Antibacterial Effect of Solenocera crassicornis Processing By-products Fermentation on Specific Spoilage Organisms in the Late Stage of Squid Refrigeration
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摘要: 目的：探究中华管鞭虾加工副产物发酵液（Solenocera crassicornis processing by-products fermentation，SPBF）对冷藏鱿鱼末期优势腐败菌（Specific spoilage organisms in the late stage of squid refrigeration，SR-SSOs）的抑菌作用。方法：采用乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum）发酵中华管鞭虾（Solenocera crassicornis）加工副产物（虾头和虾壳）制备SPBF，分析SPBF中肽段分子量分布，测定SPBF对SR-SSOs的抑菌作用及菌膜渗漏和损伤情况，采用16S rRNA测序技术揭示SPBF对SR-SSOs菌群多样性影响及抑菌作用途径。结果：SPBF中肽组分> 5000 Da，5000-1000 Da，1000-500 Da和< 500 Da的相对百分含量分别为34.61%、1.57%、5.63%和58.19%，SPBF对SR-SSOs的抑菌圈直径达到14.3±0.8 mm，最小抑菌浓度为1.89 mg/mL（以肽浓度计）。SR-SSOs经SPBF作用12~48 h未发生明显胞内遗传物质渗漏，但是SPBF中肽浓度降低，且随着作用时间的延长肽浓度进一步下降。SPBF作用12 h后SR-SSOs中大量菌体表面变得不规则、出现凹陷，但菌膜结构未发生完全裂解。SR-SSOs中相对丰度较高菌为热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）（84.68%）和麦芽芳香肉杆菌LMA28（Carnobacterium maltaromaticum LMA28）（5.20%），经SPBF作用12 h后麦芽芳香肉杆菌LMA28（16.63%）、广布肉毒杆菌（Carnobacterium_divergens）（5.00%）和隆德假单胞菌（Pseudomonas_lundensis）（3.55%）为处理组的优势菌。LEfSe线性判别分析（LDA）表明热死环丝菌、嗜冷杆菌（Psychrobacter）、隆德假单胞菌、麦芽芳香肉杆菌LMA28和广布肉毒杆菌能显著区分SPBF处理组和SR-SSOs菌群组成。与SR-SSOs相比，SPBF作用12 h显著降低了菌的碳水化合物代谢、转录、核苷酸代谢以及复制与修复途径表达水平，促进膜转运以及能量代谢等途径水平显著提高。结论：SPBF通过非膜损伤方式抑制SR-SSOs，特别是热死环丝菌，推测与SPBF中有效抗菌肽通过膜转运进入SR-SSOs胞内，抑制碳水化合物代谢和遗传物质生成有关。
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关键词:
- 中华管鞭虾加工副产物 /
- 乳酸杆菌发酵 /
- 冷藏鱿鱼末期优势腐败菌 /
- 非膜损伤 /
- 抑菌作用
Abstract: Objective: To explore the antibacterial activity of Solenocera crassicornis processing by-products fermentation (SPBF) on specific spoilage organisms in the late stage of squid refrigeration (SR-SSOs). Method: Solenocera crassicornis by-products including shrimp heads and shells were fermented with Lactobacillus fermentum to prepare SPBF. The molecular weight distribution of peptidic fractions in SPBF was analyzed. The antibacterial effect of SPBF against SR-SSOs, and membrane leakage and damage of SR-SSOs treated by SPBF were determined. Furthermore, 16S rRNA sequencing technology was used to reveal the impact of SPBF on the microbiota diversity of SR-SSOs, as well as the pathways of antibacterial action of SPBF were predicted. Results: The relative percentages of peptidic fractions >5000 Da, 5000~1000 Da, 1000~500 Da, and <500 Da in SPBF were 34.61%, 1.57%, 5.63%, and 58.19%, respectively. The diameter of the inhibition zone of SPBF against SR-SSOs reached 14.3±0.8 mm, and the minimum inhibitory concentration was 1.89 mg/mL (measured by peptide concentration). SR-SSOs did not show significant leakage of intracellular genetic material after 12 to 48 hours of SPBF treatment. However, the peptide concentration of SPBF decreased, and further reduced with action time increased. After 12 hours of SPBF treatment, a large number of bacterial surfaces of SR-SSOs became irregular and concave. However, the membrane structure of SR-SSOs did not undergo complete lysis. The relatively dominant strains in SR-SSOs were Brochothrix thermosphacta (84.68%) and Carnobacterium maltaromaticum LMA28 (5.20%). After 12 hours of SPBF treatment, the dominant