Analysis of Metabolite Composition and Isolation of Dominant Bacteria in Two Hubei Special Wheat Sauce
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摘要: 为深入了解湖北传统小麦酱的代谢物组成及菌相组成，本研究对两种湖北特色小麦酱进行了理化指标测定、非靶标代谢组学分析以及优势菌种分离。结果显示：两种小麦酱均符合GB 2718-2014《食品安全国家标准 酿造酱》的规定。液相色谱串联质谱（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）共鉴定到非挥发性代谢物236种，主要是有机酸及其衍生物、脂肪酰以及苯及其取代衍生物等，其中筛选到非挥发性差异代谢物195种。气相色谱-飞行时间质谱（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF-MS）共鉴定到挥发性代谢物178种，主要是有机酸及其衍生物、有机氧化合物以及脂质和类脂质分子等，其中筛选到挥发性差异代谢物106种。菌种鉴定结果表明小麦酱中的优势菌种主要是Bacillus、Aspergillus oryzae以及Starmerella etchellsii。本研究为传统小麦酱的主要代谢物组成以及优势菌种鉴定提供了坚实的理论基础。Abstract: To explore the metabolite composition and bacterial phase composition of Hubei traditional wheat sauce, the physicochemical indexes determination, non-targeted metabolomics analysis and dominant strains isolation were conducted in this study. The results showed that both wheat sauces met the requirements of GB 2718-2014 "National Food Safety Standard for Brewing Sauce". A total of 236 non-volatile metabolites were identified by liquid chromatograph-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), mainly organic acids and their derivatives, fatty acyls, benzene and substituted derivatives, among which 195 non-volatile differential metabolites were screened. Moreover, 178 volatile metabolites were identified by gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF-MS), mainly organic acids and their derivatives, organic oxygen compounds, lipids and lipid-like molecules, among which 106 volatile differential metabolites were screened. The results of bacterial species identification indicated that the dominant species were Bacillus, Aspergillus oryzae and Starmerella etchellsii. Collectively, this study laid a solid theoretical foundation for the analysis of flavor composition and identification of dominant bacteria in traditional wheat sauce.
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面酱又称甜面酱，作为一种承载着深厚文化底蕴的传统调味品，在我国饮食史上占据着悠久的篇章。面酱的制作基础源自谷物，依据采用的原料差异，面酱又可细分为两大类，一类是以馒头等面粉制品为核心成分进行再加工，另一类则直接选取小麦为主要原料，经由米曲霉制曲，并历经天然或保温发酵而制成[1]。小麦酱也属于面酱的一种，成品呈黑褐色的半固体状，含有多种还原糖、小分子多肽和氨基酸，具有一定的健康益处[2]。同时还富含多种有机酸以及易挥发性的呈香物质，味道鲜美，深受广大消费者的青睐与喜爱[3]。
近年来，随着仪器分析技术的持续革新，传统酱品的菌相分析、生产工艺优化以及挥发性化合物鉴定已得到广泛研究[4]。但小麦酱在市场上占有份额相对较少，目前还没有比较系统性的研究。小麦酱中的代谢物质以及风味成分是衡量小麦酱品质的重要指标，对小麦酱代谢物组成以及风味特性的研究有利于生产工艺的优化以及产品品质的精准调控[5]。非靶向代谢组学是分析小麦酱中代谢物质以及风味变化情况的有利工具，它具有选择性好、高灵敏度、高分辨率等优点[6]。孟鸳[7]利用顶空固相微萃取-气质联用-嗅闻技术对甜面酱在发酵过程中产生的挥发性风味物质进行分析鉴定，发现酯类是酱醅的主体挥发性成分。张玉玉等[8]利用气-质联用和气相色谱嗅闻结合的创新手段鉴定出小麦酱中的挥发性香气成分主要为酯类、烃类、杂环类化合物、酸类和醛类。但是目前的研究大多集中于探究挥发性代谢物与面酱之间的联系，缺乏对面酱中挥发性和非挥发性代谢产物的系统性研究。小麦酱属于面酱的一种，非挥发性代谢产物有助于小麦酱滋味以及功效成分的形成[9]，同时也是小麦酱香气形成的重要前体[10]。对麦酱中挥发性代谢物和非挥发性代谢物的系统研究有利于小麦酱质量控制及品质评价客观体系的建立。
