Protective Effects and Mechanisms of Selenium Enriched Sweet Potato Starch Noodles on Liver Injury in D-Galactose-induced Aging Mice
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摘要: 本文采用堇叶碎米荠、硒蛋白制作富硒红薯粉条,并研究其对D-半乳糖(D-Gal)诱导衰老小鼠肝脏氧化损伤的保护作用及机制。采用D-Gal腹腔注射建立小鼠氧化损伤模型,同时干预组小鼠饮食中按硒剂量10 μg/kg·d−1添加碎米荠、硒蛋白以及富硒红薯粉条,并设普通粉条空白对照组,连续干预28 d。结果表明,各组小鼠生长参数无显著差异。与正常组相比,模型组小鼠肝脏结构损伤明显,血清ALT和AST升高(P<0.01),肝脏氧化应激加重(SOD、GSH-Px、T-AOC、HO-1降低,MDA升高P<0.01),炎症因子TNF-α和IL-6浓度升高(P<0.01)。与模型组相比,碎米荠粉、硒蛋白以及富硒红薯粉条干预均显著改善肝脏组织形态,降低血清ALT、AST水平(P<0.01),上调肝脏SOD、HO-1浓度(P<0.05),下调肝脏IL-6、TNF-α浓度(P<0.01)。硒原料及富硒粉条均能显著下调D-Gal干预小鼠肝脏Keap1的相对表达量,并上调Nrf2的相对表达量(P<0.01)。富硒粉条显著增加D-Gal干预小鼠粪便中Verrucomicrobiota、Akkermansia、Bacteroides、Lachnoclostridium、Blautia等有益菌属的相对丰度(P<0.05),并增加粪便微生物代谢物短链脂肪酸(SCFAs)的分泌。硒粉条调控的肠道微生物及SCFAs与肝损伤的保护相关。综上,碎米荠粉、硒蛋白以及富硒红薯粉条可改善D-Gal诱导的肝损伤,其机制可能跟激活Keap1-Nrf2/HO-1信号通路及改善肠道微生物组成有关。研究结果为粉条营养功能强化及富硒粉条的开发提供了理论依据。Abstract: In the present study, the protective effects and mechanisms of selenium enriched sweet potato starch noodles on oxidative injury of liver in D-Galactose-induced aging mice were investigated. An oxidative damage model in mice was established through intraperitoneal injection of D-Galactose (D-Gal). The intervention groups received diets supplemented with Cardamine violifolia, selenium protein, and selenium-enriched sweet potato starch noodles at a selenium dose of 10 μg/kg·d−1. A normal starch noodles control group was enrolled. The intervention lasted 28 consecutive days. The results showed that there was no difference in growth parameters among all groups. Compared with normal group, the liver structure of model group was significantly damaged, serum ALT and AST were increased (P<0.01), liver oxidative stress was aggravated (SOD, GSH-Px, T-AOC, HO-1 were decreased, MDA was increased, P<0.01), and hepatic levels of inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 were increased (P<0.01). Compared with model group, Cardamine violifolia, selenium protein, and selenium-enriched starch noodles significantly improved liver morphology, decreased serum ALT and AST levels (P<0.01), increased liver SOD and HO-1 levels (P<0.05), and decreased liver IL-6 and TNF-α concentration (P<0.01). Both selenium-enriched raw material and selenium-enriched starch noodles could significantly down-regulate the relative expression of Keap1 and up-regulate that of Nrf2 in liver of D-Gal treated mice (P<0.01). Selenium-enriched starch noodles also markedly increased the relative abundance of beneficial gut microbiota, such as Verrucomicrobiota, Akkermansia, Bacteroides, Lachnoclostridium and Blautia (P<0.05), and promoted the secretion of fecal levels of short-chain fatty acids (SCFAs). The intestinal bacteria and SCFAs regulated by selenium-enriched starch noodles were related to the protection against liver injury. In summary, Cardamine violifolia, selenium protein and selenium-enriched starch noodles improved D-Gal induced liver injury, and the mechanism was related to the activation of Keap1-Nrf2/HO-1 signaling pathway and improvement of intestinal microbial composition. The results provide a theoretical basis for the nutritional enhancement of starch noodles and the development of selenium-rich starch noodles.
