Purification Optimization of Mung Bean Skin Polyphenols by Macroporous Adsorption Resin and Its in Vitro Hypoglycemic Activity
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摘要: 为探究绿豆皮多酚（Mung bean skin polyphenols，MBPs）的纯化工艺及其体外降血糖活性，本研究通过超声辅助提取MBPs，研究八种不同类型大孔吸附树脂对MBPs的吸附和解吸情况，筛选出最佳树脂型号，利用单因素实验对纯化工艺进行了优化，并通过超高效液相色谱-电喷雾串联飞行时间四极杆质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）鉴定了纯化后MBPs的化学成分。同时，以阿卡波糖为阳性对照，探究了MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性与抑制类型。结果显示，HPD-500树脂对MBPs的吸附-解析效果最好，优化后的纯化工艺参数为：多酚浓度0.25 mg/mL，pH为6，乙醇浓度80%，上样流速1 BV/h，洗脱流速2 BV/h。纯化后MBPs纯度为57.23%，相比粗提物提升了2.55倍。纯化后的MBPs中鉴定出没食子酸、山奈酚、牡荆素、异牡荆素、芹菜素等12种酚类化合物。体外降血糖活性研究结果显示，MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，其IC50值分别为98.85 μg/mL和7.25 μg/mL，抑制类型均为混合型抑制。综上，纯化后的MBPs具有良好的体外降血糖活性，可作为保健食品的功能成分进行开发利用。Abstract: To investigate the purification process and in vitro hypoglycemic activity of mung bean skin polyphenols (MBPs), MBPs were extracted using the ultrasonic-assisted extraction method in this study. The adsorption and desorption behaviors of MBPs on eight different types of macroporous adsorption resins were examined, and the optimal resin type was selected. The purification process was optimized through single-factor experiments, and the chemical composition of the purified MBPs was identified using ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF-MS/MS). Meanwhile, the inhibitory activities and types of MBPs on α-amylase and α-glucosidase were investigated with acarbose as the positive control. Results showed that HPD-500 resin had the best adsorption-desorption effect on MBPs. The optimized parameters of purification process were polyphenol concentration of 0.25 mg/mL, pH of 6, ethanol concentration of 80%, loading flow rate of 1 BV/h, and elution flow rate of 2 BV/h. The purity of purified MBPs was 57.23%, which was 2.55 times higher than that of the crude extract. Twelve phenolic compounds, including gallic acid, kaempferol, vitexin, isovitexin, and apigenin, were identified in the purified MBPs. The results of in vitro hypoglycemic activity study showed that MBPs had good inhibitory activities on α-amylase and α-glucosidase, with IC50 values of 98.85 μg/mL and 7.25 μg/mL, respectively, and the inhibition of MBPs against both enzymes was mixed-type inhibition. In summary, purified MBPs had good in vitro hypoglycemic activity and could be developed and utilized as functional ingredients in health foods.
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Keywords:
- Mung bean skin /
- polyphenols /
- purification /
- component analysis /
- in vitro hypoglycemia
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绿豆（Vigna radiata L.），属于豆科植物，广泛生长在亚洲、南欧干旱地区、加拿大和美国等温暖地区[1]。绿豆的蛋白质含量是谷物的2~3倍（20%~25%），满足人体所需的大量必需氨基酸，还含有其他必需营养素，包括膳食纤维、维生素A、B、C、E和钙、铁和锌等矿物质，以及多酚、多糖和肽等功能因子[2−4]，是公认的低GI食物。目前绿豆加工主要使用豆胚，而绿豆皮常作为副产物被丢弃。研究表明，绿豆皮中含有丰富的酚类物质，对抗炎、抗氧化、抗衰老以及调节肠道菌群等具有积极作用[5−7]，但目前仍处于基础研究阶段，尚未实现大规模应用转化。对绿豆皮中的酚类物质进行提取和纯化可以避免资源浪费，增加经济效益。超声辅助醇提法是获得多酚粗提物的主流方法，对绿豆皮多酚粗提物进行纯化可以提升其纯度，增强其生物活性，对后续的研究和应用至关重要。多酚纯化的主要方法有有机溶剂萃取、膜分离、沉淀法和凝胶分离，而大孔吸附树脂由于其高选择性、温和的操作条件和可重复使用等优点，被广泛应用于农业副产物中多酚的纯化和富集[8]。