species in SR-SSOs were Carnobacterium maltaromaticum LMA28 (16.63%), Carnobacterium divergens (5.00%), and Pseudomonas lundensis (3.55%). LEfSe linear discriminant analysis (LDA) revealed that the strains of Brochothrix thermosphacta, Psychrobacter, Pseudomonas lundensis, Carnobacterium maltaromaticum LMA28, and Carnobacterium divergens could significantly distinguish the microbiota composition between SPBF treatment group and SR-SSOs. Compared with SR-SSOs, SPBF significantly reduced the expression levels of carbohydrate metabolism, transcription, nucleotide metabolism, as well as replication and repair pathways in the bacteria after 12 hours of action, while significantly increasing the levels of pathways involved in membrane transport and energy metabolism. Conclusions: SPBF can inhibit SR-SSOs, especially Brochothrix thermosphacta, through a non-membrane damage mechanism, which may be speculated to be related to the effective antibacterial peptides in SPBF being transported into SR-SSOs through membrane, thereby inhibiting carbohydrate metabolism and genetic material production. -
鱿鱼营养丰富、味道鲜美，富含人体所需的必需氨基酸、牛磺酸、DHA、EPA等[1]，但是鱿鱼水分含量一般超过80%，因此在冷藏过程中极易发生腐败变质[2−3]。水产品腐败主要与致腐潜力（产生异味的能力）和致腐活性（产生代谢物的能力）强的细菌大量增殖有关，这些在菌群数量上占有绝对优势的致腐菌被称作优势腐败菌（Specific spoilage organism，SSO）[4−5]，冷藏水产品发生腐败变质一般与贮藏末期一些耐低温SSOs快速生长有关 [6]，如：沈萍[6]报道了北太平洋鱿鱼（Todarodes pacificus）冷藏（5 ℃）末期SSO为假单胞菌。PARLAPANI等[7]研究表明嗜冷杆菌属（Psychrobacter）是解冻墨鱼（Sepia officinalis）在2 ℃贮藏末期的SSO。陈家盛[8]研究发现冰鲜鱿鱼在贮藏末期SSOs包括考克氏菌属（Kocuria）、巨大球菌属（Macrococcus）、嗜冷杆菌属、肉食杆菌属（Carnobacterium）和环丝菌属（Brochothrix）。水产品在冷藏过程中，SSO会逐渐占据主导地位，最终水产品彻底腐败变质，失去食用及经济价值[9]。因此，抑制SSO引起冷藏鱿鱼腐败变质，是鱿鱼冷藏保鲜重点研究领域之一。
乳酸菌发酵是传统发酵食品常用一种制备方法，乳酸菌可通过自身分泌的蛋白酶水解植物源和动物源蛋白质，释放隐藏在蛋白质结构内的生物活性肽，将高分子量蛋白质转化为易于吸收的低分子量生物活性肽[10−12]。研究表明，乳酸菌发酵产物常常具有抗菌活性，如：洋麻籽（Hibiscus cannabinus L.）的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵产物对大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及李斯特菌（Listeria monocytogenes）有较强的抑菌作用[13]。从苦豆（Parkia speciosa）及绵羊奶的乳杆菌发酵产物鉴定出对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）等有抑菌作用的低分子量抗菌肽[14−15]。乳酸菌发酵主要以谷类、水果蔬菜、乳类以及鱼类和海鲜副产品为原料，其中探究较多的包括植物类原料和乳类[16]，而以虾加工副产物为原料，通过乳酸菌发酵制备发酵产物抑制水产品腐败菌的研究还少见报道。
中华管鞭虾（Solenocera crassicornis）又称红虾，主要用作虾仁加工，全虾利用率不到50%，在虾仁加工过程中产生大量虾头、虾壳等副产物[17−18]。前期研究发现中华管鞭虾加工副产物接种发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）不但能有效脱除虾壳蛋白质和钙，提取工业级甲壳素，而且回收完虾壳甲壳素得到的中华管鞭虾加工副产物发酵液（Solenocera crassicornis processing by-products fermentation，SPBF）有令人愉悦的风味性[19]。但是，SPBF是否具有其他生物活性还需要进一步研究。本研究以冷藏鱿鱼末期优势腐败菌（Specific spoilage organisms in the late stage of squid refrigeration，SR-SSOs）为研究对象，分析SPBF对SR-SSOs的抑菌作用，基于16S rRNA测序技术揭示SPBF对SR-SSOs的菌群组成和代谢途径影响，旨在为抗菌型水产品加工副产物发酵液用于保鲜鱿鱼研究提供技术依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
冰鲜北太平洋鱿鱼、中华管鞭虾 舟山老碶菜场，冰袋保藏运至实验室；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum GIM 1.1796） 广东省微生物菌种保藏中心；营养琼脂、营养肉汤培养基（生物试剂） 青岛高科园海博生物技术有限公司；牛血清蛋白（纯度≥98.0%） 美国Amresco公司；维生素B12（纯度≥95.0%） 国药集团化学试剂有限公司；氧化型谷胱甘肽（纯度≥98.0%） 广州锐博生物技术有限公司；还原型谷胱甘肽（纯度≥98.0%） 碧云天生物技术有限公司。
