Preparation, Structure and in Vitro Activity Analysis of Selenopolysaccharide from Auricularia
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摘要: 为促进黑木耳硒化多糖的开发与应用，以硒化黑木耳子实体为原料制备黑木耳硒化多糖，对黑木耳硒化多糖结构和功能特性进行表征与分析。结果表明，黑木耳硒化多糖最佳提取条件为：料液比1:60，温度50 ℃，时间3 h，该条件下多糖得率为11.62%。硒化黑木耳对无机硒转换率可达88.90%，硒多糖光谱中存在Se=O、Se-O等特征峰的多糖典型吸收峰，其表面呈有序网状结构，晶形无显著变化。黑木耳硒化多糖的抗氧化活性显著（P<0.05）高于非硒化多糖，在多糖浓度为5 mg/mL时α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制率较非硒化多糖分别提升18.80%和8.30%，胆固醇吸附率达到了61.40%。综上，本研究为黑木耳硒多糖产品的开发提供理论支持与技术参考。Abstract: To advance the research and application of selenopolysaccharides derived from Auriculus, selenopolysaccharides isolated from the fruiting bodies of Auricularia and subjected to structural and functional characterization. Optimal extraction conditions were determined as follows: a solid-liquid ratio of 1:60, extraction temperature of 50 ℃, and extraction time of 3 h, resulting in a polysaccharide yield of 11.62%. The conversion efficiency of selenated Auricularia to inorganic selenium was measured at 88.90%. The spectral analysis of selenium polysaccharides revealed characteristic absorption peaks corresponding to Se=O, Se-O and other functional groups. The surface morphology of selenated Auricularia exhibited a well-organized network structure with minimal alteration in crystal morphology. Additionally, the antioxidant capacity of selenopolysaccharides was significantly (P<0.05) enhanced compared to non-selenized polysaccharides. At a concentration of 5 mg/mL, selenopolysaccharides demonstrated an 18.80% increase in inhibitory activity against α-glucosidase and an 8.30% increase against α-amylase, as well as a cholesterol adsorption rate of 61.40%. These findings provide valuable theoretical and technical insights for the development of Auricularia selenopolysaccharide products.
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黑木耳（Auricularia auricular）又名树菌、木菌、木耳[1]，因其富含多种维生素、蛋白质及多糖类活性成分，具有较好的食疗效果和药用价值。其中多糖作为黑木耳中的重要活性化合物之一，具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤及增强免疫力的功效[2]。硒（Se）作为一种微量元素，对于维持人体健康至关重要[3]。然而机体无法自行合成硒[4]，因此人或动物均需通过外界摄入硒元素，否则可能会引发一系列疾病[5]。同时大量的临床研究数据表明，机体通过服用硒制剂或摄入富硒食物可以显著降低各种疾病的发病率及死亡率。而自然界中的硒多以无机盐形式存在，因其毒性较强，不适于机体吸收利用，因此寻找一种更为安全的硒制品成为了该领域的热点。
黑木耳现已被证实具有可观的耐硒及富硒能力，外源添加的硒通过菌丝细胞间物质代谢结合到大分子活性物质中，黑木耳中的多糖与硒通过Se=O、Se-O、Se-H等共价键的形式生成多糖有机硒化合物[3]，这种有机硒化合物是硒在黑木耳中存在的重要形式之一[6]，兼具了多糖与有机硒的生物活性，在抗氧化、降血糖及降血脂等方面显著优于天然多糖[7−9]。
