In Vitro Digestion and Fermentation Characteristics of Mochella Polysaccharides and the preparation of Effervescent Tablets
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摘要: 为探究羊肚菌多糖的体外消化及酵解特性并开发具有明确功效成分和含量的新型羊肚菌多糖泡腾片产品，本文探究羊肚菌多糖进行体外模拟唾液-胃肠消化和人粪酵解过程的变化，并通过大肠杆菌（Escherichia coli）和乳酸杆菌（Lactobacillus）的体外增殖试验评估其对肠道生态的影响。采用单因素实验并结合模糊数学感官评价法，以泡腾片的模糊感官评分为指标优化羊肚菌多糖泡腾片制备工艺。通过检测泡腾片水分含量、片重、厚度、崩解时限、发泡量及硬度等指标评价其品质。羊肚菌多糖模拟体外消化及酵解研究表明，其在唾液、胃和小肠液中稳定性较好，易被大肠肠道菌群降解并吸收利用，且具有益生活性，可作为益生元的潜在来源。体外增殖试验表明，羊肚菌多糖对常见的2种肠道细菌（大肠杆菌和乳酸杆菌的生长有促进作用，可参与调节人体肠道微生态。实验得到泡腾片最佳配方：羊肚菌多糖10%、崩解剂65%、甜味剂1.5%、润滑剂0.5%。对所得泡腾片理化指标进行检测，均符合《中国药典》的规定。本研究证明了羊肚菌多糖具有益生活性，为羊肚菌多糖开发利用提供理论依据。Abstract: In order to explore in vitro digestion and fermentation characteristics of Mochella polysaccharides and develop a new type of morel polysaccharide effervescent tablet with definite efficacy ingredients. In this study, the changes in simulated saliva-gastrointestinal digestion and human fecal fermentation was explored. Additionally, the impact of Mochella polysaccharides on intestinal ecology through in vitro proliferation experiments with Escherichia coli and Lactobacillus was evaluated. A single-factor experiment combined with fuzzy mathematics sensory evaluation was conducted to optimize the preparation process of Mochella polysaccharides effervescent tablets, using fuzzy sensory scores as the evaluation index. The quality of the effervescent tablets was evaluated by measuring their moisture content, weight, thickness, disintegration time, foaming capacity, and hardness. Simulated digestion and fermentation studies revealed that Mochella polysaccharides exhibited good stability in saliva, gastric, and intestinal fluids. They were readily degraded by intestinal microbiota and could be absorbed and utilized, highlighting their potential as a prebiotic source. In vitro proliferation experiments showed that Mochella polysaccharides promoted the growth of two common intestinal bacteria, Escherichia coli and Lactobacillus, thereby helping regulate human intestinal microecology. The optimal formulation of the effervescent tablets was determined to be 10% Mochella polysaccharides, 65% disintegrant, 1.5% sweetener, and 0.5% lubricant. The physicochemical properties of the resulting tablets met the standards set by the Chinese pharmacopoeia. This study highlights the probiotic potential of Mochella polysaccharides and provides a theoretical foundation for their development and utilization.