小麦酱中代谢物形成以及风味物质的变化与微生物的活动密切相关。目前，小麦酱中已研究报道的有霉菌、酵母菌、细菌等，其中霉菌主要包括米曲霉、黑曲霉、根霉等[11]，酵母菌主要为假丝酵母、接合酵母等[12]，细菌则为芽孢杆菌[13]、乳酸菌等[14]。霉菌主要在小麦酱的发酵前期发挥作用，它可以分泌水解酶，进行氨基酸代谢以及次生此生代谢产物的合成，促进小麦酱风味物质的形成[15]。酵母菌主要在小麦酱发酵的第二个阶段起作用，在无氧条件下酵母菌通过糖酵解途径将葡萄糖逐步转化为乙醇，并与有机酸反应生成具有芳香特性的酯类物质，促进小麦酱特有香气的形成[16]。在小麦酱发酵过程中接种生香酵母还能提高小麦酱风味化合物的含量和种类[17]。细菌在小麦酱发酵过程中也至关重要，芽孢杆菌是小麦酱发酵过程中的优势菌种，能够促进发酵过程中脂肪酸[18]以及吡嗪类物质[19]的形成，塑造酱类产品的风味成分和营养成分。目前针对面酱发酵过程中微生物的分离鉴定已得到广泛研究，但是针对面酱成品中微生物的研究较少。小麦酱成品中的微生物群落比较稳定，是筛选酱类发酵曲种的优良来源，同时小麦酱中微生物的分离鉴定也为小麦酱的储藏保存提供了理论依据。
本研究选择了湖北两种特色传统小麦酱，从理化指标、非挥发代谢物、挥发性代谢物以及优势菌群鉴定四个层面对小麦酱进行系统分析。通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）鉴定挥发性和非挥发性代谢物，并借助多元统计分析工具（PCA、OPLS-DA）筛选鉴定差异代谢物以及分析代谢通路差异，探究代表性小麦酱的代谢产物差异。此外，对小麦酱进行理化指标测定以及优势菌群分离，以期为小麦酱的生产加工以及品质评价提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
小麦酱共2组，分别为BL组和SL组 分别取自湖北省麻城市两个不同厂家。各组对应的生物学重复均为6例，取自同一批次产品，共计12例样本。样品详细信息如表1所示。
表 1 小麦酱样品基本信息Table 1. Basic information of wheat sauce samples项目 BL SL 原料 小麦，食用盐 小麦，食用盐 品牌 东义洲农家麦酱 禧悠鲜麻城麦酱 发酵时间 180天 180天 发酵阶段 发酵后市售产品 发酵后市售产品 铬酸钾、氢氧化钠、硝酸银、碳酸钠、三氯乙酸、酪蛋白、L-酪氨酸、碘化钾、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、甲醛、福林溶液、乳酸、乳酸钠、硫酸、盐酸、甲酸铵、氯仿、饱和脂肪酸甲酯（FAMEs）、核糖醇、磷酸氢二钾、碳酸钙、氯化钠、葡萄糖 国药集团化学有限公司，甲醇、乙腈 色谱纯，赛默飞世尔科技公司，蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、琼脂粉 杭州微生物试剂有限公司。
ST5000 pH计 奥豪斯仪器有限公司；Spectrum紫外可见分光光度计 上海棱析仪器有限公司；全波长酶标仪 赛默飞科技有限公司；基因扩增仪 杭州朗基科学仪器有限公司；凝胶成像仪 上海勤翔科学仪器有限公司；Vanquish液相色谱仪、Q Exactive质谱仪 赛默飞科技有限公司；气相色谱 安捷伦科技有限公司；PEGASUS HT质谱仪 美国力可公司；JP-020超声仪 深圳市方奥微电子有限公司；JXFSTPRP-24研磨仪 上海净信科技有限公司；LNG-T98真空干燥仪 太仓市华美生化仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 理化指标测定
盐度的测定按照GB 5009.44-2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》[20]的规定检测；总酸含量和氨基态氮含量按照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》[21]的规定检测；还原糖含量的测定参照邵锦挺等[22]的方法进行检测；葡萄糖淀粉酶活力和蛋白酶活力按照GB 1886.174-2024《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》[23]的规定检测。
1.2.2 利用LC-MS/MS进行小麦酱非挥发性物质检测
1.2.2.1 样品前处理
称量小麦酱样本100 mg于2 mL离心管中，加入600 µL甲醇涡旋振荡30 s。研磨处理60 s后室温超声15 min；12000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液过0.22 µm膜后加入到检测瓶中，用于LC-MS/MS检测。
1.2.2.2 色谱条件
参考Zelena等[24]的方法。使用ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）色谱柱，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。正离子模式，流动相为0.1%甲酸水（A1）和0.1%甲酸乙腈（B1），梯度洗脱程序为：0~1 min，8% B1；1~8min，8%~98% B1；8~10 min，98% B1；10~10.1 min，98%~8% B1；10.1~12 min，8% B1。负离子模式，流动相为5 mmol/min甲酸铵水（A2）和乙腈（B2），梯度洗脱程序为：0~1 min，8% B2；1~8min，8%~98% B2；8~10 min，98% B2；10~10.1 min，98%~8% B2；10.1~12 min，8% B2。
1.2.2.3 质谱条件
