Probiotic Characterization of β-Glycosidase Producing Lactobacillus gullinarum and Its Application in the Fermentation of Black Tea Soup
-
摘要: 本研究对健康婴儿粪便和东北酸菜中产β-葡萄糖苷酶乳酸菌进行了筛选，随后对酶活力最高的乳酸菌菌株的安全和益生特性以及其在红茶汤发酵中的应用进行了研究。实验结果发现健康婴儿粪便分离的一株乳酸菌FB20产β-葡萄糖苷酶活力最高，为0.58 U/mL，经鉴定为鸡乳杆菌（Lactobacillus gullinarum）。L. gullinarum FB20具有良好的耐酸特性，在模拟胃液中存活率可达到96.21%±1.40%，8 h自聚集率为38.87%±0.14%，与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的共聚集率分别为38.82%±1.10%和53.92%±1.96%。可有效清除DPPH自由基、ABTS+自由基、羟自由基，清除率分别为55.67%±3.19%、98.47%±0.01%和57.65%±3.42%；具有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的能力，抑制率分别为67.91%±1.24%和66.53%±0.34%。L. gullinarum FB20发酵红茶汤后，红茶汤对DPPH自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除能力显著提高了12.48%、4.35%和10.57%（P<0.05），总酚含量也显著提高了1.07 mg/mL（P<0.05）。通过电子鼻测定发现，经过L. gullinarum FB20发酵的红茶汤相较对照组有机硫化物显著降低。本研究对产β-葡萄糖苷酶菌种的挖掘以及相关菌株在改善发酵茶汤中的应用提供了一定的理论依据。Abstract: This study aims to isolate lactic acid bacteria capable of producing β-glucosidase from healthy infant feces and Chinese northeast sauerkraut. Then the strain with the highest β-glucosidase activity was identified for subsequent evaluation of the safety, probiotic characteristics, and potential application in the fermentation of black tea soup. The results indicated one of the β-glucosidase producing lactic acid bacteria FB20, derived from healthy infant feces demonstrated the highest β-glucosidase activity, quantified at 0.58 U/mL, and was classified as Lactobacillus gullinarum. L. gullinarum FB20 had good acid resistance ability, could survive in the simulated gastric fluid (a survival rate of 96.21%±1.40%), an auto-aggregation rate of 38.87%±0.14%, co-aggregation rates of 38.82%±1.10% and 53.92%±1.96% with Escherichia coli and Staphylococcus aureus, respectively. It could effectively scavenge DPPH free radicals, ABTS+ free radicals, and hydroxyl free radicals, with scavenging rates of 55.67%±3.19%, 98.47%±0.01%, and 57.65%±3.42%, respectively. It could inhibit α-amylase and α-glucosidase, and the inhibition rates were 67.91%±1.24%, and 66.53%±0.34%, separately. After fermenting black tea soup, the eliminating rates of DPPH, ABTS+, and hydroxyl radicals in the fermented black tea soup increased significantly by 12.48%, 4.35%, and 10.57% (P<0.05), respectively, and the total phenolic content also increased by 1.07 mg/mL (P<0.05). Electronic nose analysis results showed that the black tea soup fermented by L. gullinarum FB20 significantly reduced organic sulfides compared to the control group. This study provides a certain theoretical basis for the exploration of β-glucosidase-producing strains and the improvement of their application in fermenting tea soup.
-
Keywords:
- Lactobacillus gullinarum /
- β-glucosidase /
- probiotic activity /
- fermentation /
- black tea soup
-
乳酸菌是一类公认安全的益生菌，具有抗氧化、调节免疫等功能，常被用来辅助治疗多种疾病[1]。乳酸菌在生长过程中会分泌各种酶类，包括β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、胆汁盐水解酶和植酸酶等[2]。其中β-葡萄糖苷酶（β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶）是一种通过水解1,4-β和1,6-α糖苷键从低聚糖中释放非还原末端葡萄糖残基的酶[3]，根据其底物特异性可分为三大类：芳基葡萄糖苷酶（作用于芳基葡萄糖苷底物）、纤维二糖酶（作用于双糖）和广谱葡萄糖苷酶（底物广泛，也是最常见的一类）[4]。
β-葡萄糖苷酶存在于动物、植物和微生物中，其中乳酸菌是β-葡萄糖苷酶的良好来源[5]。目前产β-葡萄糖苷酶乳酸菌已经广泛应用于食品发酵中，起到改善食品风味和功能的作用。Lorn等[6]利用产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌发酵番茄后，其中具有花香和水果风味的萜类、酮类物质显著提高；Quines-Lagmay等[7]利用产β-葡萄糖苷酶乳酸菌发酵刺梨，不仅改善了果汁风味，还提高了果汁得率和生物活性。利用产β-葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌发酵可以将大豆中非活性糖苷黄酮类化合物分解为游离异黄酮苷元提高其生物活性[8]。产β-葡萄糖苷酶的酵母菌应用于葡萄酒发酵则能提升其中单萜烯（如香叶醇、橙花醇、香茅醇等）芳香族挥发物的含量，以及增加白藜芦醇和花青素的浓度[9]。目前还有大量产β-葡萄糖苷酶菌株有待挖掘。
红茶与绿茶（未发酵）、白茶（微发酵）、乌龙茶（半发酵）不同属全发酵茶，发酵过程中在各种酶的作用下产生其独特的色泽和风味。研究表明，β-葡萄糖苷酶在红茶制作中对提升其质量和风味也起到了积极的作用。在红茶叶上喷洒β-葡萄糖苷酶可显著增加芳香醇、香叶醇和水杨酸甲酯等糖苷前体挥发性化合物含量[10]。在红茶汤中加入β-葡萄糖苷酶能使芳樟醇和香叶醇风味物质的浓度分别提高10%和18.5%[11]，此外β-葡萄糖苷酶的加入可以增强红茶的“花果”香气，提升红茶甲苯醇和苯乙醇含量，实现红茶汤整体质量的提升[12]。目前也有一些研究报道了乳酸菌作为发酵剂应用于红茶发酵。Nguyen等[13]发现乳酸菌发酵红茶能提升其抗氧化性，发酵后的红茶对DPPH自由基清除能力在71.00%~89.50%，显著高于未发酵组（62.75%）（P<0.05）；Li等[14]发现植物乳杆菌RLL68发酵红茶汤，能增加有机酸和γ-氨基丁酸的含量，降低苦味氨基酸含量，提升感官品质。但是产β-葡萄糖苷酶乳酸菌作为发酵剂会对红茶汤会产生怎样的影响还有待于进一步研究证实。
