Research Progress of Solvent-free Lipase Catalysis and Its Application in the Food Field
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摘要: 脂肪酶是食品工业中重要的水解酶之一，广泛应用于风味酯生产、功能性酯开发及油脂改性等多个领域。然而，传统的脂肪酶催化反应体系需要使用大量有机溶剂，一旦处理不当，有机溶剂散失到环境中将造成严重污染，有害物质的残留将直接影响食用者的健康而引发食品安全事件。无溶剂体系脂肪酶催化具有不使用有毒有害试剂、安全性高、反应速度快、转化率高和选择性好等诸多优势，引起了学术界和食品行业的高度关注。然而无溶剂反应体系也有其固有的缺点，如：反应条件要求较高、某些反应难以进行、反应体系流动性差导致扩散困难等。由此，研究人员开发了机械、微波和超声等多种辅助强化手段优化反应。本文从无溶剂体系脂肪酶催化的反应类型、辅助强化手段及在食品领域的应用展开综述，以期为后续的研究和应用提供参考。Abstract: Lipase is one of the important hydrolase in the food industry, which is widely used in many fields such as production of flavor ester, development of functional ester and the modification of oil and fat. However, the traditional system of lipase-catalyzed reaction requires the use of a large number of organic solvents, which will cause serious pollution to the environment, and the residues of harmful solvent will directly affect the health of consumers and cause food safety incidents. Lipase catalysis in solvent-free system has many advantages, such as no use of toxic and harmful reagents, high safety, fast reaction speed, high conversion and good selectivity, which has attracted great attention from academia and food industry. However, the solvent-free reaction system also has a lot of shortcomings such as the reaction conditions are harsh, some reactions are difficult to carry out, and the poor fluidity of the reaction system leads to the difficulty of diffusion. As a result, researchers have developed a variety of assisted strengthening methods such as mechanical, microwave, and ultrasound to optimize the reaction effect. In this paper, the types of lipase-catalyzed reactions in solvent-free system, the assisted strengthening methods and its applications in the food field are reviewed so as to provide the reference for subsequent research and application.