近年来，学者对黑木耳的栽培技术及菌丝富集状况做出了广泛研究，对黑木耳多糖的提取也有大量探索[10−12]，而对黑木耳硒化多糖提取工艺、结构表征及其功能特性等方面研究较少。本研究向黑木耳中添加适量的硒，采取生物富集手段，科学有效地将无机硒转换为更易于机体吸收的有机硒，利用水提醇沉法提取黑木耳硒化多糖，通过响应面优化试验选取出黑木耳硒化多糖的最佳提取工艺。实验以黑木耳非硒化多糖为对照，考察了黑木耳硒化多糖的1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基、2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS＋）自由基清除能力，铁离子还原能力（FRAP）及总抗氧化（T-AOC）能力，探究黑木耳硒化多糖的体外降血糖、降血脂功能特性，为黑木耳硒化多糖产品开发利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试菌株及来源 黑丰收2号 克山农业科学研究所提供；亚硒酸钠 上海默克有限公司；硝酸、高氯酸、铁氰化钾、硫酸、氯仿、正丁醇、无水乙醇、葡萄糖、苯酚 国产分析纯，辽宁泉瑞试剂有限公司；ABTS、DPPH试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；FRAP、总抗氧化试剂盒 南京建成生物工程研究所。
HD-AFS01原子荧光质谱仪 山东霍尔德电子科技有限公司；IRTracer100 傅里叶红外光谱仪 日本岛津公司；MS-H550-S 恒温热力磁力搅拌器 北京大龙仪器有限公司；D8 Advance X衍射多晶衍射 德国布鲁克公司；VM-300 涡旋振荡器 宁波群安仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料制备
硒化黑木耳：取亚硒酸钠添加量为120 mg/kg（120 mg/kg表示每千克植料中亚硒酸钠添加量为120 mg）的培养料栽培的黑木耳子实体；非硒化黑木耳：未添加亚硒酸钠且与硒化黑木耳生长势一致的子实体。所得子实体采摘结束后均用蒸馏水快速清洗，45 ℃烘干。将干燥的黑木耳粉碎，经80目筛，4 ℃密封保存，备用。
1.2.2 黑木耳多糖提取工艺
采用热水浸提法[12]提取黑木耳多糖，提取工艺如下：称取适量黑木耳粉，料液比1:60（g/mL），50 ℃，水浴浸提3 h，此操作重复两次。9000 r/min离心处理，10 min后取上清液。合并2 次上清液。采用Sevag法除蛋白，正丁醇与三氯甲烷按照1:4（v:v）的比例混匀制备混合液，混合液与多糖溶液按照1:4（v:v）的比例充分混匀去除蛋白沉淀，重复操作5次，后将溶液旋蒸浓缩，浓缩液用4倍无水乙醇进行醇沉，4 ℃静置一夜，无水乙醇冲洗沉淀2～3次，60 ℃干燥后得黑木耳多糖产物。
1.2.3 黑木耳多糖提取工艺优化
选取料液比、水浴温度、浸提时间为黑木耳多糖提取条件进行单因素实验，以多糖提取率为评价指标[13]，实验重复3次。
1.2.3.1 料液比添加量对黑木耳多糖提取率的影响
确定黑木耳多糖提取工艺条件水浴温度为70 ℃，水提时间为2 h，计算料液比添加量为1:40、1:50、1:60、1:70，1:80（g/mL）条件下所得黑木耳多糖提取率。
1.2.3.2 水浴温度对黑木耳多糖提取率的影响
在料液比为1:60（g/mL）、水浴时间2 h条件下，选取水浴温度40、50、60、70及80 ℃，计算黑木耳多糖提取率。
1.2.3.3 浸提时间对黑木耳多糖提取率的影响
料液比为1:60（g/mL）、水浴温度为70 ℃时，水浴时间为1、2、3、4，5 h条件下，计算黑木耳多糖提取率。
1.2.3.4 响应面试验
结合单因素实验结果，采用 Box-Behnken 模型设计响应面，以多糖提取率为评价指标，优化黑木耳多糖提取工艺，实验重复进行3次，响应面设计见表1。
表 1 响应面实验设计Table 1. Response surface test design因素 水平 编码 −1 0 1 料液比 A 1:50 1:60 1:70 水浴温度（℃） B 50 60 70 浸提时间（h） C 2 3 4 1.2.4 黑木耳多糖含量测定
参考苯酚-硫酸法[14]对黑木耳多糖进行定量。得标准曲线：y=0.0029x+0.0039（R²=0.9943）。同时做试剂空白对照，并根据样品提取液的吸光度，计算多糖含量。
1.2.5 黑木耳多糖硒含量测定
参考GB 5009.93-2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》中的氢化物原子荧光光谱法[15]对黑木耳硒含量进行定量。
1.2.5.1 黑木耳多糖总硒含量测定
称取黑木耳多糖试样0.300 g于烧杯中，加入9 mL硝酸及1 mL高氯酸混合液，盖表面皿放置过夜，次日于160 ℃电热板消解。消解期间及时补加硝酸溶液，待溶液澄清无色伴有白烟，持续加热至溶液剩2 mL左右，冷却。再加5 mL盐酸溶液（6 mol/L），加热至溶液为清亮无色伴有白烟产生，冷却。转移至20 mL试管中，加入2.5 mL铁氰化钾溶液（100 g/L），用蒸馏水定容，混匀待测。同时做试剂空白对照。以盐酸溶液（5+95）为载流，硼氢化钠碱溶液（8 g/L）为还原剂，连续用标准系列的零管进样，待读数稳定之后，将硒标准溶液按质量浓度由低到高的顺序分别导入仪器，测定其荧光强度。以硒含量（μg）为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到标准曲线：y=64.837x−136.8（R2=0.9997）。
1.2.5.2 黑木耳多糖无机硒含量测定
准确称取黑木耳多糖试样0.300 g，不对黑木耳多糖进行酸消解处理，后续操作同1.2.5.1。由总硒及无机硒含量计算有机硒含量，计算公式如下：
E1=E0−E2 X(%)=E1E0×100% 式中E1为有机硒，mg/kg；E0为总硒，mg/kg；E2为无机硒，mg/kg；X为有机硒在总硒占比。
1.2.6 黑木耳多糖结构表征
1.2.6.1 电子显微镜（SEM）扫描检测