2型糖尿病（T2DM）是典型的由代谢紊乱引起的疾病。截至2022年，全世界糖尿病患者已突破5.37亿，其中我国患者人数超过1.43亿，防治形势极为严峻。近年来，由于多酚对多种碳水化合物水解酶良好的抑制活性，被认为是商业降糖药物的可能替代品。Luis等[9]发现菜豆皮多酚具有抑制与葡萄糖吸收相关酶的能力，有助于T2DM的管理。王思花[10]研究发现豌豆皮多酚可与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶形成非荧光复合物进而抑制酶的活性。
本文通过辅助超声醇提技术制备绿豆皮多酚（Mung bean skin polyphenols，MBPs），并采用树脂吸附法进行纯化，确定大孔树脂对MBPs的吸附、解吸性能及纯化工艺。进一步通过超高效液相色谱-电喷雾串联飞行时间四极杆质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）对纯化后的MBPs进行组分分析。最后，以阿卡波糖为阳性对照，研究纯化后的MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性并进一步研究其抑制类型。本研究旨在促进绿豆皮的综合加工利用，并为了解MBPs在高价值功能食品中的发展提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
绿豆（苏绿1号，苏绿2号，苏绿7号） 由江苏省农业科学院经作所提供；大孔树脂：D101，PD100，XAD-7，AB-8，DM301，HPD-500，NKA-9，DA201，没食子酸，福林酚试剂，3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid, DNS），α-淀粉酶（猪胰酶，9 U/mg），α-葡萄糖苷酶（33.7 U/mg），对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖（p-NPG）等 均购自上海源叶生物科技有限公司。
H2050R台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；YTLG-10A冷冻干燥机 上海叶拓科技有限公司；XD-52AA旋转蒸发器 上海贤德实验仪器有限公司；ME204万分之一天平、Epoch多功能酶标仪 美国Mettler仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 MBPs提取及总酚含量测定
将新鲜绿豆洗净，浸泡12 h至皮胚分离，取皮。绿豆皮经晾水、冷冻干燥、粉碎（过80目筛）后，在绿豆皮粉中以1:20（g/mL）的料液比加入80%乙醇溶液后，置于300 w的超声水浴锅辅助浸提1 h，离心后收集上清液，将沉淀再重复提取两次，合并三次的上清液旋蒸去除乙醇后冻干，−20 ℃储存备用。
参考Sun等[11]的方法，利用Folin-Ciocaldeu（福林酚法）检测MBPs中的总酚含量，结果以没食子酸当量mg GAE/g计。精确称量500 mg没食子酸配成1 mg/mL没食子酸贮备液，再用蒸馏水稀释成0、20、40、60、80、100 mg/L的没食子酸溶液；分别取0.5 mL没食子酸溶液放入10 mL离心管内，加入2.5 mL 0.2 mol/L的Folin-phenol，均匀混合后避光静置8 min，加入2 mL 0.075 g/mL的Na2CO3，避光静置4 h后，采用酶标仪测定其760 nm下的OD值，绘制标准曲线，其方程为：Y=0.0054X+0.0153，R2=0.9931。MBPs含量的测定方法与没食子酸一致，测量OD值后带入标准曲线中计算得到其总酚含量。
1.2.2 MBPs纯化
1.2.2.1 大孔树脂的预处理
选取8种不同性能的大孔树脂（表1），分别放在5%的NaOH和HCl溶液中浸泡去杂并洗至中性后，用无水乙醇浸泡12 h，用去离子水冲洗至无味后，备用。
表 1 八种大孔树脂的理化性质Table 1. Physicochemical properties of the eight macroporous resins树脂类型 极性 平均孔径
（nm）粒径
（mm）比表面积（m2/g） D101 非极性 90~100 0.3~1.25 500~580 HPD100 非极性 120~160 0.3~1.25 500~580 XAD-7 弱极性 45 0.5~0.71 500 AB-8 弱极性 13~14 0.3~1.25 ≥480 DM-301 中性 14~17 0.3~1.25 ≥330 HPD-500 极性 55~75 0.3~1.25 500~550 NKA-9 极性 155~165 0.3~1.25 250~290 DA201 强极性 130~140 0.3~1.25 ≥220 1.2.2.2 大孔树脂筛选
参考Timothy等[12]的方法，分别取干重1 g的八种大孔树脂中放入100 mL锥形瓶中，加入40 mL MBPs溶液（0.25 mg/mL），于25 ℃、150 r/min摇床中振荡吸附12 h；待吸附完毕后，去离子水冲滤，加入40 mL 80%乙醇溶液，在上述相同条件下解吸12 h；测定吸附后上清液和解吸液中的多酚浓度，计算八种大孔树脂的吸附率及解吸率。公式如下：
吸附量(mgg)=(C0−C1)×V0W (1) 吸附率(%)=(C0−C1)C0×100 (2) 解吸量(mgg)=C2×V1W (3) 解吸率(%)=C2(C0−C1)×100 (4) 式中：C0、C1、C2分别为MBPs的初始浓度（mg/mL）、吸附后浓度（mg/mL）、解吸后浓度（mg/mL）；V0、V1分别为MBPs吸附前的溶液体积（mL）和吸附后的溶液体积（mL）；W为树脂干重（g）。
1.2.2.3 HPD-500树脂对MBPs的吸附动力学研究
在含有1 g干重树脂的100 mL锥形瓶中加入40 mL MBPs溶液（0.25 mg/mL），于25 ℃、150 r/min摇床中振荡吸附120 min，分别在2、4、6、10、20、30、40、60、80、100和120 min时取1 mL上清液测定总酚含量，通过以下方程研究HPD-500大孔树脂的吸附动力学参数[13]。