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随着世界人口的增加，工业生产的发展及人类活动的加剧，生态环境的污染日益严重。其中许多环境问题均与人类合成的化学物质的生产和使用密切相关。20世纪90年代，“绿色化学”概念的提出，使得环境友好，反应条件温和，耗能少，副反应少的生物酶催化的化学品生产策略逐渐被人们所提倡。早期人们认为，只有在水溶液中酶才能保持活性[1−2]。1984年，美国科学家Klibanov等[3]首次发现许多酶可以在非水的有机溶剂中保持活性，甚至显示出更高的活性。这一发现为后续非水相体系酶催化的研究奠定了基础。2005年，Sheldon[4]提出“最好的溶剂就是没有溶剂”。随后，无溶剂体系酶催化生产化学品的相关研究和应用被大量报道[5]。无溶剂体系利用了一些反应物在反应温度下实际上是液体的事实，以反应物自身作为反应的溶剂，最大限度地减少了化学助剂的使用，同时减少了废物的产生，力图克服有毒有害化学物质的使用对环境造成的污染。
在食品工业中，使用的有机试剂一旦处理不当，有害物质的残留将直接影响食用者的健康，引发食品安全事件。无溶剂体系酶催化法不使用有毒有害试剂，产物易分离提纯，安全性高，容易被消费者和市场接受[6]。脂肪酶（三酰甘油水解酶，EC 3.1.1.3）具有高选择性、催化效率和操作稳定性等特点。脂肪酶在非水条件下的特殊催化特性使其成为无溶剂体系酶催化研究中最为理想的酶种类之一。目前，无溶剂体系脂肪酶催化已应用于调味剂、抗氧化剂、抗菌剂和乳化剂等添加剂的生物合成、脂肪改性及功能性食品开发等领域[7]。同时，研究人员开发了机械、超声和微波等多种无溶剂体系酶催化反应的辅助强化手段以优化反应效果[1]。本文详细阐述了无溶剂体系脂肪酶催化反应的反应类型及其适用的辅助强化手段，并对其在食品领域的应用进行了总结，以便为后续无溶剂体系脂肪酶催化的研究及其在食品领域的应用提供参考。
1. 脂肪酶催化反应的无溶剂体系
无溶剂体系酶催化反应是一种在不添加或微量添加溶剂的条件下进行酶催化反应过程的方法理论。相比于传统化学合成和其他非水相体系，无溶剂体系中脂肪酶催化的生产策略具有底物浓度高、反应速度快、转化率高、反应体积小、产物易分离纯化及环境友好等诸多优势，且生产过程中几乎不使用有毒有害试剂，非常适合应用于食品工业。根据反应底物的状态，脂肪酶催化的无溶剂体系可以分为固-固无溶剂体系、固-液无溶剂体系、液-液无溶剂体系[8]。
1.1 固-固无溶剂体系
固-固无溶剂体系酶催化反应的两个反应底物都是固体，根据底物混合状态的不同可分为固相体系和无溶剂共晶体系，见图1。通常，当底物分子差距小于1 nm时化学反应才可能发生，然而固-固无溶剂体系中的固体底物混合时异种底物分子难以达到此距离，难以发生化学反应。因此，固相体系中的脂肪酶催化通常需要借助机械化学方法，无溶剂共晶体系的脂肪酶催化反应则是利用底物的共晶效应确保反应发生[9]。
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图 1 不同反应体系中的底物状态图注：A：有机溶剂体系；B：无溶剂固相体系；C：无溶剂共晶体系。Figure 1. Substrate state diagrams in different reaction systems机械化学方法的原理是：通过机械研磨、剪切和摩擦等机械作用力促进酶催化反应的发生，加速反应进行，解决了无溶剂固相体系中酶催化反应难以发生的问题，在以脂肪酶为生物催化剂的化学相关反应中已有应用。2016年，Hernández等[10]以南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）为生物催化剂，在球磨条件下实现了仲醇的机械酶动力学拆分，见图2。Hernández等[10]的报道是首个脂肪酶在无溶剂体系机械酶催化反应中的应用，并证明了固定化CALB 在机械作用力下的高稳定性，为后续脂肪酶应用于机械酶催化的相关研究提供了基础。
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共晶反应是指两个固体反应物在共晶点处熔点显著降低，熔化形成液态，自身充当反应介质，混合并发生的化学反应。这种混合物熔化温度低于各组分熔化温度的无溶剂反应体系称为无溶剂共晶体系（或低共熔体系）[11]。Youn等[12]报道，在脂肪酶催化的柚皮苷与棕榈酸的酰化反应中，两种底物可以在温度低于熔点的情况下形成高度浓缩的均匀溶液，使得催化反应可以发生。通过向底物混合物中添加少量辅助剂DMSO可将熔化温度降低至40 ℃。相比于有机体系中的柚皮苷与棕榈酸酰化反应，无溶剂共晶体系中的底物的浓度高20~60倍，催化反应的整体产率高15倍以上。
相较于液-液和固-液无溶剂体系，固-固无溶剂体系中脂肪酶催化反应的研究起步较晚，相关研究较少。长久以来，反应物状态及混合问题限制了固-固无溶剂体系酶催化的应用和发展[9]。近些年，随着机械化学和共晶反应化学及其与酶催化反应相结合的研究逐渐成熟，固-固无溶剂体系酶催化反应的研究与应用才被进一步拓宽[10−12]。固-固无溶剂体系最大程度地避免了溶剂的使用，进而避免了有毒有害物质的残留，符合市场和消费者对于食品配料安全性的期待，具有广泛的应用前景。