DHP-9052电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；PHSJ-3FpH计 上海仪电科学仪器有限公司；721型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；TU-1810PC紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Heraeus Multifuge X1R高速冷冻离心机 湖南湘仪仪器有限公司；DSX-280KB24手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；VD-650桌上式洁净工作台 上海力辰邦西仪器科技有限公司；HPLC1260 型高效液相色谱系统、PL aquagel-OH 30（300 mm×75 mm，8 μm）色谱柱 美国安捷伦科技有限公司；SM-800酶标仪 上海永创医疗器械有限公司；ZQZY-88BV振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；SU8020场发射扫描电子显微镜 日本日立公司；ABI GeneAmp® 9700型PCR仪 美国ABI公司；NovaSeq 6000测序仪 美国Illumina公司；TM-767型搅拌机 中山市海盘电器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 SPBF制备
按照LI等[19]的方法制备SPBF，并稍作修改。将液体石蜡保存的L. fermentum转接到灭菌MRS培养基（酪蛋白胨5 g、酵母粉2.5 g、乙酸钠2.5 g、吐温80 0.5 g、七水硫酸镁0.1 g、牛肉膏5 g、葡萄糖10.0 g、柠檬酸二铵1.0 g、磷酸氢二钾1.0 g、无水硫酸锰0.0136 g，去离子水500 mL，pH调至6.80。121 ℃灭菌15 min），37 ℃活化24 h，吸取100 μL菌悬液至10 mL新鲜灭菌MRS培养基，37 ℃培养至对数生长期（630 nm吸光度0.15左右），然后按照8%（v/v）接种量将活化好的菌悬液加到新鲜灭菌MRS培养基，37 ℃培养12 h，得到发酵用种子液（630 nm吸光度1.50左右）。
手工剥离中华管鞭虾的虾头和虾壳，用搅拌机捣碎至糜状（发酵底物）。取发酵底物5.0 g到250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌15 min，冷却，加入25 mL种子液和8.6%灭菌葡萄糖溶液10 mL，混合物在45 ℃下发酵95 h（摇床转速100 r/min），然后发酵混合物经4000×g离心20 min，收集上清，即为SPBF，−20 ℃冻存，备用。
1.2.2 SPBF肽浓度和肽段分子量分布
参照GOODNO等[20]邻苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）方法，稍作修改测定SPBF的肽浓度，具体如下：75 μL样品与3 mL的OPA溶液混合，室温反应4 min，用去离子水代替样品为调零管，测定340 nm处吸光度。以氧化谷胱甘肽为肽标准品，相同条件下测定0.3~0.8 mg/mL氧化谷胱甘肽在340 nm处吸光度，以肽浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），经线性拟合得到肽标准曲线方程为y=0.3659x+0.0002（R²=0.9994），根据标准曲线计算样品中肽浓度（mg/mL）。
参考SONG等[21]的高效液相色谱（HPLC）法，稍加修改分析SPBF中肽段的分子量分布。样品经0.22 μm滤膜过滤除菌，进样量10 μL，色谱柱为PL aquagel–OH 30（7.5×300 mm，8 µm），柱温20 ℃，流动相为30%甲醇溶液（含0.1%甲酸），流速0.5 mL/min，检测波长220 nm。分子量标准品：牛血清白蛋白（68000 Da）、维生素B12（1355.37 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.03 Da）和还原型谷胱甘肽（307.32 Da）在相同条件下洗脱，以保留时间（Rt）为横坐标，分子量对数（lg Mt）为纵坐标，经拟合得到分子量标准曲线线性回归方程：y=-0.2437x+7.4001（R²=0.9457）。SPBF中肽段根据洗脱时间依据分子量标准曲线计算分子量，按照>5000 Da、5000~1000 Da、1000~500 Da和<500 Da划分为四个级分，结果以各级分占总峰面积的相对百分含量（%）计。
1.2.3 SR-SSOs收集
参考谷萝等[22]方法，将新鲜鱿鱼切块，置于无菌培养皿中，4 ℃放置至严重腐败（约7 d）。用少量无菌水洗涤鱿鱼块，得到菌悬液为SR-SSOs。SR-SSOs分装到无菌离心管中，用灭菌液体石蜡密封，−20 ℃冻存，备用。
1.2.4 SPBF对SR-SSOs的抑菌作用
参考琼脂孔扩散法[23]，将15 mL营养琼脂加到灭菌培养皿中，待凝固后加入100 μL对数期SR-SSOs（4 ℃培养4 d，600 nm吸光度为0.40左右），用灭菌棉棒涂布均匀，然后用灭菌不锈钢打孔器打孔（直径7 mm），每孔加入75 μL经0.22 μm滤膜过滤除菌的SPBF（肽浓度30.22 mg/mL），用等体积灭菌生理盐水代替SPBF加到琼脂孔中作为空白组，培养皿先4 ℃放置1 h，然后4 ℃下倒置培养4 d，观察是否形成抑菌圈，测量抑制圈直径。
1.2.5 SPBF对SR-SSOs的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）
采用微量二倍稀释法[24−25]，将100 μL对数期SR-SSOs加到10 mL灭菌营养肉汤中，制备含菌液体培养基；在96孔培养板依次加入100 μL不同稀释倍数的SPBF（用生理盐水稀释0、2、4、8、16、32倍，肽浓度从30.22~0.12 mg/mL），然后每孔加100 μL含菌液体培养基，相同体积灭菌生理盐水代替样品作为菌对照组，4 ℃下培养4 d，以肉眼未见浑浊孔所对应最低肽浓度为MIC值。分别从MIC、2×MIC和4×MIC对应微孔吸取100 μL混合液到营养琼脂培养板上，涂布均匀，4 ℃培养4 d，观察是否有菌落生成，无菌落生长对应的肽浓度即为MBC值。
1.2.6 细胞膜渗漏性检测
1.2.6.1 样品处理方法
参考GU等[25]方法，并稍加修改。取5 mL对数期SR-SSOs菌悬液在3500×g离心10 min，灭菌生理盐水洗涤菌沉淀两次，3500×g离心10 min后弃去上清液，菌沉淀与10 mL过滤除菌SPBF混合，4 ℃培养，分别在0、12、24、36和48 h时取5 mL混合液，3500×g离心10 min，收集上清液经0.22 μm滤膜过滤除菌，所得滤液用作胞内遗传物质渗漏和滤液中多肽浓度检测。相同条件下，用等体积灭菌生理盐水代替SPBF与SR-SSOs菌沉淀作用为SR-SSOs对照组（CK组）。
1.2.6.2 胞内遗传物质渗漏性检测
将已过滤除菌的滤液用灭菌生理盐水适当稀释，测定260 nm处吸光度，用相同稀释倍数的SPBF（灭菌生理盐水稀释）作为调零管，以消除SPBF自身在260 nm吸收值对检测结果影响，CK组用灭菌生理盐水为调零管。
1.2.6.3 肽浓度测定
参考1.2.2肽浓度测定方法，用灭菌生理盐水作为调零管。
1.2.7 菌体微观形貌观察
