistics 26作图，每组进行3次重复试验，结果以平均值±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 碳酸钠浓度对PDB得率的影响
如图1（A）所示，随着碳酸钠浓度增加，PDB的得率呈先升后降的趋势，在碳酸钠浓度为4 mg/mL时提取率达到峰值，此时继续增加碳酸钠浓度，提取的底物无法使碳酸钠达到饱和，过量的碳酸钠也会附着在竹笋壳粉表面，阻碍多糖的溶出，导致得率降低[27]。综上所述，选择3、4、5 mg/mL三个水平进行响应面优化试验。
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图 1 各因素对PDB提取率的影响注：不同字母（a~e）表示处理间差异有统计学意义（P<0.05）。Figure 1. Effect of factors on the extraction rate of PDB2.1.2 超声功率对PDB得率的影响
从图1（B）所示，在超声功率160~280 W之间，随着超声功率增大，空化效应加剧，促进细胞壁的降解，使多糖更多的暴露在溶剂中[28]，多糖得率增加并在280 W时达到峰值；继续增大超声功率可能破坏多糖结构[29]，导致得率下降。综上，选择240、280、320 W三个水平进行响应面优化试验。
2.1.3 超声时间对PDB得率的影响
如图1（C）所示，随着超声时间延长，持续的空化和微泡内爆加剧了植物细胞壁的破裂，减少了细胞结构对传质过程的限制，有利于多糖扩散使多糖得率提高[30]。但长时间的超声作用会导致多糖降解[31]，当降解速率大于溶出速率时，导致多糖得率下降。综上，选择55、75、95 min三个水平进行响应面优化试验。
2.1.4 超声温度对PDB得率的影响
如图1（D）所示，在实验温度范围内，适当升高温度使溶液表面张力降低，超声所需要的空化强度阈值降低，有助于多糖提取，然而过高的温度会导致多糖的结构降解，抵消了温度升高带来的传质速率的增加[32]，因此选择55、65、75 °C三个水平进行响应面优化试验。
2.2 响应面优化
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
响应面试验设计及结果见表2。通过回归拟合得到回归模型方程：Y=1.98+0.0523A+0.1773B+0.0475C+0.1443D+0.0605AB+0.0227AC+0.0507AD+0.1527BC−0.0112BD+0.0570CD−0.4342A2−0.2392B2−0.2197C2−0.3207D2。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Response surface experimental design and results序号 A碳酸钠浓度
（mg/mL）B超声功率
（W）C超声时间
（min）D超声温度
（°C）多糖得率
（%）1 0 −1 0 1 2.01±0.14 2 0 1 0 1 1.15±0.12 3 −1 −1 0 0 1.47±0.21 4 −1 0 1 0 1.08±0.17 5 0 0 −1 −1 2.04±0.13 6 0 0 0 0 1.48±0.14 7 0 0 1 1 1.48±0.17 8 0 1 0 −1 1.69±0.02 9 0 −1 0 −1 1.66±0.13 10 −1 0 −1 0 1.24±0.15 11 0 0 0 0 1.89±0.25 12 −1 0 0 −1 1.32±0.13 13 0 0 0 0 1.29±0.27 14 1 0 0 −1 1.12±0.08 15 0 0 0 0 1.51±0.13 16 1 0 1 0 2.00±0.05 17 1 0 −1 0 1.98±0.02 18 0 −1 −1 0 1.75±0.06 19 0 −1 1 0 1.40±0.22 20 1 −1 0 0 1.91±0.12 21 0 0 0 0 1.42±0.07 22 0 1 1 0 1.21±0.09 23 1 1 0 0 1.22±0.21 24 −1 1 0 0 1.56±0.08 25 0 0 1 −1 1.15±0.10 26 1 0 0 1 1.25±0.09 27 0 1 −1 0 1.37±0.19 28 −1 0 0 1 1.14±0.17 29 0 0 −1 1 1.23±0.19 响应面试验的方差分析结果见表3，其中回归模型显著（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.3890），决定系数R2=0.9760，调整系数Radj2=0.9520，表明回归方程拟合度良好，试验方法有较高可信度，该模型可用来分析和预测PDB的提取条件[33]。此外，各因素对PDB的得率影响有一定差异，其影响大小顺序为超声功率（B）>超声温度（D）>碳酸钠浓度（A）>超声时间（C）。