1.2 液-液无溶剂体系
液-液无溶剂体系的两种反应底物均为液态，液态底物自身即可充当催化反应的介质以确保反应发生，是最常见的无溶剂体系。丁酯能够在液-液无溶剂体系下以富含脂肪酸的棕榈脂肪酸馏出物（PFAD）和丁醇为底物高效酶促合成，产率高达92%[13]。Martinez-Garcia等[14]报道了一种无溶剂酶促合成脂肪酸甲酯（FAME）的方法，对游离脂肪酸与甲醇的直接酯化反应进行了优化，使反应最终转化率达到98%。Jaiswal等[15]利用脂肪酶催化癸醇和油酸进行酯化反应，在无溶剂体系下合成了油酸癸酯（见图3），与使用己烷作为溶剂的传统方法相比此方法大幅缩短了反应时间。在食品工业中，液-液无溶剂体系的脂肪酶催化反应已应用于调味酯、脂类抗氧化剂、脂类抗菌剂及食品乳化剂的合成等领域。液-液无溶剂体系中脂肪酶催化反应的底物浓度高，相较于传统有机体系，反应可于短时间内达到高产率或高转化率[13−15]。
在传统酶催化反应中，影响酶促反应的因素主要有温度、底物浓度、pH、酶浓度等，除去这些，液-液无溶剂体系酶催化存在其特有的影响因素，主要包括：水分活度、底物摩尔比和固定化酶生物负载量三个方面[16−24]。这三种因素直接影响无溶剂体系脂肪酶催化的反应效率，下文将进行详细说明。
无溶剂反应体系中的水分活度是酶催化反应的关键参数。反应体系的过度水合会导致酶活性降低或使脂肪酶催化的反应更有利于水解。因此，无溶剂体系的酶催化反应通常需要使用真空压力、分子筛连续除水，或饱和盐溶液法严格控制水活度[16]。另一方面，无溶剂酶催化反应中的水分活度也不是越低越好，高极性底物争抢酶所需的必须水或体系水分活度过低都会导致会酶活性降低甚至失活。因此，无溶剂体系中需含有使脂肪酶具有催化活性的必须水，以保证催化反应正常进行[17]。
在无溶剂体系中，底物的摩尔比至关重要，它决定了反应介质在极性、粘度、互溶性和水活度等方面的性质。反应体系中的高极性底物会争抢酶所需的必须水，导致酶活性降低，而在无溶剂体系中，过量极性底物试剂引起酶抑制的概率远高于常规反应体系[18]。因此，体系中的极性底物比例越高，底物对酶的负面影响越大。当疏水底物占比较大时，反应体系的粘度通常也较大。反应体系的高粘度不利于反应的传质，直接影响催化反应效率。此外，试剂的摩尔比决定了固定化脂肪酶的作用环境，其影响的强度取决于生物催化剂的负载量[19−20]。
考虑到生物催化剂（酶）的高成本，生物催化剂负载量是酶催化反应的一个关键变量，在无溶剂体系中使用低生物催化剂负载获得高产量是具有挑战性的。酶负载量不影响平衡时的产物摩尔分数（即反应产率），但影响反应速率，此外，载体和酶都可能捕获一些水分子，改变体系的最佳初始水活度[21]。当体系中存在破坏酶水合层的过量底物试剂，而生物催化剂的负载相对较低时，底物对酶的水合层产生的有害影响就会很明显。因此，只有高负载量才能降低底物对酶抑制效果。增加酶负载量，则体系中可用的酶的量增多，从而加快反应速率，降低抑制效果[22−24]。
1.3 固-液无溶剂体系
固-液无溶剂体系中存在固态和液态两类反应物，其中固态反应物溶解于液态反应物中，液态反应物作为反应底物的同时也充当反应介质，使得催化反应顺利发生，见图4。因此，固-液无溶剂体系要考虑固体底物的溶解度问题，反应体系的混合程度和传质效果非常重要。目前固-液无溶剂酶催化反应主要有振荡、搅拌桨式反应器及流化床反应器三种反应形式[9]。Yu等[25]采用气-固-液三相体系合成了月桂酸异赤藓糖醇酯，发现反应速率较有机溶剂体系和固液体系有较大提高。Venturi等[26]通过在固-液无溶剂体系中微波辅助酶法成功合成了多种香叶酯（丁酸香叶酯、己酸香叶酯、辛酸香叶酯、（R）-3-羟基丁香叶酯等）。Jaiswal等[27]报道，在固-液无溶剂体系中利用CALB催化戊醇和乙酰丙酸酯化可以合成乙酰丙酸戊酯，最高产率可达73.2%。目前，固-液无溶剂体系的脂肪酶催化反应一般应用于脂肪改性、功能性脂类合成及新型食品添加剂开发等食品领域[25−27]。此外，适当提高温度可以降低体系粘度，有利于体系的混合和传质。类似于液-液无溶剂体系，温度、水分活度及底物摩尔等因素也影响固-液无溶剂体系的酶促反应[28]。
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图 4 固-液无溶剂体系中的酶催化反应示意图Figure 4. Schematic diagram of an enzyme-catalyzed reaction in a solid-liquid solvent-free system2. 无溶剂体系脂肪酶催化反应的辅助强化手段