准一级动力学方程：ln(qe−qt)=−k1t+lnqe (5) 准二级动力学方程：tqt=1k2q2e+tqe (6) 颗粒内扩散方程：qt=kd⋅t1/2+C (7) 式中：qt、qe分别代表不同时间树脂的吸附量（mg/g）和树脂达到的平衡吸附量（mg/g）；k1、k2、kd为准一级、准二级及颗粒内扩散方程的吸附速率常数；公式（7）中的C表示颗粒内扩散方程中的常数项。
1.2.2.4 HPD-500树脂对MBPs的吸附热力学研究
在含有0.5 g干重树脂的100 mL锥形瓶中分别加入40 mL不同浓度的MBPs溶液（2.5、5、7.5、10、12.5、15 mg/mL），其多酚含量分别为0.562、1.123、1.685、2.246、2.8075、3.369 mg/mL，在25、35和45 ℃下于摇床中振荡吸附120 min。绘制吸附等温曲线，根据Langmuir和Freundlich方程[14]，研究HPD-500的吸附热力学参数。
Langmuir公式：qe=qmKLCe1+KLCe (8) Freundlich公式：qe=KFC1/ne (9) 式中：qm是单分子吸附层的最大吸附量，mg/g；KL是Langmuir常数；KF，1/n为Freundlich常数；R为理想气体常数（8.314 J·mol−1·K−1），T为绝对温度（K），A为Van’t Hoff方程常数。为方便计算Langmuir及 Freundlich吸附等温方程将式（8），式（9）稍作变形，如下式（10），式（11）：
Langmuir公式：Ceqe=1qm⋅Ce+1qmKL (10) Freundlich公式：lnqe=1n⋅lnCe+lnKL (11) Van′tHoff方程lnKL=−ΔHRT+A (12) 1.2.2.5 HPD-500大孔树脂静态吸附-解吸单因素实验
为探究不同多酚浓度对HPD-500树脂吸附效果的影响，在含有0.5 g干重树脂的100 mL锥形瓶中分别加入40 mL不同浓度的 MBPs溶液（0.1、0.2、0.25、0.3和0.4 mg/mL），于25 ℃、150 r/min摇床中振荡吸附120 min，测定上清液中的总酚含量。
为探究不同pH对HPD-500树脂吸附效果的影响，在含有0.5 g干重树脂的100 mL锥形瓶中加入40 mL（0.25 mg/mL）的MBPs溶液，用0.1 mol/L的HCl溶液和0.1 mol/L的NaOH溶液分别将溶液pH调至5、6、7、8、9，于25 ℃、150 r/min摇床中振荡吸附120 min，测定上清液中的总酚含量。
为探究不同乙醇浓度对HPD-500树脂解吸效果的影响，在含有1 g干重树脂的100 mL锥形瓶中加入40 mL的MBPs溶液（0.25 mg/mL），在25 ℃、150 r/min条件下振荡吸附120 min后，用去离子水冲洗，分别加入40 mL 60%、70%、80%、90%、100%乙醇进行解吸，测定解吸液中的总酚含量。
1.2.2.6 HPD-500大孔树脂动态吸附-解吸单因素实验
为探究不同上样流速对动态吸附效果的影响，取80 mL经活化处理后的HPD-500大孔树脂，湿法上柱，待平衡24 h后，分别以1、2、3、4 BV/h的流速将100 mL MBPs溶液（0.25 mg/mL）上样进行动态吸附，计算MBPs的吸附情况。
为探究不同洗脱流速对动态解吸效果的影响，取80 mL经活化处理后的HPD-500大孔树脂，湿法上柱，平衡24 h后，将100 mL 0.25 mg/mL的MBPs溶液以1 BV/h的流速流入吸附柱，用去离子水清洗至树脂上层液面无色后，分别以1、2、3、4 BV/h的流速利用80%乙醇洗脱液洗脱至无色，测定流出液的总酚含量。
1.2.3 MBPs的UPLC-ESI-QTOF-MS/MS定性分析
参考Zheng等[15]测定绿豆皮多酚的方法，并稍作修改。取2 mL 0.01%的MBPs溶液过0.22 μm有机滤膜后注入进样瓶。利用岛津LC20系统与Waters四极杆飞行时间质谱仪（QTOF-MS）对MBPs中的酚类化合物进行鉴定。色谱条件：在安捷伦poroshell 120 EC-C18 （2.1×100 mm，2.7 µm）色谱柱上进行分离，流动相为乙腈（A）和1%甲酸水（B），洗脱梯度程序：0~2 min，95%B；2~25 min，95%~0%B；25~28 min，0%B；28~28.1 min，0%~95%B；28.1~32 min，95%B。柱温控制在30 ℃，进样量为5 μL，流速设置为0.3 mL/min。质谱条件：毛细管电压4 kV，干燥气体流量8 L/min，干燥气体温度250 ℃，雾化气体压力40 psi，一级m/z 100~1500，二级m/z 50~1500。
1.2.4 纯化后MBPs对α-淀粉酶的抑制效果
参考Chen等[16]的方法，并作适当修改。称取1.0 g可溶性淀粉溶解于100 mL缓冲液中，在90 ℃下糊化10 min，冷却至室温得1%淀粉溶液，作为酶促反应底物。将100 μL α-淀粉酶（9 mg/mL）溶液与100 μL不同浓度的MBPs溶液（0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）混匀，在37 ℃下共孵育6 min；加入1%淀粉溶液至1 mL；在37 ℃下共孵育6 min后加入1 mL DNS显色剂；沸水浴10 min冷却后定容至4 mL，测定其540 nm处的OD值。以等体积阿卡波糖溶液（0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）为阳性对照，等体积PBS为阴性对照，此时的α-淀粉酶活性记作100%。
抑制率(%)=(AC−AS)/AC×100 (13) 式（13）中：AC为PBS空白对照组的吸光值，As为MBPs的吸光值。通过Origin 2021软件对酶活抑制率-样品浓度曲线进行回归分析得到半抑制率浓度（IC50值）。
1.2.5 纯化后MBPs对α-葡萄糖苷酶的抑制效果
参考KARIM等[17]的方法，并作适当修改。将20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（2 U/mL）、20 μL不同浓度的MBPs溶液（0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mg/mL）及90 μL PBS缓冲液加入96孔板中混匀，37 ℃下共孵育5 min，加入pNPG底物（5 mmol/L）至150 μL，孵育后立刻加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液至体系为200 μL终止反应，测定其在405 nm处的OD值。等体积阿卡波糖溶液（0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mg/mL）为阳性对照，等体积PBS为阴性对照，此时的α-葡萄糖苷酶活性记作100%。半抑制率浓度（IC50值）计算同1.2.4。