本研究拟对健康婴儿粪便和东北酸菜中的产β-葡萄糖苷酶能力的乳酸菌进行筛选分离，随后选择酶活力最高的乳酸菌，对其安全性和益生特性以及在发酵红茶汤中的应用进行研究。为产β-葡萄糖苷酶益生菌菌种资源的开发以及在发酵红茶汤中的应用提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
婴儿粪便 3月龄男婴；东北酸菜 农家自制；红茶 辽宁锦州农贸市场；MRS（Man Rogosa Sharpe）肉汤培养基、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖、牛肉粉、酵母提取物 北京奥博星生物技术有限公司；抗生素药敏纸片 杭州滨和微生物试剂有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼） 四川省维克奇生物科技有限公司；ABTS（2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、七叶苷、水系尼龙滤膜 生工生物工程（上海）股份有限公司；α-葡萄糖苷酶（100 U）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、3,5-二硝基水杨酸试剂 上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖、明胶 上海麦克林生化科技有限公司；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）S1、大肠杆菌（Escherichia coli）E1 本实验室保存；蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）BI6Y、蜂房哈夫尼亚菌（Hafinia alvei）A1 分离于腐败鱼肉；植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LHZ4 分离于自制酸菜；短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）FB18 分离于婴儿粪便。
UV-2550型分光光度计 日本Shimadzu公司；DYY-8C型电泳仪 中国六一仪器厂；全自动生长曲线分析仪 芬兰Bioscreen公司；Biofuge Stratos型冷冻高速离心机 美国Thermo公司；LDZX-75KBS型立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械有限公司；EDU3电子鼻 德国AirSense公司；YT-1101全自动酶标仪 中国叶拓科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 产β-葡萄糖苷酶乳酸菌分离鉴定与生长性能分析
1.2.1.1 乳酸菌初筛
准确称取1 g婴儿粪便或酸菜汁样品与9 mL生理盐水（0.85%w/v）涡旋混匀，采用梯度稀释法连续稀释至10−5后，吸取适量10−3、10−4、10−5的稀释样品涂布于含1%CaCO3的固体MRS培养基上，在37 ℃厌氧条件下静置培养24 h后，选择含有溶钙圈菌落，在相同条件下划线纯化一次，选取纯化后单菌落接入MRS液体培基在上述相同条件下培养后保存。
1.2.1.2 具有产β-葡萄糖苷酶能力乳酸菌的复筛
为判定菌株是否具备产β-葡萄糖苷酶能力，参考Deng等[15]的方法，用接种环蘸取所分离菌株活化后菌液在β-葡萄糖苷酶验证培养基（蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、葡萄糖20 g、酵母提取物4 g、乙酸钠5 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）2 g、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2 g、柠檬酸三铵（C6H17N3O7）2 g、一水硫酸锰（MnSO4·H2O）0.05 g、吐温80 1 mL、七叶苷10 g、柠檬酸铁铵（C6H11FeNO7）25 g、琼脂粉20 g溶于1000 mL蒸馏水）上进行划线，37 ℃静置培养48 h，待菌株在培养基上生长出明显单菌落后，菌落周围产生明显黑色晕圈即初步判定其具有产β-葡萄糖苷酶能力。
1.2.1.3 菌株产β-葡萄糖苷酶酶活力测定
采用Liu等[16]的方法对菌株产β-葡萄糖苷酶酶活力进行测定。以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）为底物，根据pNPG释放的硝基苯酚（pNP）的量测定菌株所产β-葡萄糖苷酶活力。首先将菌悬液于4 ℃下5000×g离心10 min收集无细胞上清液以制备粗酶液，吸取0.1 mL粗酶液与0.2 mL用柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH5.0）配制的pNPG溶液（0.002 mol/L）混合于40 ℃反应30 min，最后用2 mL Na2CO3（0.25 mol/L）溶液终止反应。用多功能酶标仪于405 nm下测定吸光度。一个酶活力单位（U）定位为上述实验条件下每分钟释放1 nmol pNP的量。确定产β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株进行后续实验。
1.2.1.4 产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的鉴定
对产β-葡萄糖苷酶乳酸菌进行革兰氏染色。选取革兰氏阳性菌采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取其DNA，选择通用引物27F（5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ）和 1492R（5ʹ-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3ʹ）进行PCR扩增，PCR产物送至上海生工进行测序。测序结果提交至GenBank进行BLASTN比较分析，利用MEGA 11.0软件构建系统发育树。
1.2.1.5 菌株生长曲线测定
利用全自动生长曲线仪于吸光度600 nm下在48 h内测定菌株的生长情况。
1.2.2 菌株安全性分析
1.2.2.1 溶血性
采用Kanpiengjai等[17]的方法测定菌株溶血性。用接种环蘸取活化后的菌液在含5%羊血哥伦比亚血琼脂上划线，37 ℃孵育3 d，以金黄色葡萄球菌为阳性对照。若菌株所形成菌落为暗绿色或菌落周围出现透明圈则代表其具有溶血性。
1.2.2.2 明胶酶活性
采用Khan等[18]的方法测定菌株明胶酶活性。用接种针蘸取活化后的菌液穿刺接种于明胶培养基（NaCl 5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明胶120 g，蒸馏水1000 mL）中，37 ℃孵育5~7 d，以金黄色葡萄球菌S1为阳性对照。孵育结束后，将培养基放入4 ℃冰箱中静置1 h后观察明胶液化情况。若穿刺区域出现液化则代表其明胶酶活性阳性。
1.2.2.3 DNase活性
采用Mausamy等[19]的方法测定菌株DNase酶活性。用接种环蘸取活化后的菌液在DNase验证平板（胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、DNA 2 g、NaCl 5 g、琼脂粉15 g，溶解于1000 mL蒸馏水）上划线，37 ℃孵育48 h后，滴入1 mol/L的盐酸后观察透明圈的生成，以金黄色葡萄球菌为阳性对照。若菌株周围出现明显透明圈则代表其DNase酶活性阳性。
1.2.2.4 产生物胺能力
采用Li等[20]的方法并稍作修改，用牛津杯打孔法测定菌株产生物胺能力。将活化后的产β-葡萄糖苷酶乳酸菌与蜂房哈夫尼亚菌A1（具有产生物胺能力，作为阳性对照）分别于4 ℃下8000×g离心10 min收集无细胞上清液。吸取100 μL不同菌株的上清液分别注入生物胺培养基（胰蛋白胨5 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g、CaCl2 1 g、溴甲酚紫0.06 g、组氨酸2 g、酪氨酸2 g、赖氨酸2 g、色氨酸2 g、琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL）上牛津杯所预先形成的孔洞内，在37 ℃孵育48 h后，观察孔洞周围颜色变化，紫色则代表其产生物胺能力为阳性。
1.2.2.5 抗生素敏感性
采用Saeed等[21]的方法使用圆纸片扩散法测定菌株抗生素敏感性。将活化后的菌株接种于（接种量1‰，v/v）冷却至40 ℃含1.5%琼脂粉的MRS肉汤培养基中，混合均匀后倾倒于平皿中，待培养基凝固后将药敏片镀于培养基表面，37 ℃孵育48 h后测定所形成透明圈直径。所使用抗生素分别为诺氟沙星（10 μg）、四环素（30 μg）、青霉素G（10 μg）、红霉素（15 μg）、克拉霉素（15 μg）、庆大霉素（10±2.5 μg）、氯霉素（30 μg）、链霉素（10 μg）、克林霉素（10 μg）、氨苄西林（10 μg）、卡那霉素（30 μg）、万古霉素（30 μg）。
1.2.3 菌株益生特性分析
1.2.3.1 耐酸耐胆盐能力测定