参考GU等[25]扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）方法。收集1.2.6.1中SPBF作用12 h的SR-SSOs菌沉淀，灭菌生理盐水至少洗涤两次，3500×g离心10 min，菌沉淀用2.5%戊二醛4 ℃下固定过夜，然后3500×g下离心10 min，收集菌沉淀，依次用10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇和丙酮脱水（各30 min），吸取丙酮脱水后菌悬液至干净盖玻片上，摊平，冷冻干燥12 h，喷金后用于SEM观察。灭菌生理盐水代替SPBF与SR-SSOs作用12 h的菌沉淀为CK组，其他处理方法同样品组。
1.2.8 SPBF对SR-SSOs菌群多样性影响和抑菌作用途径分析
1.2.8.1 样品制备
取2 mL 4 ℃下培养至对数期的SR-SSOs，3500×g离心10 min，菌沉淀与4 mL SPBF在4 ℃下作用12 h，然后3500×g离心10 min，收集菌沉淀，用灭菌生理盐水洗涤两次，3500×g离心10 min，菌沉淀用4 mL灭菌生理盐水复悬。吸取100 μL菌悬液到10 mL灭菌营养肉汤，4 ℃下富集培养6 d，然后3500×g离心10 min，收集菌沉淀用于细菌总DNA提取。用灭菌生理盐水代替SPBF，在相同条件下处理所得菌沉淀为SR-SSOs的CK组。
1.2.8.2 细菌总DNA提取及检测
采用E.Z.N.A.® Soil DNAKit试剂盒提取SPBF处理组和CK组菌体总DNA，引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’），对细菌16S rRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增。PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系：包括4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、各引物0.8 μL（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu Polymerase和10 ng模板DNA，补ddH2O至20 μL。PCR反应参数：95 ℃预变性5 min，28个循环（95 ℃扩增30 s，55 ℃扩增30 s，72 ℃扩增45 s），最后在72 ℃延伸10 min。使用2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化后PCR产物，将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，构建llumina PE250文库，进行Illumina PE250测序（由上海凌恩生物科技有限公司完成）。
1.2.8.3 生物信息分析
使用trimmomati（http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic，version 0.30）软件对原始数据进行质控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）软件进行拼接。之后使用UPARSE软件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1）对所有样品进行操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）聚类分析，基于OTUs进行SPBF处理组和CK组的Alpha多样性、Beta多样性、物种组成（门、科、属、种水平）和LEfSe线性判别分析（LEfSe linear discriminant analysis，LDA）。进一步使用Wilcoxon rank-sum test比较SPBF处理组和CK组在京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）level2水平路径相对丰度的组间差异。
1.3 数据处理
实验结果用平均值±标准差表示（n=3或n=5），采用SPSS®26.0软件进行单因素方差（ANOVA）分析和Tukey检验，评估各个平均值之间的差异，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 SPBF肽浓度及肽段的分子量分布
经测定SPBF的肽浓度为30.22 mg/mL，根据HPLC法测定的分子量标准曲线（y=−0.2437x+7.4001，将SPBF分为>5000 Da，5000~1000 Da，1000~500 Da和<500 Da四个肽组分，相对百分含量分别为34.61%、1.57%、5.63%和58.19%。由此可知，SPBF中小于1000 Da肽组分占到63%以上。与高分子量肽组分相比，低分子量肽具有更高的抗菌作用，如ALMI-SEBBANE等[26]测试了膜分离β-酪蛋白及其消化水解产物的抗菌活性，发现分子量小于1000 Da肽组分较大于10000 Da和1000~10000 Da肽组分表现出更强的抗菌性。图1结果表明，乳酸杆菌发酵中华管鞭虾加工副产物制备的SPBF中<1000 Da肽段相对百分含量高，分离鉴定其中的有效抗菌肽类有进一步开发应用价值。
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图 1 SPBF中肽组分的分子量分布情况Figure 1. Molecular weight distribution of peptide fractions in SPBF2.2 SPBF对SR-SSOs的抑菌作用
如图2a所示，SPBF（肽浓度为30.22 mg/mL）能抑制SR-SSOs生长，形成直径为14.3±0.8 mm的抑菌圈。经微量二倍逐倍稀释法测定，当SR-SSOs含菌液培与稀释8倍的SPBF共培养未形成肉眼可见浑浊，即SPBF稀释8倍的浓度为SR-SSOs的MIC值（此时肽的终浓度为1.89 mg/mL）。
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图 2 SPBF对SR-SSOs抑菌作用注：a琼脂孔扩散法（空白孔添加相同体积生理盐水）；b微量二倍逐倍稀释法。Figure 2. Antibacterial activity of SPBF against SR-SSOs如图3所示，与CK组比较，SR-SSOs经MIC、2×MIC和4×MIC的SPBF作用后，再转接到营养琼脂培养板上，处理组的菌落数量明显减少，但是SR-SSOs经4×MIC的SPBF作用后在营养琼脂培养基上仍可见有菌落生成，说明SR-SSOs中的菌群未被完全杀死。推测与SR-SSOs不是单一菌，而是几种/类菌组成，SPBF可以抑制或杀死SR-SSOs中某种/类菌，但是对SPBF不敏感的菌在培养基上仍具有生长繁殖能力有关。
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图 3 不同浓度SPBF（MIC、2×MIC和4×MIC）作用后SR-SSOs的复生长情况Figure 3. Effects of different concentrations of SPBF (MIC, 2×MIC, and 4×MIC) on the re-growth of SR-SSOs2.3 SR-SSOs胞内物质渗漏及SPBF中肽浓度变化