表 3 方差分析结果Table 3. Analysis of variance results来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 2.57 14 0.1838 40.70 <0.0001 A 0.0329 1 0.0329 7.28 0.0173 B 0.3774 1 0.3774 83.57 <0.0001 C 0.0271 1 0.0271 6.00 0.0281 D 0.2500 1 0.2500 55.36 <0.0001 AB 0.0146 1 0.0146 3.24 0.0933 AC 0.0021 1 0.0021 0.46 0.5094 AD 0.0103 1 0.0103 2.28 0.1532 BC 0.0933 1 0.0933 20.67 0.0005 BD 0.0005 1 0.0005 0.11 0.7427 CD 0.0130 1 0.0130 2.88 0.1119 A2 1.22 1 1.22 270.78 <0.0001 B2 0.3710 1 0.3710 82.17 <0.0001 C2 0.3130 1 0.3130 69.32 <0.0001 D2 0.6670 1 0.6670 147.71 <0.0001 残差 0.0632 14 0.0045 失拟项 0.0494 10 0.0049 1.43 0.3890 纯误差 0.0138 4 0.0034 总误差 2.64 28 R2=0.9760 Radj2=0.9520 C.V.=4.53 2.2.2 响应面3D图形
响应曲面的陡峭程度可以直观的反应出各因素间的交互规律，图越陡峭说明交互作用越显著。如图2所示，各因素两两交互的响应面开口向下，等高线接近于椭圆，表明各因素交互作用对PDB得率有一定影响。
2.2.3 验证试验
模型预测的提取条件为碳酸钠浓度4.12 mg/mL、超声功率306.69 W、超声时间80.32 min、超声温度66.64 °C，在此条件下PDB得率的预测值为2.04%；基于实际操作的可行性，将工艺调整为碳酸钠浓度4.1 mg/mL、超声功率310 W、超声时间81 min、超声温度66 °C，此条件下，PDB的得率为2.09%±0.02%，与预测值吻合度较高，结果验证了模型的有效性，该模型可用于优化PDB提取工艺。
2.3 PDB分离纯化
如图3所示，PDB经DEAE-52纤维素离子交换柱，分别通过0、0.1、0.3和0.5 mol/L NaCl溶液洗脱得到三个多糖组分PDB-0、PDB-1、PDB-2，各组分冻干后称质量分别占粗多糖的5.85%、20.45%、16.81%，同时测得各组分的纯度分别为54.99%±2.05%、83.54%±1.07%、57.96%±0.63%。
2.4 结构表征
2.4.1 分子量、单糖组成
如图4（A）各组分在33~41 min内显示出较强的激光散射信号，在42~55 min范围内无明显的激光散射信号，是溶剂峰的特征。由表4知，PDB-0和PDB-1均含有两个峰，重均分子量（Mw）的分布范围分别是7.324×103~1.045×105 Da和7.091×103~5.83×104 Da，其中7.324×103 Da和5.83×104 Da分别占PDB-0和PDB-1相对峰面积的96.38%和93.68%，是主要成分；PDB-2中分子量分布更多样，有四个峰值，Mw的分布范围在6.384×103~1.33×105 Da。由图4（B）PDB-0由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖组成，摩尔比为0.137:0.415:0.253:0.192；PDB-1由鼠李糖、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸组成，摩尔比为0.005:0.192:0.001:0.639:0.029:0.125:0.009；PDB-2由岩藻糖、氨基半乳糖盐酸盐、鼠李糖、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖糖醛酸组成，摩尔比为0.005:0.019:0.038:0.169:0.016:0.383:0.079:0.091:0.020:0.168:0.013。