无溶剂反应体系存在反应时间长、散热不良、传质困难以及反应体系流动性差等固有的缺点。因此，无溶剂体系的脂肪酶催化反应通常采用加热并搅拌（或振荡）的反应方式进行。加热促使反应进行，降低反应液粘度。搅拌和振荡有利于反应体系传质，提高反应效率。目前，能够提供反应所需加热并搅拌（或振荡）条件的机器设备有集热式恒温磁力搅拌器、恒温气浴振荡器及流化床反应器等[2]。此外，研究人员还开发了多种无溶剂体系酶催化反应的辅助强化手段以优化反应效果，例如：机械化学辅助、微波辅助和超声辅助等[1]。其中，机械化学法通常用以辅助强化固-固无溶剂体系中的脂肪酶催化反应，而超声辅助和微波辅助则常用于液-液和固-液无溶剂体系中的脂肪酶催化反应。
2.1 机械辅助
机械辅助法是一种利用剪切、冲击、摩擦力等机械作用促进酶催化反应的发生，在不添加或微量添加溶剂的条件下促进酶催化反应过程的方法。其原理是：研磨反应器中球体的摩擦和敲击产生的应力在反应混合物中产生高温微观位点，促进反应物基底中键的断裂和新键的形成，从而产生相应的产物，也就是利用机械能促进酶催化反应的发生，实现对反应底物的修饰、聚合及解聚，突出酶的高效性、选择性及专一性，见图5。目前，使用最广泛的自动化研磨设备有高速球磨机（HSBM）、行星磨机和螺杆磨机等[29−30]。
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图 5 机械辅助的无溶剂体系脂肪酶催化反应Figure 5. Mechanically assisted solvent-free lipase-catalyzed reaction作为生物催化剂的脂肪酶具有良好的机械稳定性是机械辅助的无溶剂酶催化反应可以进行的前提。机械力的施加一定程度上会引起酶结构的改变，稳定性较差的脂肪酶可能因此失去催化活性[29]。另一方面，机械辅助有时可以提高活性。当受到机械力作用时，自由能的变化引起酶蛋白分子的构象变化，增加了活性中心与底物的结合，进一步增加了反应中心的电荷密度，促使电子转移，降低了反应的活化能，从而在短时间内提高了酶催化反应的速率[30]。Pérez-Venegas等[31]报道，Novozym 435的酶动力学结果显示其在研磨过程中具有非常高的活性，计算得出的热力学参数也证实了Novozym 435具有很高的机械稳定性。此外，可溶性 II 型猪胰脂肪酶（PPL）的酶促反应动力学结果研究发现：PPL在己烷溶液中未表现出催化活性，但当反应在机械化学辅助的条件下进行时，检测到显著的非对映选择性的酰化产物转化，表明机械力可以诱导所需的生物转化，机械能的外加作用有利于增强酶的催化活性。这一观察结果为进一步研究机械力化学条件下的生物催化过程奠定了基础[31]。在无溶剂体系机械辅助的酶催化反应中，CALB可以催化γ位双木酚衍生物的酰化，以乙酸异丙烯酯为酰基供体，2 h内实现木质素模型化合物的完全转化，以乙酸乙烯酯为酰基供体，反应收率可达74%。此研究表明，机械辅助的催化反应不仅能有效缩短反应时间还能提高反应转化率[32]。
机械辅助的无溶剂体系脂肪酶催化是一个新兴领域，有效克服了固相体系中反应难以发生的问题，不仅避免了大量有机溶剂的使用，同时还可以提高反应速率，已逐渐成为无溶剂体系酶催化领域的研究热点。
2.2 微波辅助
微波应用于酶促反应可在短时间内提高转化率和产率，并且可以通过调整微波参数选择性地得到特定产物[33−34]。其中波长为12.24 cm，频率为2.45 GHz的微波最常应用于辅助酶催化反应。无溶剂体系的酶促反应存在反应难以发生和反应缓慢的问题，特别是流动性较差的固-固无溶剂共晶体系和涉及固体反应物溶解性问题的固-液无溶剂体系，微波辅助可以针对性解决这些问题。许多研究报道，在无溶剂条件下，微波辅助的酶催化反应可减少反应时间，提高产物的产率[35−38]，微波辅助强化无溶剂体系脂肪酶催化反应的机制见图6。
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在酶催化反应中，微波辐射最开始是作为取代常规加热方式（如水浴、油浴等）的一种新方法。微波结合了热效应和非热效应两种效应，能与反应系统中的分子直接耦合，产生与反应温度无关的振动，产生的离子传导会导致瞬间局部过热[39]。相较于常规加热，微波加热具备瞬时加热（内部深层加热）、均匀性高温加热和选择性加热等优势，见图7。因此，一些在常规加热下需要几个小时才能完成的反应，使用微波可以在很短的时间内成功完成。在无溶剂酶法合成聚乙二醇硬脂酸酯时，常规加热需要6 h才能达到转化率，而在微波辅助下仅需70 min[35]。