当菌体细胞膜完整性遭到破坏时，胞内一些低分子量物质如：K+，PO43−等，以及大分子遗传物质DNA和RNA会渗漏出来，导致260 nm处吸光度上升，因此可以用菌体上清液在260 nm处吸光度变化来反映菌体细胞膜破损程度[25]。对数期SR-SSOs与SPBF作用0~48 h，上清液在260 nm处吸光度及SPBF中肽浓度变化结果见表1。
表 1 SR-SSOs胞内遗传物质渗漏及SPBF中肽浓度变化Table 1. Leakage of intracellular genetic compounds from SR-SSOs and changes in peptide concentration of SPBF作用时间
（h）胞内遗传物质渗漏（OD260nm吸光度） 肽浓度（mg/mL） CK组 SPBF处理组 CK组 SPBF处理组 0 0.002±0.00d − − 30.52±1.19a 12 0.036±0.00a − − 29.48±1.71ab 24 0.005±0.00c − − 29.21±0.68ab 36 0.006±0.00c − − 27.57±1.12b 48 0.023±0.00b − − 27.35±0.16b 注：同组不同小写字母表示不同作用时间下差异显著（P<0.05），−表示检测数值小于0。 表1结果显示，CK组在260 nm吸光度出现一定程度波动，其中在12 h时吸光度最大，可能与SR-SSOs在CK组生理盐水作用下，释放一些260 nm有吸收的物质到胞外适应环境压力有关。如SMITH等[27]报道环境胁迫诱导大肠杆菌分泌胞外核酸酶，降解外源DNA来提高细胞的生存和竞争能力。本研究中CK组在260 nm处吸光度虽然有波动，但是一直处于较低水平（均小于0.05），也提示SR-SSOs在CK组生理盐水作用下细胞膜应该未出现破裂，即CK组中生理盐水对菌体细胞膜的完整性几乎无影响，与图2a的CK组无明显抑菌圈及图4中CK组菌体细胞膜保持完整结果一致。相比下，SPBF处理组的260 nm吸光度未提高（测定值低于0），说明SPBF处理也未破坏SR-SSOs的细胞膜完整性。当作用12 h时，SPBF处理组的肽浓度开始下降，且随着作用时间的延长，肽浓度逐渐降低，其中作用36 h时SPBF中肽浓度已经显著低于未作用时的浓度，推测可能与SPBF中活性肽进入胞内发挥抗菌作用，结果导致胞外肽浓度减少有关。
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图 4 扫描电镜观察SR-SSOs经SPBF作用后菌体形貌变化注：a、b为CK组（放大倍数分别为5000和10000倍）；c、d为SPBF处理组（放大倍数分别为5000和10000倍）。Figure 4. Morphological changes of SR-SSOs after SPBF treatment by scanning electron microscopy observation抗菌肽的作用机制主要分为膜损伤和非膜损伤两大类，在非膜损伤抑菌机制中，抗菌肽通过膜转运等途径进入胞内，通过抑制DNA和RNA的合成、破坏关键代谢酶和细胞呼吸过程、破坏核酸修复、抑制细胞分裂等途径来发挥抑菌作用[28]。由表1结果推测SPBF对SR-SSOs的抑菌机制可能与非膜损伤有关。
2.4 SPBF对SR-SSOs的菌体微观形貌影响
SEM结果显示，CK组菌体主要由杆菌组成，有细杆状和短杆状，说明SR-SSOs不是单一菌。CK组大多数菌的菌体完整、形状较为规则、膜表面也比较光滑饱满（图4a、4b）。与CK组相比较，SPBF作用后菌体的微观形貌发生明显变化，有的菌体发生变形、有的菌体细胞膜出现大的凹陷，但是未观察到菌体细胞膜发生完全裂解现象（图4c、4d），说明胞内遗传物质还未发生大量外泄，与表1中SPBF处理组结果一致。综合图4及表1和图3结果，推测SPBF对SR-SSOs的抑菌作用与活性肽进入胞内与靶标结合，抑制菌体正常生长繁殖有关。LI等[29]报道细胞穿透肽ppTG20并不裂解细胞膜，而是穿透大肠杆菌细胞膜，与胞内DNA相互作用，影响DNA复制，最终抑制菌体正常生长。表1中SPBF与SR-SSOs作用后，肽浓度逐渐降低也提示SPBF中的抗菌肽极有可能进入特定菌胞内，作用于胞内靶标来发挥抑菌作用。
2.5 SPBF对SR-SSOs菌体组成影响
2.5.1 Alpha多样性分析
Ace指数和Chao1指数可以用来判定物种丰度，其值越高表示物种丰度越大。Shannon指数和Simpson指数则常用于衡量群落多样性，但它们从不同的角度反映群落的多样性特征。其中，Shannon指数是综合考虑物种丰富度和均匀度，其指数值越高表示群落物种多样性越丰富，且物种间的分布越均匀。Simpson指数主要侧重于物种的相对丰富度，Simpson指数越大，说明群落中优势物种较为突出，少数物种占据较大比例，意味着群落主要由少数物种组成，因此多样性较低[25,30]。表2结果显示SPBF处理组的Ace指数和Chao1指数值均小于CK组，其中Chao1指数值显著降低（P<0.05），说明SPBF对SR-SSOs的物种丰度有显著抑制作用，即SPBF对SR-SSOs有较好的抑菌作用。
表 2 Alpha多样性指数Table 2. Alpha diversity index组别 Ace指数 Chao1指数 Shannon指数 Simpson指数 CK组 84.92±3.33a 89.41±1.37a 0.87±0.10b 0.30±0.03b SPBF处理组 81.38±1.61a 79.56±1.68b 1.79±0.04a 0.78±0.00a 注：相同指标下不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 SPBF处理组的Simpson指数值显著大于CK组（P<0.05），说明SPBF能有效降低SR-SSOs中菌群多样性，即SPBF对SR-SSOs中某些菌具有持久抑菌或杀灭作用，该结果与琼脂孔扩散法形成较为透明抑菌圈（图2）和4×MIC下仅有少量菌落生成一致（图3）。通常情况下，Shannon指数和Simpson指数的变化趋势是相反的，而本研究中SPBF处理组的Shannon指数也显著高于CK组，推测可能与SPBF处理后SR-SSOs原本优势菌的丰度降低，但是其他丰度较低菌在SPBF处理后丰度增加，结果导致群落物种间均匀度提高有关。综合表1结果可以得出，SPBF能够抑制SR-SSOs中某些特定菌的增殖（物种丰度降低），在一定程度上降低菌群多样性。与本研究结果一致，GU等[25]用胃蛋白酶水解虾加工副产物制备的抗菌型水解液作用室温下鱿鱼腐败末期菌，其中样品处理组的Simpson指数显著高于对照组，也具有降低鱿鱼腐败菌多样性作用。
2.5.2 Beta多样性分析
主坐标分析（PCoA）是在可视化的低维空间重新排列样本，用来研究样本群落组成的相似性或差异性，纵坐标和横坐标分别表示一个主成分，百分比表示主成分对样品差异的贡献值，样品距离越远，代表其微生物结构差异越大[31]。如图5所示，纵坐标PC1主成分对两组样品差异贡献值达到99%，两组样品可以完全分开，表明SPBF处理能显著改变SR-SSOs菌群结构组成。而且，SPBF处理组的样本离散程度明显低于CK组，也表明SPBF处理组物种的均匀度优于CK组，与表1中SPBF处理组Shannon指数显著高于CK组一致。