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图 4 PDB的分子量和单糖组成图注：1.岩藻糖2.氨基半乳糖盐酸盐3.鼠李糖4.阿拉伯糖5.盐酸氨基葡萄糖 6.半乳糖7.葡萄糖8.木糖9.甘露糖10.果糖11.核糖12.半乳糖醛酸13.古罗糖醛酸14.葡萄糖醛酸15.甘露糖醛酸Figure 4. Diagram of molecular weight and monosaccharide composition of PDB表 4 PDB分子量Table 4. Molecular weight of PDB样品 PDB-0 PDB-1 PDB-2 Mw（Da） 1.045×105 5.83×104 1.33×105 7.324×103 7.091×103 5.13×104 1.67×104 6.384×103 Mn（Da） 1.03×105 5.75×104 1.30×105 7.289×103 7.059×103 5.06×104 1.62×104 6.191×103 Mw/Mn 1.02 1.01 1.02 1.00 1.00 1.01 1.03 1.03 注：表中Mw为重均分子量；Mn为数均分子量；Mw/Mn为多分散性指数；分子量的单位是Da。 2.4.2 傅里叶红外光谱、紫外光谱
利用红外光谱检测三个组分中的主要化学键和官能团。在3650~500 cm−1范围内，三个组分的吸收谱带表现出微弱的强度差异和单个吸收峰。如图5（A）所示。在3425 cm−1处均有一个宽而强的吸收峰，这是O-H的拉伸振动形成的，表明三个组分中都有羟基的存在[34]；在2920 cm−1附近形成的小带与C-H拉伸振动有关，这些条带是多糖的典型特征[28]；在1635 cm−1和1412 cm−1附近的吸收峰分别被认为是C=O拉伸振动和C-H弯曲振动引起的，这说明多糖中可能有糖醛酸的存在[24]；在约1244 cm−1处的出现的峰是由C-O拉伸振动引起的，在1200 cm−1 到1000 cm−1处观察到的吸收峰与C-O-C和C-O-H的拉伸有关，表明可能存在吡喃糖环[22]。
为了确定蛋白质和核酸的存在，纯化后的多糖通常采用紫外可见光光谱分析。如图5（b）所示，在288 nm附近处检测到了吸收峰，表明各组分多糖中含有蛋白质残留[35]。
2.4.3 刚果红实验
刚果红实验可初步确定多糖的三螺旋构象，研究表明，刚果红可以与具有三螺旋构象的多糖形成络合物，当加入不同浓度NaOH时，光谱扫描中的最大吸收波长会发生偏移[36]。如图6所示，三个多糖溶液的最大吸收波长均不随NaOH浓度的增加而降低，说明多糖可能不具有三螺旋结构。
2.4.4 扫描电镜
扫描电镜被认为是研究多糖形态最直接的方法之一。如图7所示，三个多糖组分的表观形态存在差异。PDB-0表面呈分散的块状结构，PDB-1表面呈网状，有许多小孔，PDB-2为表面存在孔洞的不规则块状结构，碎片化程度更高。这种情况可能源于分子之间作用力的差异[37]。
2.5 体外抗氧化活性
如图8所示，三个组分多糖均表现出一定的体外抗氧化能力，且在实验浓度范围内呈现剂量-效应关系。在相同条件下，PDB-0、PDB-1、PDB-2清除DPPH·和ABTS+·的半抑制浓度（IC50）值分别为1.35±0.07、1.23±0.03、0.74±0.05 mg/mL和1.18±0.04、0.92±0.08、0.64±0.01 mg/mL；当多糖浓度为1 mg/mL时，铁还原实验发现三个组分的还原能力大小为PDB-2>PDB-0>PDB-1。这种抗氧化活性的差异可能源于多糖的分子量、单糖、结构组成等[38]。由于糖醛酸中的醛或酮等亲电基团有助于抢夺自由基，所以多糖的糖醛酸含量与抗氧化能力成正相关[39]，在本试验中，含有半乳糖醛酸的PDB-2，抗氧化活性也明显优于其他两个组分，这与前人研究相符[40]。
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图 8 PDB对DPPH·（A）和ABTS+·清除率（B）及铁离子还原能力（C）影响注：不同字母（a~e）表示组内差异，（A~C）表示组间差异，有统计学意义（P<0.05），图9同。Figure 8. Effect of PDB on DPPH· (A) and ABTS+· scavenging (B) and ferricion reducing (C)2.6 体外降血糖、降血脂活性
2.6.1 PDB对α-淀粉酶抑制活性分析
