Isolation, Identification and Analysis of Growth Characteristics of Functional Potential Fungi from Tibetan Traditional Air-Dried Yak Meat
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摘要: 以西藏传统风干牦牛肉为基质，分离筛选具有功能潜力的发酵真菌。通过形态学观察、生理生化分析，以及ITS序列分析进行鉴定，以产蛋白酶、脂肪酶特性，耐NaCl、NaNO2能力和耐酸性等评价菌株功能潜力和生长特性。结果表明，从西藏六地样品中共分离得到5株真菌，经鉴定包含2株马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus，编号B2和sn）、2株扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera，编号C-2和C-7）及1株涎沫假丝酵母（Candida zeylanoides，编号M1-3）。其中M1-3、B2、C-2产蛋白酶、脂肪酶能力较强，可发酵葡萄糖、蔗糖和乳糖，能耐受8.0%的NaCl和250 mg/kg 的NaNO2浓度，在pH3.0~6.0酸性条件下均能生长，但随着pH的不断降低生长能力也不断被抑制，适宜生长范围为pH5.0～6.0。此外，3株菌株之间无拮抗作用，可良好共存，对东京芽孢杆菌、隆德假单胞菌、黑曲霉等具有一定抑菌效果，是具有良好生长特性的功能潜力真菌。研究结果为风干牦牛肉中功能菌株分离筛选及其发酵剂开发提供理论依据。Abstract: Fungi with bioactive potential were isolated from Tibetan traditional air-dried yak meat. The stains were identified by morphological observation, physiological and biochemical analysis, ITS sequence analysis, functional potential and growth characteristics including protease and lipase production, tolerance to NaCl and NaNO2 and acid resistance. The results showed that five strains were isolated from samples collected from six Tibetan regions, including two strains of Kluyveromyces marxianus (B2, sn), two strains of Saccharomycopsis fibuligera (C-2, C-7) and one strain of Candida zeylanoides (M1-3). Among them, M1-3, B2 and C-2 had strong protease and lipase production abilities. They could ferment glucose, sucrose lactose and tolerate 8.0% NaCl with 250 mg/kg NaNO2. They can grow at pH values between 3.0~6.0. However, the growth of stains was continuously inhibited with the decreasing pH, and the optimum pH ranged from 5.0 to 6.0. In addition, there was no antagonistic effect among the three strains and they could coexist well. These three stains had a certain antibacterial effect on Bacillus toyonensis, Pseudomonas lundensis and Aspergillus niger, which indicates they arebioactive potential stains with good growth abilities. The results provide a theoretical basis for the isolation and screening of functional strains in Tibentan air-dried yak meat and the development of fermentation agents.