1.2.6 纯化后MBPs对α-淀粉酶抑制类型的研究
参考王梦婷[18]的方法，并作适当调整。将100 μL α-淀粉酶（9 mg/mL）溶液与100 μL纯化后不同浓度的MBPs溶液（0、0.04、0.08、0.12 mg/mL）混匀，在37 ℃下共孵育6 min；分别加入800 μL不同浓度的淀粉溶液（5、10、20、30、40 mg/mL）；其反应方法同1.2.4。α-淀粉酶、MBPs溶液和淀粉溶液的最终浓度分别为0.225 mg/mL、0~3 μg/mL和1~8 mg/ mL。以反应速率的倒数（1/V）为纵坐标，最终的底物浓度倒数（1/[S]）为横坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数图，进一步计算得到米氏常数Km和最大反应速率Vmax值。研究MBPs对α-淀粉酶的抑制类型。
1.2.7 纯化后MBPs对α-葡萄糖苷酶抑制类型的研究
参考王梦婷[18]的方法，并作适当调整。将20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（2 U/mL）、20 μL不同浓度的MBPs溶液（0、0.04、0.08、0.12 mg/mL）及90 μL PBS缓冲液加入96孔板中混匀，37 ℃下共孵育6 min，分别加入20 μL不同浓度的pNPG底物（2、5、8、11、14 mmol/L）反应方法同1.2.5。α-葡萄糖苷酶溶液、MBPs溶液和pNPG底物的最终浓度分别为0.2 U/mL、0~0.012 mg/mL和0.2~1.4 mmol/L。参照1.2.6的方法绘制Lineweaver-Burk双倒数图，研究MBPs对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。
1.3 数据处理
所有数据都是经过三次平行实验并采用SPSS 27.0进行统计学分析得到，结果以平均值±标准差的形式表示，P<0.05被认为为差异有统计学意义。采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面实验并对数据进行回归分析，通过Origin 2021软件作图。
2. 结果与分析
2.1 MBPs提取及总酚含量测定
本研究以苏绿1号、苏绿2号和苏绿7号三种绿豆的豆皮为原料进行多酚提取，总酚含量分别为5.75±0.03，6.36±0.02和7.13±0.01 mg GAE/g。其中，苏绿7号绿豆皮中多酚含量最高，因此，选择苏绿7号进行后续纯化试验。
2.2 8种大孔树脂对MBPs的静态吸附-解吸性能比较
大孔树脂的极性、粒径、平均孔径和比表面积是决定其对多酚类化合物吸附和解吸能力的重要因素[19]。如表1所示，选取D101，PD100，XAD-7，AB-8，DM301，HPD500，NKA-9，DA201八种粒径、平均孔径、极性及比表面积都不相同的大孔树脂对MBPs进行吸附、解吸试验。由图1可知，相比其他的大孔树脂，HPD-500和NKA-9的吸附率和吸附量都具有更好的表现，分别为91.6%、2.06 mg和91.46%、2.05 mg，这是因为MBPs中含有大量的极性羟基和糖苷键，都具有相当的极性和亲水性[5]。而HPD-500和NKA-9极性相似，两种树脂都属于极性树脂且其比表面积、平均孔径大于其他树脂，因此，MBPs能更好的吸附在这两种树脂上。最后结合解吸性能来看，HPD-500的解吸率和解吸量分别为87.32%、1.80 mg，高于NKA-9的77.48%、1.59 mg，说明由HPD-500吸附的多酚更容易洗脱下来。结合吸附-解吸性能考虑，选取HPD-500大孔树脂进行后续纯化实验。
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图 1 八种树脂对MBPs的吸附-解吸率（A）和吸附-解吸量（B）Figure 1. Adsorption-desorption rate (A) and adsorption-desorption amount (B) ability of eight resins to MBPs2.3 HPD-500大孔树脂对MBPs的吸附动力学研究
如图2（A）所示，10 min以内时，HPD-500对MBPs的吸附量随时间迅速上升；10~60 min时，HPD-500对MBPs的吸附量随时间上升速度开始下降；吸附60 min以后，吸附量随时间而缓慢增加，吸附趋于饱和，逐渐达到平衡状态。总得来说，HPD-500可以在短时间内快速吸附MBPs，为快速吸附型树脂。
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图 2 HPD-500树脂对MBPs的（A）吸附动力学曲线和（B）颗粒内扩散曲线Figure 2. Adsorption kinetic curve (A) and intracellular diffusion curve (B) of HPD-500 resin吸附动力学参数和相关系数如表2所示。准二级动力学方程拟合时的相关系数（0.9961）明显高于准一级动力学方程（0.9794）和颗粒内扩散方程（0.8121），表明其能够更好地阐述HPD-500树脂对MBPs的整个吸附过程。先前报道在大孔树脂吸附猕猴桃皮多酚的动力学模型上得出的结论也是准二级动力方程更适合模拟树脂对多酚的吸附过程[20]。由准二级动力学方程计算得到HPD-500树脂对MBPs的吸附速率常数为0.0947 g/（mg·min），平衡吸附量为2.1468 mg/g，与实验结果相吻合。
表 2 吸附动力学模型拟合参数Table 2. Fitting parameters of adsorption kinetics models大孔树脂 动力学方程 相关系数（R2） 动力学参数 准一级动力学方程y=−0.0437x+0.2362 0.9794 \ HPD-500 准二级动力学方程y=0.4658x+2.2911 0.9961 qe=2.1468
k2=0.0947颗粒内扩散方程y=0.1285x+0.9255 0.8121 \ 虽然颗粒内扩散方程的相关系数较准一级、准二级动力方程较偏低，似乎不能准确的描述HPD-500对MBPs吸附的完整过程，但是由图2（B）可知，这是因为HPD-500对MBPs的吸附并不是呈直线相关的，而是多阶段的。第一阶段（0~10 min）主要涉及到MBPs与HPD-500接触后，而发生的表面扩散，是一个快速吸附的过程；第二阶段（10~60 min）树脂对MBPs的吸附较第一阶段开始变得缓慢，主要是由于MBPs已经进入到了树脂的孔隙内部；第三个阶段（60~120 min），树脂对MBPs吸附逐渐饱和，进入平衡吸附阶段。总的来说，HPD-500树脂对MBPs的吸附主要受表面扩散与颗粒内扩散两个过程的影响，先前林恋竹[14]研究了树脂对溪黄草多酚的吸附机理，同样也报道了该吸附过程是受到这两个阶段的影响。