参考Want等[25]的方法。Thermo Q Exactive质谱检测器，电喷雾离子源（ESI），正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压3.50 kV，负离子喷雾电压-2.50 kV，鞘气40 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率70000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 100~1000，并采用高能碰撞解离（HCD）进行二级裂解，碰撞能量为30 eV，二级分辨率为17500，采集信号前10离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的信息。
1.2.2.4 LC-MS/MS数据处理：采用XCMS（V3.12.0）软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，得到代谢物定量列表。通过与派森诺自建数据库和公共库中代谢物的保留时间、分子质量（误差<10
ppm）、二级碎裂谱图、碰撞能等信息进行匹配，对样本中的代谢物进行结构鉴定并定性。
1.2.3 利用GC-TOF-MS进行小麦酱非靶向代谢组学分析
1.2.3.1 样品前处理
取样本50 mg与500 µL提取液（甲醇：氯仿=3:1，含内标核糖醇）混合，研磨处理4 min后冰浴超声15 min；12000 r/min 4 ℃离心15 min；取100 µL上清液于1.5 mL EP管中，其中每个样本各取50 µL混合成QC样本；提取物真空浓缩干燥后加入80 µL甲氧胺盐（20 mg/mL），80 ℃孵育30 min；向每个样品中加入100 µL BSTFA进行衍生化处理，70 ℃孵育1.5 h；冷却至室温，向混合样本中加入5 µL FAMEs，用于标定代谢物保留指数，提高代谢物鉴定的准确性[26]。
1.2.3.2 GC-TOF-MS测定条件
气相色谱-飞行时间质谱联用仪配有Agilent DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样量1 µL，隔垫吹扫流速3 mL/min，柱流速1 mL/min，前进样口温度280 ℃，传输线温度280 ℃，离子源温度250 ℃，电离电压-70 eV，质量范围m/z：50~500；扫描速率12.5 spectra/s，溶剂延迟6.4 min。
1.2.3.3 GC-TOF-MS数据处理
使用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析，利用内标归一法（每个样本的每个物质原始峰面积除以对应内标峰面积）进行定量。使用LECO-Fiehn Rtx5数据库进行质谱匹配（相似度>500）对代谢物定性。
1.2.4 小麦酱中优势菌种的分离鉴定
将10 g小麦酱与90 mL无菌生理盐水（0.9%）混合，30 ℃孵育30 min，然后用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释。取各梯度100 μL稀释液分别均匀涂布于LB、MRS-CaCO3、YPD和PDA平板上，每个梯度做三个平行，LB和MRS-CaCO3平板于37 ℃恒温培养箱培养24 h，YPD和PDA平板于30 ℃恒温培养箱培养中培养48 h。观察菌落形态，挑选菌落形态不同的单菌落进行纯化，直至获得单菌落，将纯化得到的单菌落送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在NCBI网站的GenBank数据库进行同源性比对，利用MEGA（version 11.0）软件构建系统发育树，确定菌株的种属关系。
1.3 数据处理
使用SIMCA V16.0.2软件进行PCA和OPLS-DA分析，通过VIP值、P值进行差异代谢物筛选。当VIP>1和P<0.05时，认为代谢物分子具有统计学显著差异。通过R Pheatmap绘制差异代谢物相对定量层次聚类热图。使用R软件和KEGG数据库对差异代谢物进行注释、富集分析及代谢通路分析。通过Origin 2022b软件和派森诺基因云平台绘图。检测分析结果以平均值±标准偏差的形式表示。
2. 结果与分析
2.1 小麦酱理化指标分析
本研究选择湖北地方特色产品土家小麦酱作为研究对象，小麦酱经日晒自然发酵，均呈黑褐色，有酱香及酯香气味，鲜、咸、甜适口，呈半固态。
小麦酱的关键理化指标，尤其是氨基酸态氮含量，是评估其是否符合国家标准的决定要素[27]。根据前面所述方法对两种小麦酱样品的关键理化指标进行测定，实验结果如表2所示。根据GB 2718-2014《食品安全国家标准 酿造酱》[28]的规定，小麦酱的氨基酸态氮含量应大于等于0.3 g/100 g，本实验选用的两种品牌小麦酱均符合国家标准。朱楠楠[29]测定了东三省20种市售黄豆酱样品的盐度范围分布在7~15 g/100 g，贾云[30]发现不同季节蚕豆酱酱醅的盐度分布在7~13 g/100 g，相较于黄豆酱和蚕豆酱，湖北小麦酱的盐度含量低，适合开发低盐蘸料。在小麦酱发酵过程中，葡萄糖淀粉酶和蛋白酶协同作用，将淀粉和蛋白质分解为小分子风味物质，赋予小麦酱独特而丰富的风味特征[31]。在发酵前期酶活可达2000 U/g，随着发酵时间的延长，葡萄糖淀粉酶和蛋白酶的活力会逐渐降低，发酵后期仅达100 U/g左右[32]。在小麦酱储存过程中，酶活会进一步降低，在两种湖北小麦酱成品中检测到的葡萄糖淀粉酶活力和蛋白酶活力均比较低，仅为0.71 U/100 g和1.56 U/100 g。
表 2 2种小麦酱理化指标测定结果（n=3）Table 2. Measurement results of physical and chemical indicators of two kinds of wheat paste (n=3)理化指标 BL SL 盐度（g/100 g） 4.44±0.34 3.13±0.35 总酸含量（g/100 g） 1.49±0.03 1.73±0.16 氨基酸态氮含量（g/100 g） 0.44±0.12 0.40±0.06 还原糖含量（μg/100 g） 7.48±0.04 8.20±0.25 葡萄糖淀粉酶活力（U/mL） 44.94±0.18 11.89±0.33 蛋白酶活力（U/100 g） 0.71±0.04 1.56±0.01 2.2 基于LC-MS/MS分析小麦酱非挥发性物质