微波加热和生物催化显示出协同效应，可提高速率和最终转化率，在酯化以及酯交换反应中显示出良好的效果。在酶催化己二酸与各种醇的酯化反应中，与正常加热相比，低微波能量可使速率提高2.63倍[36]。 微波辐射增加了底物与酶有效相互作用的可能性。这是由于微波照射下的酶发生构象改变，能够帮助底物更容易地接近酶的活性位点。此外，微波场的影响通过干扰脂肪酶蛋白质簇中的极性氢键引起活性位点的构象翻转，从而激活酶并导致底物结合以及产物以更快的速度从脂肪酶的活性位点释放[40]。
2.3 超声辅助
在工业规模上，无溶剂体系生物酶法的反应时间过长成为大规模生产的障碍，超声辅助是其有效的解决方案之一。超声辅助酶催化的原理是：高功率的超声波引起的“空化效应”加速了酶、底物和产物间的传质速度从而提高了酶活[41]。超声辅助作用的强弱与超声波的频率和强度有关。将超声技术和无溶剂酶学催化方法相结合可以改善体系的传质情况、大幅度提高酶活和反应速率，超声辅助无溶剂体系脂肪酶催化反应的机制见图8。目前，超声辅助酶催化反应主要有两种方式，一种是将酶预先进行超声处理后，再进行催化反应；另外一种方法是酶促反应与超声处理同时进行[42]。
Diao等[44]报道，经超声波预处理后，脂肪酶催化猪油与甘油单月桂酸酯（GML）酯交换合成甘油二酯（DAG）的产率可从28.47%提升至40.59%。Zhang等[45]以阿魏酸乙酯（EF）与甘油三酯为原料，在超声预处理下进行酶交换反应，制备了一系列富含阿魏酰结构脂质（FSLs）的功能油。与传统机械搅拌相比，超声处理1 h反应的活化能从50.0 kJ/mol降低到40.7 kJ/mol，表观动力学常数提高了13倍以上。利用超声辅助反应的最大转化时间从20~60 h急剧缩短到4~6 h。同时，将酶促反应和超声处理同时进行的无溶剂酶催化相关研究也取得了显著的成果。在脂肪酶催化的月桂酸香茅酯的合成过程中，采用超声辅助时香茅醇的转化率是传统酶催化法的3.6倍[42]。研究报道，在超声辅助下，脂肪酶催化的丙酸异丁酯合成反应3 h的转化率可达95.14%，而常规方法所需时间为10 h。同时，超声辅助条件下的最佳酶负载量也低于常规的酶负载量，酶的效率显著提高，且可重复使用达7个循环，保持其原有的天然活性[46]。因此，以上两种辅助强化策略均可提高无溶剂体系脂肪酶催化反应中酶的活性，提高反应产率的同时缩短了反应时间。
另外，Nieto等[43]在无溶剂条件下，利用超声辅助固定化脂肪酶将游离脂肪酸与木糖醇酯化，成功地合成了五种木糖酰基酯。在这种半固体体系中，超声辅助可以使底物分子运输到酶催化位点，使木糖基脂肪酯高效合成（90 min的收率达到95%），其中主产物木糖基单酰基酯和木糖醇二酰基酯产量占比大于96%。因此，超声辅助也是克服固-液无溶剂和液-液无溶剂反应体系中底物相互不混溶以及初始反应混合物的半固体特性所造成的障碍的关键工具。
综上所述，机械、超声或微波等辅助强化手段的运用可能使脂肪酶的高级结构改变，酶的活性位点暴露，进而加大酶中心位点与底物的接触概率，提高反应速率，缩短反应时间。目前，利用超声或微波等辅助强化手段的无溶剂脂肪酶催化反应已在食品领域广泛应用。然而，辅助强化手段的施加也可能会对脂肪酶结构造成影响，导致酶活性发生改变而直接丧失催化活性，特别是机械辅助法。因此，在机械、超声或微波等条件下进行的酶催化反应通常选用结构相对稳定的游离脂肪酶或固定化脂肪酶，例如：商业化南极假丝酵母固定化脂肪酶 B（Novozym 435）固定化黑根毛霉脂肪酶（Lipozym®RM IM）、PPL和CALB等，以免酶因辅助条件的施加而失活[5−6]。
3. 无溶剂体系脂肪酶催化反应在食品领域的应用
脂肪酶在非水条件下可以催化多种底物的酯化、酯交换、氨解和酸解反应，非常适合作为无溶剂体系催化反应的生物催化剂[7]。在食品工业中，无溶剂体系脂肪酶催化反应主要应用于香精香料、抗氧化剂和乳化剂等食品添加剂的生产和功能性食品开发领域，主要涉及液-液和固-液体系两种无溶剂体系的酶催化反应及微波和超声两种辅助强化手段，通常根据底物状态和溶解度匹配合适的体系与辅助强化手段。
3.1 食品添加剂的开发
3.1.1 香精、调味剂（风味酯）
带有特殊风味和香味的短链风味酯在食品工业中广受欢迎。然而从天然植物和水果提取风味酯的方法和传统化学生产都存在成本高、生产效率低及污染程度高等缺点[47]。为了满足市场需求，在无溶剂体系中酶促合成风味酯的生产策略被广泛研究。Aljawish等[22]分别在乙腈和乙醇两种有机体系及无溶剂体系中，使用Novozym 435催化甲酸与直链醇酯化合成了甲酸酯。研究发现，有机溶剂体系中反应达到最大产率需要8 h，而在无溶剂体系中仅需5 h。Tomke等[48]在超声辅助的无溶剂体系中通过肉桂醇和醋酸乙烯酯的酯交换反应催化合成了乙酸肉桂酯，产率高达99%。此外，微波辅助使反应达到最大产率所需的时间从60 min缩短到20 min。在微波辅助的无溶剂脂肪酶催化反应体系中，丙酸和正丁醇酯化合成丙酸正丁酯的产率可在8 h转内达到92%，实现了丙酸正丁酯的高效生产[49]。目前，关于无溶剂体系中酶法生产风味酯的策略已较为成熟，并已成功应用于生产多种芳香酯（见表1）。