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粉条是一种凝胶制品,属于我国的传统食品,主要原料是淀粉[1],包括薯类粉条和豆类粉条等[2]。红薯粉条因口感嫩滑,耐贮藏等优点,深受消费者喜爱[3]。在健康中国的大背景下,以淀粉为主要原料的红薯粉条已经不能满足人们对营养和健康食物的需求。近年来,有不少学者对粉条进行营养和功能等多元化的研发。如郭卫芸等[4]在红薯淀粉中添加茶多酚,制作出具有抗氧化生理功能的粉条。焦婷婷等[5]研究了葛根和山药对鲜湿薯类粉条品质的影响,成功制备出血糖生成指数降低的功能性鲜湿薯类粉条。研究营养功能强化的粉条对丰富粉条制品种类、保护人体健康具有重要意义。
硒(Selenium,Se)是人体的必需微量元素之一,具有增强免疫力、抗氧化、抗癌等生理功效[6]。堇叶碎米荠(Cardamine violifolia)是具有硒积累能力的十字花科植物,在野外一年生的条件下,叶硒含量可达到1427 mg/kg干重(Dry weight,DW)[7],对土壤硒的富集系数达到68倍。堇叶碎米荠中的硒主要存在形式为有机硒蛋白,与无机硒相比,它们具有更高的吸收效率,更容易滞留在组织中[8]。作为一种富硒的植物原料,堇叶碎米荠具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、调节免疫等多种活性[7]。Xu等[9]研究表明,堇叶碎米荠与亚硒酸钠相比,在3 mg/kg的日粮添加下,显著改善了肉鸡运输应激导致的体重减少、氧化应激及肉质问题。Yu等[10]在D-半乳糖(D-Galactose,D-Gal)诱导衰老大鼠饲料中补充来自堇叶碎米荠的富硒多肽,发现其能改善大鼠体内代谢紊乱、记忆退化及氧化应激状态。因此,堇叶碎米荠作为一种新型富硒原料,具有良好的开发前景及应用价值。
衰老是一个复杂且不可避免的退行性过程,与所有重要器官的损伤相关,并常伴随许多疾病,如心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和肝脏疾病[11]。过度积累的活性氧(ROS)引起的氧化应激被认为是衰老的主要机制。由于肝脏在氧化代谢中发挥核心作用,易受到ROS的攻击,衰老伴随的氧化应激易引起肝脏损伤[12]。硒元素具有良好的抗氧化作用。李丽娟[13]研究发现,添加0.6 mg/kg的硒能够有效保护D-Gal诱导的小鼠肝脏损伤,上调小鼠肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,TAOC),并显著下调丙二醛(Malondialdehyde,MDA)浓度。由于硒无法在人体内合成,必须从饮食中摄入,膳食补硒成为最安全、最方便的形式。富硒食品因此逐渐成为健康食品开发的热点[14−16]。目前,尚无富硒粉条、堇叶碎米荠及其中硒蛋白对衰老伴随肝氧化损伤的相关报道。
基于此,本实验以硒蛋白和堇叶碎米荠为原料,制作富硒粉条,建立D-Gal诱导的衰老小鼠模型,探究富硒粉条及两种硒原料对D-Gal诱导的衰老小鼠肝脏损伤的影响及潜在作用机制。本研究为富硒粉条的开发及其保护衰老伴随肝损伤的作用及机制提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
56只清洁级昆明(KM)种雄性小鼠 维通利华(北京)生物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2021-0011;小鼠维持饲料 购自江苏美迪森生物医药有限公司,实验动物操作及相关福利均经青岛大学动物伦理委员会批准认可(No.20230602KM5620230804118);红薯淀粉 山东华涛食品有限公司;堇叶碎米荠(1000 ppm;蛋白质 45.1 g/100 g;碳水化合物 33.9 g/100 g;脂肪 4.7 g/100 g;灰分 14.2 g/100 g;总硒 100 mg/100 g)、硒蛋白(500 ppm;蛋白质 >90%;总硒 50 mg/100 g) 恩施硒德生物工程有限公司;D-半乳糖 上海麦克林生化科技股份有限公司;HO-1、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒 江苏晶美生物科技有限公司;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px、T-AOC化学试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司;Keap1(10503-2-AP)、Nrf2(16396-1-AP)抗体 武汉三鹰生物技术有限公司。