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图 5 SPBF处理组和CK组的主坐标分析Figure 5. Principal coordinate analysis (PCoA) distribution between SPBF treated and CK groups2.5.3 SPBF处理对SR-SSOs菌群结构影响（门、科、属、种水平）
在门（Phylum）水平上（图6a），SR-SSPs（即CK组）中厚壁菌门（Firmicutes）（96.84%）和变形菌门（Proteobacteria）（2.64%）菌的平均相对丰度总和达到99%以上，而SPBF处理可显著改变SR-SSOs在门水平上菌群丰度，其中厚壁菌门的相对丰度显著降至42.95%，而变形菌门则显著提高到56.78%（P<0.05）。与本研究结果类似，侯温甫等[32]报道冷藏草鱼鱼肉在贮藏末期腐败菌主要包括厚壁菌门和变形菌门，而用ε-聚赖氨酸处理可显著降低厚壁菌门的相对丰度，但是变形菌门相对丰度增加明显。
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图 6 SPBF处理后SR-SSOs在门、科、属和种上菌群结构组成变化注：a门水平；b科水平；c属水平；d种水平。Figure 6. Changes of bacterial composition of SR-SSOs at the phylum, family, genus and species levels after SPBF treatment在科（Family）水平上（图6b），SR-SSOs的菌群主要由厚壁菌门的李斯特菌科（Listeriaceae）和肉杆菌科（Carnobacteriaceae）以及变形菌门的假单胞菌科（Pseudomonadaceae）组成。SPBF处理显著降低了李斯特菌科菌的相对丰度，增加了肉杆菌科和假单胞菌科的相对丰度，因为SPBF处理后SR-SSOs的菌群多样性降低（表1），SPBF处理组中少数优势菌的相对丰度就会提高，所以SPBF处理组的肉杆菌科和假单胞菌科菌群相对丰度提高与SPBF抑制了李斯特菌科菌有关。李斯特菌科是参与海鲜变质的主要腐败菌之一，它在食物储存过程中的生长与代谢活动会产生与异味相关的代谢产物[33]。通过抑制李斯特菌科菌的生长，有可能减缓食物变质速度，延长产品货架期。潘艳艳等[34]的研究中，李斯特菌科的环丝菌属是冰藏鲈鱼贮藏末期优势腐败菌，但用壳聚糖处理后其相对丰度显著降低，延长了冷藏鲈鱼货架期。
在属（Genus）水平上（图6c），CK组优势腐败菌主要由李斯特菌科的环丝菌属（Brochothrix）（85.25%）和肉杆菌科的肉食杆菌属（Carnobacterium）（10.35%）组成。环丝菌是冷藏肉类和肉制品常见腐败菌，通过产生酶将肉类中大分子营养物质分解为挥发性有机化合物，导致冷藏肉制品味道和品质劣变，缩短保质期[35−36]。CK组SR-SSOs的环丝菌相对百分含量高达85.25%，与本研究结果相似，LI等[37]报道鲑鱼4 ℃下贮藏结束时，优势腐败菌环丝菌的相对百分含量达到81.13%。SR-SSOs经SPBF作用后，环丝菌的相对丰度降至1.00%，说明SPBF处理能有效抑制环丝菌的增殖。相比下，SPBF处理组肉食杆菌的相对丰度在提高到41.71%，显著高于CK组的10.35%。此外，SPBF处理组假单胞菌（Pseudomonas）的相对丰度（56.47%）显著高于CK组（2.17%）。由此可知，SPBF处理后SR-SSOs的优势腐败菌为肉食杆菌属和假单胞菌属。
肉食杆菌属为革兰氏阳性、杆状乳酸菌，可产乳酸，在pH7~9范围能生长，可产生有抑菌作用的细菌素、抗菌肽[35]。肉食杆菌可能会产生一定量酪胺，但是对大多数消费者无不良影响，个别敏感个体会产生偏头痛，因此食品中肉食杆菌基本不会构成有人类疾病的危险因素[38]。假单胞菌属好氧嗜冷杆菌，与冷藏水产品的腐败和变质密切相关，0~5 ℃下能在水产品中快速生长并具有较强的蛋白质降解能力、生物黏附能力与生物膜形成能力，容易引起水产品中多种生物胺的产生和ATP的分解[39−40]。假单胞菌属由于良好的适宜能力以及产蛋白酶和脂肪酶的高活性，因此是引起冷藏食品变质的关键菌[41]。本研究中SPBF处理组的假单胞菌属相对丰度显著高于CK组，推测与SPBF处理降低了SR-SSOs菌群丰度和多样性（表2）有关，即对SPBF不敏感的假单胞菌经过富集培养（见1.2.8.1样品制备）在数量上占据优势，所以相对丰度发生显著性提高。SPBF处理组的肉食杆菌属和假单胞菌属相对丰度总和高达98.18%，而环丝菌属的相对丰度降至1.00%，说明SPBF对SR-SSOs中环丝菌属发挥了有效抑菌作用。肉食杆菌属的菌一般能够产生有抗菌作用的细菌素，但是SPBF处理组假单胞菌的相对丰度也提高了，说明优势菌肉食杆菌的存在对假单胞菌的生长未造成阻碍作用。
在种水平上，CK组相对丰度排名前5的种为：热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）（84.68%）、麦芽芳香肉杆菌LMA28（Carnobacterium maltaromaticum LMA28）（5.20%）、麦芽芳香肉杆菌（Carnobacterium maltaromaticum）（0.77%）、广布肉毒杆菌（Carnobacterium divergens）（0.29%）和隆德假单胞菌（Pseudomonas lundensis）（0.27%）。SR-SSOs经过SPBF作用后，优势种为麦芽芳香肉杆菌LMA28（16.63%）、广布肉毒杆菌（5.00%）和隆德假单胞菌（3.55%）。由此可知，SPBF可显著抑制热死环丝菌的生长，但是肉杆菌属下麦芽芳香肉杆菌LMA28和广布肉毒杆菌，假单胞菌属的隆德假单胞菌相对丰度有所增加。
目前已报道的肉食杆菌属有11个种，其中从海产品中鉴定出的两个种：广布肉毒杆菌和麦芽香茅杆菌，在不同的新鲜度和轻度保存海产品中可以生长到高浓度[42]。这两种菌在腌制肉类和海鲜中大量存在或生长会产生挥发性气味，影响产品的感官[43]。有研究将麦芽香茅杆菌接种到虾中，发现当菌体生长达到最大值时产品会出现黄油和奶酪异味[44]。但是一定数量的广布肉毒杆菌和和麦芽香茅杆菌产生的抗菌肽和细菌素具有广谱抑菌性，所以有抑制腐败菌潜力[43]。STUPAR等[45]将广布肉毒杆菌和和麦芽香茅杆菌分别与李斯特菌共培养，均表现出高度抑制李斯特菌效果。隆德假单胞菌是引起肉制品腐败常见一种细菌，通过分泌蛋白酶和脂肪酶利用肉类营养，并释放出一些含硫化类和胺类挥发性以及有机酸等非挥发性代谢产物，导致肉制品腐败变质[46]。在SPBF处理组，麦芽芳香肉杆菌LMA28和广布肉毒杆菌共存并没有抑制腐败菌隆德假单胞菌的生长，说明SR-SSOs经SPBF作用后，其中的SSOs间相互作用关系比较复杂，一些腐败菌生长并未因为存在可产抗菌肽和细菌素的菌而被抑制，但是SPBF处理组优势菌的致腐性是否发生改变需要后续进一步研究。
2.6 LEfSe——线性判别分析（LDA）