2.2.1 非挥发代谢物鉴定
LC-MS/MS结果显示，两种小麦酱共鉴定出236种代谢物，其化学分类及数量占比如图1所示。小麦酱中代谢物种类较多的物质是有机酸及其衍生物（53种）、脂肪酰（34种）、苯及其取代衍生物（24种）、有机氮化合物（13种）、吲哚及其衍生物（10种）、孕烯醇酮脂（10种）、类固醇和类固醇衍生物（10种）、有机氧化合物（8种）以及酚类（8种）。黄明泉等[33]利用双柱定性法分离鉴定出甜面酱中有37种非挥发性有机酸，它们不仅可以作为酸味剂或增味剂改善小麦酱的口感，还可以作为抗氧化剂、防腐剂保证小麦酱的品质。
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图 1 小麦酱中非挥发代谢物数量及分类图Figure 1. Quantity and classification chart of non-volatile metabolites in wheat sauce2.2.2 非挥发性代谢物的多元统计分析
PCA能够有效揭示不同组别样品之间的总体差异性，并量化同一组内各样品之间的变异水平[34]。对两种不同的小麦酱样品进行PCA分析，如图2所示，两种小麦酱样品之间的距离较远，能够明显的区分开，说明两种小麦酱的非挥发性代谢物有一定的差异。SL组的6个平行样品之间比较聚集，而BL组的六个样品之间有一定的离散性，这可能是因为组内样品间的小麦酱个体差异导致的。
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图 2 两种小麦酱非挥发代谢物PCA分析Figure 2. PCA analysis of non-volatile metabolites in two types of wheat saucesOPLS-DA能够在保持模型预测精度的同时，显著简化模型结构并提升其解释力，最大程度地查看组间差异而无需牺牲模型的预测效能[35]。BL和SL两种小麦酱的OPLS-DA得分图和置换检验如图3所示。如图3a所示，BL和SL样品之间的非挥发性代谢物存在明显差异，这与PCA的结果一致。OPLS-DA模型中R2X和R2Y分别表示模型对自变量和因变量的解释率，Q2表示模型的可预测度[36]。由图3b可知，R2值为1，Q2值为0.982，说明模型的拟合准确性较好，具备稳定分析的能力，能够准确全面地分析小麦酱的代谢物信息。
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图 3 两种小麦酱非挥发代谢物OPLS-DA分析注：（a）OPLS-DA得分图；（b）OPLS-DA 置换检验Figure 3. OPLS-DA analysis of non-volatile metabolites in two types of wheat sauces2.2.3 非挥发性差异代谢物筛选
在OPLS-DA模型的基础上，设定VIP>1、P值<0.05作为显著性差异代谢物的筛选标准，结果如图4所示。两种小麦酱共筛选到195种差异代谢物，其中BL vs SL显著上调代谢物99种，显著下调代谢物96种，SL vs BL显著下调代谢物96种，显著上调代谢物99种。
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图 4 两种小麦酱非挥发差异代谢物筛选注：（a）非挥发差异代谢物筛选火山图；（b）非挥发差异代谢物筛选柱形图Figure 4. Screening of non-volatile differential metabolites in two types of wheat sauces2.2.4 非挥发性差异代谢物分析
通过聚类分析对195种非挥发性差异代谢物的相对含量进行分析，图S1（附图S1，详见本刊官网http://www.spgykj.com/_文章的网络版）直观地展现了非挥发性差异代谢物在两种小麦酱中的丰度分布。其中有机酸及其衍生物48种，脂肪酰25种，苯及其取代衍生物14种，有机氧化合物8种，吲哚及其衍生物7种，有机氮化合物7种，孕烯醇酮脂7种以及其余化合物79种。SL小麦酱中苯乙醇、诺特酮和紫苏醇等可食用香精香料物质丰度较高，BL小麦酱中D-苯丙氨酸、L-丝氨酸、色氨酸和L-瓜氨酸等物质丰度较高，可作为小麦酱中的呈味物质，可见小麦酱滋味丰富。
基于随机森林机器学习算法，对非挥发性差异代谢物进行进一步分析，根据重复特征消除算法筛选出最重要的非挥发性差异代谢物并计算其重要性分数（importance），结果如图5a所示。排在前十的显著差异代谢物是5-羟基吲哚-3-乙酸、N,N-二甲基-D-赤型鞘氨醇、二氢咖啡酸、L-瓜氨酸、莽草酸、十六醇、玉米赤霉烯酮、3-（2-羟苯基）丙酸、表茉莉酸、L-谷氨酸。其中，5-羟基吲哚-3-乙酸[37]是色氨酸的分解产物，常作为类癌瘤的诊断和监测标记物。二氢咖啡酸是一种苯丙酸衍生物，具有抗氧化和抗炎活性，对人体肝脏具有保护作用[38]。L-瓜氨酸和L-谷氨酸都属于氨基酸类，其中谷氨酸可以增强小麦酱的风味，瓜氨酸具有提高人体肌肉强度和增强免疫力的功效[39]。不同小麦酱的氨基酸含量差异大，这与黄明泉等[40]的实验结果一致。对差异物质进行ROC分析，并计算其曲线下面积（AUC），由图5b可以看出AUC在0.9以上，表明分类效果具有较高的准确性。
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图 5 两种小麦酱非挥发差异代谢物分析注：（a）非挥发差异代谢物热棒图；（b）ROC分析Figure 5. Analysis of non-volatile differential metabolites in two types of wheat sauces2.2.5 非挥发差异代谢物KEGG富集分析
KEGG通路富集分析是以特定KEGG代谢或信号传导途径为分析单元，揭示并鉴定出哪些关键的代谢与信号传导通路在特定条件下受到了显著的生物学扰动或调节的方法[41]。结果如图6所示，富集最显著的途径有氨基酸的生物合成、癌症的中心碳代谢和亚油酸代谢等，这些通路主要与代谢、人类疾病、有机体系统、基因信息加工、环境信息加工以及细胞加工有关。此外，在前文提到的显著差异代谢物中，5-羟基吲哚-3-乙酸、二氢咖啡酸、L-瓜氨酸、莽草酸和3-（2-羟苯基）丙酸均参与了氨基酸代谢通路，由此可见，氨基酸的合成与分解是影响小麦酱理化特性以及滋味品质的重要因素。