试验前对硒化黑木耳多糖及非硒化黑木耳多糖表面镀金，用洗耳球吹去浮样，然后在扫描电子显微镜下观察其表观形貌[12]。
1.2.6.2 傅里叶红外光谱扫描
称取少量黑木耳多糖样品与200 mg溴化钾混匀后，压制厚度为1 mm片状，然后上机检测[16]。
1.2.6.3 X射线多晶体衍射
使用X射线衍射仪探究样品分子的无定形性与结晶性。取1 mg干燥样品置于测试样品台上，2θ测试角度5～90°范围，速率为10°/min[14]。
1.2.7 黑木耳多糖抗氧化活性分析
1.2.7.1 DPPH自由基清除力测定
分别配制1.0、2.0、3.0、4.0及5.0 mg/mL 浓度梯度的黑木耳硒化多糖及黑木耳非硒化多糖水溶液。参考DPPH自由基试剂盒说明书操作试验。设无水乙醇为空白对照。于515 nm处测吸光度值。计算公式如下：
D1(%)=A0−(A1−A2)A0×100 式中D1为DPPH自由基清除率，%；A0为空白组吸光度值；A1为待测样品吸光度值；A2为对照组样品吸光度值。
1.2.7.2 ABTS＋自由基清除能力测定
本实验按ABTS＋自由基清除能力检测试剂盒说明书进行测定，分别配制1.0、2.0、3.0、4.0，5.0 mg/mL浓度梯度的黑木耳硒化多糖及黑木耳非硒化多糖溶液，充分混匀，室温避光静置6 min。测定405 nm处的吸光度。ABTS＋自由基清除率公式如下：
D2(%)=A0−A1A0×100 式中D2为ABTS＋自由基清除率，%；A0为空白组吸光度值；A1为待测样品吸光度值。
1.2.7.3 铁离子还原能力测定
使用FRAP试剂盒测定，根据说明书平行3次实验。于593 nm处测定吸光值。
1.2.7.4 总抗氧化能力测定
使用T-AOC试剂盒说明书重复试验三次测定黑木耳多糖的总抗氧化能力。
1.2.8 黑木耳多糖体外降血糖活性研究
α-葡萄糖苷酶活性抑制实验和α-淀粉酶活性抑制实验参考刘楠楠[12]的方法，并稍做修改。配制浓度为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的黑木耳硒化多糖及非硒化多糖溶液，将0.25 mL 0.02 mmol/L的对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷溶液和0.25 mL不同浓度的黑木耳多糖溶液充分混匀，水浴15 min（37℃），加入0.25 mL的α-葡萄糖苷酶溶液（1.0 U/mL）混合均匀后水浴反应20 min（37℃），1 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测定405 nm处吸光度值。按如下公式计算黑木耳硒多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。
α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=1−A样品−A对照A空白×100 式中：A样品为加入葡萄糖苷酶样品溶液吸光值；A对照为未加入葡萄糖苷酶样品溶液吸光值；A空白为未加入样品的溶液吸光度。
用中性磷酸钠缓冲溶液（20 mmol/L）配制浓度为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的黑木耳硒化多糖及非硒化多糖溶液，将0.25 mL不同浓度的黑木耳多糖溶液与0.25 mL α-淀粉酶（1.0 U/mL，中性磷酸钠缓冲溶液溶解）混合均匀，水浴反应15 min（37 ℃）。随后加入0.5 mL 1%淀粉溶液继续反应10 min（37 ℃）后与0.6 mL 3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂终止反应，沸水浴5 min，冷却至室温，540 nm处测定吸光度。按如下公式计算黑木耳硒多糖对α-淀粉酶活性的抑制率。
α-淀粉酶抑制率(%)=1−A样品−A对照A空白×100 式中：A样品为加入淀粉酶样品吸光值；A对照为未加入淀粉酶的样品吸光值；A空白为未加入样品的溶液吸光度。
1.2.9 黑木耳多糖降血脂活性分析
参考LIU等[9]的方法进行胆固醇吸附实验。分别取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL的标准胆固醇溶液（1 mg/mL，冰乙酸溶解），冰乙酸补至0.5 mL，混匀后加入0.5 mL邻苯二甲醛溶液（1 mg/mL，冰乙酸溶解），4 mL浓硫酸-冰乙酸混合液按照1:1（v:v）的比例充分混匀，水浴10 min（37 ℃），550 nm处测定吸光度。以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线为（y=1.313x−0.2508，R2=0.9976）。分别取1 mL浓度为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的黑木耳多糖溶液与2 mL胆固醇溶液（1 mg/mL）混合均匀，37 ℃恒温振荡2 h，4000 r/min离心20 min，取0.5 mL上清液测定胆固醇含量，按如下公式计算胆固醇吸附率。
胆固醇吸附率(%)=C0−C1C0×100 式中：C0为胆固醇加入量，mg；C1为胆固醇剩余量，mg。
1.3 数据处理
所有实验3次重复，实验数据采用Origin 2021进行绘图，SPSS27软件进行数据分析与邓肯检验（P<0.05为差异显著），采用Design expert 8.0.6软件对响应面的综合评分进行数学统计，实验结果以“平均值±标准差”表示。
2. 结果与分析
2.1 黑木耳多糖提取工艺单因素分析
2.1.1 料液比对黑木耳多糖提取率的影响