2.4 HPD-500D大孔树脂对MBPs的吸附热力学研究
HPD-500对MBPs的等温吸附曲线见图3，在25、35和45 ℃下，树脂的平衡吸附量随温度升高而显著降低，平衡浓度随温度的升高而增加，表明MBPs吸附是放热过程，增加温度不利于吸附的进行。
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图 3 HPD-500树脂对MBPs的吸附等温曲线Figure 3. Adsorption isotherm curves of Mung bean polyphenols by LX-8 resin为进一步研究HPD-500树脂对MBPs的等温吸附行为，分别以Ceqe对Ce、lnqe对lnCe作图，并进行线性回归分析，计算相关系数后，得到Langmuir和Freundlich两种吸附等温方程的相关参数（表3）。在不同温度下，HPD-500树脂对MBPs的吸附等温线与Langmuir和Freundlich两个等温方程均有较好的拟合性，但在25 ℃下，二者线性回归方程的相关性（R2）分别为0.9475和0.9903，说明Freundlich等温方程可更好地描述HPD-500树脂对MBPs的等温吸附行为，其对MBPs的热力学吸附表现主要是多分子层吸附，这与先前树脂吸附薏苡仁麸皮多酚的热力学研究中所报道的结果一致[13]。再由lnKL对1T作图，并进行线性回归，通过直线斜率可计算树脂对MBPs吸附过程的焓变值（ΔH）为−1.62，再次表明树脂对MBPs的吸附是轻微的放热过程，整个吸附过程可在室温下进行[13]。此外，ΔH的绝对值小于43 kJ/mol，证明了HPD-500树脂对MBPs的吸附属于物理过程而不是化学行为[14]。
表 3 Freundlich、Langmuir 吸附等温方程及热力学参数Table 3. Freundlich model, Langmuir model and thermodynamic parameters大孔树脂 温度
（℃）Langmuir吸附等温方程 Freundlich吸附等温方程 ∆H
（KJ/mol）qm KL R2 KF 1/n R2 HPD-500 25 ℃ 175.1313 0.7975 0.9475 0.0120 0.6741 0.9903 −1.62 35 ℃ 148.8095 0.9333 0.9699 0.0139 0.5633 0.9691 45 ℃ 138.8889 0.8285 0.9776 0.0158 0.5459 0.9775 2.5 HPD-500树脂静态吸附-解吸单因素实验
2.5.1 不同多酚浓度对HPD-500树脂吸附效果的影响
不同MBPs浓度对HPD-500树脂吸附效果的影响如图4所示，随着MBPs浓度的从0.1 mg/mL增加到0.25 mg/mL，HPD-500树脂的吸附率从87.8%逐渐上升到92.1%，这可能是由于溶液中多酚含量增加，加大了树脂与MBPs接触的机会，进而提高了吸附率。当MBPs浓度高于0.25 mg/mL后，HPD-500树脂的吸附率逐步下降至90.3%，这可能是由于溶液中MBPs含量增加后，杂质含量也随之增加，干扰了树脂与多酚的接触。此外，部分多酚产生了絮状聚合，导致树脂堵塞，影响MBPs与树脂的相互吸附，进一步降低了HPD-500树脂的吸附率[19]。因此，选择0.25 mg/mL的浓度作为MBPs上样浓度。
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2.5.2 不同pH对HPD-500树脂吸附效果的影响
样品溶液的pH会影响MBPs的电离程度，进而改变MBPs与HPD-500树脂的吸附亲和力[21]。从图5可看出，吸附率随pH的增加呈先上升后下降趋势，在pH为6的弱酸环境下，吸附率达到了91.87%，当样品溶液pH继续上升时，吸附率显著下降（P<0.05）。这是因为MBPs含有丰富的酚羟基，是一种弱酸性物质，在弱酸环境下能维持相对稳定的分子形态，有利于树脂吸附。但随着pH增加，MBPs的离子化程度增加，吸附效果又会逐渐减弱[20]。因此，pH6的弱酸性环境更有利于树脂吸附MBPs。
2.5.3 不同乙醇浓度对HPD-500树脂解吸效果的影响
乙醇浓度会影响多酚与树脂之间的相互作用力[22]，进而导致解吸效果的差异。因此，本文考察了不同乙醇浓度对HPD-500树脂解吸效果的影响。从图6可观察到，当洗脱液乙醇浓度从60%增加到80%时，MBPs的解吸率显著上升（P<0.05），达到87.89%，这可能是因为乙醇浓度80%的洗脱液与MBPs极性相似，可以最大程度地弱化多酚与树脂间的范德华力[22]，使MBPs更容易扩散到洗脱液中，增大解吸率。洗脱液乙醇浓度继续上升后，解吸率开始快速下降，其原因可能是随着乙醇浓度的增加，树脂极性与MBPs极性的相似程度降低，可带走的酚类物质含量下降，同时一些亲醇类的脂质、色素等溶出量增加，与MBPs竞争与洗脱液的结合，从而降低对树脂的解吸率。因此，本文选择了洗脱液的乙醇浓度为80%。
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图 6 乙醇浓度对HPD-500树脂解吸率的影响Figure 6. Effect of ethanol concentration on the desorption rate of HPD-500 resin2.6 HPD-500树脂动态吸附-解析单因素实验
2.6.1 上样流速对HPD-500树脂吸附效果的影响
先前已有报道，不同的上样流速可显著影响树脂对多酚的吸附效果[23]。见图7所示，当流速为1 BV/h时，HPD-500树脂对MBPs的吸附率最高（89.24%），在这个流速下MBPs与HPD-500树脂有充分时间进行相互吸附，从而增加吸附率。但随着上样流速的增加，树脂对MBPs的吸附率逐渐下降，流速为4 BV/h时下降至77.12%，这可能是由于过快的流速使得树脂没有与多酚充分接触，降低了吸附效率。最终选择1 BV/h的上样流速进行后续实验。
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图 7 上样流速对HPD-500树脂吸附效果的影响Figure 7. Efrfect of sample flow rate on the adsorption effect for HPD-500 resin2.6.2 洗脱流速对HPD-500树脂解吸效果的影响