ZH-57压面机 冀华强机械厂;和面机 深圳市三利达电器科技有限公司;电磁炉 广东美的生活电器制造有限公司;DHG-9023A鼓风干燥箱、E-1000UV紫外分光光度计 青岛蓝特恩科教仪器设备有限公司;HH4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;KZ-III-F高速组织研磨仪 武汉赛维尔生物科技有限公司;Spark酶标仪 瑞士Tecan公司;JB-P5包埋机 武汉俊杰电子有限公司;RM2016病理切片机 上海徕卡仪器有限公司;Nikon Eclipse E100正置光学显微镜 日本尼康;Pannoramic MIDI 组织切片数字扫描仪 3DHISTECH;ASF-8220原子荧光光谱仪 北京吉天有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 富硒粉条的制备
将30 g红薯淀粉加入60 mL、70 ℃左右的温水混合制芡,再依次向其加入堇叶碎米荠粉或硒蛋白(按每kg淀粉0.3 g堇叶碎米荠粉或0.6 g硒蛋白添加)、200 mL的沸水和270 g的淀粉,搅拌均匀,将面团放入压粉机中进行压粉,压出的粉条在沸水中煮15 min,再放入冷水中冷却10 min;冷却后放置于烘箱架子上,在60 ℃下烘干约3 h至水分含量低于20%,即可得到成品。
1.2.2 硒含量的确定
堇叶碎米芥粉与硒蛋白的添加量主要依据本团队前期专利《一种富硒粉条及其制备方法》(专利号:CN202210769924.2)[17]进行确定,该专利硒添加量参照标准DB 61/T 556-2018《富硒含硒食品与相关产品硒含量标准》,DBS 42/002-2022《食品安全地方标准 富有机硒食品硒含量要求》,确定粉条中硒添加量为:150~280 µg/kg。其中,DB 61/T 556-2018《富硒含硒食品与相关产品硒含量标准》中规定淀粉及淀粉制品中硒含量不低于150 µg/kg;DBS 42/002-2022《食品安全地方标准 富有机硒食品硒含量要求》标准规定薯类及其制品中硒含量不高于500 µg/kg。
1.2.3 硒含量检测
参照GB 5009.93-2017食品中硒的测定,采用氢化物原子荧光光谱法对总硒含量进行定量检测。
1.2.4 粉条品质检测
参照实验室前期方法[2],对粉条断条率、透光率、蒸煮特性品质,感官评价指标进行检测。
1.2.4.1 断条率
在小锅中加入10至20根10 cm的粉条和1000 mL蒸馏水,加热至沸腾,记录煮前粉条的总根数(N)。粉条煮沸15 min后,取出并在常温水中冷却2 min。记录煮后10 cm粉条的根数(M)。按照以下公式计算断条率(B,%)。
B(%)=N−MN×100 1.2.4.2 透光率
用上述冷却后的汤汁在波长为650 nm处测定其吸光度(A),同时将蒸馏水煮制15 min后,取冷却后的汤汁作为空白对照,记录数据。根据以下公式计算出透光率。
透光率(%)=10−(A)×100 1.2.4.3 粉条蒸煮特性
将3 g湿粉条(W1),在60 ℃的烘箱中干燥3 h,记录干粉条的质量(W2)。随后将干粉条放入蒸馏水中煮沸,15 min后放于常温水中冷却2 min,沥干表面水分,记录质量(W3)。将粉条再次放入60 ℃烘箱中烘干,记录质量(W4)。根据上述步骤,求出膨润度(S,%)、蒸煮损失(L,%)、干物质含量(D,%)和复水率(R,%)。下列公式(1)膨润度计算粉条在煮沸后吸水膨胀的程度;公式(2)蒸煮损失表示粉条在煮沸过程中因溶解和分解丢失的干物质;公式(3)干物质含量是指湿粉条中不含水分的物质比例;公式(4)复水率表示干粉条在煮沸后重新吸水并膨胀的能力。
S(%)=W3W2×100 (1) L(%)=W2−W4W2×100 (2) D(%)=W2W1×100 (3) R(%)=W3−W2W2×100 (4) 1.2.4.4 感官评价
根据GB/T 23587-2009《粉条》的规定,结合GB/T 16291.1《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则》的人员选拔和培训要求,10名食品专业研究生对粉条的感官特性进行评分,评分标准见表1。每个评审员的评分满分为100分,最后在所有评分中去掉最高分和最低分,再取剩余评分的平均值,作为最终的感官评价结果。
表 1 粉条感官评分标准Table 1. Sensory evaluation score standard of starch noodles项目 评价标准 分值 外形 粗细均匀,洁白,有光泽 11~15 粗细较均匀,色泽发暗,微有光泽 6~10 粗细不均匀,色泽暗淡,无光泽 0~5 组织状态 光滑,粘弹性好,组织紧密。 11~15 光滑,粘弹性较好,组织稍松散。 6~10 不光滑,粘弹性差,组织松散。 0~5 口感 软硬适中,嚼劲足,口感爽滑。 61~70 软硬适中,嚼劲较大,口感较爽滑。 51~60 质地较软,嚼劲一般,口感较爽滑。 41~50 质地软,嚼劲差。 31~40 质地过软,无嚼劲 0~30 1.2.5 小鼠分组、建模及给药