表 1 无溶剂体系脂肪酶催化合成风味酯的研究汇总Table 1. Summary of studies on the synthesis of flavor esters catalyzed by solvent-free lipases产物 无溶剂体系类型 脂肪酶种类 辅助强化手段 应用 参考文献 甲酸丁酯 液-液 Novozym 435、Lipozym®RM IM、固定化疏
棉状嗜热丝孢菌脂肪（Lipozym®TL IM）等\ 李子味香精 [22] 甲酸正辛酯 液-液 Novozym 435 \ 玫瑰橘味和苦味香精 [22] 乙酸肉桂酯 固-液 Novozym 435 超声辅助 苹果、菠萝、肉桂味食用香精 [48] 丙酸正丁酯 液-液 Novozym 435 微波辅助 杏、桃味香精 [49] 丙酸香叶酯 液-液 固定化皮壳青霉源脂肪酶（Penicillium crustosum） \ 花香味和甜果香香精 [50] 戊酸乙酯 液-液 Novozym 435 微波辅助 草莓、苹果、菠萝蜜等果味香精 [51] 己酸乙酯 液-液 Novozym 435 \ 菠萝味香精 [52] 辛酸丁酯 液-液 Novozym 435 超声辅助 香蕉、青苹果、梨、李子和草莓等水果风味香精 [37] 苯甲酸丙酯 液-液 固定化褶皱假丝酵母脂肪酶（CCL） \ 坚果味和甜果味香精 [53] 苯甲酸苄酯 固-液 Novozym 435
Lipozyme TL-IM
Lipozyme RM-IM超声辅助 配制草莓、菠萝、樱桃等水果型食用香精
和酒类香精[54] 3.1.2 防腐剂、抗氧化剂
近年来，人们日益关注传统化学防腐剂对人类健康和环境的影响，研究人员一直在寻求安全环保的食品防腐剂生产策略。无溶剂体系脂肪酶催化法生产具有防腐和抗氧化功能的脂类成为研究热点，其中微波和超声辅助的固-液无溶剂体系酶催化的生产策略占比最大。Lee等[55]首次尝试无溶剂脂肪酶催化香草醇与丙酸乙酯的酯交换反应，以高产率合成了天然抗氧化剂丙酸香草酯。Sun等[56]开发了一种利用脂肪酶催化阿魏酸乙酯（EF）与蓖麻油酯交换合成阿魏酰化结构脂质（FSL）的新路线，所得的产物FSL保持了阿魏酸（FA）的抗氧化性。这种无溶剂体系酶促合成FSL的生产策略解决了FA易受到高温、碱性溶剂等反应条件影响的生产问题，使生产过程环保、安全、可持续的进行。基于此，Abdelgawad等[57]在无溶剂体系中利用酶促酯交换反应成功合成了两亲性阿魏酸棕榈硬脂酸酯，开发了一种绿色、安全的FSL生产的技术路线，拓宽了FA在食品工业中的应用。目前，研究报道的可通过无溶剂酶法合成的防腐剂和抗氧化剂还有没食子酸甘油酯[58]和月桂酸异赤藓糖醇酯[25]、蔗糖油酸酯和果糖油酸酯[59]等。
3.1.3 乳化剂
许多脂类物质均具有乳化特性，上文中具有抗氧化活性的酯类同时也可作为乳化剂。月桂酸甘油酯是一种优良的食品级乳化剂和化妆品表面活性剂。在工业中，月桂酸甘油酯是通过传统的高温（170~220 °C）化学方法生产的。然而，采用高反应温度所产生的深色产物和最终制剂中的甘油单酯均会影响加工食品的质地和口感。基于此，Mustafa等[60]报道了一种无溶剂体系酶催化生产月桂酸甘油酯（GML）的方法策略，此方法可在相对温和的60 ℃条件下反应，实际转化率可达93%以上，且不产生影响食品质地和口感的副产物。在无溶剂体系中以脂肪酶为催化剂的酶促合成策略已经成功合成多种乳化剂和表面活性剂，如PG-10月桂酸酯、PG-10辛酸酯[61]、蔗糖油酸酯、果糖油酸酯[59]、海藻糖单酯（TMEs）和海藻糖二酯（TDEs）[62]等，这些脂肪酸酯均具有良好的生物相容性，应用于各个工业领域。
3.2 功能性食品及保健品开发
3.2.1 脂肪改性（合成结构化脂）
在无溶剂体系中，脂肪酶能够作用于三酰甘油的不同酯键，从而控制脂肪酸在甘油骨架中的结合和分布，这是无溶剂体系酶催化生产结构脂类的基本机制。脂质结构改性可提高脂质的营养及功能特性，产生低能量、具有功能特性或物理化学特性得到改善的新脂质分子[63]。
Remonatto等[64]以米黑根毛霉脂肪酶（Lipozyme RM IM）为催化剂，以棉籽油和癸酸为原料，在流化床反应器中成功酶解制备了中-长-中（MLM）链结构的三酰甘油，见图9。在无溶剂体系中，Lipozyme RM IM具有选择性，可以控制脂肪酸在三酰基甘油结构中甘油链的sn-1和sn-3特定位置的结合。MLM结构的三酰甘油能量普遍低于常规脂肪和油，可快速代谢，绕过脂肪组织的储存，有助于控制餐后血液中的脂质水平，进而有助于体重管理。Baloch等[65]报道，在无溶剂体系中使用脂肪酶催化鲣鱼眼球油与商用乳脂的酯交换反应，可以合成富含中长链n-3脂肪酸的结构化脂肪，这类结构脂与母乳中脂肪的脂肪酸组成类似，更容易消化，可被用于婴幼儿配方乳的研究与开发。