α-淀粉酶参与膳食淀粉转化为葡萄糖的生理过程，在血糖调控中起到重要作用[41]。三个组分对α-淀粉酶抑制活性如图9（A）所示，在实验浓度范围内，PDB-0、PDB-1、PDB-2对α-淀粉酶抑制活性与其浓度呈剂量依赖性，且IC50值分别为0.78±0.05、0.82±0.04和0.94±0.02 mg/mL。这说明PDB具有一定的降血糖活性。
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图 9 PDB对α-淀粉酶抑制率及结合胆酸盐能力Figure 9. Inhibition of α-Amylase and ability to bind bile salts by PDB2.6.2 结合胆酸盐能力测定
机体内的胆汁酸大多以结合胆酸盐的形式存在，植物多糖可以与其结合排出体外[42]。如图9（B）、（C）、（D），三个组分吸附胆酸盐的能力与其浓度呈剂量依赖性，在浓度达到1 mg/mL时，PDB-0、PDB-1、PDB-2吸附胆酸钠的比率最大，分别为17.66%±0.12%，21.06%±0.45%和22.28%±0.51%；吸附甘氨胆酸钠的比率分别为22.46%±0.79%，25.52%±0.23%和23.16%±0.78%；吸附牛黄胆酸钠的比率分别为24.79%±0.79%、26.27%±0.78%和32.57%±0.75%。说明PDB具有较好的降血脂活性。
3. 结论
通过单因素、响应面优化得到PDB的最佳提取工艺条件为碳酸钠浓度4.1 mg/mL、超声功率310 W、超声时间81 min、超声温度66 °C，该条件下PDB的提取率可达到2.09%±0.04%。对经DEAE-52纤维素柱分离后得到三个组分PDB-0、PDB-1和PDB-2进行了结构表征和体外活性测定，发现三个组分的分子量、单糖组成和微观结构存在差异，但均具有典型的多糖特征；PDB-2表现出更强的抗氧化活性，PDB-0可以更有效地抑制α-淀粉酶活性，三个组分均具有一定的降血脂活性。综上所述，本研究为勃氏甜龙竹笋壳多糖的制备，以及在抗氧化、降血糖、降血脂功能等方面的研究提供了参考，也为笋壳多糖构效关系的研究奠定了基础，本实验只初步分离勃氏甜龙竹笋壳多糖，在后续研究中，将进行进一步分离纯化得到高纯度的笋壳多糖，并采用包括动物、细胞模型在内的一些高级实验模型进一步研究。
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图 1 各因素对PDB提取率的影响
注：不同字母（a~e）表示处理间差异有统计学意义（P<0.05）。
Figure 1. Effect of factors on the extraction rate of PDB
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图 4 PDB的分子量和单糖组成图
注：1.岩藻糖2.氨基半乳糖盐酸盐3.鼠李糖4.阿拉伯糖5.盐酸氨基葡萄糖 6.半乳糖7.葡萄糖8.木糖9.甘露糖10.果糖11.核糖12.半乳糖醛酸13.古罗糖醛酸14.葡萄糖醛酸15.甘露糖醛酸
Figure 4. Diagram of molecular weight and monosaccharide composition of PDB
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图 8 PDB对DPPH·（A）和ABTS+·清除率（B）及铁离子还原能力（C）影响
注：不同字母（a~e）表示组内差异，（A~C）表示组间差异，有统计学意义（P<0.05），图9同。
Figure 8. Effect of PDB on DPPH· (A) and ABTS+· scavenging (B) and ferricion reducing (C)
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图 9 PDB对α-淀粉酶抑制率及结合胆酸盐能力
Figure 9. Inhibition of α-Amylase and ability to bind bile salts by PDB
表 1 Box-Behnken试验设计
Table 1 Box-Behnken experimental design
因素 水平 −1 0 1 A碳酸钠浓度（mg/mL） 3 4 5 B超声功率（W） 240 280 320 C超声时间（min） 55 75 95 D超声温度（°C） 55 65 75 