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图 6 两种小麦酱非挥发差异代谢物KEGG通路分析及富集分析注：（a）非挥发差异代谢物KEGG通路富集分析；（b）非挥发差异代谢物KEGG通路富集气泡图Figure 6. KEGG pathway analysis and enrichment analysis of two non-volatile differential metabolites in wheat sauce2.3 基于GC-TOF-MS非靶向代谢组学分析小麦酱挥发性风味物质
2.3.1 挥发性代谢物鉴定
GC-TOF-MS挥发性代谢物定性鉴定结果如图7和表S1所示（附表S1，详见本刊官网http://www.spgykj.com/_文章的网络版），两种小麦酱共鉴定出挥发性代谢物178种，主要包括有机酸及其衍生物（46种），有机氧化合物（45种），脂质和类脂质分子（20种），苯甲酸（13种），有机杂环化合物（11种），有机氮化合物（6种），核苷、核苷酸及其类似物（4种），苯丙烷和聚酮类化合物（2种），均质非金属化合物（1种）。这与张玉玉等[42]和金华勇等[43]的结果相一致，小麦酱中最多的挥发性代谢物是醛类、酸类、酯类以及脂质，它们共同赋予小麦酱独特的风味成分。
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图 7 两种小麦酱挥发性风味物质检测结果Figure 7. Detection results of volatile flavor compounds in two types of wheat sauces2.3.2 挥发性代谢物多元统计分析
对BL和SL两种小麦酱的挥发性代谢物进行PCA分析，结果如图8所示，两种不同品牌的小麦酱分别分布在两个象限，说明品牌对小麦酱的挥发性代谢物会有一定的影响。SL组6个平行样品之间比较聚集，而BL组的6个样品之间比较松散，这可能是由于样品之间的差异导致的。可以看到，所有样本点基本处于95%置信区间内。
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图 8 两种小麦酱挥发性代谢物PCA得分图Figure 8. PCA score chart of two volatile metabolites in wheat sauce由于在使用PCA模型进行分析时，相关变量的交互作用会导致差异变量在主成分中呈现更为分散的模式，不利于发现组间的真实差异和筛选有效的差异代谢物[44]。所以我们采用OPLS-DA对结果进行进一步分析，结果如图9所示。由图9a可以看出，不同品牌的小麦酱分布在不同的象限，与PCA结果一致。SL vs BL的置换检验结果显示R2为0.998，Q2为0.984，均接近于1，说明模型可以很好地解释不同品牌的小麦酱挥发性代谢物差异。经过200次置换检验，R2大于Q2且Q2的起点为负数，说明OPLS-DA模型可靠，有效排除了模型过拟合的可能性。
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图 9 两种小麦酱挥发性代谢物OPLS-DA得分图和置换检验图注：（a）挥发性代谢物OPLS-DA得分图；（b）挥发性代谢物OPLS-DA置换检验图Figure 9. Score chart and displacement test chart of two volatile metabolites OPLS-DA in wheat sauce2.3.3 挥发性差异代谢物筛选
按照同样的筛选标准筛选挥发性差异代谢物，筛选结果如图10所示。BL和SL两种小麦酱共有106种挥发性差异代谢物，其中SL vs BL的上调化合物102种，如脯氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、木糖等在BL组中含量丰富，下调化合物4种，油酸、花生酸、尿酸和马来酸在SL组中含量丰富。
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图 10 两种小麦酱挥发性差异代谢物筛选Figure 10. Screening of volatile differential metabolites in two types of wheat sauces2.3.4 挥发性差异代谢物分析
通过聚类分析对106种挥发性差异代谢物的相对含量进行分析，见图S2（附图S2，详见本刊官网http://www.spgykj.com/_文章的网络版），其中红色代表代谢物在所在组含量高表达，蓝色代表代谢物在所在组含量低表达。其中有机酸及其衍生物差异代谢物最多（37种），其次为有机氧化合物（31种），脂质和类脂分子（13种），苯环型化合物（8种），有机杂环化合物（7种），有机氮化合物（5种），核苷、核苷酸及其类似物（2种），苯丙烷类和聚酮类（2种），均质非金属化合物（1种）。其中BL小麦酱中代谢物含量丰富，SL小麦酱中油酸、花生酸、尿酸和马来酸等物质的含量较高。
对每一组对比，计算挥发性差异代谢物定量值对应的比值，并做对数转换，结果如图11所示，差异最大的挥发性差异代谢物主要是有机酸及其衍生物和脂质及类脂分子。其中，L-高丝氨酸和环亮氨酸都属于氨基酸，L-高丝氨酸是合成必需氨基酸的重要前体[45]，环亮氨酸可被用作营养补充剂和膳食补充剂。小麦酱中的乳酸菌和酵母菌在无氧条件下发酵可产生乳酸，乳酸和草酸协同作用可赋予小麦酱鲜味和酸味[46]。油酸和花生四烯酸都属于脂质及类脂分子，它们能够调节人体血脂水平，降低胆固醇，预防心血管疾病及自身免疫病的发生[47]。曾灿伟[48]发现在甜面酱发酵过程中，温度与湿度的调控会影响面酱的挥发性成分。本研究中两种品牌小麦酱挥发性差异代谢物的差异可能是由于制作工艺、储藏条件等的不同。