料液比对黑木耳多糖提取率的影响如图1所示，在1:40～1:60范围内，提取率随料液比的增加而得到提升，液料比的增加，使多糖与溶剂间的浓度差逐渐增大，当料液比为1:60时，多糖提取率达到最大，此时多糖已充分溶出；持续增大料液比，多糖的提取率则有所下降。研究表明料液比增大后多糖提取率呈现上升后下降趋势，当料液比较低时，溶液体系粘度高导致多糖得率较低[12]。但过大的料液比降低了溶液的浓度，不利于多糖溶出[11]。
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2.1.2 水浴温度对黑木耳多糖提取率的影响
不同水浴温度对黑木耳多糖提取率的影响见图2，在40～60 ℃时，提取率随温度的升高而增加，这是由于提取温度的升高加剧分子间热运动，导致黑木耳细胞壁遭到破坏，加速硒多糖向溶剂中的扩散，使硒多糖迅速溶出[12]；当温度为60 ℃时，硒多糖的提取率达到最高水平；而过高的温度可能会破坏多糖结构，稳定性降低，在溶剂中易发生降解，最终导致硒多糖得率下降[12]。因此单因素水浴温度设置为50～70 ℃。
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图 2 温度对硒多糖提取率的影响Figure 2. Effect of temperature on the extraction yield of selenium polysaccharide2.1.3 浸提时间对黑木耳多糖提取率的影响
浸提时间对硒多糖提取率的影响见图3，结果表明提取率随着时间的增加而增大，提取时间增加可以促进分子获得更多能量[14]，多糖充分溶解在溶剂中，当水浴时间为3 h时，硒多糖提取率最大，这表明此时大部分硒多糖已溶出；所以延迟提取时间对硒多糖得率无显著提高。
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图 3 时间对硒多糖提取率的影响Figure 3. Effect of time on the extraction yield of selenium polysaccharide2.2 黑木耳多糖工艺响应面优化分析
2.2.1 响应面试验结果
使用Design Expert软件，以黑木耳多糖提取率为响应值，料液比（A）、温度（B）、时间（C）为因变量，进行Box-Behnken响应面试验设计，得到多糖提取率的拟合全变量二次回归模型为：Y=−104.78+2.02A+1.51B+11.62C−0.01AC−0.05BC−0.01A2−0.01B2−1.40C2，实验结果如表2。
表 2 响应面实验设计及结果Table 2. Experimental design and results of response surface试验号 料液比（A） 温度（B） 时间（C） 多糖得率（%） 1 1 0 −1 8.94 2 0 0 0 11.68 3 0 0 0 11.58 4 −1 0 −1 8.45 5 −1 0 1 8.73 6 0 1 −1 9.63 7 −1 1 0 9.02 8 1 1 0 8.79 9 0 0 0 11.60 10 0 0 0 11.66 11 0 1 1 8.50 12 0 −1 −1 8.64 13 0 0 0 11.30 14 1 0 1 8.74 15 −1 −1 0 8.35 16 1 −1 0 9.95 17 0 −1 1 9.51 2.2.2 回归分析
由表3可知，各影响因素对黑木耳多糖提取率的影响大小顺序为A>B>C，即料液比>温度>时间；方差结果的P值显示，一次项除A显著（P<0.05）外，B、C均不显著（P>0.05），二次项中除AC不显著（P>0.05），其余均极显著（P<0.01）；同时该回归模型P值极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），软件分析的复项关系数R2为0.9915，调整后的可决系数R2adj为0.9807。以上说明该模型与实际实验的拟合效果较好，因此可用此模型对热水浸提法提取的黑木耳多糖进行分析和预测。
表 3 黑木耳硒多糖提取率回归模型方差分析Table 3. Analysis of variance of regression model of extraction rate of selenium polysaccharide from auricularia方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 27.02 9 3.00 91.13 < 0.0001 A-料液比 0.4371 1 0.4371 13.27 0.0083 B-温度 0.0325 1 0.0325 0.9870 0.3536 C-时间 0.0040 1 0.0040 0.1229 0.7362 AB 0.8372 1 0.8372 25.42 0.0015 AC 0.0576 1 0.0576 1.75 0.2276 BC 1.0000 1 1.0000 30.36 0.0009 A2 8.80 1 8.80 267.16 < 0.0001 B2 5.01 1 5.01 152.07 < 0.0001 C2 8.29 1 8.29 251.68 < 0.0001 残差 0.2306 7 0.0329 失拟项 0.1367 3 0.0456 1.94 0.2649 纯误差 0.0939 4 0.0235 总和 27.25 16 R2=0.9915，R2adj=0.9807 2.2.3 响应面交互作用分析
各因素之间交互作用对富硒黑木耳多糖提取率影响的响应面图如图4。由实验结果可看出，各响应面均为上凸曲面，最高点均落在所选区域之中，说明实验所选因素水平较为合适。响应面的陡峭坡度反映了考察指标在各反应条件发生变化时的程度，AB、AC、BC的响应面均表现出较陡的状态，这意味着随着反应条件的改变，响应值（多糖提取率）较为灵敏。在交互作用方面，AB与BC交互作用均呈现极显著的现象。