采用Motey等[22]描述的方法测定菌株对酸和胆盐的耐受能力。用1 mol/L的HCl将MRS肉汤的pH调至2.5、3.0、4.0以模拟低pH环境。用添加0.1%、0.2%、0.3%牛胆盐的MRS肉汤模拟不同浓度胆盐存在的环境。分别将乳酸菌以2%接种量（v/v）接种于上述各培养基中，37 ℃孵育、于0 h和4 h两个时间点取样进行菌落计数。存活率计算公式如下所示：
存活率(%)=C1C0×100 (1) 式中：C0和C1分别代表菌株处理前（0 h）和处理后（4 h）的菌落数。
1.2.3.2 模拟胃肠液耐受能力测定
采用Hacioglu等[23]描述的方法测定菌株在模拟胃肠液中的耐受能力。用1 mol/L的HCl将人工胃液（NaCl 0.85% w/v，胃蛋白酶 0.5% w/v）的最终pH调整至2.0。取1 mL菌悬液接种于9 mL人工胃液中涡旋混匀后，吸取1 mL混合后的人工胃液进行梯度稀释并涂布以测定初始菌落数，剩余混合后的人工胃液于37 ℃、160 r/min振荡培养4 h后重复上述操作，吸取1 mL人工胃液进行梯度稀释并涂布以确定最终的菌落数量。
将上步的人工胃液在5000×g下4 ℃离心10 min后收集菌体沉淀。并用PBS洗涤2次。最终将菌体重悬于人工肠液（胰酶0.1%w/v，牛胆盐0.15%w/v，pH7.0）。吸取1 mL混合后的人工肠液进行梯度稀释并涂布以测定初始菌落数，剩余混合后的人工肠液于37 ℃、160 r/min振荡培养4 h后重复上述操作，吸取1 mL人工肠液进行梯度稀释并涂布以确定最终的菌落数量。
1.2.3.3 自聚集能力测定
采用Shazaid等[24]描述的方法测定菌株自聚集能力。将菌悬液于8000×g下4 ℃离心10 min收集菌体沉淀。用PBS缓冲液（pH7.0）洗涤两次后重悬于PBS缓冲液中制备菌悬液，于OD600 nm下调整吸光度至1.00±0.02。取5 mL菌悬液涡旋10 s后，于37 ℃下静置孵育8 h。于4、6、8 h时吸取1 mL菌悬液上层与1 mL PBS混合后于OD600 nm下测定吸光度。自聚集能力百分比计算公式如下所示：
自聚集率(%)=A0−A1A0×100 (2) 式中：A0为0 h时的吸光度，A1为各取样时间点（4、6、8 h）的吸光度。
1.2.3.4 共聚集能力测定
采用Soemarie等[25]描述的方法测定菌株共聚集能力。选取一株革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌 S1）和一株革兰氏阴性菌（大肠杆菌E1）用于测定乳酸菌共聚集能力。将所用细菌培养液于8000×g下4 ℃离心10 min，用PBS缓冲液（pH7.0）洗涤两次后重悬于PBS缓冲液中制备菌悬液，于OD600 nm下调整OD值1.00±0.02。将乳酸菌菌悬液分别与金黄色葡萄球菌S1和大肠杆菌的菌悬液以1:1的比例混合，于37 ℃静置孵育8 h。于4、6、8 h时吸取菌悬液上层于OD600 nm下测定吸光度值。共聚集能力百分比计算公式如下所示：
共聚集率(\%)=(1−A1A0)×100 (3) 式中：A0为0 h时的吸光度，A1为各取样时间点（4、6、8 h）的吸光度。
1.2.4 抑菌能力测定
采用Ramadhanti等[26]描述的牛津杯打孔法测定菌株无细胞上清液的抑菌能力。分别选取金黄色葡萄球菌S1、大肠杆菌E1、蜡样芽孢杆菌 BI6Y和植物乳杆菌作为指示菌。首先将活化后的菌株菌悬液5000×g下4 ℃离心10 min收集无细胞上清液，并过0.22 μm的水系滤膜（比克曼生物，中国）备用，指示菌以0.2%接种量分别接种于含0.5%琼脂粉的LB或MRS培养基中，混匀后倾注于放置好牛津杯的培养皿内，待培养基凝固后取出牛津杯，在牛津杯产生的孔洞内加入180 μL待测菌株无细胞上清液，37 ℃静置孵育24 h后观察是否有透明圈出现，并测量其直径。
1.2.5 菌株无细胞上清液的体外抗氧化能力测定
1.2.5.1 菌株无细胞上清液及细胞破碎提取液的制备
将活化后的菌株菌悬液8000×g下4 ℃离心10 min后过0.22 μm水系滤膜（比克曼生物，中国）于无菌管内得到菌株无细胞上清液。离心所得菌体沉淀用PBS缓冲溶液洗涤2~3次，并重悬于PBS缓冲溶液中，得到完整细胞菌悬液（OD=1.000±0.2），并将其置于冰浴中进行超声破碎（超声功率为400 W，超声2 s，停止2.2 s，超声10 min），随后于4 ℃下8000×g离心10 min得到的上清液即为细胞破碎液，用于后续测定乳酸菌体外降糖能力。
1.2.5.2 DPPH自由基清除能力测定
采用Kunduhoglu等[27]描述的方法测定菌株无细胞上清液对DPPH自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力。分别吸取1 mL乳酸菌无细胞上清液和1 mL抗坏血酸溶液（1 μg/mL）置于5 mL离心管内，随后加入等体积0.2 mmol/L的DPPH-无水乙醇溶液，涡旋20 s后于37 ℃下避光反应30 min，反应完成后，使用紫外分光光度计于波长517 nm处测定吸光度，DPPH自由基清除百分比计算公式如下所示：
DPPH清除率(\%)=AC−ASAC×100 (4) 式中：AS为DPPH-无水乙醇溶液与乳酸菌无细胞上清液的吸光度；AC为DPPH-无水乙醇溶液与蒸馏水的吸光度。
1.2.5.3 ABTS+自由基清除能力测定
采用Ragul等[28]描述的方法测定菌株无细胞上清液对ABTS+自由基（2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）的清除能力。首先将7 mmol/L ABTS+与2.45 mmol/L过硫酸钾（1:1 v/v）混合形成ABTS+溶液，在避光条件下室温反应24 h以制备ABTS+自由基，反应结束后于波长734 nm处调整ABTS+溶液吸光度至0.70±0.02后备用。随后分别吸取500 μL乳酸菌无细胞上清液和抗坏血酸溶液（1 μg/mL）与1 mL ABTS+溶液混合，于室温下静置反应10 min，使用紫外分光光度计于波长734 nm处测定吸光度，ABTS+自由基清除百分比计算公式如下所示：
ABTS+自由基清除率(%)=AC−ASAC×100 (5) 式中：AS为1 mL的ABTS+溶液与500 μL乳酸菌无细胞上清液的吸光度；AC为1 mL的ABTS+溶液与500 μL蒸馏水的吸光度。
1.2.5.4 羟自由基清除能力测定
采用Xia等[29]描述的水杨酸法测定菌株无细胞上清液对羟自由基的清除能力。首先将9 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2（1:1 v/v）混合以制备羟自由基溶液。随后加入500 μL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液后分别加500 μL乳酸菌无细胞上清液和抗坏血酸溶液（1 μg/mL）。于37 ℃下静置孵育30 min，使用紫外分光光度计于波长510 nm处测定吸光度，羟自由基清除百分比计算公式如下所示：
羟自由基清除率(%)=(1−AS−A′SAC)×100 (6) 式中：AS为1 mL的羟自由基溶液与500 μL水杨酸乙醇溶液和500 μL乳酸菌无细胞上清液的吸光度；A'S为1 mL的羟自由基溶液与500 μL乳酸菌无细胞上清液的吸光度；AC为1 mL的羟自由基溶液与500 μL水杨酸乙醇溶液的吸光度。
1.2.6 乳酸菌体外降糖能力测定
1.2.6.1 α-淀粉酶抑制活性
采用Fan等[30]描述的方法测定菌株无细胞上清液或细胞破碎后的提取液对α-淀粉酶的抑制能力。分别在试管中加入500 μL菌株无细胞上清液或细胞破碎提取液，再分别依次加入500 μL PBS（pH7.4）和500 μL α-淀粉酶（0.5 mg/mL），37 ℃下静置孵育10 min后加入500 μL 1%可溶性淀粉，再次于37 ℃下静置孵育10 min。孵育结束后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，沸水浴5 min。水浴结束后加入5 mL蒸馏水并冷却至室温，使用紫外分光光度计于波长540 nm处测定吸光度，以阿卡波糖为阳性对照。α-淀粉酶抑制活性百分比计算公式如下所示：
α-淀粉酶抑制率(%)=(1−A1−A2A3)×100 (7) 式中：A1为实验样品（含样品和α-淀粉酶）的吸光度，A2为空白样品（含样品、不含α-淀粉酶）的吸光度，A3为对照样品（含α-淀粉酶、不含样品）的吸光度。
1.2.6.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性
采用Li等[31]描述的方法测定菌株无细胞上清液或细胞破碎后的提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。分别在试管中加入25 μL无细胞上清液或细胞破碎液后，分别依次加入50 μL α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL）、150 μL PBS（pH7.4）和75 μL对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）溶液（20 mmol/L），37 ℃静置孵育10 min后加入0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，使用紫外分光光度计于波长405 nm处测定吸光度，以阿卡波糖为阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制活性百分比计算公式如下所示：