将56只雄性昆明种小鼠适应性饲养一周,随机分为7组(n=8):正常组、D-Gal(模型组)、碎米荠组(10 mg/kg·d−1)、硒蛋白组(20 mg/kg·d−1)、碎米荠粉条组(50 g/kg·d−1)、硒蛋白粉条组(50 g/kg·d−1)、普通粉条组(50 g/kg·d−1),参照Zeng等[18]的方法,给药剂量均按硒剂量10 μg/kg·d−1折算,并将各受试物均匀混合在每日饲料当中。除正常组外,其余组小鼠腹腔注射800 mg/kg·d−1D-Gal[19−20],正常组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。实验进行8周,期间检测小鼠体重及摄食量变化。第8周末,各组小鼠经麻醉后摘眼球取血液样本并处死,分离肝脏、肾脏、脑、脂肪等组织器官进行后续实验。
1.2.6 小鼠脏器指数的测定
将以上组织器官(肝脏、肾脏、心脏、脾脏、胸腺、附睾脂肪及肾周脂肪)称重并计算脏器指数。
脏器指数(mg/g)=脏器质量小鼠体重 1.2.7 小鼠血清及组织中生化指标的测定
小鼠血清ALT、AST、TC、TG;肝脏TC、TG、HO-1、IL-6、TNF-α;血清、肝脏MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC水平均按照试剂盒说明书进行。
1.2.8 肝组织病理学切片H&E染色分析
参考文献方法[21]进行实验,将固定好的肝脏组织冲洗干净,经梯度乙醇洗涤,石蜡包埋后切片(4 μm)。后经过二甲苯、乙醇洗涤,苏木精、伊红染色,中性树胶封片,普通光镜观察。切片组织全景扫描使用3D HISTECH扫描仪,并用SlideViewer 2.5全景查看器软件进行查看。
1.2.9 免疫组化
参考文献方法[22]进行实验,将肝脏组织石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复,待切片自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤。随后将切片放入3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶。用3%BSA封闭后分别加入一抗和二抗孵育,使用DAB显色液显色,超纯水冲洗后,使用苏木素复染细胞核,并经苏木素分化液、返蓝液处理后脱水封片,白光显微镜下观察并采集图像。使用Image-Pro Plus图像分析系统对小鼠肝脏Keap1和核Nrf2表达进行测算。
1.2.10 肠道微生物多样性分析
处死小鼠前一天收集小鼠粪便,粪便样品由上海派森诺生物科技有限公司进行16S RNA测序,V3V~4区进行微生物多样性注释,前引物序列为:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3';后引物序列为:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。对于预处理完成的样品,采用 OMEGA Soil DNA Kit(D5635-02)(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)试剂盒提取核酸。对抽提完成的DNA,进行0.8%琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断,利用Nanodrop对DNA进行定量。使用Illumina NovaSeq平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序并使用QIIME2(2019.4)软件进行序列分析,测序原始数据以FASTQ格式保存。
1.2.11 短链脂肪酸(SCFAs)的测定
准确称取100 mg小鼠粪便(处死小鼠前一天收集),依次加入270 µL纯水,500 µL丙酮,50 µL 50%硫酸,500 µL甲基叔丁基醚以及200 mg氯化钠,充分混合5 min。然后在4 ℃,12000 r/min的条件下离心10 min,取上清并过0.22 µm滤膜,采用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)检测SCFAs水平[22]。
1.3 数据处理
数据以均数±标准差(SD)表示。采用SPSS Statistics 25.0软件进行数据处理,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Tukey多重比较的方法进行显著性分析,以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。采用GraphPad Prism软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 粉条品质及硒含量