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Keywords:
- air-dried yak meat /
- fungi /
- isolation and identification /
- growth characteristics
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西藏自治区牦牛资源量大，能够在西藏地区（海拔2500~6000 m）气候恶劣的条件下进行繁衍生长[1]。牦牛肉是西藏人民摄取优质蛋白，获取机体所需高能量的重要食物来源，而风干牦牛肉则是一种独特的传统藏式牛肉食品形态[2]。这种传统风干牦牛肉属于发酵肉制品[3]，是利用西藏高原特殊的气候因子（低温、高风和低气压等），将牦牛肉进行自然风干制成，并具有营养丰富、风味独特、耐咀嚼和耐储存的优点[4]。但是，风干牦牛肉也存在发酵周期不稳定和产品品质不标准等产业共性问题[5]。
在传统发酵肉制品中，微生物是影响其色泽、品质、风味、滋味和安全性的主要因素[6]，通过筛选具有发酵功能的微生物，进行生长特性等评价，可为开发功能性发酵剂并应用于发酵肉制品中提供重要支撑[7]。王松等[8]从四川发酵腊肉中共分离出13株酵母菌，发现均具备具有脂肪酶活性和丰富发酵产品风味的功能；Iucci等[9]表明，在发酵香肠表面接种酵母菌，能显著降低香肠水分活度，促进脂肪和蛋白质的水解；Olesen等[10]发现近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）发酵香肠的口感优于汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）；Zhang等[11]发现藏区曲拉中的酵母菌数量比云南乳饼高34倍，其中西藏曲拉的优势菌株为发酵毕赤氏酵母（Pichiafermentans）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。因此，具有发酵功能的真菌在改善发酵肉制品色泽、风味，提升安全性等方面显现良好的潜力[12]。目前，关于西藏传统风干牦牛肉的研究报道较少，主要集中在微生物菌群组成及发酵品质解析方面，对其发酵功能微生物的特性尤其对发酵功能真菌尚无相关研究报道。因此，本研究拟从西藏风干牦牛肉中分离真菌，筛选适合发酵肉制品的优良菌株，为发酵肉制品加工用发酵剂的开发利用提供菌种资源，为提升西藏地区肉制品加工行业水平，解决产业共性问题提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
风干牦牛肉样品 采自西藏昌都市、山南市、拉萨市、那曲市、日喀则市、林芝市等六个地区，共16份样品，均为牧民家庭式生产，无任何添加剂。采集好的样品装入无菌袋，带回实验室后于−20 ℃冰箱储藏、待用；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、氯霉素 上海麦克林生化科技有限公司；脱脂牛奶 品渥食品股份有限公司；亚硝酸钠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、三丁酸甘油酯、氯化钠等 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；YPD固体培养基、YPD液体培养基、PDA培养基、WL营养琼脂、TSB培养基、孟加拉红琼脂、BIGGY琼脂 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
真菌分离筛选培养基配方（g/L）：YPD固体培养基49 g、YPD液体培养基50 g、PDA培养基46 g、WL琼脂培养基78.25 g，孟加拉红琼脂培养基36.6 g、BIGGY琼脂培养基44 g、胰蛋白胨大豆肉汤30 g；产蛋白酶初筛培养基配方（g/L）：蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、脱脂牛奶200 mL、琼脂15 g；产脂肪酶初筛培养基配方（g/L）：蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、三丁酸甘油酯10 mL、琼脂15 g；产蛋白酶发酵培养基配方（g/L）：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g， Na2HPO4 4 g，KH2PO4 3 g，NaCl 1 g，CaCl2 1 g；产脂肪酶发酵培养基参照配方（g/L）：橄榄油乳化液10 mL、（NH4）2SO4 10g、K2HPO4 10 g、MgSO4·7H2O 10 g、NaCl 5 g、蛋白胨20 g、蔗糖15 g。