α-葡萄糖苷酶抑制率(\%)=(1−A1−A2A3)×100 (8) 式中：A1为样品（含样品和α-葡萄糖苷酶）的吸光度，A2为空白（含样品、不含α-葡萄糖苷酶）的吸光度，A3为对照（含α-葡萄糖苷酶、不含样品）的吸光度。
1.2.7 产β-葡萄糖苷酶菌株发酵红茶中的应用
1.2.7.1 发酵红茶汤的制备
称取3 g干制红茶叶浸泡于100 mL纯净水中，100 ℃加热5 min后静置20 min至茶汤呈棕红色，室温晾凉至50 ℃，加入5 g蔗糖并充分搅拌，121 ℃湿热灭菌20 min晾凉备用。将活化好的菌株菌悬液于5000×g下4 ℃离心10 min收集菌体沉淀，用PBS（pH7.0）洗涤两次后重悬于PBS中并调整OD600 nm至1.0±0.02。以2%的接种量（v/v）接种至制备好的红茶汤中，37 ℃、160 r/min发酵24 h，5000×g下4 ℃离心30 min收集没有菌体的茶汤用于后续实验分析。
1.2.7.2 发酵红茶汤体外抗氧化能力测定
采用本文1.2.5的实验方法对发酵红茶汤的DPPH自由基、ABTS+自由基和羟自由基的清除能力进行测定；总还原力采用Chang等[32]描述的方法进行测定，具体方法为吸取300 μL发酵红茶汤至5 mL离心管内，加入300 μL PBS缓冲液（pH7.4）及300 μL铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）溶液后混匀，50 ℃水浴20 min后迅速冰浴冷却以终止反应，向管内加入300 μL 10%（v/v）三氯乙酸（C2HCl3O2）溶液，混匀，3500×g下4 ℃离心10 min，吸取离心上清液500 μL至全新离心管内并加入500 μL蒸馏水和1 mL 0.1%（w/v）三氯化铁（FeCl3）溶液，摇匀静置10 min。空白组以蒸馏水代替样品进行实验。利用紫外分光光度计于700 nm处测定吸光度。还原力按如下公式计算：
还原力=A1−A0 (9) 式中：A 0代表空白组的吸光度；A1代表实验组的吸光度。
发酵红茶总酚含量的测定采用Ning等[33]描述的方法。于100 μL Folin-Ciocalteu（FC）试剂中加入2 mL发酵红茶汤，混匀后室温静置反应15 min后加入3 mL的2% Na2CO3，混匀后于避光条件下反应30 min，以未发酵的红茶汤为对照，测定波长760 nm的吸光度值，通过以没食子酸为标准绘制标准曲线计算红茶汤的总酚含量。
1.2.7.3 发酵红茶汤的电子鼻分析
采用Zhu等[34]描述的方法使用电子鼻测定发酵红茶汤的气味特征。电子鼻各个传感器所对应的响应特性见表1。将发酵红茶汤置于50 mL离心管内，用保鲜膜封闭管口且使其中顶空平衡30 min。在测定阶段，采样器以300 mL/min的速度吸取管内气体并通过传感器，测定持续时间为120 s以确保传感器可达到稳定响应值且为减少实验误差，环境温度控制为25 ℃。
表 1 电子鼻传感器Table 1. Electronic nose sensor阵列检测器序号 传感器名称 性能描述 1 W1C 对芳香成分，苯类敏感 2 W5S 对氮氧化合物敏感 3 W3C 对芳香成分，氨类敏感 4 W6S 对氢化物敏感 5 W5C 对芳香成分，烷烃类敏感 6 W1S 对甲烷等断链烷烃敏感 7 WSW 对无机硫化物敏感 8 W2S 对醇醚醛酮类敏感 9 W2W 对无机硫化物敏感 10 W3S 对长链烷烃类敏感 1.3 数据处理
以上每个数据均独立重复三次，实验结果以平均值±标准差表示。数据采用SPSS（IBM SPSS Statistics 22）进行方差分析和Tukey检验。当P<0.05时，认为结果具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 产β-葡萄糖苷酶乳酸菌分离
经过初筛和复筛，从发酵酸菜中分离了6株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌LHZ6、B3、js3、js5、js6和js7，酶活力分别为0.28、0.39、0.35、0.38、0.16和0.42 U/mL；婴儿粪便分离一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌FB20，酶活为0.58 U/mL，酶活力最高，本研究后续实验围绕FB20进行分析。
![]()
图 1 所分离的乳酸菌产β-葡萄糖苷酶的酶活力注：不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。Figure 1. Enzyme activity of the β-glycosidase producing lactic acid bacteria2.2 FB20的鉴定和生长性能分析
经观察，FB20在厌氧条件下生长菌落周围有明显白色絮状分泌物（图2a），革兰氏染色后判断为革兰氏阳性菌、杆状（图2b），在含CaCO3的MRS琼脂平板上生长时会产生明显溶钙圈说明其产酸（图2c），在β葡萄糖苷酶验证培养基上生长时，菌落周围生成明显晕圈说明其具备产β-葡萄糖苷酶的能力（图2d）。对其16S rDNA进行测序，经过BLASTN序列对比及构建系统发育树分析，鉴定FB20其为鸡乳杆菌（图2e）。已有研究证实鸡乳杆菌是一种潜在益生菌，具有降低患结肠肿瘤的风险的作用[35]。生长曲线（图2f）显示鸡乳杆菌的生长在4 h时进入对数期，在18 h进入稳定期，在30 h之后进入衰亡期。
![]()
图 2 鸡乳杆菌FB20的鉴定和生长特性分析注：（a）鸡乳杆菌FB20在厌氧条件下培养的菌落形态图；（b）鸡乳杆菌FB20革兰氏染色后于光学显微镜下1000×观察图；（c）鸡乳杆菌FB20在CaCO3平板上的生长情况；（d）鸡乳杆菌FB20产β葡萄糖苷酶能力；（e）鸡乳杆菌FB20系统发育树图；（f）鸡乳杆菌FB20生长曲线。Figure 2. Identification and growth characteristic of L. gallinarum FB202.3 鸡乳杆菌FB20安全性分析
安全性是益生菌开发的前提，如表2所示，鸡乳杆菌FB20未表现出α溶血或β溶血，不具有溶血性。此外，鸡乳杆菌FB20产明胶酶、DNase和生物胺的能力均呈阴性，表明其具有作为发酵剂应用于发酵食品的潜力。
表 2 鸡乳杆菌FB20产有害代谢物能力Table 2. Ability of L. gallinarum FB20 to produce harmful metabolites安全指标 测定结果 溶血性 − 明胶酶 − DNase活性 − 产生物胺能力 − 注：+代表阳性，−代表阴性。 鸡乳杆菌FB20对抗生素的敏感性如表3所示，研究发现其对四环素、青霉素G、红霉素、克拉霉素、氯霉素、克林霉素、氨苄西林和万古霉素表现出了高敏感性，对链霉素中等敏感，而对诺氟沙星、庆大霉素和卡那霉素低敏感。根据现有报道诺氟沙星与卡那霉素的抑菌靶点分别是参与DNA复制的酶和参与细胞壁生物合成的青霉素结合蛋白[36]，且二者的抑菌效果也与微生物是否携带抗性基因有关[37]。因此推测鸡乳杆菌FB20对诺氟沙星和卡那霉素的低敏感性可能与其细胞结构或某些抗性基因的存在有关。
表 3 鸡乳杆菌FB20抗生素药敏性Table 3. Antibiotic susceptibility of L. gallinarum FB20抗生素类型 抑制直径（mm） 敏感程度 诺氟沙星 0.00±0.00 R 四环素 31.16±3.42 S 青霉素G 48.60±1.66 S 红霉素 36.38±0.45 S 克拉霉素 43.39±2.37 S 庆大霉素 9.66±0.19 R 氯霉素 30.55±2.32 S 链霉素 16.97±0.07 IR 克林霉素 26.26±0.25 S 氨苄西林 44.50±2.69 S 卡那霉素 0.00±0.00 R 万古霉素 30.65±1.49 S 注：抗生素药敏性的抑制程度分为R（低敏感性，抑制直径≤14 mm）、IR （中等敏感性，抑制直径15~19 mm）、S（高敏感性，直径>20 mm）。 2.4 鸡乳杆菌FB20益生特性分析
2.4.1 鸡乳杆菌FB20耐酸耐胆盐能力分析
耐酸、耐胆盐特性是益生菌发挥益生作用的前提。鸡乳杆菌FB20在pH2.5、pH3、pH4以及含0.1%、0.2%、0.3%浓度的胆盐存在条件下的存活率见表4。研究发现在不同酸性条件下，处理4 h后，鸡乳杆菌FB20存活率均高于100%，略呈现上升趋势，不同条件下存活率没有显著性差异，说明其在酸性条件下能够很好的存活。一些报道表明乳酸菌在酸性条件下会产生自我防护机制，分泌质子转运ATP酶，有助于其稳定细胞内外pH，以适应低pH的外部环境[38]。