采用对数线性判别分析（LDA）（默认LDA值>2和P<0.05为差异物种）分析SPBF处理组和CK组的显著差异菌，LDA值越大，表示差异性越大。从图7可以看出，CK组的热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）（属于环丝菌属（Brochothrix）、李斯特菌科（Listeriaceae）、乳杆菌目（Lactobacillales）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、厚壁菌门（Firmicutes））与SPBF处理组有显著差异。此外，乳杆菌目下的链球菌科（Streptococcaceae）、阴道球菌科（Vagococcaceae）的阴道球菌属（Vagococcus），乳杆菌目下的肉杆菌种（Carnobacterium_iners）也是区分CK组和SPBF处理组显著差异菌。莫拉菌科（Moraxellaceae）的嗜冷杆菌（Psychrobacter）是引起冷藏水产品（冷藏肉制品）主要优势腐败菌之一，能够产生水解不同底物的脂肪酶[47]。有研究表明，在煮熟的褐虾中检测到嗜冷杆菌和假交替单胞菌属为主要腐败菌，参与脂质和蛋白质水解[48]。PARLAPANI等[7]研究发现2 ℃下变质墨鱼中嗜冷杆菌生长与TVB-N积累有关。
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图 7 CK和SPBF处理组之间显著差异菌的线性判别分析Figure 7. LEfSe–LDA of significant bacteria between the CK and SPBF groupsCK组的罗斯氏菌属（Roseburia）和融合杆菌属（Fusicatenibacter）（同属于毛螺菌科Lachnospiracea）、丹毒丝菌属（Erysipelotrichaceae_UCG_003）（属于Erysipelatoclostridiaceae科）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）（属于Peptostreptococcaceae科，Peptostreptococcales_Tissierellales目）、柯林斯菌属（Collinsella）（属于柯林斯菌科（Coriobacteriaceae）、柯林斯菌目（Coriobacteriales）、柯林斯菌纲（Coriobacteriia）、放线菌目（Actinobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota））和产粪甾醇真细菌科（Eubacterium_coprostanoligenes_group）也是区分CK和SPBF处理组显著差异菌。上述菌群均与肠道菌群有关，推测与鱿鱼捕获运输过程中受到一定程度污染有关。
SPBF处理组区分于CK组显著差异菌有隆德假单胞菌（Pseudomonas_lundensis）（相对丰度3.53%）、麦芽香茅杆菌_LMA28（Carnobacterium_maltaromaticum_LMA28）（相对丰度16.63%）和广布肉毒杆菌（Carnobacterium_divergens）（相对丰度5.00%）和球菌Pediococcus_pentosaceus种（相对丰度0.0077%）。其中，隆德假单胞菌归属于假单胞菌属（Pseudomonas）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、变形杆菌门（Proteobacteria）。麦芽香茅杆菌_LMA28和广布肉毒杆菌属于乳酸杆菌目（Lactobacillales）下的肉食杆菌科（Carnobacteriaceae）、肉食杆菌属（Carnobacterium）。球菌Pediococcus_pentosaceus种属于乳酸杆菌目下的乳酸杆菌科、球菌属（Pediococcus）。
由此可知，CK组和SPBF处理组菌群组成差异明显，SPBF能够显著降低SR-SSOs中与水产食品腐败相关的热死环丝菌丰度（图6d）。热死环丝菌属一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，而革兰氏阳性菌一般对低分子量肽组分（<1000 Da）敏感[49]，SPBF中<1000 Da肽组分相对含量达到60%以上，所以SPBF显著降低热死环丝菌丰度推测与其低分子量肽的抑菌作用有关。假单胞菌属于革兰氏阴性菌，存在脂磷酸壁结构，会阻碍有效抑菌组分在细胞膜中渗透作用于抗菌靶标[50]。另外，在冷藏条件下，假单胞菌可利用乳酸杆菌发酵液中生成的乳酸以及未被乳酸杆菌消耗完的葡萄糖，进一步生长繁殖[51−52]。SPBF处理组中存在相对丰度较高的麦芽香茅杆菌_LMA28和广布肉毒杆菌，说明这两种菌能与隆德假单胞菌共生长，可能与肉食杆菌属菌大多数可以产生乳酸，为隆德假单胞菌生长提供营养有关。
2.7 SPBF作用后SR-SSOs的功能基因变化
KEGG数据库可以根据已知的微生物基因组数据预测菌群代谢功能，将基因组信息与功能信息联系起来。微生物的致腐性取决于它们产生腐败代谢化合物的能力[53]，基于16S rRNA测序比较了CK组和SPBF处理组细菌代谢途径和水平，如图7所示。
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图 8 通过重建未观察状态对群落进行系统发育调查（PICRUSt）预测CK和SPBF组之间的功能差异Figure 8. Predicting functional differences between the CK and SPBF groups using phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states (PICRUSt)在KEGG的Level 2水平上，SPBF处理组和CK组共有29项功能发生显著变化，其中SPBF处理组的细胞运动（Cell motility）、信号转导（Signal transduction）、异种生物降解和代谢（Xenobiotics biodegradation and metabolism）、膜运输（Membrane transport）、能量代谢（Energy metabolism）等19项功能较CK组显著上调，而碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、翻译（Translation）、核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）、复制与修复（Replication and repair）等10项功能显著低于CK组。
在下调的代谢途径中，碳水化合物代谢相关的基因丰度最高。碳水化合物代谢包括乙醛酸和二羧酸代谢、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径和柠檬酸循环等，为细菌生长和繁殖提供必需的营养物质[54]。CK组碳水化合物代谢基因丰度显著高于SPBF处理组，说明SPBF处理大幅度降低了与碳水化合物代谢相关的营养物质生成，从而达到抑制SR-SSOs部分特定菌目的。此外，碳水化合物代谢失调会降低细胞膜的修复和合成活性[55]。与SEM结果相对应，SR-SSOs经SPBF作用后可见大量菌体细胞膜表面出现凹陷（图4b）。