SW-CJ-1C型双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；JA2002电子天平 上海天美天平仪器有限公司；INFINITEE PLEX多功能酶标仪 北京普朗新技术有限公司；LHP-250恒温恒湿培养箱 上海三发科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 风干牦牛肉中真菌的分离鉴定
1.2.1.1 分离纯化
参考廖娟等[13]的方法，并稍作修改。在无菌条件下进行操作，将传统风干牦牛肉在无菌环境下捣碎，准确称取25 g，分散于225 mL无菌生理盐水中，并进行10倍梯度稀释，选取10−3、10−4、10−5下的梯度稀释液，分别涂布于加有氯霉素的YPD、PDA、孟加拉红和WL营养琼脂平板上培养（28 ℃，48 h），挑取单菌落进行重复划线培养，获得纯化的菌株，并保存于甘油管中，−80 ℃冻存。菌株活化参照何萍等[14]的方法，将保存的菌株接种于200 mL YPD液体培养基中培养（28 ℃，48 h）。
1.2.1.2 形态学及生化鉴定
参考魏景超[15]的真菌鉴定手册方法，将待测菌株接种于YPD平板上培养（28 ℃，48 h），待菌落生长后，观察菌落外形，同时对菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶检验[16]。
1.2.1.3 分子生物学鉴定
参考文献[17]的分子生物学鉴定方法，用酵母基因组提取试剂盒提取酵母菌基因组DNA，以提取的DNA为模板，PCR扩增引物为ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反应体系（50 μL）：PCR Buffer10 μL、dNTPs 2 μL、上下引物各1 μL、ddH20 50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共29个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增送至上海凌恩生物科技有限公司测序，将测定获得的序列在NCBI数据库中进行BLAST相似性比对、同源性分析，并使用MEGA 5.0软件构建系统发育树，根据分子进化关系确定种属水平。
1.2.2 菌株功能特性分析
1.2.2.1 产H2S、H2O2、粘性测定
参考Zhan等[18]和张二豪等[19]的方法，将待测菌株分别接种于营养琼脂BIGGY、YPD上培养（28 ℃，48 h），然后分别进行产H2S、H2O2和产粘性测定。在BIGGY平板上，根据菌落颜色变化观察产H2S结果，菌落颜色越深，表明菌株产H2S越多；从YPD平板中挑取单菌落于载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，观察菌株是否产生气泡；在YPD平板上直接挑起单菌落，观察是否有拉丝现象，若拉丝则证明菌株产粘性。
1.2.2.2 糖发酵能力测定
参考刘晓柱等[20]的方法，并稍做修改。取1 mL浓度为1×106 CFU/mL菌悬液，分别接种于含终浓度为2%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖的0.6%的酵母浸粉溶液中，装入含倒置杜氏小管的试管中培养（28 ℃，48 h），观察杜氏小管顶部是否有气泡产生，若产气泡则为阳性（+）、不产则为阴性（−）。
1.2.2.3 产蛋白酶、脂肪酶酶活测定
参考张红等[21]的方法，并稍作修改。将分离纯化的菌株，接种于产蛋白酶（双层脱脂牛奶）和产脂肪酶（三丁酸甘油酯）平板上培养（28 ℃，48 h），观察和测定菌株所产透明圈直径和菌落直径，计算HE比值（HE值=水解圈直径/菌落直径），并参考杨勇等[22]的方法，利用Folin-酚法测定蛋白酶活力、NaOH滴定法测定脂肪酶活力。
1.2.3 菌株生长特性分析
1.2.3.1 生长、产酸测定
参考Wei等[23]的方法，将待测菌株接种于YPD液体培养基中培养（28 ℃，72 h），间隔12 h测定OD600和pH，以无菌YPD液体培养基为空白对照，分别绘制生长曲线和产酸曲线。