表 4 鸡乳杆菌FB20耐酸耐胆盐及模拟胃肠液存活率Table 4. Acid and bile salt tolerant and survival rate in simulated gastrointestinal fluid of L. gallinarum FB20益生指标 0 h（log CFU//mL） 4 h（log CFU/mL） 存活率（%） 耐酸 pH2.5 6.07±5.21 6.15±5.14 120.81±12.44a pH3 6.31±5.32 6.34±5.60 105.50±10.51a pH4 6.43±4.33 6.44±5.11 103.10±4.92a 耐胆盐 0.1% 4.87±3.57 4.81±3.40 88.39±1.15a 0.2% 4.74±3.33 4.59±2.91 70.97±1.93b 0.3% 4.60±2.91 4.51±3.33 82.64±7.07a 模拟胃肠液 胃液 7.94±0.01 7.64±0.01 96.21±1.40a 肠液 5.58±0.01 2.13±0.04 38.27±2.79b 注：不同小写字母代表各实验组内有显著性差异（P<0.05）。 鸡乳杆菌FB20在含0.1%、0.2%、0.3%浓度胆盐下的存活率分别为88.39%±1.15%、70.97%±1.93%和82.64%±7.07%。研究发现乳酸菌Zhang等[39]的生长会受到胆盐的影响。而乳酸菌生长时所分泌的可水解胆盐的酶或产生应激反应蛋白会在一定程度上起到对胆盐的耐受作用[40]。
2.4.2 鸡乳杆菌FB20模拟胃肠液耐受性分析
菌株对模拟胃肠液的耐受性在一定程度上反映其在体内的存活情况（表4）。鸡乳杆菌FB20在模拟胃液中表现出较高的存活率，为96.21%±1.40%，而在模拟肠液中存活率较低，为38.27%±2.79%。研究表明，菌株对模拟胃肠液的耐受性与其是否产胞外多糖有关[41]，鸡乳杆菌FB20菌落周围有白色絮状分泌物（图2a），推测其可能通过产生胞外多糖增加了对环境的耐受性。
2.4.3 鸡乳杆菌FB20自聚集、共聚集能力分析
鸡乳杆菌FB20自聚集、共聚集能力如表5所示，其自聚集能力随时间增加显著增高（P<0.05）；鸡乳杆菌FB20与金黄色葡萄球菌S1和大肠杆菌E1的共聚集能力也随时间的增加显著增强（P<0.05），在与两株不同的菌株共孵育4 h时，其与大肠杆菌E1的共聚集能力显著高于金黄色葡萄球菌S1（P<0.05），而在6 h和8 h时，其对金黄色葡萄球菌S1的共聚集能力更强。乳酸菌与病原菌的共聚集会在一定程度上阻碍病原体定殖[42]。同时菌株之间聚集能力的强弱也与细胞表面相关蛋白有关，因此不同类型乳酸菌其聚集能力也不尽相同[43]。
表 5 鸡乳杆菌FB20自聚集、共聚集率Table 5. Auto-aggregation and co-aggregation rates of L. gallinarum FB20时间（h） 自聚集能力（%） 共聚集能力（%） 鸡乳杆菌FB20 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 4 27.61±0.09c 11.14±0.47Bc 14.78±0.18Ac 6 29.88±0.32b 47.14±0.93Ab 16.59±0.26Bb 8 38.87±0.14a 53.92±1.96Aa 38.82±1.10Ba 注：大写字母代表组间显著性，小写字母代表组内显著性（P<0.05）。 2.5 鸡乳杆菌FB20抑菌能力分析
如图3所示，鸡乳杆菌FB20对大肠杆菌E1、金黄色葡萄球菌S1及蜡样芽孢杆菌BI6Y分别产生直径为16.27±0.40、11.53±1.23和12.94±0.52 nm的抑菌圈，对大肠杆菌抑制效果最优。鸡乳杆菌FB20的抑菌能力发挥可能与有机酸类物质有关[44]。鸡乳杆菌FB20对植物乳杆菌没有抑制作用。
2.6 鸡乳杆菌FB20无细胞上清液的体外抗氧化能力
乳酸菌及其代谢物可作为抗氧化剂以应对多种氧化应激引发的相关疾病，例如心血管疾病、癌症、肥胖等[45−46]。实验结果发现鸡乳杆菌FB20无细胞上清液具有良好的抗氧化性（图4），对ABTS+自由基的清除能力最高为98.47%±0.01%；对DPPH自由基和羟自由基的清除能力分别为55.67%±3.19%和57.65%±3.42%。Xia等[29]从马粪中分离了4株魏斯氏菌测定其无细胞上清液DPPH自由基清除能力分别在9.93%~35.78%之间，对羟自由基的清除率在12%~15%之间；林瑛兰等[47]从酸粥中分离了一株植物乳杆菌Y3，其无细胞上清液对羟自由基的清除能力为51.26%。Lepecka等[48]从发酵肉制品中分离了23株乳酸菌，其无细胞上清液对DPPH自由基的清除率在0.00%±0.00%~36.05%±1.08%之间，对ABTS+自由基的清除率在5.72%±2.54%~33.33%±5.05%之间。最终确定戊糖片球菌KL14对两种自由基清除能力最强，分别为36.05%±1.08%和33.33%±5.05%。由此可见乳酸菌抗氧化能力可能与菌株来源和类型有关。
![]()
图 4 鸡乳杆菌FB20对DPPH自由基、ABTS＋自由基、羟自由基清除能力注：不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。Figure 4. Scavenging ability of L. gallinarum FB20 on DPPH radicals, ABTS+ radicals, and hydroxyl radicals2.7 鸡乳杆菌FB20的降糖能力
降糖能力是益生菌开发的一项重要指标。淀粉等在胃肠道消化过程中经α-淀粉酶裂解1,4-α-糖苷键转化为双糖或寡糖，又通过α-葡萄糖苷酶的作用水解为单糖后经小肠吸收[49−50]，血糖升高会加速自由基的产生，进而导致内源性抗氧化水平降低，从而诱发其他慢性疾病[51]，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性可以作为控制血糖增高以及减少其他疾病发生的一个方法。研究结果发现鸡乳杆菌FB20的无细胞上清液及细胞破碎提取液均具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制能力（表6），且无细胞上清液优于细胞破碎提取液，抑制率分别为67.91%±1.24%和66.53%±0.34%。曹英等[52]从骆驼乳中分离出34株乳酸菌并对其无细胞上清液的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果进行测定，发现有6株乳酸菌表现出较好的体外降糖能力，对α-葡萄糖苷酶的抑制率在11%~16%之间，对α-淀粉酶的抑制率在50%以上。Shirkhan等[53]从天然发酵乳中分离了一株德氏乳杆菌，其无细胞上清液和细胞破碎液对α-淀粉酶的抑制率分别为50%和25%。与本研究结果类似，这可能与无细胞上清液中含有的菌株代谢物例如胞外多糖有关[54]。
表 6 鸡乳杆菌FB20降糖能力Table 6. Hypoglycemic ability of L. gallinarum FB20指标 类型 抑制率（%） α-淀粉酶抑制活性 无细胞上清液 67.91±1.24b 细胞破碎液 20.76±4.05c 阿卡波糖 77.41±0.76a α-葡萄糖苷酶抑制活性 无细胞上清液 66.53±0.34b 细胞破碎液 48.17±14.06c 阿卡波糖 97.63±0.00a 注：不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。 2.8 鸡乳杆菌FB20发酵对红茶汤抗氧化能力的影响
红茶因本身含有酚类物质而具备一定的抗氧化能力[55]。这些酚类物质主要是一些儿茶素、绿原酸等，其在绿茶含量最高，乌龙茶次之，红茶最低[56]。本研究发现经鸡乳杆菌FB20发酵后的红茶汤抗氧化能力显著提高（P<0.05）（图7），对DPPH、ABTS+、羟自由基的清除能力分别从43.52%、69.37%、81.38%提高至56.00%、73.72%、91.95%，分别显著提升了12.48%、4.35%、10.57%。总还原力没有显著变化，但总酚含量由7.53 mg/mL显著提升至8.60 mg/mL（P<0.05）。
![]()
图 5 鸡乳杆菌FB20发酵红茶体外抗氧化能力注：（a）自由基清除能力；（b）总酚含量与还原力；不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。Figure 5. In vitro antioxidant capacity of fermented black tea soup已有研究表明乳酸菌发酵可以提高产品的抗氧化能力[57]，这可能与发酵后提升了活性产物的释放有关。发酵会增加总酚含量，菌株所产生的酶可以促进儿茶素、黄酮类化合物的生物转化，增强抗氧化性[58]。也有研究表明在植物基食品发酵过程中，产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌通过将糖苷转换成其糖苷元来提升食品的抗氧化能力[59]。鸡乳杆菌FB20发酵可以在一定程度弥补红茶因制作工艺过程中抗氧化能力的损耗。
2.9 鸡乳杆菌FB20发酵后红茶汤的电子鼻结果分析
红茶以其独特的香气而闻名，是最受欢迎的非酒精饮料之一[60]。Liu等[61]采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）鉴定了红茶有157种挥发性化合物。这些化合物大致可分为11类，主要包括醇类、酯类、酮类、醛类、萜烯类和硫化物。如图8a所示，经鸡乳杆菌发酵后的红茶与未发酵的红茶气味具有显著性差异，且与未发酵组相比，发酵组的红茶汤无机硫化物有所下降，无机硫化物是一种刺激性的挥发成分，降低其浓度可以提高产品感官属性。Wu等[62]研究发现电子鼻的W3C、W6S、W5C、 W2S和 W3S传感器所形容的气味特征与红茶风味有关，如图7（b）所示，本研究W3C、W6S、W5C、W2S和 W3S传感器所检测的挥发性物质均高于未发酵组，说明鸡乳杆菌FB20发酵可以在一定程度上提高红茶汤的风味。