感官评分可以反映出粉条的外观是否透亮、口感是否劲道等重要性质,也是评价粉条质量好坏非常重要的指标。由表2可以看出添加硒原料对粉条品质影响不大,无明显不利影响。添加硒原料对粉条蒸煮损失影响不大,无明显不利影响。三种粉条在蒸煮断条率为0,表明粉条损失较少,品质好。此外,与普通粉条相比,碎米荠粉条和硒蛋白粉条复水率、膨润度、干物质均无显著性差异(P>0.05)。结果表明,三种粉条具有蒸煮损失少、膨润度适中、口感爽滑有弹性、不易断条、耐煮性好的特性。
表 2 堇叶碎米芥及硒蛋白添加对红薯粉条品质的影响Table 2. Effects of Cardamine violifolia and selenium protein on the quality of sweet potato starch noodles粉条品质指标 堇叶碎米芥粉条 硒蛋白粉条 普通红薯粉条 感官评分 90.14±1.53a 90.33±1.64a 90.61±2.00a 透光率(%) 0.19±0.04a 0.18±0.03a 0.21±0.01a 蒸煮损失(%) 0.43±0.15a 0.33±0.09a 0.29±0.04a 断条率(%) 0 0 0 复水率(%) 185.63±1.22a 187.94±1.20a 186.30±4.77a 膨润度(%) 291.90±1.09a 292.13±1.30a 291.02±4.74a 干物质含量(%) 24.61±0.47a 23.20±0.31a 24.10±0.52a 硒含量(μg/kg) 223.13±3.22a 218.13±5.38b 0c 注:同行字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。 2.2 富硒红薯粉条对小鼠生长参数的影响
各组小鼠初始体重无差异。喂养8周后,模型组小鼠体重缓慢增加,伴有精神萎靡、运动缓慢、毛发粗糙、活动减少等状态,但与正常组相比,模型组各干预组的体重变化、摄食量、肝指数、脾指数、肾指数、心脏指数、胸腺指数、脑指数、肾周脂肪、附睾脂肪均无显著变化(P>0.05)(如图1所示)。与模型组相比,各干预组的体重变化、摄食量、肝指数、脾指数、肾指数、心脏指数、胸腺指数、脑指数、肾周脂肪、附睾脂肪均无显著变化(P>0.05)。
2.3 富硒红薯粉条对D-Gal诱导衰老小鼠肝脏组织损伤的影响
由图2A可知,正常组小鼠肝脏细胞排列细致紧密,具有良好的肝脏结构,肝索和肝细胞呈根状排列,边界清晰。模型组小鼠肝细胞形态破坏,肝索排列紊乱,细胞边界模糊,说明肝损伤模型建立成功。与模型组相比,碎米荠组、硒蛋白组、碎米荠粉条组、硒蛋白粉条组细胞排列基本有序,肝索排列相对整齐,肝细胞轻度肿胀,核结构比较清晰,基本恢复至正常水平。普通粉条组与模型组无差别。添加硒元素能够缓解由D-Gal诱导的衰老模型小鼠的肝脏组织病变现象。以上切片观察结果说明碎米荠、硒蛋白、碎米荠粉条、硒蛋白粉条均能缓解肝脏受氧化应激所致的损伤。
图 2 碎米荠、硒蛋白、富硒红薯粉条对肝脏组织形态及功能的影响注:(A)肝组织HE染色(40×),绿色区域代表细胞结构,红色箭头所指为两细胞边界形成的间隙,蓝色区域代表肝索;(B~C)血清ALT和AST水平;(D~E)肝脏TG、TC水平;(F~G)血清TC、TG水平。#与正常组相比有显著性差异(P<0.05),##与正常组相比有极显著性差异(P<0.01);*与模型组相比有显著性差异(P<0.05),**与模型组相比有极显著性差异(P<0.01),图3~图8同。Figure 2. Effects of Cardamine violifolia, selenium protein, and selenium-rich sweet potato starch noodles on hepatic histomorphology and functionALT和AST是机体内两种重要的氨基酸转移酶,是反映肝脏健康状态的重要血清学指标[23]。当肝脏受到损伤时,血清ALT和AST水平显著升高,提示肝损伤的发生[24]。如图2B~C所示,D-Gal处理极显著提高了血清ALT、AST水平(P<0.01),进一步说明肝损伤模型建立成功。碎米荠、硒蛋白、碎米荠粉条、硒蛋白粉条干预均极显著降低了血清ALT、AST水平(P<0.01),表明这些处理能够有效改善肝功能损伤。在ALT和AST的具体降低幅度上,四种样品之间趋势基本一致,表明在相同硒干预剂量下,两种硒原料及硒粉条保护D-Gal诱导肝损伤的效果一致。值得注意的是,粉条组显著降低了ALT(P<0.05)。原因可能是粉条属于淀粉制品,在制作过程中会产生少量抗性淀粉[25],据报道,抗性淀粉可以通过影响肠道-肝脏轴,恢复肝脏的代谢平衡[26]。此外,各实验组之间,肝脏TC、TG浓度(图2D~E)和血清TC、TG水平(图2F~G)均无显著性差异。综合以上结果,碎米荠、硒蛋白及其富硒粉条均能够显著改善D-Gal诱导的肝功能损伤,且不同干预组效果相近。
2.4 富硒红薯粉条改善D-Gal诱导衰老小鼠肝脏氧化应激和炎症