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图 4 三因素之间交互作用硒化黑木耳多糖提取率影响的响应面图Figure 4. Response surface of the interaction between the three factors on the extraction rate of selenopolysaccharide2.2.4 最佳工艺参数验证
通过Design-Expert 13软件对实验数据进行优化预测，得到硒化黑木耳多糖提取率最佳工艺参数为料液比1:60.89，温度为49.51 ℃，时间为2.99 h，该提取条件下黑木耳多糖提取率为11.58%。结合实际操作，选取进料量1:60，温度为50 ℃，时间为3 h，测得黑木耳多糖提取率为11.62%，与预测值较为接近，说明该模型可用于富硒黑木耳多糖提取率的工艺优化。
2.3 黑木耳多糖硒含量测定
实验结果如表4所示，两种多糖中有机硒含量均显著高于无机硒含量，且未添加外源硒的黑木耳非硒化多糖中有机硒含量占比为81.00%，添加外源硒的黑木耳硒化多糖中有机硒含量占比为88.90%，说明黑木耳自身对硒元素具有较强的生物转化能力，这与刘书畅等[17]认为食用菌具有较强富硒能力的研究相一致。
表 4 不同黑木耳多糖的硒含量Table 4. Selenium content of different auricultural polysaccharides名称 总硒含量
（mg/kg）无机硒含量
（mg/kg）有机硒含量
（mg/kg）有机硒含量
占比（%）黑木耳非
硒化多糖0.79±0.03b 0.15±0.02b 0.64±0.04b 81.00±5.10b 黑木耳
硒化多糖90.00±0.19a 9.97±0.12a 80.03±0.34a 88.90±0.80a 注：表中不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。 2.4 黑木耳硒多糖的结构分析
2.4.1 红外光谱测定分析
黑木耳非硒化多糖及黑木耳硒化多糖的红外光谱图由图5可见。在峰值为3383、2934、1018 cm−1等多处出现多糖特征吸收峰。波长3383 cm−1处出现的峰值较高且吸收带较宽，这是糖类物质中O-H键的伸缩振动引起的，2934 cm−1处的吸收带是由亚甲基（-CH2-）振动引起的，在1730 cm−1处检测到振动吸收峰，表明该多糖中含有醛酸类物质，1654 cm−1处出现的吸收峰是由多糖和水结合所产生的[18]，1378 cm−1的吸收峰为C-H的伸缩振动，1249 cm−1处是由C=O键引起的弱吸收峰，1071 cm−1出现的峰为吡喃环的特征吸收峰，610～434 cm−1范围内吸收峰是由C-H弯曲振动所引起的[12]。由红外光谱可知，黑木耳硒化多糖其主要特征峰与黑木耳非硒化多糖保持一致，这说明硒化未对黑木耳多糖结构造成较大影响且保留了多糖构型，区别在于黑木耳硒化多糖在896、829及792 cm−1出现了三个硒特征明显吸收峰，896 cm−1、792 cm−1均为Se=O键的伸缩振动[19−20]，829 cm−1是Se-O键的伸缩振动，因此可以推测硒可能由Se=O、Se-O键的形式连接在多糖的支链上[21]。此外，红外光谱在1136 cm−1处出现明显吸收峰，这是由于硒可能以Se-H键的形式存在于多糖的分支结构中[22]。上述结果均表明，本试验通过硒化处理使硒以共价键形式与黑木耳多糖结合，得到了稳定的黑木耳硒化多糖。
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图 5 黑木耳非硒化多糖和黑木耳硒化多糖的红外光谱图Figure 5. Infrared spectra of non-selenated polysaccharides and selenated polysaccharides of Auricularia2.4.2 XRD检测分析
硒化是否改变了多糖晶体状态或确定有无定形形态可通过X射线衍射光谱进行判断[23]。晶体特征通常表现为尖而窄的衍射峰，而非晶体特征则为宽而散的峰型[24]。本文X衍射结果显示，在低角度衍射图中观察到两条衍射峰（30°，42°）均表现为较宽松散的峰，黑木耳非硒化多糖的晶型为无定形非晶体结构，而黑木耳硒化多糖在2θ为14.2°出现尖峰，但总体衍射峰较非硒化多糖变化不大，其晶型表现为半晶体结构。结果表明硒化作用会使黑木耳多糖晶体倾向于半晶体结构但并未对晶体结构造成较大破坏。啜世琛[25]研究发现，生物合成的裂褶菌硒多糖更易形成半晶体结构，且硒化条件不会改变裂褶菌多糖的晶体结构，这与本文的研究结果相符。
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图 6 黑木耳非硒化多糖和黑木耳硒化多糖的X-衍射图Figure 6. X-ray diffraction of non-selenated polysaccharides and selenated polysaccharides of Auricularia2.4.3 扫描电镜检测
硒化前后黑木耳多糖的扫描电镜如图7。由图可知，黑木耳非硒化多糖（A1，放大倍数10 K）呈现紧密的蜂窝状孔洞，表面粗糙有少量突出的球状物质且结构间孔隙较小，结构紧凑；黑木耳硒化多糖（B1，放大倍数10 K）表面为分布较均匀的蜂窝状结构，孔隙有所增大，整体结构较松散。持续放大倍数后发现黑木耳硒化多糖（B2，放大倍数50 K）微观结构发生了较大变化，表面呈现出有序的网状结构，硒化后多糖的表面分散性更好、网状更明显且孔隙大小均一，本实验通过对二者进行稀释溶解发现硒化后黑木耳多糖明显比非硒化黑木耳多糖易溶，这也进一步印证了硒化会造成多糖表面孔洞的疏松[26]。黑木耳硒化多糖出现规则交联结构，这可能是因为硒化对黑木耳多糖的原始链接方式造成了影响，也可能是因为硒与多糖结合后产生疏水作用[26−27]，从而导致微观形貌发生改变。本文与硒化多糖类物质研究结果所表明的结构特征类似[28−30]。