1.2.3.2 耐NaCl、NaNO2和酸性测定
参考Wang等[24]的方法对菌株进行耐NaCl、NaNO2和酸性测定，并稍做修改。将菌株接种到不同盐浓度（0%、2%、4%、6%、8%、10%）、不同NaNO2浓度（0、50、100、150、200、250 mg/kg）、不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）的YPD液体培养基中培养（28 ℃，48 h），测定液体培养基的OD600值，以无菌YPD液体培养基为空白对照，比较不同菌株的生长情况。
1.2.3.3 拮抗性试验
参考Merchán等[25]的方法，将待测菌株在无菌条件下用接菌环挑取菌株的单菌落交叉划线进行培养（28 ℃，48 h），观察菌株生长情况。
1.2.3.3 抑菌性能测定
参考García-Béjar等[26]的方法，采用牛津杯双层琼脂扩散法测定菌株的抑菌能力。操作步骤：将水琼脂均匀倾倒至四分格培养皿中，待凝固后放置牛津杯，取1×106 CFU/mL指示菌100 μL与自然冷却至50 ℃左右的胰蛋白胨大豆琼脂混合后倾注于培养皿内，待凝固后拔出牛津杯，向孔内分别打入100 μL供试菌（1×107 CFU/mL），空白对照孔内打入无菌液体培养基进行培养（28 ℃，48 h），培养结束后测定抑菌圈直径。
1.3 数据处理
所有试验设置3次平行，结果以平均值±标准差形式表示。采用SPSS 26.0软件进行统计分析，显著性差异分析为单因素方差分析，利用Origin 9.0软件作图。
2. 结果与分析
2.1 风干牦牛肉中真菌的分离、鉴定
从西藏六地传统风干牦牛肉中共分离纯化到19株真菌，通过形态学观察及显微镜镜检，去除形态特征相似的菌株，共筛选出5株酵母菌，编号为B2、sn、M1-3、C-2、C-7，这5株酵母菌均在发酵食品用微生物菌种名单[27]。其菌落形态和细胞形态见图1及表1。由图1及表1可知，5株酵母菌菌落形态边缘均较整齐，颜色为白色、灰白色和乳白色，细胞形态多数为椭圆形和圆形。
表 1 菌株形态特征Table 1. Characteristics of morphology strain菌株编号 菌落形态 细胞形态 B2 圆形，中间突起，表面光泽，湿润，白色 椭圆形 sn 圆形、中间突起，表面光泽，湿润，呈姜黄色 椭圆形 M1-3 圆形，中间突起，表明光泽，湿润，灰白色 球形 C-2 圆形，表明光泽，扁平，粗糙，乳白色 圆形 C-7 圆形，表明褶皱、无光泽，扁平，粗糙，灰白色 圆形 菌株的系统发育树如图2所示。菌株B2、sn与马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）聚于同一分支，M1-3与涎沫假丝酵母（Candida zeylanoides）聚于一支，C-2、C-7与扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）聚于同一分支，结合形态学特征分析，菌株B2和sn被鉴定为马克斯克鲁维酵母，M1-3被鉴定为涎沫假丝酵母，C-2、C-7被鉴定为扣囊复膜孢酵母。
2.2 菌株功能特性分析
2.2.1 产H2S、H2O2、粘性结果
菌株产过氧化氢酶和产粘性结果如表2所示。由表可见，所有菌株过氧化氢酶结果呈阳性，表明5株酵母菌均具有较好的产过氧化氢酶能力。研究表明，酵母菌通过产生过氧化氢酶，其能够消耗发酵肉制品中的氧气含量，抑制脂质的自动氧化酸败现象，有利于发酵肉制品的色泽稳定[28]。所有菌株中，仅sn菌株产少量粘性，且略带刺鼻味。
表 2 菌株产过氧化氢酶、粘性结果Table 2. Physiological and biochemical characteristics results of strains编号 过氧化氢酶试验 产粘性试验 B2 阳性 − sn 阳性 + M1-3 阳性 − C-2 阳性 − C-7 阳性 − 注：“−”：不产粘性、“+”：产粘性。 硫化氢（H2S）是对发酵食品风味有不良的影响。在发酵过程中，通过微生物的硫代谢产生H2S，它的挥发性较强，具有不愉快的气味，通常描述为臭鸡蛋味等。因此，筛选低产或者不产H2S的发酵菌株，对于控制发酵食品中不良风味的产生和保证发酵食品品质具有重要意义[29]。BIGGY培养基是一种选择性培养基，可与H2S发生颜色反应，颜色越深，说明菌株产H2S越多。培养基上菌株的颜色可分为白色、浅棕褐色、棕褐色、浅褐色、褐色和黑色6个等级。如图2所示，sn菌株产硫化氢较多，其余菌株均不产H2S。硫化氢产生的不良气味会影响产品风味和品质，且对人体有害[30]。因此，sn菌株不适合用于食品发酵，B2、C-2、C-7、M1-3可作为优良的发酵剂菌种资源。