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针对酶法合成中长链三酰甘油（MLCTs）反应时间长、适应范围有限的问题，Lai等[66]开发了一种高效的无溶剂酶法酯化策略，以亚麻籽油、向日葵籽油和紫苏籽油等及中链三酰甘油为底物，酶促合成了富含亚麻酸、油酸、二十二碳六烯酸（DHA）和神经酸的MLCT产物，这是首次成功制备含有神经酸的MLCT，产生的MLCT具有开发保健品和药物的潜力。二酰基甘油（DAG）的酶促合成具有与MLCTs相似的问题。基于此，Zou等[67]报道，无溶剂体系中脂肪酶催化裂殖壶菌油脂甘油解可制备富含DHA的DAG，所得产物可作为补充剂应用于婴儿配方奶粉，提高DHA的生物利用度。Choong等[68]报道，在无溶剂体系中采用固定化脂肪酶催化棕榈油水解，也是一种高效生产富含DAG和油脂的方法。
无溶剂体系脂肪酶催化法生产结构酯的生产策略具有选择性好、反应条件温和、不良副产物少、浪费少、产物回收容易等优点，所生产的结构酯常用于婴幼儿配方乳、功能性食品及药品开发等领域。
3.2.2 合成功能活性成分
许多功能性成分难以通过直接提取或化学方法生产，而传统体系的酶法合成需使用有害试剂，引起了人们对食品安全和环境可持续性的担忧。另外，大量功能性成分因自身溶解度的限制难以应用于食品体系中[69]。为了解决这些问题，在无溶剂体系中以酶催化法生产或酯化功能性成分的策略被开发，相关研究见表2。
表 2 无溶剂体系脂肪酶催化合成功能性酯的研究汇总Table 2. Summary of studies on the synthesis of functional esters catalyzed by solvent-free lipases功能性酯 无溶剂体系类型 脂肪酶 功能活性 参考文献 植物甾醇酯 固-液 皱褶假丝酵母脂肪酶（CRL） 降低血液胆固醇水平、抑制肿瘤、预防前列腺肥大、调节免疫力等 [70] 吡哆醇脂肪酸酯 固-液 Lipozyme 435 维生素B6类似的功能活性 [71] 阿魏酸酯 固-液 Novozym® 435 预防多种疾病（心血管相关疾病、炎症相关疾病和癌症等） [72] β-谷甾醇油酸酯 固-液 CRL 抑制胆固醇吸收、抗炎、抗氧化及预防癌症等 [73] 亚油酸冰片酯 固-液 Lipozyme 435 抗炎、镇痛、抗病原微生物和中枢神经系统双向调节作用 [74] D-α-生育酚乙酸酯 液-液 木瓜脂肪酶（CPL） 有利于促进健康，预防和治疗不孕、眼疾、心脏病、癌症等疾病 [75] 传统方法合成植物甾醇酯存在反应温度较高、产品外观较差、化学催化剂残留等缺点，而无溶剂体系酶法合成植物甾醇酯反应条件温和、产品质量高。这种简单、绿色、低成本的无溶剂酶法生产策略为松甾醇酯和其他食物源营养素的高效生产提供了新的可能性[70]。Yu等[71]报道了一种无溶剂气体鼓泡系统的酶催化高效生产吡哆醇单月桂酸酯的生产策略，并对吡哆醇单月桂酸酯的界面性能进行了评估，证明了其作为一种新型的食品乳化剂的潜力。Huang等[72]在无溶剂条件下，以脂肪酶催化阿魏酸（FA）与辛醇酯化反应生成阿魏酸辛酯，为阿魏酸酯的合成提供一种生物催化方法。Chen等[73]报道了一种无溶剂体系酶法合成β-谷甾醇油酸酯的工艺策略，在最佳反应条件下，β-谷甾醇油酸酯产率超过98%。Chen等[73]成功将合成过程扩大了100倍，表明其可用于工业规模的β-谷甾醇油酸酯合成，为其在功能食品工业中的应用开辟了更广阔的途径。通过无溶剂体系脂肪酶催化法酯化功能活性成分的策略针对性解决了功能性成分难以应用于食品体系的问题，拓宽了多种功能性成分的应用范围。
4. 总结与展望
本文根据反应底物的状态，将脂肪酶催化的无溶剂体系分为固-固无溶剂体系、固-液无溶剂体系、液-液无溶剂体系三类，并通过分析各类型的反应特点和影响因素，匹配合适的辅助强化手段。最后，总结归纳了无溶剂体系脂肪酶催化在各个食品领域中的应用。无溶剂体系中的脂肪酶催化反应结合了无溶剂体系和酶催化的优势，是一种极具潜力的清洁反应新技术。目前，无溶剂体系脂肪酶催化的理论研究已较为成熟，相关应用的报道也很丰富。无溶剂体系脂肪酶催化反应生产的脂类产物已应用于香精香料、抗氧化剂、抗菌剂、乳化剂和功能性食品开发等食品工业领域。然而，无溶剂反应体系存在的体系粘度大、传质困难以及散热不良等问题均制约着无溶剂酶催化的发展和应用。机械、微波和超声等辅助强化方法可以改善无溶剂体系酶催化反应的传质问题，加速反应进行，提高反应效率。后续研究应继续着眼于新型辅助强化手段的开发。另外，辅助强化方法对脂肪酶结构的影响问题也不容忽视。在机械、微波和超声等辅助强化的作用下，部分酶因结构改变而失去催化活性。为了保证反应过程中酶活性的保持，通过酶固定化、杂合酶、生物印迹、蛋白质工程等手段开发稳定性高的“新酶”或将成为研究热点。无溶剂体系酶催化法的生产成本通常高于传统化学方法，且针对其生产成本的经济学相关研究非常欠缺，阻碍了大规模生产。因此，在后续的研究和应用中，低成本无溶剂体系酶催化生产策略的开发和生产过程的优化应作为重点，以降低大规模生产的成本。