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图 11 两种小麦酱挥发性差异代谢物分析注：*代表显著性，其中* 0.01<P<0.05，** 0.001<P<0.01，*** P<0.001Figure 11. Analysis of volatile differential metabolites in two types of wheat sauces2.3.5 挥发性差异代谢物KEGG分析
基于KEGG数据库对挥发性差异代谢物进行通路分析和富集分析，从图12可以看到，约93%的挥发性差异代谢物主要注释和富集到代谢通路。其中有多个代谢物同时注释到多个代谢通路，比如L-高丝氨酸同时参与了半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及赖氨酸生物合成两条通路。这种一个代谢物横跨多条代谢通路的现象，表明映射出的差异代谢物对整体代谢网络具有广泛的影响。
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图 12 挥发性差异代谢物KEGG通路分类及富集分析注：（a）挥发性差异代谢物KEGG通路富集分析；（b）挥发性差异代谢物KEGG通路富集气泡图Figure 12. Classification and enrichment analysis of KEGG pathway of volatile differential metabolites为了进一步分析生产厂家对小麦酱代谢物质的变化及其所涉通路的调控机制，对差异代谢物所在通路进行整合分析并进行进一步筛选，以期找到影响差异代谢物的关键通路[49]，结果如图13所示。差异代谢物对其所在通路影响较大的目标通路为亚油酸代谢，β-丙氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢和泛酸及辅酶合成等。可见亚油酸以及氨基酸的代谢变化是造成BL和SL两种品牌小麦酱代谢物差异的主要因素。左勇等[2]通过主成分分析发现甜面酱保温发酵过程中的主要挥发性风味物质有棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯和1-亚油酸单甘油酯等。金华勇等[43]通过顶空固相微萃取气质联用技术检测出3种甜面酱共有的香气成分是棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯和油酸乙酯等，而亚油酸则是生成这些风味化合物的重要前体物质，对于小麦酱的香气形成至关重要。进一步研究发现参与亚油酸代谢通路的化合物有亚油酸、18碳二烯酸和磷脂酰胆碱，其中18碳二烯酸和磷脂酰胆碱[50]都是亚油酸的代谢产物，具有降低胆固醇水平、提升人体免疫力以及预防心血管疾病的功效。
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图 13 挥发性差异代谢物代谢通路分析Figure 13. Analysis of metabolic pathways of volatile differential metabolites2.4 两种小麦酱中优势菌群的分离
两种小麦酱中优势菌群的鉴定结果以及菌落形态特征分别如图14、图15和表3所示。其中B1、B2、B3分别与Bacillus amyloliques、Priestia megaterium、Bacillus subtilis属于同一分支，相似性均为98%，分别鉴定为解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。Y1与Starmerella etchellsii属于同一分支，相似性为97%，属于非模式酵母。M1与Aspergillus oryzae属于同一分支，相似性为96%，鉴定为米曲霉。
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图 14 优势菌群系统发育树注：（a）细菌；（b）酵母；（c）霉菌；Figure 14. Phylogenetic tree of dominant microbial communities![]()
图 15 霉菌菌落形态及显微形态注：（a）霉菌菌落正面；（b）霉菌菌落背面；（c）霉菌显微（×200）形态Figure 15. Morphology and microscopic morphology of fungal colonies表 3 两种小麦酱优势菌群分离结果Table 3. Isolation results of two dominant microbial communities in wheat sauce分类 编号 分子生物学鉴定 菌落形态 个体形态 小麦酱种类 细菌 B1 Bacillus amyloliques 表面有褶皱，淡黄色，圆形，边缘不规则，
直径约2~5 mm，无渗出液，无色素生成好氧或兼性厌氧，G+，杆状，有芽孢，较大较多，中生。 BL、SL B2 Priestia megaterium 表面光滑，淡黄色，圆形，边缘规则，，
直径约1~3 mm，无渗出液，无色素生成好氧，G+，粗大杆状，单个或短链排列，有芽孢。 BL B3 Bacillus subtilis 表面光滑，灰白色，圆形，边缘光滑，
直径约2~5 mm，无渗出液，无色素生成好氧或兼性厌氧，G+，短杆状，有芽孢，较大较多。 BL、SL 酵母 Y1 Starmerella etchellsii 表面光滑，在YPD培养基上呈现白色圆形
菌落，边缘规则，不透明卵圆形，耐盐18% BL 霉菌 M1 Aspergillus oryzae 质地蓬松，初白色、黄色，后变为淡绿褐色，
菌落正反面颜色一致，孢子呈黄色分生孢子梗顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面有小梗，