2.2.2 菌株糖发酵能力分析
菌株糖发酵能力结果如表3所示。所有菌株均可利用葡萄糖产酸产气，其中B2、sn、C-2和C-7可利用蔗糖和乳糖产酸产气、M1-3可利用麦芽糖和半乳糖产酸产气，表明，在单糖半乳糖中菌株M1-3有良好的发酵效果，在双糖蔗糖和乳糖中，菌株B2、sn、C-2、C-7具有较好的发酵能力。与田辉等[31]研究马克斯克鲁维酵母糖发酵能力的结果相似。
表 3 菌株糖发酵能力测定结果Table 3. Determination results of sugar fermentation capacity of strains菌株 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 半乳糖 B2 + + − + − sn + + − + − M1-3 + − + − + C-2 + + − + − C-7 + + − + − 注：“+”：能发酵；“−”：不能发酵。 2.2.3 产蛋白酶、脂肪酶活性测定
菌株产蛋白酶结果如表4和图4所示。根据双层脱脂牛奶培养基上的水解圈，发现菌株M1-3的水解圈直径与菌落直径比值最大，为3.48，其次是C-2和C-7，分别为2.80和2.71，B2和sn的直径比则相对最低。由蛋白酶活性测定结果发现，酶活最高的也为M1-3菌株，其次是B2、C-2，分别为76.20、61.27和67.86 U/mL，而sn和C-7的酶活性则明显较低。表明，M1-3、B2和C-2菌株有较好的产蛋白酶能力。有研究报道，产蛋白酶微生物可以降低风干肉的pH，还能在一定程度上改善产品的色泽和质构[32]。
表 4 菌株产蛋白酶活性测定结果Table 4. Determination results of protease activity of strains菌株编号 菌落直径d
（mm）水解圈直径
（mm）直径比（d） 蛋白酶活
（U/mL）B2 8.24±0.51ab 19.22±0.33bc 2.33±0.13bc 61.27±0.84c sn 7.70±0.47ab 17.50±0.90c 2.27±0.25bc 47.62±0.55e M1-3 7.32±0.98b 25.50±0.89a 3.48±0.63a 76.20±0.20a C-2 7.30±0.63b 20.50±2.17b 2.80±0.05b 67.86±0.58b C-7 7.44±1.21b 20.20±0.92b 2.71±0.53bc 28.33±0.50f 注：同一列中不同字母表示差异显著（P<0.05），表5同。 ![]()
图 4 菌株在产蛋白酶培养基上的水解圈注：每个培养皿的右上角圆孔为空白对照。Figure 4. Hydrolysis circle produced by strains on protease producing medium菌株产脂肪酶结果如表5和图5所示。所有菌株均产脂肪酶且水解圈形成大小不同，说明产酶强弱效果也不同[31]。依据三丁酸甘油酯培养基上的水解圈，发现菌株B2的水解圈直径与菌落直径比值最大，为2.10，其次是C-2和C-7，分别为1.91和1.99，sn和M1-3的直径比则相对较低。由脂肪酶活性测定结果发现，酶活最高的为B2，其次是C-2和C-7，分别为58.91、40.18和46.76 U/mL，而sn和M1-3酶活性则显著较低。表明，B2、C-2和C-7菌株有较强的产脂肪酶能力，可用来发酵肉制品。Lv等[33]研究报道，产脂肪酶酵母菌在接种发酵香肠后可提升产品香气，并通过解脂的作用影响香肠色泽。
表 5 菌株产脂肪酶活性测定结果Table 5. Determination results of lipase-producing of strains菌株编号 菌落直径d
（mm）水解圈直径
（mm）直径比值
（d）脂肪酶活
（U/mL）B2 7.0±1.05b 14.7±1.76ab 2.10±0.33a 58.91±0.28a sn 7.22±0.19b 13.33±0.23b 1.84±0.04a 35.11±0.77d M1-3 8.5±0.65b 15.0±0.99ab 1.76±0.18a 33.26±0.01d C-2 8.0±0.96b 15.3±1.53a 1.91±0.37a 40.18±0.05c C-7 7.36±0.77b 14.7±0.44ab 1.99±0.14a 46.76±0.03b ![]()
图 5 菌株在三丁酸甘油酯平板上产生的水解圈注：每个培养皿右上角圆孔为空白对照。Figure 5. Hydrolysis circle produced by strains on tributyric glycerol ester plate2.3 菌株生长特性分析