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图 1 不同反应体系中的底物状态图
注：A：有机溶剂体系；B：无溶剂固相体系；C：无溶剂共晶体系。
Figure 1. Substrate state diagrams in different reaction systems
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图 4 固-液无溶剂体系中的酶催化反应示意图
Figure 4. Schematic diagram of an enzyme-catalyzed reaction in a solid-liquid solvent-free system
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图 5 机械辅助的无溶剂体系脂肪酶催化反应
Figure 5. Mechanically assisted solvent-free lipase-catalyzed reaction
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表 1 无溶剂体系脂肪酶催化合成风味酯的研究汇总
Table 1 Summary of studies on the synthesis of flavor esters catalyzed by solvent-free lipases
产物 无溶剂体系类型 脂肪酶种类 辅助强化手段 应用 参考文献 甲酸丁酯 液-液 Novozym 435、Lipozym®RM IM、固定化疏
棉状嗜热丝孢菌脂肪（Lipozym®TL IM）等\ 李子味香精 [22] 甲酸正辛酯 液-液 Novozym 435 \ 玫瑰橘味和苦味香精 [22] 乙酸肉桂酯 固-液 Novozym 435 超声辅助 苹果、菠萝、肉桂味食用香精 [48] 丙酸正丁酯 液-液 Novozym 435 微波辅助 杏、桃味香精 [49] 丙酸香叶酯 液-液 固定化皮壳青霉源脂肪酶（Penicillium crustosum） \ 花香味和甜果香香精 [50] 戊酸乙酯 液-液 Novozym 435 微波辅助 草莓、苹果、菠萝蜜等果味香精 [51] 己酸乙酯 液-液 Novozym 435 \ 菠萝味香精 [52] 辛酸丁酯 液-液 Novozym 435 超声辅助 香蕉、青苹果、梨、李子和草莓等水果风味香精 [37] 苯甲酸丙酯 液-液 固定化褶皱假丝酵母脂肪酶（CCL） \ 坚果味和甜果味香精 [53] 苯甲酸苄酯 固-液 Novozym 435
Lipozyme TL-IM
Lipozyme RM-IM超声辅助 配制草莓、菠萝、樱桃等水果型食用香精
和酒类香精[54] 
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表 2 无溶剂体系脂肪酶催化合成功能性酯的研究汇总
Table 2 Summary of studies on the synthesis of functional esters catalyzed by solvent-free lipases
功能性酯 无溶剂体系类型 脂肪酶 功能活性 参考文献 植物甾醇酯 固-液 皱褶假丝酵母脂肪酶（CRL） 降低血液胆固醇水平、抑制肿瘤、预防前列腺肥大、调节免疫力等 [70] 吡哆醇脂肪酸酯 固-液 Lipozyme 435 维生素B6类似的功能活性 [71] 阿魏酸酯 固-液 Novozym® 435 预防多种疾病（心血管相关疾病、炎症相关疾病和癌症等） [72] β-谷甾醇油酸酯 固-液 CRL 抑制胆固醇吸收、抗炎、抗氧化及预防癌症等 [73] 亚油酸冰片酯 固-液 Lipozyme 435 抗炎、镇痛、抗病原微生物和中枢神经系统双向调节作用 [74] D-α-生育酚乙酸酯 液-液 木瓜脂肪酶（CPL） 有利于促进健康，预防和治疗不孕、眼疾、心脏病、癌症等疾病 [75]
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