由图8可知，树脂对MBPs的解吸率随洗脱液流速的增加呈先上升后下降趋势。当洗脱流速由1 BV/h上升到2 BV/h时，解吸率显著增加，达到87.67%（P<0.05）。这主要是因为本研究选择的洗脱液为80%乙醇，在较低洗脱流速下会有部分挥发导致解吸率不高。当洗脱流速为2 BV/h时，洗脱液能有充分时间与树脂接触，破坏多酚与树脂的相互作用力，使更多的多酚类物质被解吸出来[24]。洗脱流速过快又会减少树脂与洗脱液的接触机会，从而降低洗脱率。综合考虑，最终选择2 BV/h 的洗脱流速进行洗脱。
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图 8 洗脱液流速对HPD-500树脂解吸率的影响Figure 8. Effect of eluent flow rate on the desorption rate of HPD-500 resin最终优化后的纯化工艺为：MBPs浓度0.25 mg/mL、pH为6、洗脱液乙醇浓度为80%、上样流速1 BV/h和洗脱液流速2 BV/h。纯化后MBPs的纯度从22.46%增加到57.23%，提升了2.55倍。
2.7 基于UPLC-ESI-QTOF-MS/MS的MBPs组分分析
采用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定纯化后的MBPs提取物中的酚类单体。通过保留时间、分子式和特征离子片段（m/z）与数据库和文献进行匹配，共鉴定出12种酚类化合物。主要由没食子酸、山奈酚、牡荆素、异牡荆素、芹菜素等黄酮和酚酸组成（表4）。香草酸、没食子酸是绿豆中最常见的酚酸[11]，牡荆素和异牡荆素是绿豆中两种主要的黄酮类化合物。先前报道绿豆中含有丰富的牡荆素、异牡荆素等活性成分，且主要存在于绿豆皮中，与本次鉴定结果一致[25]。牡荆素、异牡荆素等酚类物质可有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，预防糖尿病及其并发症[26]。因此，MBPs是一种具有降血糖潜力的活性成分。
表 4 纯化后MBPs提取物的成分鉴定Table 4. Composition identification of MBPs extracts after purification序号 成分 化学式 中性质量
（Da）质荷比m/z 保留时间（min） 1 山奈酚Kaempferol C15H10O6 287.0550 287.0541 9.94 2 牡荆素Vitexin C21H20O10 431.0984 431.0976 7.8 3 异牡荆苷Isovitexin C21H20O10 431.0984 431.1021 7.91 4 芹菜素Apigenin C15H10O5 269.0455 269.0445 11.40 5 矢车菊素Cyanidin-3-O-glucoside C21H21O11 285.0407 285.0391 10.34 6 染料木苷Genistin C21H20O10 432.0984 432.1024 7.46 7 芦丁Rutin C27H30O16 609.1123 609.1427 5.11 8 二氢槲皮素Dihydroquercetin C15H12O7 304.058 305.122 6.87 9 香橙素Dihydrokaempferol C15H12O6 287.0561 287.0544 10.09 10 大豆苷Daidzin C21H20O9 415.1034 415.1000 8.66 11 香草酸Vanillic acid C8H8O4 167.0359 167.0350 11.41 12 没食子酸Gallic acid C7H6O5 169.0130 169.0147 2.67 2.8 MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性
由图9可知，MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性随着MBPs浓度增加上升，具有明显的剂量依赖性。在0.12 mg/mL的浓度下，MBPs对α-淀粉酶的抑制率为64.71%，已接近于阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率（74.22%），表明MBPs对α-淀粉酶具有一定的抑制作用。而MBPs对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率为84.12%，高于阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率82.03%，表现出了比阿卡波糖更强的降血糖活性。先前已有报道，山竹皮多酚有助于迟缓淀粉消化，是因其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有良好的抑制效果[27]，这与本文研究的结果一致，证明MBPs具有良好的降血糖活性。
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图 9 不同浓度的阿卡波糖、MBPs对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的抑制作用Figure 9. Inhibition of α-amylase (A) and α-glucosidase (B) by different concentrations of acarbose and MBPs进一步计算MBPs对两种酶的半抑制率浓度（IC50），对于α-淀粉酶，MBPs和阿卡波糖的IC50值分别为19.38 μg/mL和98.85 μg/mL，可知MBPs对α-淀粉酶抑制效果不及阿卡波糖，这可能与MBPs提取纯度不高有关，纯化后MBPs纯度为57.23%，远低于阿卡波糖的纯度98%。而对于α-葡萄糖苷酶，MBPs和阿卡波糖的IC50值分别为7.25 μg/mL和10.51 μg/mL。阿卡波糖虽然是目前控制T2DM的主要药物，但具有引起腹肠胀气、腹泄、红斑、皮疹等皮肤症状的副作用[28]。而从绿豆皮中提取的多酚更为天然安全，提取成本低廉，原料来源广泛，还可以实现农产品副产物的资源再利用。
2.9 MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制类型