小梗上长有球形分生孢子。孢子2层排列，成球形或近球形BL、SL 两种小麦酱中的优势细菌属均为芽孢杆菌属，这与沈芳等[13]和Nam等[51]的实验结果一致，这是由于小麦含有丰富的淀粉和蛋白质，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌可以代谢小麦中的淀粉和蛋白质等有机物质，产生丰富的氨基酸以及多种芳香化合物，这些氨基酸和化合物经过复杂的生化反应，可以形成小麦酱特有的香味。在两种小麦酱中鉴定出丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸等多种氨基酸，赋予小麦酱以甜味、酸味、鲜味及苦味，形成小麦酱的特有风味。在BL小麦酱中分出Starmerella etchellsii，它是一种普遍存在于面酱中的真菌，Feng等[52]从酱油中分离出Candida etchellsii，发现它可以生成有机酸、氨基酸以及挥发性风味物质。Wang[53]等发现Starmerella etchellsii可以提高酱油中2,6-二甲基吡嗪、甲基吡嗪和苯乙醛的含量。GC-TOF-MS鉴定结果（图S2）（附图S2，详见本刊官网http://www.spgykj.com/_文章的网络版）显示BL组中的苯乙醛含量远高于SL组，这可能与BL小麦酱中Starmerella etchellsii的代谢活动有关。从两种小麦酱中都分出了米曲霉，这是因为小麦酱生产的关键步骤就是通过曲霉进行微生物发酵，它能够分泌多种水解酶，进行氨基酸代谢以及多种次生代谢产物的合成[15]。庞惟俏等[54]发现曲霉可以通过分泌酶降解代谢产物，提高大豆酱的总酸含量以及淀粉酶和蛋白酶活性。贾云等[32]通过体外模拟发酵也验证了A.oryzae是传统豆瓣酱中分泌蛋白酶和葡萄糖淀粉酶的主要微生物。米曲霉菌落形态以及显微形态如图15所示。在小麦酱发酵过程中，各种微生物协同作用，赋予产品以丰富的营养以及多样的风味[55]。
3. 结论
本研究从理化指标、非挥发和挥发性代谢产物分析鉴定以及小麦酱成品菌相分析四个层面上对湖北两种特色传统小麦酱进行了系统性的分析。首先基于国标检测方法对小麦酱的关键理化指标进行测定，结果显示两种小麦酱均符合GB 2718-2014《食品安全国家标准 酿造酱》的规定，但盐度、葡萄糖淀粉酶以及蛋白酶活力较低，这可能与小麦酱成品中微生物数量较少有关。通过LC-MS/MS和GC-TOF-MS对两种小麦酱中的挥发性和非挥发性代谢物进行鉴定，其中LC-MS/MS共鉴定到非挥发性代谢物236种，成功筛选到非挥发性差异代谢物195种，这些非挥发性差异代谢物注释和富集到的最显著KEGG通路为氨基酸的生物合成。GC-TOF-MS共鉴定出挥发性代谢物178种，成功筛选到挥发性差异代谢物106种，这些挥发性差异代谢物注释和富集到的最显著KEGG通路为代谢通路，其中影响差异代谢物的关键通路为亚油酸代谢通路。最后，通过分子生物学鉴定以及菌落形态观察对小麦酱中优势菌群进行分离，发现小麦酱中的优势菌群主要为芽孢杆菌属、曲霉属以及非传统酵母。综上，本研究通过对小麦酱的理化特性、代谢物组成以及菌相构成进行系统分析，为小麦酱的生产工艺以及储藏条件优化提供了理论参考。后期将进一步探究微生物群落与小麦酱代谢物变化以及理化指标之间的联系，为小麦酱的品质控制提供数据支撑。
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图 1 小麦酱中非挥发代谢物数量及分类图
Figure 1. Quantity and classification chart of non-volatile metabolites in wheat sauce
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图 2 两种小麦酱非挥发代谢物PCA分析
Figure 2. PCA analysis of non-volatile metabolites in two types of wheat sauces
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图 3 两种小麦酱非挥发代谢物OPLS-DA分析
注：（a）OPLS-DA得分图；（b）OPLS-DA 置换检验
Figure 3. OPLS-DA analysis of non-volatile metabolites in two types of wheat sauces
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图 4 两种小麦酱非挥发差异代谢物筛选
注：（a）非挥发差异代谢物筛选火山图；（b）非挥发差异代谢物筛选柱形图
Figure 4. Screening of non-volatile differential metabolites in two types of wheat sauces
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图 5 两种小麦酱非挥发差异代谢物分析
注：（a）非挥发差异代谢物热棒图；（b）ROC分析
Figure 5. Analysis of non-volatile differential metabolites in two types of wheat sauces
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图 6 两种小麦酱非挥发差异代谢物KEGG通路分析及富集分析
注：（a）非挥发差异代谢物KEGG通路富集分析；（b）非挥发差异代谢物KEGG通路富集气泡图
Figure 6. KEGG pathway analysis and enrichment analysis of two non-volatile differential metabolites in wheat sauce
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图 7 两种小麦酱挥发性风味物质检测结果
Figure 7. Detection results of volatile flavor compounds in two types of wheat sauces
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图 8 两种小麦酱挥发性代谢物PCA得分图