D-Gal诱导的肝损伤伴有氧化应激和慢性炎症反应。氧化应激水平过高以及抗氧化酶活性的下降会导致肝细胞的蛋白质、脂质以及核酸降解,从而导致肝脏损伤[21]。如图3A~G所示,D-Gal处理极显著降低了肝脏中SOD、GSH-Px、T-AOC,HO-1的水平(P<0.01),极显著增加了肝脏中MDA、IL-6、TNF-α的水平(P<0.01),表明肝脏氧化应激和慢性炎症的升高。碎米荠、硒蛋白、碎米荠粉条、硒蛋白粉条干预均显著升高了肝脏SOD、HO-1水平(P<0.01或者P<0.05),极显著降低肝脏TNF-α、IL-6水平(P<0.01)。碎米荠组、硒蛋白组和硒蛋白粉条组肝脏中GSH-Px水平相对于模型组极显著增加(P<0.01)。与模型组相比,碎米荠粉条组和硒蛋白粉条组肝脏中T-AOC水平显著增加(P<0.05),肝脏MDA浓度极显著降低(P<0.01)。对于肝脏中T-AOC和MDA组,两种富硒原料组无显著影响,而制作成富硒粉条后对结果影响显著,可能原因是在粉条中的硒和其他成分相互协同,从而对肝脏的抗氧化系统产生更显著的影响。李晓丽等[27]的研究证明硒结合刺五加多糖能很大程度的降低D-半乳糖导致的小鼠细胞的氧化应激反应。
血清氧化应激参数如图3H~K所示。D-Gal处理极显著增加血清MDA浓度(P<0.01),极显著降低血清SOD、GSH-Px、T-AOC的浓度(P<0.01)。与模型组相比,硒原料及硒粉条处理均极显著升高了血清SOD水平(P<0.01),碎米荠组、硒蛋白组、硒蛋白粉条组血清MDA水平极显著降低(P<0.01)。碎米荠组和硒蛋白组血清GSH-Px水平显著升高(P<0.05)。硒蛋白组、碎米荠粉条组和硒蛋白粉条组血清T-AOC浓度显著高于模型组(P<0.05)。粉条组肝脏和血清各项指标与模型组无显著性差异。上述结果表明,碎米荠、硒蛋白、碎米荠粉条、硒蛋白粉条对D-gal诱导的小鼠血液氧化应激同样具有明显改善作用。Zeng等[18]发现硒可以阻止D-Gal诱导小鼠肝脏和血清氧化应激(MDA)的增加,以及抗氧化酶(T-AOC、SOD、GSH-Px)的降低。这与本文的结果是一致的。此外,碎米荠、硒蛋白、碎米荠粉条、硒蛋白粉条之间改善D-Gal诱导小鼠肝脏及血液氧化应激及慢性炎症参数的效果基本一致。说明硒原料(碎米荠、硒蛋白)和硒粉条(碎米荠粉条、硒蛋白粉条)对D-Gal诱导的小鼠氧化应激均有显著的改善作用,两种硒原料作用效果类似。
2.5 富硒红薯粉条对肝脏Keap1-Nrf2信号通路的影响
Keap1-Nrf2/HO-1信号通路是机体对抗氧化应激的重要途径之一[28]。本研究通过免疫组化技术检测了肝脏Keap1和Nrf2蛋白的表达情况,分别计算阳性细胞分布面积(Area)和细胞总面积(Sum-Area)。如图4所示,与空白组比较,模型组肝脏组织Keap1表达极显著升高(P<0.01),Nrf2表达极显著下降(P<0.01),表明氧化应激导致了该信号通路的失调。与模型组比较,碎米荠组、硒蛋白组、碎米荠粉条组、硒蛋白粉条组Keap1表达极显著下降(P<0.01),Nrf2极显著升高(P<0.01)。而粉条组Keap1和Nrf2表达量与模型组无差异。结合前述肝脏HO-1及氧化应激相关参数结果,碎米荠、硒蛋白以及富硒粉条可能通过抑制Keap1-Nrf2相互作用,激活下游抗氧化相关蛋白的表达,从而缓解氧化应激引起的肝损伤。李世印[29]的研究同样发现,硒源能显著提高断奶小鼠肝脏Nrf2的相对表达量(P<0.05)并显著降低肝脏Keap1的相对表达量(P<0.05)。此外,Xu等[30]研究表明,干酪乳杆菌合成的生物硒纳米颗粒可通过上调Nrf2和HO-1蛋白水平,能够有效保护肠上皮屏障功能免受氧化损伤。这些研究结果与本研究的发现相一致,进一步支持了硒及硒粉条通过调节Keap1-Nrf2/HO-1信号通路缓解氧化应激改善肝损伤的作用。
2.6 富硒红薯粉条对肠道微生物多样性的影响
为了进一步探索富硒粉条对D-Gal诱导肝损伤的保护机制,本研究重点检测了正常、模型、硒粉条及普通粉条组小鼠粪便微生物组成,考察富硒粉条对小鼠肠道微生物结构的影响。Alpha多样性反映样品内物种的丰富度和均一性[31]。随着序列数的增加,稀释曲线趋于平缓,说明测序样本数据量合理(图5A)。多样性指数值的高低可反映样品所包含的微生物群落内复杂度的大小。其中Chao1和Observed species指数代表菌群丰度(图5B~C);Shannon和Simpson指数代表菌群多样性(图5D~E)。如图5B~E所示,模型组Chao1、Observed species、Shannon和Simpson多样性指数极显著低于正常组(P<0.01),表明D-Gal处理会降低小鼠的菌群丰度和多样性,这与Li等[32]的研究结果一致。硒蛋白粉条组Chao1和Observed species指数显著低于模型组(P<0.05),碎米荠粉条组、硒蛋白粉条组Shannon指数和Simpson指数极显著低于模型组(P<0.01),表明菌群多样性降低,肠道微生物菌群发生改变。粉条组Shannon指数极显著低于模型组(P<0.01),Chao1、Simpson和Observed species与模型组无显著性差异。这些多样性指数的变化可能反映了富硒粉条对肠道菌群的调节机制较为复杂。Liu等[33]发现富硒鸡蛋可以调节D-Gal诱导小鼠的氧化应激,但其对肠道菌群的作用则显示,尽管某些菌群比例有所改善,但多样性并未显著提高,并有所下降,这与本文的研究结果一致。