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图 7 黑木耳非硒化多糖（A）和黑木耳硒化多糖（B）的电镜图Figure 7. Electron microscopic images of non-selenated polysaccharide (A) and selenated polysaccharide (B) of Auricularia2.5 黑木耳硒化多糖的体外抗氧化活性
2.5.1 DPPH自由基清除能力测定
由图8可知，随浓度的升高，黑木耳非硒化多糖DPPH自由基清除率呈现上升趋势，在达到4 mg/mL时趋于稳定。随着浓度的升高，黑木耳硒化多糖DPPH自由基清除能力不断提升，当多糖浓度为5.0 mg/mL 时，清除率可达49.35%，较黑木耳非硒化多提升了147.53%。这表明，黑木耳硒化多糖具有较强的DPPH自由基清除能力，这种能力的提升可能与多糖的供氢能力与抗氧化活性密切相关[14]。张金荣等[16]研究发现，硒化可能会激发阳极区的氢供体，使硒多糖DPPH自由基清除率较天然多糖得到显著提升。
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图 8 不同黑木耳多糖的自由基清除能力Figure 8. Scavenging activities of different Auricularia polysaccharides on DPPH free radicals2.5.2 ABTS＋自由基清除能力测定
图9表明，ABTS＋自由基清除能力对多糖浓度有依赖性。随着多糖浓度的升高，黑木耳非硒化及硒化多糖对ABTS＋自由基的清除能力均呈现逐渐增大的趋势，非硒化多糖在浓度3.0～5.0 mg/mL时，ABTS＋自由基清除率增加平缓，几乎保持不变，而硒化多糖浓度为5.0 mg/mL时，ABTS＋自由基清除能力仍在不断增长，清除率可达19.61%。本实验可证实黑木耳硒化多糖较非硒化多糖具有更高的ABTS＋自由基清除能力。有研究表明，硒化后的平菇多糖ABTS＋自由基清除率较天然多糖更高，因硒对异丙基碳的氢原子具有较好的激活能力，多糖与硒结合可以提供更多的氢原子，从而产生更多的自由基[31]。
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图 9 不同黑木耳多糖的ABTS＋自由基清除能力Figure 9. Scavenging activities of different Auricularia polysaccharides on ABTS＋ free radicals2.5.3 铁离子还原能力测定
结果如图10所示，对两种黑木耳多糖进行铁离子还原力能力的测定，黑木耳非硒化多糖浓度不断增加，其铁离子还原力能力也在逐渐加强，当黑木耳硒化多糖浓度为4.0 mg/mL时，铁离子还原力能力趋于稳定，说明硒化多糖对铁离子还原能力逐渐达到饱和，但黑木耳硒化多糖上升趋势较黑木耳非硒化多糖差异明显，结果表明黑木耳硒化多糖具有更强的铁离子还原力能力，硒化对黑木耳多糖的铁离子还原能力有一定增强作用。
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图 10 不同黑木耳多糖的铁离子还原能力Figure 10. The ferric ion reducing antioxidant power of different Auricularia polysaccharides2.5.4 总抗氧化能力测定
图11为两种黑木耳多糖的总抗氧化能力测定，当黑木耳非硒化多糖浓度为3.0～4.0 mg/mL范围内时，总抗氧化能力几乎保持稳定，将非硒化多糖浓度提高至5 mg/mL后总抗氧化能力得到增强，而黑木耳硒化多糖浓度在2.0～3.0 mg/mL范围时，总抗氧化能力趋于饱和，增加硒化多糖浓后总抗氧化活性提高，结果说明黑木耳多糖对抗氧化的能力有限，提高多糖的浓度会破坏机体内氧化与抗氧化的平衡，从而导致总抗氧化活性发生变化[16]。同时发现硒化多糖可更快打破平衡机制提高自身总抗氧化能力，这可能跟硒本身的抗氧化作用有关，多糖与硒的结合可以有效提高抗氧化酶的活性，从而达到抗氧化这一目的[16,32]。
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图 11 不同黑木耳多糖的总抗氧化能力Figure 11. Total antioxidant capacity of different Auricularia polysaccharides2.6 黑木耳硒化多糖的体外降血糖活性研究
α-葡萄糖苷酶可以催化α-（1,4）-葡萄糖苷键的水解，将低聚糖转化为葡萄糖。胰岛素受到α-葡萄糖苷酶的活性抑制其敏感性增强，达到降低血糖的效果[33]。由图12可知，黑木耳非硒化多糖随浓度升高对α-葡萄糖苷酶活性抑制率逐渐升高在4 mg/mL浓度后逐步趋于稳定，可能是黑木耳多糖浓度已达到饱和导致α-葡萄糖苷酶活性遭到抑制[33]。而经过硒化后的黑木耳多糖较未硒化黑木耳多糖在5 mg/mL浓度时对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率显著提升19.02%，且抑制率还在不断升高，这说明硒的加入对α-葡萄糖苷酶的抑制能力起着促进作用。