2.3.1 生长能力测定
生长曲线是微生物生长状况的一个宏观表现。可以大致确定微生物延滞期、对数期、稳定期、衰亡期，为微生物在工业生产中提供依据。菌株生长曲线结果如图6所示。由图6可知，所有菌株的生长趋势相似，均能较好的生长。0～6 h为菌株生长延滞期，6～24 h为生长对数期，生长对数期结束时OD600平均达到1.3左右；随后进入生长稳定期，因此菌株活化培养时间为24～48 h[34]。
2.3.2 产酸能力测定
菌株产酸速率结果如图7所示。由图7可知，所有菌株的产酸趋势相似，与生长曲线变化相对应。随着发酵时间的延长，pH不断降低，其5株菌株pH值无显著差异，6 h开始pH保持在4.5～5.0之间，说明5株酵母菌均有较强的产酸能力。在发酵食品中，低pH（4.0～5.0）环境有助于抑制腐败微生物生长，保障产品的安全[35−36]。
2.3.3 耐NaCl能力测定
酵母菌常被应用于一些高盐发酵食品中，如：酱油、豆瓣酱、辣椒酱、腊肉、火腿、腊鱼等，这些发酵食品中的食盐含量也有所不同，含盐量在2%～20%[37−39]，因此具有一定的耐NaCl能力至关重要。
本研究对耐NaCl能力测定结果发现，随着NaCl浓度的增加，所有菌株的生长能力呈下降趋势，但下降不明显（见图8）。当NaCl浓度范围2%～4%时，5株菌株均可以生长，与对照组相比并没有显著性差异；在NaCl浓度范围6%～8%时，菌株生长能力开始呈下降趋势，其中菌株B2和C-2表现优于其余菌株，与对照组相比；在NaCl浓度为10%时，5株菌株生长能力受到显著抑制（P<0.05），5株菌株均可微弱生长，与Karim等[40]探究马克斯克鲁维酵母和扣囊复膜孢酵母耐NaCl能力的结果相似。根据耐盐菌随盐浓度升高生长受到抑制，达到其最适浓度后, 耐盐特性得到激发从而生长活力恢复的特点[41]，其中菌株B2和C-2具有耐高盐能力。
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2.3.4 耐亚硝酸盐能力测定
肉制品中添加亚硝酸盐的主要目的是改善产品的色泽、风味和抑制有害菌的生长[42]。用来生产肉品发酵剂的微生物一般要求可耐150 mg/kg的亚硝酸盐浓度[43]。为研究菌株对亚硝酸盐的耐受能力，以含有0～250 mg/ kg NaNO2的YPD液体培养基检测菌株耐亚硝酸盐能力，结果如图9所示。由图9可知，菌株在50～250 mg/kg NaNO2培养体系下具有较好的耐亚硝酸盐能力。在NaNO2 浓度为50～100 mg/ kg范围内，所有菌株生长良好；在NaNO2浓度为150 mg/kg时，相比不添加NaNO2的生长能力来看，5株菌株耐NaNO2能力分别达到48%、25%、54%、29%、35%；在NaNO2 浓度200～250 mg/kg范围内，菌株C-2耐受能力优于其余菌株，达到41%。因此，从亚硝酸盐耐受的角度考虑，B2、C-2、M1-3菌株可作为优良发酵剂。
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图 9 不同NaNO2浓度对菌株生长能力影响Figure 9. The effect of different concentrations of NaNO2 on the growth ability of bacterial strains2.3.5 耐酸能力测定
菌株对耐酸能力结果如图10所示。由图10可知，随着液体培养基中pH的增加，菌株生长能力均受到中度抑制。在pH=6.0条件下所有菌株生长状态较好，OD600值均在0.5以上；pH=5.0条件下，所有菌株OD600值开始显著下降（P<0.05），但C-2和M1-3菌株生长能力优于其余菌株。在pH3.0～4.0范围内生长较差。结果表明，C-2和M1-3菌株适宜在pH5.0～6.0范围内生长。相关研究也表明，酵母菌在酸性环境（pH≤4.0）中生长代谢受到显著抑制（P<0.05）[44−45]。
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图 10 不同pH条件下菌株的生长能力影响Figure 10. The influences of different pH on the growth ability of strains2.3.6 拮抗能力测定