Venn图用于评判各种样本之间的相似程度,能够直观地反映出组与组之间的相似部分和独有部分。结果如图5F所示,本研究共获得2542个操作分类单元(Operational taxonomic units,OTU),5组共有37个OTU。这表明虽然各组之间存在共有的微生物群落,但也存在显著的独特微生物组成。此外,主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA),是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法。如图5G所示,5个组相互区分,表明它们具有不同的微生物组成。这种组间的区分进一步说明了各组之间存在不同微生物组成,表明硒粉条干预措施可能通过改变肠道菌群结构,影响肠道健康和肝脏代谢功能。
2.7 富硒红薯粉条对D-Gal诱导衰老小鼠肠道菌群组成的影响
为了进一步探讨肠道微生物群组成的差异,本研究比较了各组在不同分类水平上的微生物群落结构。图6显示了粪便中的主要菌门水平,小鼠肠道菌群主要由Bacteroidota、Firmicutes和Verrucomicrobiota等菌门组成,其中Firmicutes和Bacteroidota的比值(F/B)是衡量机体衰老的常见指标之一。与正常组相比,模型组Bacteroidota、Verrucomicrobiota和Acidobacteriota相对丰度极显著升高(P<0.01),而Firmicutes相对丰度和F/B比值极显著下降(P<0.01),该结果与Gao等[19]和Sheng等[34]的研究结果一致。在不同干预组中,碎米荠粉条和硒蛋白粉条均极显著降低了Bacteroidota和Acidobacteriota的相对丰度(P<0.01)。此外,硒蛋白粉条组还极显著增加了F/B比值和Verrucomicrobiota的相对丰度(P<0.01)。粉条组相对于模型组,Acidobacteriota极显著降低,Campylobacterota相对丰度极显著升高(P<0.01),这一现象可能与环境因素相关,如饮食。据报道,饮食是改变肠道微生物组成的主要因素[35]。硒粉条及粉条干预引起的肠道菌群组成变化,可能与其饮食成分的差异有关,具体机制有待进一步研究。
粪便中最丰富的前30个属如图7A~I所示。与正常组相比,模型组Akkermansia、Alistipes、Enterorhabdus和Erysipelatoclostridium相对丰度极显著升高,Lachnoclostridium相对丰度极显著降低(P<0.01)。Blautia也是一种SCFAs分泌菌属,具有缓解炎症、维持肠道稳态等功能[36−37]。Bacteroides[38]、Lachnoclostridium[39]作为有益菌,具有抗炎等机体保护功能。与模型组相比,碎米荠粉条组和硒蛋白粉条组Lachnoclostridium和Blautia相对丰度极显著升高(P<0.01)。硒蛋白粉条组Akkermansia相对丰度极显著高于模型组(P<0.01),该菌种是一种新型益生菌,具有抗炎,维持机体肠道健康和产SCFAs等作用[40]。碎米荠粉条组Bacteroides菌落相对丰度极显著高于模型组(P<0.01)。与此同时,两种富硒粉条和粉条组显著下调了与炎症相关的有害菌,如Alistipes[41]、Enterorhabdus[42]和Erysipelatoclostridium[43]的相对丰度(P<0.05)。此外,相比于模型组,两种富硒粉条组Lactobacillus显著降低(P<0.05),而粉条组极显著升高(P<0.01),可能是小鼠饮食结构的差异有关。以上结果说明,富硒粉条通过调节有害菌和益生菌的平衡,改善了D-半乳糖诱导的小鼠肠道紊乱,一定程度上恢复了小鼠肠道的健康生态环境。
2.8 富硒红薯粉条对D-Gal诱导衰老小鼠肠道菌群衍生代谢物的影响
短链脂肪酸(Short-chain fatty acid,SCFAs)是肠道菌群衍生的有益代谢产物,是肠-肝轴的重要介质[44]。研究表明,丁酸盐可通过抑制转录因子κB(NF-κB)的激活,从而减少促炎细胞因子的分泌,发挥抗炎作用。此外,丁酸盐和丙酸盐还可通过激活Keap1-Nrf2信号通路以维持机体氧化还原稳态[45]。如图8A~G所示,与正常组相比,模型组小鼠粪便中总短链脂肪酸、乙酸含量显著降低(P<0.05)。干预组中,碎米荠粉条组总短链脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量极显著高于模型组(P<0.01)。