Figure 8. PCA score chart of two volatile metabolites in wheat sauce
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图 9 两种小麦酱挥发性代谢物OPLS-DA得分图和置换检验图
注：（a）挥发性代谢物OPLS-DA得分图；（b）挥发性代谢物OPLS-DA置换检验图
Figure 9. Score chart and displacement test chart of two volatile metabolites OPLS-DA in wheat sauce
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图 10 两种小麦酱挥发性差异代谢物筛选
Figure 10. Screening of volatile differential metabolites in two types of wheat sauces
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图 11 两种小麦酱挥发性差异代谢物分析
注：*代表显著性，其中* 0.01<P<0.05，** 0.001<P<0.01，*** P<0.001
Figure 11. Analysis of volatile differential metabolites in two types of wheat sauces
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图 12 挥发性差异代谢物KEGG通路分类及富集分析
注：（a）挥发性差异代谢物KEGG通路富集分析；（b）挥发性差异代谢物KEGG通路富集气泡图
Figure 12. Classification and enrichment analysis of KEGG pathway of volatile differential metabolites
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图 13 挥发性差异代谢物代谢通路分析
Figure 13. Analysis of metabolic pathways of volatile differential metabolites
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图 14 优势菌群系统发育树
注：（a）细菌；（b）酵母；（c）霉菌；
Figure 14. Phylogenetic tree of dominant microbial communities
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图 15 霉菌菌落形态及显微形态
注：（a）霉菌菌落正面；（b）霉菌菌落背面；（c）霉菌显微（×200）形态
Figure 15. Morphology and microscopic morphology of fungal colonies
表 1 小麦酱样品基本信息
Table 1 Basic information of wheat sauce samples
项目 BL SL 原料 小麦，食用盐 小麦，食用盐 品牌 东义洲农家麦酱 禧悠鲜麻城麦酱 发酵时间 180天 180天 发酵阶段 发酵后市售产品 发酵后市售产品 
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表 2 2种小麦酱理化指标测定结果（n=3）
Table 2 Measurement results of physical and chemical indicators of two kinds of wheat paste (n=3)
理化指标 BL SL 盐度（g/100 g） 4.44±0.34 3.13±0.35 总酸含量（g/100 g） 1.49±0.03 1.73±0.16 氨基酸态氮含量（g/100 g） 0.44±0.12 0.40±0.06 还原糖含量（μg/100 g） 7.48±0.04 8.20±0.25 葡萄糖淀粉酶活力（U/mL） 44.94±0.18 11.89±0.33 蛋白酶活力（U/100 g） 0.71±0.04 1.56±0.01
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表 3 两种小麦酱优势菌群分离结果
Table 3 Isolation results of two dominant microbial communities in wheat sauce
分类 编号 分子生物学鉴定 菌落形态 个体形态 小麦酱种类 细菌 B1 Bacillus amyloliques 表面有褶皱，淡黄色，圆形，边缘不规则，
直径约2~5 mm，无渗出液，无色素生成好氧或兼性厌氧，G+，杆状，有芽孢，较大较多，中生。 BL、SL B2 Priestia megaterium 表面光滑，淡黄色，圆形，边缘规则，，
直径约1~3 mm，无渗出液，无色素生成好氧，G+，粗大杆状，单个或短链排列，有芽孢。 BL B3 Bacillus subtilis 表面光滑，灰白色，圆形，边缘光滑，
直径约2~5 mm，无渗出液，无色素生成好氧或兼性厌氧，G+，短杆状，有芽孢，较大较多。 BL、SL 酵母 Y1 Starmerella etchellsii 表面光滑，在YPD培养基上呈现白色圆形
菌落，边缘规则，不透明卵圆形，耐盐18% BL 霉菌 M1 Aspergillus oryzae 质地蓬松，初白色、黄色，后变为淡绿褐色，
菌落正反面颜色一致，孢子呈黄色分生孢子梗顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面有小梗，
小梗上长有球形分生孢子。孢子2层排列，成球形或近球形BL、SL
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