作为发酵剂用的微生物菌株，之间如果存在拮抗则会复配使用时影响它们各自作用的发挥，因此，要考虑不同菌株之间是否存在相互拮抗作用。本研究测定了5株菌株之间的拮抗性，共10个组合，结果见表6和图11。由表6和图11可知，sn与B2、C-2、C-7、M1-3之间出现两两拮抗现象，这可能是由于菌株的来源、种类、特性的不同，菌株产生的胞外分泌物可能会有一定的抑制作用进而表现为菌株间的拮抗效应[46]。菌株B2和C-2、B2和M1-3、C-2和M1-3之间无拮抗现象，说明这三株菌均可良好共存。
表 6 菌株拮抗性测定结果Table 6. Determination results of antagonistic test of strains菌株编号 B2 sn C-2 C-7 M1-3 B2 / + − − − sn − / + + + C-2 − + / − − C-7 − + − / − M1-3 − + − − / 注：“/”：同种菌之间并未进行拮抗描述；“+”：有拮抗效应；“−”：无拮抗效应。 2.3.7 抑菌能力测定
菌株抑菌活性结果如表7所示。由表7可知，所有菌株均有一定的抑菌能力，其中B2菌株对东京芽孢杆菌、隆德假单胞菌和黑曲霉有抑菌作用，C-2菌株对东京芽孢杆菌和隆德假单胞菌有抑菌作用，M1-3对隆德假单胞菌和粘质沙雷氏菌有抑菌作用。
表 7 菌株抑菌能力测定结果Table 7. Determination results of antibacterial capacity of strains菌株编号 指示菌株 东京芽孢杆菌 隆德假单胞菌 黑曲霉 粘质沙雷氏菌 B2 + + + − sn + + − − M1-3 − + − + C-2 + + − − C-7 + + − − 注：抑菌性根据抑菌圈直径（d）判断，“+”：有抑菌圈；“-”：无抑菌圈。 3. 结论
本试验从西藏传统风干牦牛肉中共筛选出5株酵母菌，分别命名为B2、sn、M1-3、C-2、C-7。通过形态特征观察和生理生化鉴定，菌株B2和sn被鉴定为马克斯克鲁维酵母，M1-3被鉴定为涎沫假丝酵母，C-2和C-7被鉴定为扣囊复膜孢酵母。由功能特性和生长特性分析结果发现，B2菌株产脂肪酶活能力较强，酶活达到58.91 U/mL，M1-3和C-2菌株产蛋白酶活能力较强，酶活分别为76.20和67.86 U/mL。三株菌（B2、M1-3、C-2）可发酵葡萄糖、蔗糖和乳糖，24～48 h为稳定生长期，适宜生长pH范围为5.0～6.0，能耐受8.0%的NaCl和250 mg/kg 的NaNO2浓度。此外，3株菌株之间无拮抗作用，均可良好共存；B2对东京芽孢杆菌、隆德假单胞菌和黑曲霉，C-2对东京芽孢杆菌和隆德假单胞菌，M1-3对隆德假单胞菌和粘质沙雷氏菌具有一定抑菌效果，是具有良好生长特性的功能潜力真菌。研究结果为发酵肉制品加工用发酵剂的开发利用提供菌种资源，同时为提升西藏地区肉制品加工行业水平，解决产业共性问题提供技术支撑。
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图 4 菌株在产蛋白酶培养基上的水解圈
注：每个培养皿的右上角圆孔为空白对照。
Figure 4. Hydrolysis circle produced by strains on protease producing medium
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图 5 菌株在三丁酸甘油酯平板上产生的水解圈
注：每个培养皿右上角圆孔为空白对照。
Figure 5. Hydrolysis circle produced by strains on tributyric glycerol ester plate
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图 9 不同NaNO2浓度对菌株生长能力影响
Figure 9. The effect of different concentrations of NaNO2 on the growth ability of bacterial strains
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图 10 不同pH条件下菌株的生长能力影响
Figure 10. The influences of different pH on the growth ability of strains
表 1 菌株形态特征
Table 1 Characteristics of morphology strain
菌株编号 菌落形态 细胞形态 B2 圆形，中间突起，表面光泽，湿润，白色 椭圆形 sn 圆形、中间突起，表面光泽，湿润，呈姜黄色 椭圆形 M1-3 圆形，中间突起，表明光泽，湿润，灰白色 球形 C-2 圆形，表明光泽，扁平，粗糙，乳白色 圆形 C-7 圆形，表明褶皱、无光泽，扁平，粗糙，灰白色 圆形 