![]()
图 6 鸡乳杆菌FB20发酵对红茶汤风味影响的电子鼻分析注：（a）发酵红茶汤PCA；（b）鸡乳杆菌FB20发酵红茶汤雷达图。Figure 6. Effect of L. gallinarum FB20 fermentation on the flavor of black tea soup by electronic nose analysis3. 结论
本研究从泡菜汁和健康婴儿粪便中共分离了7株产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，通过测定酶活力确定了一株从健康婴儿粪便中分离的高产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，通过16S rDNA和BLASTN序列对比鉴定为一株鸡乳杆菌（L. gallinarum）。对其安全、益生特性进行了分析。该菌株溶血性、明胶酶活性、DNase活性均为阴性，对酸性环境具有较强耐受性，在pH2.5时，存活率为120.81%±12.44%，并且具有较高的抗氧化和降糖功能，其中对ABTS+自由基的清除率为98.47%±0.01%，与VC对ABTS+自由基的清除率无显著性差异。无细胞上清液和细胞破碎液均表现出良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制效果，是一株潜在的益生菌。利用该菌株发酵红茶汤后，能够在一定程度上改善和强化发酵红茶汤的风味和抗氧化性，也为其在发酵红茶汤中的应用提供了一定的理论依据。后续研究可以针对鸡乳杆菌FB20发酵后红茶汤的代谢物以及风味变化进行关联分析，并进一步通过体外发酵以及动物模型实验探索发酵对红茶汤营养功能的影响，解析鸡乳杆菌FB20发酵改善红茶汤品质的机制。
-
![]()
图 1 所分离的乳酸菌产β-葡萄糖苷酶的酶活力
注：不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。
Figure 1. Enzyme activity of the β-glycosidase producing lactic acid bacteria
![]()
图 2 鸡乳杆菌FB20的鉴定和生长特性分析
注：（a）鸡乳杆菌FB20在厌氧条件下培养的菌落形态图；（b）鸡乳杆菌FB20革兰氏染色后于光学显微镜下1000×观察图；（c）鸡乳杆菌FB20在CaCO3平板上的生长情况；（d）鸡乳杆菌FB20产β葡萄糖苷酶能力；（e）鸡乳杆菌FB20系统发育树图；（f）鸡乳杆菌FB20生长曲线。
Figure 2. Identification and growth characteristic of L. gallinarum FB20
![]()
图 4 鸡乳杆菌FB20对DPPH自由基、ABTS＋自由基、羟自由基清除能力
注：不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。
Figure 4. Scavenging ability of L. gallinarum FB20 on DPPH radicals, ABTS+ radicals, and hydroxyl radicals
![]()
图 5 鸡乳杆菌FB20发酵红茶体外抗氧化能力
注：（a）自由基清除能力；（b）总酚含量与还原力；不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。
Figure 5. In vitro antioxidant capacity of fermented black tea soup
![]()
图 6 鸡乳杆菌FB20发酵对红茶汤风味影响的电子鼻分析
注：（a）发酵红茶汤PCA；（b）鸡乳杆菌FB20发酵红茶汤雷达图。
Figure 6. Effect of L. gallinarum FB20 fermentation on the flavor of black tea soup by electronic nose analysis
表 1 电子鼻传感器
Table 1 Electronic nose sensor
阵列检测器序号 传感器名称 性能描述 1 W1C 对芳香成分，苯类敏感 2 W5S 对氮氧化合物敏感 3 W3C 对芳香成分，氨类敏感 4 W6S 对氢化物敏感 5 W5C 对芳香成分，烷烃类敏感 6 W1S 对甲烷等断链烷烃敏感 7 WSW 对无机硫化物敏感 8 W2S 对醇醚醛酮类敏感 9 W2W 对无机硫化物敏感 10 W3S 对长链烷烃类敏感 
下载: 导出CSV
表 2 鸡乳杆菌FB20产有害代谢物能力
Table 2 Ability of L. gallinarum FB20 to produce harmful metabolites
安全指标 测定结果 溶血性 − 明胶酶 − DNase活性 − 产生物胺能力 − 注：+代表阳性，−代表阴性。
下载: 导出CSV
表 3 鸡乳杆菌FB20抗生素药敏性
Table 3 Antibiotic susceptibility of L. gallinarum FB20
抗生素类型 抑制直径（mm） 敏感程度 诺氟沙星 0.00±0.00 R 四环素 31.16±3.42 S 青霉素G 48.60±1.66 S 红霉素 36.38±0.45 S 克拉霉素 43.39±2.37 S 庆大霉素 9.66±0.19 R 氯霉素 30.55±2.32 S 链霉素 16.97±0.07 IR 克林霉素 26.26±0.25 S 氨苄西林 44.50±2.69 S 卡那霉素 0.00±0.00 R 万古霉素 30.65±1.49 S 注：抗生素药敏性的抑制程度分为R（低敏感性，抑制直径≤14 mm）、IR （中等敏感性，抑制直径15~19 mm）、S（高敏感性，直径>20 mm）。
下载: 导出CSV
表 4 鸡乳杆菌FB20耐酸耐胆盐及模拟胃肠液存活率
Table 4 Acid and bile salt tolerant and survival rate in simulated gastrointestinal fluid of L. gallinarum FB20
益生指标 0 h（log CFU//mL） 4 h（log CFU/mL） 存活率（%） 耐酸 pH2.5 6.07±5.21 6.15±5.14 120.81±12.44a pH3 6.31±5.32 6.34±5.60 105.50±10.51a pH4 6.43±4.33 6.44±5.11 103.10±4.92a 耐胆盐 0.1% 4.87±3.57 4.81±3.40 88.39±1.15a 0.2% 4.74±3.33 4.59±2.91 70.97±1.93b 0.3% 4.60±2.91 4.51±3.33 82.64±7.07a 模拟胃肠液 胃液 7.94±0.01 7.64±0.01 96.21±1.40a 肠液 5.58±0.01 2.13±0.04 38.27±2.79b 注：不同小写字母代表各实验组内有显著性差异（P<0.05）。
下载: 导出CSV
表 5 鸡乳杆菌FB20自聚集、共聚集率
Table 5 Auto-aggregation and co-aggregation rates of L. gallinarum FB20
时间（h） 自聚集能力（%） 共聚集能力（%） 鸡乳杆菌FB20 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 4 27.61±0.09c 11.14±0.47Bc 14.78±0.18Ac 6 29.88±0.32b 47.14±0.93Ab 16.59±0.26Bb 8 38.87±0.14a 53.92±1.96Aa 38.82±1.10Ba 注：大写字母代表组间显著性，小写字母代表组内显著性（P<0.05）。
下载: 导出CSV
表 6 鸡乳杆菌FB20降糖能力
Table 6 Hypoglycemic ability of L. gallinarum FB20
指标 类型 抑制率（%） α-淀粉酶抑制活性 无细胞上清液 67.91±1.24b 细胞破碎液 20.76±4.05c 阿卡波糖 77.41±0.76a α-葡萄糖苷酶抑制活性 无细胞上清液 66.53±0.34b 细胞破碎液 48.17±14.06c 阿卡波糖 97.63±0.00a 注：不同小写字母代表有显著性差异（P<0.05）。
下载: 导出CSV
-
[1] KANG C H, KIM J S, PARK H M, et al. Antioxidant activity and short-chain fatty acid production of lactic acid bacteria isolated from Korean individuals and fermented foods[J]. Biotech,2021,11(5):1−8.