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α-淀粉酶作为一种良好的糖苷酶抑制剂[12]，随着黑木耳多糖浓度的增大，对α-淀粉酶活性抑制率逐步升高，非硒化多糖浓度为4 mg/mL浓度时趋于稳定，说明黑木耳非硒化多糖浓度对α-淀粉酶的活性有饱和作用，这与黑木耳非硒化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力结果相似。硒化后的黑木耳多糖在5 mg/mL浓度时对α-淀粉酶活性抑制高于黑木耳非硒化多糖11.09%，且在不断升高。两组数据均表明黑木耳硒化多糖增强了体外降血糖功效。硒化后黑木耳多糖的体外降血糖能力提高，这可能与自身结构有关，SEM结果显示硒化后黑木耳多糖结构更松散，疏松多孔的表面暴露了更多的结合位点[27]。
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图 13 不同黑木耳多糖对α-淀粉酶的抑制作用Figure 13. Inhibition of α-amylase by different auricultural polysaccharides2.7 黑木耳硒化多糖的体外降血脂活性研究
本研究通过体外降血脂实验，发现黑木耳多糖浓度对胆固醇的吸附能力呈正相关。黑木耳非硒化多糖浓度为4 mg/mL时，胆固醇吸附率趋于饱和，胆固醇吸附可达55.40%，之后提高多糖浓度，抑制率无显著变化；黑木耳硒化多糖在4 mg/mL时胆固醇吸附能力趋于稳定，胆固醇吸附率为61.40%，硒化前后黑木耳多糖对胆固醇吸附能力差异显著，这可能由于硒化导致其表面孔隙疏松，加大了两者间的疏水相互作用[26]。结果表明黑木耳硒化多糖具有更强的降血脂能力，这为辅助治疗高血脂类疾病带来更多的研究思路。
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图 14 不同黑木耳多糖的胆固醇抑制作用Figure 14. Cholesterol-inhibiting effects of different auricultural polysaccharides3. 结论
黑木耳因其安全有效的生物富硒能力被广泛应用于硒补充剂食品的开发制备，但有关黑木耳硒化多糖及相关产品的研究较少。本研究对黑木耳进行富硒培养，通过热水浸提法提取多糖，发现料液比、水浴温度及浸提时间对黑木耳多糖提取率影响较大，经过响应面优化处理，选取进料量1:60、温度50 ℃、时间3 h，此时黑木耳多糖提取率为11.62%。研究发现硒化多糖中总硒含量较非硒化多糖得到显著提升，两种黑木耳多糖的有机硒含量占比均较高，表明了黑木耳自身对硒具有很强的生物富集和转化能力。结构表征的结果表明，在896、829、792 cm−1发现Se=O与Se-O键的特殊吸收峰，此外1136 cm−1峰值表明硒可能还以Se-H键的形式存在于多糖的分支上。同时，硒化后的黑木耳多糖表面为有序蜂窝状，结构间规则交联，孔隙分布均匀，硒化使黑木耳多糖晶体倾向于半晶体结构但并未对晶体结构造成较大破坏。硒化可不同程度的提升DPPH、ABTS＋自由基清除能力、铁离子还原能力及总抗氧化能力，α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶活性抑制率及胆固醇吸附能力均受多糖浓度影响，但较黑木耳非硒化多糖，黑木耳硒化多糖具有更强的体外降血糖、降血脂能力。研究结果证实，黑木耳硒多糖可以从多个方面提供更加全面的保健功能，但还需开展进一步的体内实验以验证黑木耳硒多糖的功能特性，为黑木耳硒多糖及相关产品开发提理论支持。
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图 2 温度对硒多糖提取率的影响
Figure 2. Effect of temperature on the extraction yield of selenium polysaccharide
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图 3 时间对硒多糖提取率的影响
Figure 3. Effect of time on the extraction yield of selenium polysaccharide
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图 4 三因素之间交互作用硒化黑木耳多糖提取率影响的响应面图
Figure 4. Response surface of the interaction between the three factors on the extraction rate of selenopolysaccharide
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图 5 黑木耳非硒化多糖和黑木耳硒化多糖的红外光谱图
Figure 5. Infrared spectra of non-selenated polysaccharides and selenated polysaccharides of Auricularia
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图 6 黑木耳非硒化多糖和黑木耳硒化多糖的X-衍射图
Figure 6. X-ray diffraction of non-selenated polysaccharides and selenated polysaccharides of Auricularia
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图 7 黑木耳非硒化多糖（A）和黑木耳硒化多糖（B）的电镜图
Figure 7. Electron microscopic images of non-selenated polysaccharide (A) and selenated polysaccharide (B) of Auricularia
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图 8 不同黑木耳多糖的自由基清除能力