图10为不同浓度MBPs作用下α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的Lineweaver-Burk曲线图。不难看出，随着MBPs浓度的增加，两种酶的曲线斜率增加，Km值均随着Vmax值的减小而增大（表5），且Lineweaver-Burk曲线在坐标轴上分别相交于第二象限和第三象限，这表明MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制均为混合型抑制，具有竞争性和非竞争性的抑制特性[29]。换而言之，MBPs不仅可以通过与游离酶反应来抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，还可以通过与酶-底物复合物反应抑制二者的活性。YU等[30]发现秋葵多酚能以混合型模式抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，对两种淀粉酶的作用位点具有完整性和单一性，LAI等[27]发现山药皮多酚不仅可以与α-葡萄糖苷酶竞争活性pNPG结合位点，而且还可以与α-葡萄糖苷酶pNPG包合物以非竞争模式结合，这些都与本文研究结果相似。此外，从Vmax和Km值可以看出，α-淀粉酶的Km值整体上大于α-葡萄糖苷酶。说明MBPs对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于α-淀粉酶，这与先前酶活性抑制实验IC50的结果一致（α-葡萄糖苷酶IC50值7.25 μg/mL和α-淀粉酶IC50值 98.85 μg/mL）。综上所述，MBPs可被认为是α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的混合型抑制剂，可与底物竞争与酶活性中心的结合，减少葡萄糖的产生进而发挥降血糖作用。
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图 10 MBPs对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的Lineweaver-Burk曲线Figure 10. Effect of MBPs on α-amylase (A) and α-glycosidase (B) Lineweaver-Burk curves表 5 MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线方程Table 5. Lineweaver-Burk curve equations of MBPs for α-amylase and α-glucosidase消化酶 MBPs
（mg/mL）线性回归方程 Km
（mg/mL）Vmax
（OD/min）斜率 截距 R2 α-淀粉酶 0 12.813 2.652 0.996 0.034 0.377 0.04 19.325 3.275 0.991 0.063 0.305 0.08 26.893 3.967 0.994 0.107 0.252 0.12 34.220 4.475 0.985 0.153 0.223 α-葡萄糖苷酶 0 2.39 1.023 0.998 0.002 0.978 0.04 3.145 1.602 0.994 0.005 0.624 0.08 4.172 2.339 0.987 0.010 0.428 0.12 4.662 3.504 0.998 0.016 0.285 3. 结论
本研究对MBPs的纯化工艺进行了优化，并初步探讨了MBPs的体外降血糖活性。通过比较八种不同类型大孔吸附树脂的静态吸附-解吸性能筛选出最适合MBPs纯化的HPD-500树脂。通过吸附动力学试验发现准二级方程最适合描述HPD-500树脂对MBPs的吸附过程。吸附热力学研究显示HPD-500树脂对MBPs的吸附是轻微的放热过程，可在室温下进行。利用静/动态单因素吸附解吸实验对纯化工艺参数进行了优化，当多酚浓度为0.25 mg/mL，pH为6，乙醇浓度为80%，上样流速为1 BV/h，洗脱流速为2 BV/h时，所得MBPs纯度从22.46%提高到57.23%，表明该纯化条件切实可行。经UPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析可知，纯化后MBPs中含有没食子酸、山奈酚、牡荆素、异牡荆素、芹菜素等12种酚类化合物。体外降血糖活性研究表明，MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，IC50值分别为98.85 μg/mL和7.25 μg/mL。进一步分析了其抑制类型，结果显示MBPs是α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶的竞争型和非竞争型的混合型抑制剂。MBPs是一种存在于农业副产物中的天然降血糖成分，后续将对MBPs的酶抑制机理进行深入探究，以期为MBPs的综合开发利用提供理论依据。
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图 1 八种树脂对MBPs的吸附-解吸率（A）和吸附-解吸量（B）
Figure 1. Adsorption-desorption rate (A) and adsorption-desorption amount (B) ability of eight resins to MBPs
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图 2 HPD-500树脂对MBPs的（A）吸附动力学曲线和（B）颗粒内扩散曲线
Figure 2. Adsorption kinetic curve (A) and intracellular diffusion curve (B) of HPD-500 resin
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图 3 HPD-500树脂对MBPs的吸附等温曲线
Figure 3. Adsorption isotherm curves of Mung bean polyphenols by LX-8 resin
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图 6 乙醇浓度对HPD-500树脂解吸率的影响
Figure 6. Effect of ethanol concentration on the desorption rate of HPD-500 resin
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图 7 上样流速对HPD-500树脂吸附效果的影响
Figure 7. Efrfect of sample flow rate on the adsorption effect for HPD-500 resin
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图 8 洗脱液流速对HPD-500树脂解吸率的影响