[2] MASKE B L, de MELO P G V, da S VALE A, et al. A review on enzyme-producing Lactobacilli associated with the human digestive process:From metabolism to application[J]. Enzyme and Microbial Technology,2021,149(3):109836−109854.
[3] KETUDAT CAIRNS J R, ESEN A. β-Glucosidases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2010,67(20):3389−3405. doi: 10.1007/s00018-010-0399-2
[4] GODSE R, BAWANE H, TRIPATHI J, et al. Unconventional β-glucosidases:A promising biocatalyst for industrial biotechnology[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2021,193(9):2993−3016. doi: 10.1007/s12010-021-03568-y
[5] MICHLMAYR H, KNEIFEL W. β-Glucosidase activities of lactic acid bacteria:Mechanisms, impact on fermented food and human health[J]. FEMS Microbiology Letters,2014,352(1):1−10. doi: 10.1111/1574-6968.12348
[6] LORN D, NGUYEN T-K-C, HO P-H, et al. Screening of lactic acid bacteria for their potential use as aromatic starters in fermented vegetables[J]. International Journal of Food Microbiology,2021,350(5):109242−109252.
[7] QUINES-LAGMAY V C, JEONG B-G, KERR W L, et al. Antioxidative properties of eastern prickly pear (Opuntia humifusa) fermented with lactic acid bacteria and cell wall-hydrolyzing enzymes[J]. LWT-Food Science and Technology,2020,122(1):109029−109048.
[8] LI C, XU T, LIU X W, et al. The expression of β-glucosidase during natto fermentation increased the active isoflavone content[J]. Food Bioscience,2021,43(7):101286−101292.
[9] ZHANG P, ZHANG R, SIRISENA S, et al. Beta-glucosidase activity of wine yeasts and its impacts on wine volatiles and phenolics:A mini-review[J]. Food Microbiology,2021,100(6):103859−103872.
[10] SUPRIYADI S, NARESWARI A R, FITRIANI A, et al. Enhancement of black tea aroma by adding the β-glucosidase enzyme during fermentation on black tea processing[J]. International Journal of Food Science,2021,2021(8):1−9.
[11] ÇELIK A, DINçER A, AYDEMIR T. Characterization of β-glucosidase immobilized on chitosan-multiwalled carbon nanotubes (MWCNTS) and their application on tea extracts for aroma enhancement[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016,89(5):406−414.
[12] LIANG S, WANG F, GRANATO D, et al. Effect of β-glucosidase on the aroma of liquid-fermented black tea juice as an ingredient for tea-based beverages[J]. Food Chemistry,2023,402(9):134201−134210.
[13] NGUYEN N K, DONG N T N, NGUYEN H T, et al. Lactic acid bacteria:Promising supplements for enhancing the biological activities of kombucha[J]. SpringerPlus,2015,4(1):1−6. doi: 10.1186/2193-1801-4-1
[14] LI R, LUO W, LIU Y, et al. The investigation on the characteristic metabolites of Lactobacillus plantarum RLL68 during fermentation of beverage from by-products of black tea manufacture[J]. Current Research in Food Science,2022,5(7):1320−1329.
[15] DENG P, MENG C, WU Y, et al. An unusual GH1 β-glucosidase from marine sediment with β-galactosidase and transglycosidation activities for superior galacto-oligosaccharide synthesis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104(11):4927−4943. doi: 10.1007/s00253-020-10578-z
[16] LIU X, LI Y, YU Z, et al. Screening and characterisation of β-glucosidase production strains from Rosa roxburghii Tratt[J]. International Journal of Food Engineering,2021,17(1):1−9. doi: 10.1515/ijfe-2020-0152
[17] KANPIENGJAI A, NUNTIKAEW P, WONGSANITTAYARAK J, et al. Isolation of efficient xylooligosaccharides-fermenting probiotic lactic acid bacteria from ethnic pickled bamboo shoot products[J]. Biology,2022,11(5):638−654. doi: 10.3390/biology11050638
[18] KHAN A N, YASMIN H, GHAZANFAR S, et al. Antagonistic, anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-diabetic probiotic potential of Lactobacillus agilis isolated from the rhizosphere of the medicinal plants[J]. Saudi Journal of Biological Sciences,2021,28(11):6069−6076. doi: 10.1016/j.sjbs.2021.08.029
[19] NANDHA M C, SHUKLA R M. Exploration of probiotic attributes in lactic acid bacteria isolated from fermented Theobroma cacao L. fruit using in vitro techniques[J]. Frontiers in Microbiology,2023,14(9):1274636−1274656.
[20] LI Y, ZHAO N, LI Y, et al. Dynamics and diversity of microbial community in salmon slices during refrigerated storage and identification of biogenic amine-producing bacteria[J]. Food Bioscience,2023,52(1):102441−102450.
[21] SAEED A, YASMIN A, BAIG M, et al. Isolation and Characterization of Lactobacillus crispatus, Lactococcus lactis, and Carnobacterium divergens as potential probiotic bacteria from fermented black and green olives (Olea europaea):An exploratory study[J]. BioMed Research International,2023,2023(4):1−14.
[22] MOTEY G A, OWUSU-KWARTENG J, OBIRI-DANSO K, et al. In vitro properties of potential probiotic lactic acid bacteria originating from Ghanaian indigenous fermented milk products[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2021,37(3):52−65. doi: 10.1007/s11274-021-03013-6
[23] HACIOGLU S, KUNDUHOGLU B. Probiotic characteristics of Lactobacillus brevis KT38-3 isolated from an artisanal Tulum cheese[J]. Food Sci Anim Resour,2021,41(6):967−82. doi: 10.5851/kosfa.2021.e49
[24] SHAZADI K, ARSHAD N. Evaluation of inhibitory and probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from vaginal microflora[J]. Folia Microbiologica,2022,67(3):427−45. doi: 10.1007/s12223-021-00942-5
[25] SOEMARIE Y B, MILANDA T, BARLIANA M I, et al. Isolation, characterization, and identification candidate of probiotic bacteria isolated from Wadi Papuyu (Anabas testudineus Bloch. ) a fermented fish product from Central Kalimantan, Indonesia[J]. International Journal of Food Science,2022,2022(5):1−9.
[26] RAMADHANTI N, MELIA S R I, HELLYWARD J, et al. Characteristics of lactic acid bacteria isolated from palm sugar from west Sumatra, Indonesia and their potential as a probiotic[J]. Biodiversitas Journal of Biological Diversity,2021,22(5):2610−2616.
[27] KUNDUHOGLU B, HACIOGLU S. Probiotic potential and gluten hydrolysis activity of Lactobacillus brevis KT16-2[J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins,2020,13(3):720−733.
[28] RAGUL K, KANDASAMY S, DEVI P B, et al. Evaluation of functional properties of potential probiotic isolates from fermented brine pickle[J]. Food Chemistry,2020,311(12):126057−126065.
[29] XIA Y, QIN S, SHEN Y. Probiotic potential of Weissella strains isolated from horse feces[J]. Microbial Pathogenesis,2019,132(4):117−123.
[30] FAN S, XUE T, BAI B, et al. Probiotic properties including the antioxidant and hypoglycemic ability of lactic acid bacteria from fermented grains of Chinese Baijiu[J]. Foods,2022,11(21):3476−3482. doi: 10.3390/foods11213476
[31] LI L, SU Y, FENG Y, et al. A comparison study on digestion, anti-inflammatory and functional properties of polysaccharides from four Auricularia species[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2020,154(3):1074−1081.
[32] CHANG H M, FOO H L, LOH T C, et al. Comparative studies of inhibitory and antioxidant activities, and organic acids compositions of postbiotics produced by probiotic Lactiplantibacillus plantarum strains isolated from Malaysian foods[J]. Frontiers in Veterinary Science,2021,7(1):602280−602294.