Figure 8. Scavenging activities of different Auricularia polysaccharides on DPPH free radicals
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图 9 不同黑木耳多糖的ABTS＋自由基清除能力
Figure 9. Scavenging activities of different Auricularia polysaccharides on ABTS＋ free radicals
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图 10 不同黑木耳多糖的铁离子还原能力
Figure 10. The ferric ion reducing antioxidant power of different Auricularia polysaccharides
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图 11 不同黑木耳多糖的总抗氧化能力
Figure 11. Total antioxidant capacity of different Auricularia polysaccharides
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图 13 不同黑木耳多糖对α-淀粉酶的抑制作用
Figure 13. Inhibition of α-amylase by different auricultural polysaccharides
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图 14 不同黑木耳多糖的胆固醇抑制作用
Figure 14. Cholesterol-inhibiting effects of different auricultural polysaccharides
表 1 响应面实验设计
Table 1 Response surface test design
因素 水平 编码 −1 0 1 料液比 A 1:50 1:60 1:70 水浴温度（℃） B 50 60 70 浸提时间（h） C 2 3 4 
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表 2 响应面实验设计及结果
Table 2 Experimental design and results of response surface
试验号 料液比（A） 温度（B） 时间（C） 多糖得率（%） 1 1 0 −1 8.94 2 0 0 0 11.68 3 0 0 0 11.58 4 −1 0 −1 8.45 5 −1 0 1 8.73 6 0 1 −1 9.63 7 −1 1 0 9.02 8 1 1 0 8.79 9 0 0 0 11.60 10 0 0 0 11.66 11 0 1 1 8.50 12 0 −1 −1 8.64 13 0 0 0 11.30 14 1 0 1 8.74 15 −1 −1 0 8.35 16 1 −1 0 9.95 17 0 −1 1 9.51
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表 3 黑木耳硒多糖提取率回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model of extraction rate of selenium polysaccharide from auricularia
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 27.02 9 3.00 91.13 < 0.0001 A-料液比 0.4371 1 0.4371 13.27 0.0083 B-温度 0.0325 1 0.0325 0.9870 0.3536 C-时间 0.0040 1 0.0040 0.1229 0.7362 AB 0.8372 1 0.8372 25.42 0.0015 AC 0.0576 1 0.0576 1.75 0.2276 BC 1.0000 1 1.0000 30.36 0.0009 A2 8.80 1 8.80 267.16 < 0.0001 B2 5.01 1 5.01 152.07 < 0.0001 C2 8.29 1 8.29 251.68 < 0.0001 残差 0.2306 7 0.0329 失拟项 0.1367 3 0.0456 1.94 0.2649 纯误差 0.0939 4 0.0235 总和 27.25 16 R2=0.9915，R2adj=0.9807
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表 4 不同黑木耳多糖的硒含量
Table 4 Selenium content of different auricultural polysaccharides
名称 总硒含量
（mg/kg）无机硒含量
（mg/kg）有机硒含量
（mg/kg）有机硒含量
占比（%）黑木耳非
硒化多糖0.79±0.03b 0.15±0.02b 0.64±0.04b 81.00±5.10b 黑木耳
硒化多糖90.00±0.19a 9.97±0.12a 80.03±0.34a 88.90±0.80a 注：表中不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。
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