氨基酸代谢在微生物中作用主要包括两个方面，一方面是氨基酸的合成代谢，可以产生相应的氮源为微生物利用；另一方面是氨基酸的分解代谢，通过脱氨基、转氨基、联合脱氨基的方式分解为α-酮酸、胺类和二氧化碳等[56]。氨基酸代谢可为腐败细菌生长提供氮和碳源[57]。SPBF处理组的氨基代谢水平显著低于CK组，也进一步说明SPBF通过抑制氨基酸代谢方式抑制SR-SSOs中一些特定腐败菌生长。
能量代谢在生物体的分子功能、生物过程、生理行为、生长甚至生存中起着至关重要的作用，当生物体中的能量平衡会受到影响，就需要额外的能量来维持或恢复体内平衡[58]。SPBF处理组的能量代谢途径基因丰度显著高于CK组，可能与SPBF对SR-SSOs造成损害，菌体需要更多的能量修复自身有关。SPBF处理组的核苷酸代谢、转录、翻译以及复制与修复的基因丰度显著降低，但是膜转运、信号转导（Signal transduction）基因丰度增加，由此推测SPBF中活性肽可以通过膜转运方式穿过细菌膜进入胞内，通过与细胞内靶标，如核酸或新生蛋白结合[59]，随后影响正常细胞过程，如复制、转录、翻译、蛋白质折叠和细胞壁合成等[60]，从而达到抑菌作用。
3. 结论
乳酸杆菌发酵虾壳副产物制备的SPBF含有63%左右分子量<1000 Da低分子量肽，SPBF作用下SR-SSOs的菌体表面虽然会出现一定程度不规则，但是菌膜结构仍保持完整，SPBF可能通过非膜损伤方式抑制SR-SSOs生长。SPBF处理可显著降低SR-SSOs菌群丰度和多样性，降低与腐败相关的热死环丝菌丰度，促进了肉食杆菌增殖。SR-SSOs菌群结构上的显著变化推测与SPBF中抗菌肽通过膜转运进入细菌内部作用靶标，抑制遗传物质生成有关。SR-SSOs经SPBF处理后麦芽芳香肉杆菌LMA28、广布肉毒杆菌和隆德假单胞菌的相对丰度较高，但是SPBF处理后菌的致腐能力是否发生改变，SPBF中有效抗菌肽分离鉴定以及如何抑制SR-SSOs中特定菌等均需要后续进一步深入研究。
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图 1 SPBF中肽组分的分子量分布情况
Figure 1. Molecular weight distribution of peptide fractions in SPBF
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图 2 SPBF对SR-SSOs抑菌作用
注：a琼脂孔扩散法（空白孔添加相同体积生理盐水）；b微量二倍逐倍稀释法。
Figure 2. Antibacterial activity of SPBF against SR-SSOs
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图 3 不同浓度SPBF（MIC、2×MIC和4×MIC）作用后SR-SSOs的复生长情况
Figure 3. Effects of different concentrations of SPBF (MIC, 2×MIC, and 4×MIC) on the re-growth of SR-SSOs
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图 4 扫描电镜观察SR-SSOs经SPBF作用后菌体形貌变化
注：a、b为CK组（放大倍数分别为5000和10000倍）；c、d为SPBF处理组（放大倍数分别为5000和10000倍）。
Figure 4. Morphological changes of SR-SSOs after SPBF treatment by scanning electron microscopy observation
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图 5 SPBF处理组和CK组的主坐标分析
Figure 5. Principal coordinate analysis (PCoA) distribution between SPBF treated and CK groups
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图 6 SPBF处理后SR-SSOs在门、科、属和种上菌群结构组成变化
注：a门水平；b科水平；c属水平；d种水平。
Figure 6. Changes of bacterial composition of SR-SSOs at the phylum, family, genus and species levels after SPBF treatment
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图 7 CK和SPBF处理组之间显著差异菌的线性判别分析
Figure 7. LEfSe–LDA of significant bacteria between the CK and SPBF groups
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图 8 通过重建未观察状态对群落进行系统发育调查（PICRUSt）预测CK和SPBF组之间的功能差异
Figure 8. Predicting functional differences between the CK and SPBF groups using phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states (PICRUSt)
表 1 SR-SSOs胞内遗传物质渗漏及SPBF中肽浓度变化
Table 1 Leakage of intracellular genetic compounds from SR-SSOs and changes in peptide concentration of SPBF
作用时间
（h）胞内遗传物质渗漏（OD260nm吸光度） 肽浓度（mg/mL） CK组 SPBF处理组 CK组 SPBF处理组 0 0.002±0.00d − − 30.52±1.19a 12 0.036±0.00a − − 29.48±1.71ab 24 0.005±0.00c − − 29.21±0.68ab 36 0.006±0.00c − − 27.57±1.12b 48 0.023±0.00b − − 27.35±0.16b 注：同组不同小写字母表示不同作用时间下差异显著（P<0.05），−表示检测数值小于0。 
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表 2 Alpha多样性指数
Table 2 Alpha diversity index
组别 Ace指数 Chao1指数 Shannon指数 Simpson指数 CK组 84.92±3.33a 89.41±1.37a 0.87±0.10b 0.30±0.03b SPBF处理组 81.38±1.61a 79.56±1.68b 1.79±0.04a 0.78±0.00a 注：相同指标下不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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