Figure 8. Effect of eluent flow rate on the desorption rate of HPD-500 resin
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图 9 不同浓度的阿卡波糖、MBPs对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的抑制作用
Figure 9. Inhibition of α-amylase (A) and α-glucosidase (B) by different concentrations of acarbose and MBPs
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图 10 MBPs对α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）的Lineweaver-Burk曲线
Figure 10. Effect of MBPs on α-amylase (A) and α-glycosidase (B) Lineweaver-Burk curves
表 1 八种大孔树脂的理化性质
Table 1 Physicochemical properties of the eight macroporous resins
树脂类型 极性 平均孔径
（nm）粒径
（mm）比表面积（m2/g） D101 非极性 90~100 0.3~1.25 500~580 HPD100 非极性 120~160 0.3~1.25 500~580 XAD-7 弱极性 45 0.5~0.71 500 AB-8 弱极性 13~14 0.3~1.25 ≥480 DM-301 中性 14~17 0.3~1.25 ≥330 HPD-500 极性 55~75 0.3~1.25 500~550 NKA-9 极性 155~165 0.3~1.25 250~290 DA201 强极性 130~140 0.3~1.25 ≥220 
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表 2 吸附动力学模型拟合参数
Table 2 Fitting parameters of adsorption kinetics models
大孔树脂 动力学方程 相关系数（R2） 动力学参数 准一级动力学方程y=−0.0437x+0.2362 0.9794 \ HPD-500 准二级动力学方程y=0.4658x+2.2911 0.9961 qe=2.1468
k2=0.0947颗粒内扩散方程y=0.1285x+0.9255 0.8121 \
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表 3 Freundlich、Langmuir 吸附等温方程及热力学参数
Table 3 Freundlich model, Langmuir model and thermodynamic parameters
大孔树脂 温度
（℃）Langmuir吸附等温方程 Freundlich吸附等温方程 ∆H
（KJ/mol）qm KL R2 KF 1/n R2 HPD-500 25 ℃ 175.1313 0.7975 0.9475 0.0120 0.6741 0.9903 −1.62 35 ℃ 148.8095 0.9333 0.9699 0.0139 0.5633 0.9691 45 ℃ 138.8889 0.8285 0.9776 0.0158 0.5459 0.9775
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表 4 纯化后MBPs提取物的成分鉴定
Table 4 Composition identification of MBPs extracts after purification
序号 成分 化学式 中性质量
（Da）质荷比m/z 保留时间（min） 1 山奈酚Kaempferol C15H10O6 287.0550 287.0541 9.94 2 牡荆素Vitexin C21H20O10 431.0984 431.0976 7.8 3 异牡荆苷Isovitexin C21H20O10 431.0984 431.1021 7.91 4 芹菜素Apigenin C15H10O5 269.0455 269.0445 11.40 5 矢车菊素Cyanidin-3-O-glucoside C21H21O11 285.0407 285.0391 10.34 6 染料木苷Genistin C21H20O10 432.0984 432.1024 7.46 7 芦丁Rutin C27H30O16 609.1123 609.1427 5.11 8 二氢槲皮素Dihydroquercetin C15H12O7 304.058 305.122 6.87 9 香橙素Dihydrokaempferol C15H12O6 287.0561 287.0544 10.09 10 大豆苷Daidzin C21H20O9 415.1034 415.1000 8.66 11 香草酸Vanillic acid C8H8O4 167.0359 167.0350 11.41 12 没食子酸Gallic acid C7H6O5 169.0130 169.0147 2.67
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表 5 MBPs对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线方程
Table 5 Lineweaver-Burk curve equations of MBPs for α-amylase and α-glucosidase
消化酶 MBPs
（mg/mL）线性回归方程 Km
（mg/mL）Vmax
（OD/min）斜率 截距 R2 α-淀粉酶 0 12.813 2.652 0.996 0.034 0.377 0.04 19.325 3.275 0.991 0.063 0.305 0.08 26.893 3.967 0.994 0.107 0.252 0.12 34.220 4.475 0.985 0.153 0.223 α-葡萄糖苷酶 0 2.39 1.023 0.998 0.002 0.978 0.04 3.145 1.602 0.994 0.005 0.624 0.08 4.172 2.339 0.987 0.010 0.428 0.12 4.662 3.504 0.998 0.016 0.285
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