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表 2 菌株产过氧化氢酶、粘性结果
Table 2 Physiological and biochemical characteristics results of strains
编号 过氧化氢酶试验 产粘性试验 B2 阳性 − sn 阳性 + M1-3 阳性 − C-2 阳性 − C-7 阳性 − 注：“−”：不产粘性、“+”：产粘性。
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表 3 菌株糖发酵能力测定结果
Table 3 Determination results of sugar fermentation capacity of strains
菌株 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 半乳糖 B2 + + − + − sn + + − + − M1-3 + − + − + C-2 + + − + − C-7 + + − + − 注：“+”：能发酵；“−”：不能发酵。
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表 4 菌株产蛋白酶活性测定结果
Table 4 Determination results of protease activity of strains
菌株编号 菌落直径d
（mm）水解圈直径
（mm）直径比（d） 蛋白酶活
（U/mL）B2 8.24±0.51ab 19.22±0.33bc 2.33±0.13bc 61.27±0.84c sn 7.70±0.47ab 17.50±0.90c 2.27±0.25bc 47.62±0.55e M1-3 7.32±0.98b 25.50±0.89a 3.48±0.63a 76.20±0.20a C-2 7.30±0.63b 20.50±2.17b 2.80±0.05b 67.86±0.58b C-7 7.44±1.21b 20.20±0.92b 2.71±0.53bc 28.33±0.50f 注：同一列中不同字母表示差异显著（P<0.05），表5同。
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表 5 菌株产脂肪酶活性测定结果
Table 5 Determination results of lipase-producing of strains
菌株编号 菌落直径d
（mm）水解圈直径
（mm）直径比值
（d）脂肪酶活
（U/mL）B2 7.0±1.05b 14.7±1.76ab 2.10±0.33a 58.91±0.28a sn 7.22±0.19b 13.33±0.23b 1.84±0.04a 35.11±0.77d M1-3 8.5±0.65b 15.0±0.99ab 1.76±0.18a 33.26±0.01d C-2 8.0±0.96b 15.3±1.53a 1.91±0.37a 40.18±0.05c C-7 7.36±0.77b 14.7±0.44ab 1.99±0.14a 46.76±0.03b
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表 6 菌株拮抗性测定结果
Table 6 Determination results of antagonistic test of strains
菌株编号 B2 sn C-2 C-7 M1-3 B2 / + − − − sn − / + + + C-2 − + / − − C-7 − + − / − M1-3 − + − − / 注：“/”：同种菌之间并未进行拮抗描述；“+”：有拮抗效应；“−”：无拮抗效应。
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表 7 菌株抑菌能力测定结果
Table 7 Determination results of antibacterial capacity of strains
菌株编号 指示菌株 东京芽孢杆菌 隆德假单胞菌 黑曲霉 粘质沙雷氏菌 B2 + + + − sn + + − − M1-3 − + − + C-2 + + − − C-7 + + − − 注：抑菌性根据抑菌圈直径（d）判断，“+”：有抑菌圈；“-”：无抑菌圈。
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