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表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface experimental design and results
序号 A碳酸钠浓度
（mg/mL）B超声功率
（W）C超声时间
（min）D超声温度
（°C）多糖得率
（%）1 0 −1 0 1 2.01±0.14 2 0 1 0 1 1.15±0.12 3 −1 −1 0 0 1.47±0.21 4 −1 0 1 0 1.08±0.17 5 0 0 −1 −1 2.04±0.13 6 0 0 0 0 1.48±0.14 7 0 0 1 1 1.48±0.17 8 0 1 0 −1 1.69±0.02 9 0 −1 0 −1 1.66±0.13 10 −1 0 −1 0 1.24±0.15 11 0 0 0 0 1.89±0.25 12 −1 0 0 −1 1.32±0.13 13 0 0 0 0 1.29±0.27 14 1 0 0 −1 1.12±0.08 15 0 0 0 0 1.51±0.13 16 1 0 1 0 2.00±0.05 17 1 0 −1 0 1.98±0.02 18 0 −1 −1 0 1.75±0.06 19 0 −1 1 0 1.40±0.22 20 1 −1 0 0 1.91±0.12 21 0 0 0 0 1.42±0.07 22 0 1 1 0 1.21±0.09 23 1 1 0 0 1.22±0.21 24 −1 1 0 0 1.56±0.08 25 0 0 1 −1 1.15±0.10 26 1 0 0 1 1.25±0.09 27 0 1 −1 0 1.37±0.19 28 −1 0 0 1 1.14±0.17 29 0 0 −1 1 1.23±0.19
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表 3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance results
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 2.57 14 0.1838 40.70 <0.0001 A 0.0329 1 0.0329 7.28 0.0173 B 0.3774 1 0.3774 83.57 <0.0001 C 0.0271 1 0.0271 6.00 0.0281 D 0.2500 1 0.2500 55.36 <0.0001 AB 0.0146 1 0.0146 3.24 0.0933 AC 0.0021 1 0.0021 0.46 0.5094 AD 0.0103 1 0.0103 2.28 0.1532 BC 0.0933 1 0.0933 20.67 0.0005 BD 0.0005 1 0.0005 0.11 0.7427 CD 0.0130 1 0.0130 2.88 0.1119 A2 1.22 1 1.22 270.78 <0.0001 B2 0.3710 1 0.3710 82.17 <0.0001 C2 0.3130 1 0.3130 69.32 <0.0001 D2 0.6670 1 0.6670 147.71 <0.0001 残差 0.0632 14 0.0045 失拟项 0.0494 10 0.0049 1.43 0.3890 纯误差 0.0138 4 0.0034 总误差 2.64 28 R2=0.9760 Radj2=0.9520 C.V.=4.53
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表 4 PDB分子量
Table 4 Molecular weight of PDB
样品 PDB-0 PDB-1 PDB-2 Mw（Da） 1.045×105 5.83×104 1.33×105 7.324×103 7.091×103 5.13×104 1.67×104 6.384×103 Mn（Da） 1.03×105 5.75×104 1.30×105 7.289×103 7.059×103 5.06×104 1.62×104 6.191×103 Mw/Mn 1.02 1.01 1.02 1.00 1.00 1.01 1.03 1.03 注：表中Mw为重均分子量；Mn为数均分子量；Mw/Mn为多分散性指数；分子量的单位是Da。
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