相对于模型组,硒蛋白粉条组总短链脂肪酸、乙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸含量显著升高(P<0.05)。本文的研究结果表明富硒粉条,显著上调粪便的SCFAs浓度,这与上述硒粉条上调Akkermansia、Blautia等SCFAs产生菌属的结果相一致。普通粉条粪便SCFAs浓度与模型组无差异。结果表明,富硒粉条可能通过改善肠道菌群代谢产物改善D-Gal引起的肝损伤。此外,如图9A~B所示,Blautia和Lachnoclostridium等有益菌与抗氧化相关指标(血清SOD、GSH-Px、T-AOC和肝脏血清SOD、GSH-Px、T-AOC)呈显著正相关(P<0.05),SCFAs、乙酸、丁酸与血清ALT、AST呈显著负相关,与抗氧化相关指标呈显著正相关(P<0.05),进一步说明调节肠道微生物及其衍生代谢物可能是硒粉条改善肝损伤的潜在机制。
3. 结论
本研究通过将碎米荠粉和硒蛋白添加至粉条中,探究碎米荠粉、硒蛋白以及富硒粉条对D-Gal诱导小鼠的肝损伤的影响。结果表明,硒原料和硒粉条均显著改善了肝功能,抑制了肝脏的氧化应激及慢性炎症,其作用机制跟激活肝脏Keap1-Nrf2/HO-1抗氧化信号通路密切相关。肠道微生物群及其代谢产物结果表明,富硒粉条可能通过增加肠道有益菌属(Akkermansia、Bacteroides、Blautia等)并下调有害菌(Alistipes、Erysipelatoclostridium、Enterorhabdus等)的相对丰度来改善肠道微生物组成,增加有益代谢产物SCFAs的分泌,起到肝保护的作用。此外,相关性分析进一步揭示,硒粉条引起的肠道细菌和微生物代谢物的改变与大部分肝功能、氧化应激和炎症指标的改善显著相关,提示硒粉条可能通过肠-肝轴发挥肝脏保护作用。研究结果为粉条营养及功能强化提供了新思路,为富硒粉条的开发提供了理论依据。
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图 2 碎米荠、硒蛋白、富硒红薯粉条对肝脏组织形态及功能的影响
注:(A)肝组织HE染色(40×),绿色区域代表细胞结构,红色箭头所指为两细胞边界形成的间隙,蓝色区域代表肝索;(B~C)血清ALT和AST水平;(D~E)肝脏TG、TC水平;(F~G)血清TC、TG水平。#与正常组相比有显著性差异(P<0.05),##与正常组相比有极显著性差异(P<0.01);*与模型组相比有显著性差异(P<0.05),**与模型组相比有极显著性差异(P<0.01),图3~图8同。
Figure 2. Effects of Cardamine violifolia, selenium protein, and selenium-rich sweet potato starch noodles on hepatic histomorphology and function
表 1 粉条感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation score standard of starch noodles
项目 评价标准 分值 外形 粗细均匀,洁白,有光泽 11~15 粗细较均匀,色泽发暗,微有光泽 6~10 粗细不均匀,色泽暗淡,无光泽 0~5 组织状态 光滑,粘弹性好,组织紧密。 11~15 光滑,粘弹性较好,组织稍松散。 6~10 不光滑,粘弹性差,组织松散。 0~5 口感 软硬适中,嚼劲足,口感爽滑。 61~70 软硬适中,嚼劲较大,口感较爽滑。 51~60 质地较软,嚼劲一般,口感较爽滑。 41~50 质地软,嚼劲差。 31~40 质地过软,无嚼劲 0~30 表 2 堇叶碎米芥及硒蛋白添加对红薯粉条品质的影响
Table 2 Effects of Cardamine violifolia and selenium protein on the quality of sweet potato starch noodles
粉条品质指标 堇叶碎米芥粉条 硒蛋白粉条 普通红薯粉条 感官评分 90.14±1.53a 90.33±1.64a 90.61±2.00a 透光率(%) 0.19±0.04a 0.18±0.03a 0.21±0.01a 蒸煮损失(%) 0.43±0.15a 0.33±0.09a 0.29±0.04a 断条率(%) 0 0 0 复水率(%) 185.63±1.22a 187.94±1.20a 186.30±4.77a 膨润度(%) 291.90±1.09a 292.13±1.30a 291.02±4.74a 干物质含量(%) 24.61±0.47a 23.20±0.31a 24.10±0.52a 硒含量(μg/kg) 223.13±3.22a 218.13±5.38b 0c 注:同行字母不同表示有显著性差异(P<0.05)。 -
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