[33] NING X, LUO Z, CHEN Z, et al. Fortification of set yogurt with passion fruit juice:Effects on fermentation kinetics, physicochemical properties, and functionality[J]. Journal of Dairy Science,2021,104(4):4084−4093. doi: 10.3168/jds.2020-19261
[34] ZHU D, REN X, WEI L, et al. Collaborative analysis on difference of apple fruits flavour using electronic nose and electronic tongue[J]. Scientia Horticulturae,2020,260(10):108879−88.
[35] SUGIMURA N, LI Q, CHU E S H, et al. Lactobacillus gallinarum modulates the gut microbiota and produces anti-cancer metabolites to protect against colorectal tumourigenesis[J]. Gut microbiota,2022,71(10):2011−2021.
[36] HANCOCK R E W. The complexities of antibiotic action[J]. Molecular Systems Biology,2007,3(1):142−144. doi: 10.1038/msb4100184
[37] SHAW K J, MILLER N, LIU X, et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents[J]. Microbial Physiology,2003,5(2):105−122. doi: 10.1159/000069981
[38] MBYE M, BAIG M A, ABUQAMAR S F, et al. Updates on understanding of probiotic lactic acid bacteria responses to environmental stresses and highlights on proteomic analyses[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2020,19(3):1110−1124. doi: 10.1111/1541-4337.12554
[39] ZHANG J, LIU M, XU J, et al. First insight into the probiotic properties of ten Streptococcus thermophilus strains based on in vitro conditions[J]. Current Microbiology,2019,77(3):343−352.
[40] AYYASH M M, ABDALLA A K, ALKALBANI N S, et al. Invited review:Characterization of new probiotics from dairy and nondairy products—Insights into acid tolerance, bile metabolism and tolerance, and adhesion capability[J]. Journal of Dairy Science,2021,104(8):8363−8379. doi: 10.3168/jds.2021-20398
[41] VAMANU E. Effect of gastric and small intestinal digestion on lactic acid bacteria activity in a GIS1 simulator[J]. Saudi Journal of Biological Sciences,2017,24(7):1453−1457. doi: 10.1016/j.sjbs.2015.06.028
[42] NIKOLIC M, JOVCIC B, KOJIC M, et al. Surface properties of Lactobacillus and Leuconostoc isolates from homemade cheeses showing auto-aggregation ability[J]. European Food Research and Technology,2010,231(6):925−931. doi: 10.1007/s00217-010-1344-1
[43] GUAN C, CHEN X, JIANG X, et al. In vitro studies of adhesion properties of six lactic acid bacteria isolated from the longevous population of China[J]. RSC Advances,2020,10(41):24234−24240. doi: 10.1039/D0RA03517C
[44] PUNIA BANGAR S, SURI S, TRIF M, et al. Organic acids production from lactic acid bacteria:A preservation approach[J]. Food Bioscience,2022,46(2):101615−31.
[45] CHEN W, XIE C, HE Q, et al. Improvement in color expression and antioxidant activity of strawberry juice fermented with lactic acid bacteria:A phenolic-based research[J]. Food Chemistry:X,2023,17(12):100535−100546.
[46] NALIYADHARA N, KUMAR A, KUMAR GANGWAR S, et al. Interplay of dietary antioxidants and gut microbiome in human health:What has been learnt thus far?[J]. Journal of Functional Foods,2023,100(12):105365−105376.
[47] 林瑛兰, 张悦, 李阔, 等. 传统酸粥中乳酸菌的分离筛选及其体外抗氧化能力分析[J]. 食品工业科技,2023,44(20):126−134. [LIN Yinglan, ZHANG Yue, LI Kuo, et al. Screening lactic acid bacteria in traditional sour porridge and analysis of their antioxidant activity[J]. Science and Technology of Food Industry,2023,44(20):126−134.] LIN Yinglan, ZHANG Yue, LI Kuo, et al. Screening lactic acid bacteria in traditional sour porridge and analysis of their antioxidant activity[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44（20）: 126−134.
[48] ŁEPECKA A, SZYMAŃSKI P, OKOŃ A, et al. Antioxidant activity of environmental lactic acid bacteria strains isolated from organic raw fermented meat products [J]. LWT-Food Science and Technology 2023, 12(2) :174-181.
[49] LORDAN S, SMYTH T J, SOLER-VILA A, et al. The α-amylase and α-glucosidase inhibitory effects of Irish seaweed extracts[J]. Food Chemistry,2013,141(3):2170−2176. doi: 10.1016/j.foodchem.2013.04.123
[50] HEDRINGTON M S, DAVIS S N. Considerations when using alpha-glucosidase inhibitors in the treatment of type 2 diabetes[J]. Expert Opinion on Pharmacotherapy,2019,20(18):2229−2235. doi: 10.1080/14656566.2019.1672660
[51] AJIBOYE B O, OJO O A, OKESOLA M A, et al. In vitro antioxidant activities and inhibitory effects of phenolic extract of Senecio biafrae (Oliv and Hiern) against key enzymes linked with type II diabetes mellitus and Alzheimer's disease[J]. Food Science & Nutrition,2018,6(7):1803−1810.
[52] 曹英, 侯敏, 易光平, 等. 驼乳制品中抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性乳酸菌的筛选及益生特性研究[J]. 食品工业科技,2022,43(19):191−201. [CAO Ying, HOU Min, YI Guangping, et al. Screening and probiotic properties of lactic acid bacteria inhibiting α-amylase and α-glucosidase activities in camel dairy products[J]. Science and Technology of Food Industry,2022,43(19):191−201.] CAO Ying, HOU Min, YI Guangping, et al. Screening and probiotic properties of lactic acid bacteria inhibiting α-amylase and α-glucosidase activities in camel dairy products[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43（19）: 191−201.
[53] SHIRKHAN F, MIRDAMADI S, MIRZAEI M, et al. The α-amylase and α-glucosidase inhibitory effects and antioxidant properties of native Lactobacilli strains isolated from traditional fermented dairy products[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2024,60(2):331−346. doi: 10.1134/S0003683824020170
[54] AL-NABULSI A A, JARADAT Z W, AL QUDSI F R, et al. Characterization and bioactive properties of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus isolated from Labaneh[J]. LWT-Food Science and Technology,2022,167(8):113817−113827.
[55] CARDOSO R R, NETO R O, DOS SANTOS D'ALMEIDA C T, et al. Kombuchas from green and black teas have different phenolic profile, which impacts their antioxidant capacities, antibacterial and antiproliferative activities[J]. Food Research International,2020,128(11):108782−108792.
[56] VU D C, ALVAREZ S. Phenolic, carotenoid and saccharide compositions of Vietnamese Camellia sinensis teas and herbal teas[J]. Molecules,2021,26(21):6496−6510. doi: 10.3390/molecules26216496
[57] CHOURASIA R, KUMARI R, SINGH S P, et al. Characterization of native lactic acid bacteria from traditionally fermented Chhurpi of Sikkim Himalayan region for the production of Chhurpi cheese with enhanced antioxidant effect[J]. LWT-Food Science and Technology,2022,154(11):112801−112810.
[58] JAKUBCZYK K, KAŁDUŃSKA J, KOCHMAN J, et al. Chemical profile and antioxidant activity of the kombucha beverage derived from white, green, black and red tea[J]. Antioxidants,2020,9(5):1−15.
[59] LIU L, ZHANG C, ZHANG H, et al. Biotransformation of polyphenols in apple pomace fermented by β-glucosidase-producing Lactobacillus rhamnosus L08[J]. Foods,2021,10(6):1−12.
[60] WANG Z, HAN B, JING W, et al. Effects of different steeping temperatures on the leaching of aroma components in black tea by SPME-GC-MS coupled with chemometric method[J]. Journal of AOAC International,2019,102(6):1834−1844. doi: 10.5740/jaoacint.18-0405
[61] LIU H, XU Y, WEN J, et al. A comparative study of aromatic characterization of Yingde black tea infusions in different steeping temperatures[J]. LWT-Food Science and Technology,2021,143(1):110860−110875.
[62] WU R, REN G, YIN L, et al. Characterization of Congou black tea by an electronic nose with grey wolf optimization (GWO) and chemometrics[J]. Analytical Letters,2022,56(13):2123−2136.
下载:
计量
- 文章访问数: 18
- HTML全文浏览量: 6
- PDF下载量: 7