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羊肚菌（Morchella）是一种味道鲜美的食用菌，生长于低温环境，主要分布在北半球的温带地区，是世界上最珍贵的食用菌之一[1]，具有较高的经济价值，风味独特且保健功能优越。羊肚菌富含氨基酸、蛋白质和不饱和脂肪酸，具有极高的营养价值。羊肚菌多糖（Morchella polysaccharide，MEP）是羊肚菌的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎、免疫调节、降血糖、预防动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种生物活性[2]，是羊肚菌生物活性的基础[3]，有重要的研究价值。此外，MEP还通过刺激有益菌的生长调节肠道微生物群进而改善肠道健康的功效也引起了广泛关注。
泡腾片具有优良的崩解性能，有效成分逸出迅速，可以充分发挥组合物的生物活性和疗效，不必经过肠胃崩解的过程。除此之外，泡腾片相较于常规药剂口感更好，可以添加到水或液体饮料中，更容易服用，可为吞咽困难的人群提供便利[4]。传统子实体泡腾片功效成分及含量不明确，功效作用复杂。羊肚菌富含多种生物活性物质，目前已开发出部分羊肚菌保健品、食品以及饮品等，但产品结构过于单一，不能完全满足消费者的需求[5]。
本文基于模拟人体体外消化和酵解实验，探究MEP在体外消化酵解过程中的变化，并通过富集培养评估了MEP对双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的益生作用，为MEP的益生活性研究提供参考依据。结合模糊数学法与单因素实验制备以MEP为主成分的泡腾片，开发具有明确功效成分和含量的新型功能食品，为MEP相关产品的制作提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
MEP组分纯化 实验室提取、纯化获得[6]（干基总糖含量75.11%，其中甘露糖3.32%、葡萄糖56.03%、半乳糖40.65%）；GAM培养基 上海源叶生物科技有限公司；MRS液体培养基、TSB肉汤液体培养基、TPY液体培养基、TPY琼脂养基、MRS琼脂培养基、GAM培养基 上海源叶生物科技有限公司；猪胆盐、胃脂肪酶（1500 U/mL）、胃蛋白酶（2000 U/mL）、胰酶（160 U/mL）、胰蛋白酶（250 U/mL） 上海阿拉丁生化科技有限公司；食品级柠檬酸、碳酸氢钠、阿斯巴甜、甘露醇、甜菊糖苷、麦芽糊精、聚乙二醇6000 河南万邦食品有限公司。
D930A药片压片机 北京新龙立科技有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；JT-K6水分测定仪 泰州市精泰仪器仪表有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；YD-20硬度仪 天大天发科技有限公司；SX-500全自动高压灭菌锅 日本TOMY公司；Daisy II体外模拟消化培养箱 美国安卡姆科学技术公司；T10B S25手持式均质器 德国IKA公司；RCT basic磁力搅拌器 德国IKA公司；TU-1900酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；UV-6000PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；DHG-9053J精密恒温鼓风干燥箱 上海三发科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 MEP体外消化实验
消化试验参考张鑫淼等[7]的方法，略有调整如下：收集4名健康志愿者的新鲜唾液，4 ℃、5000 r/min 离心5 min，收集上清液，并测定唾液淀粉酶活性，保存备用。用去离子水溶解羊肚菌多糖配制质量浓度为5 mg/mL的羊肚菌多糖溶液，并以5 mg/mL的魔芋葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）作为对照，纯水作空白组，将所有样品与唾液按1:1混合后置于37 ℃的水浴锅进行模拟口腔消化反应，并在0、0.25、0.5、1 h时取样测定还原糖及分子量。
模拟胃消化试验。首先配制胃电解质溶液，称取23.6 mg胃蛋白酶、25.0 mg胃脂肪酶和1 mL CH3COONa（1 mol/L）溶解于100 mL胃电解质溶液中，以0.1 mol/L HCl溶液调节pH至2.0，该溶液即为模拟胃液。
设置3个试验组，分别为：Control组（15 mL蒸馏水与15 mL模拟胃液）；MEP试验组（15 mL MEP溶液与15 mL模拟胃液）；MEP对照组（15 mL蒸馏水与15 mL MEP溶液）。反应开始后置于37 ℃恒温加热磁力搅拌器中孵育。分别在反应时间点0、0.5、1、2、4 h从每组试管中各取三支作为平行测定还原糖含量和分子量。反应结束将样本浸入沸水浴10 min灭酶活，保存后续试验使用。
将经过胃液消化的样品用1 mol/L NaHCO3溶液调节pH至7。配制肠电解质溶液，补充胆盐与所需胰酶，加入模拟肠液进行体外肠道模拟消化，并使用1.0 mol/L NaOH调节pH至7。同上设置Control组、MEP试验组和MEP对照组[8]。消化时，分别在反应0、0.5、1、2、4 h时从每组各取三支作为平行测定还原糖含量和分子量，结束后将样本浸入沸水浴灭酶10 min。
1.2.2 羊肚菌多糖体外酵解实验
人粪便样本来自于三位健康且在过去三个月没有接受抗生素治疗的志愿者，年龄为20~30岁。参考Cao等[9]的方法，取新鲜粪便于灭菌离心管，在厌氧条件用灭菌的0.1 mol/L磷酸钠缓冲溶液（pH7.4）按1:9（w/v）的比例旋涡混匀。粪便浆液通过四层无菌粗棉布过滤，并迅速接种。基础培养基选择GAM培养基，以羊肚菌多糖样品作为唯一碳源。以魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）为对照组，以无碳源添加的为阴性对照（Control组）。配制培养基121 ℃高压灭菌20 min。按菌液接种量10%（v/v），羊肚菌多糖添加量1%（w/v）配制发酵液，取10 mL于厌氧发酵管，氮吹2 min以去除发酵管中氧气，密封后置于37℃摇床恒温振荡培养36 h，每组6个重复。
1.2.3 羊肚菌多糖体外消化及酵解相关指标测定
1.2.3.1 消化过程中还原糖含量
每隔一定时间取经过唾液、模拟胃液和小肠液消化的消化产物1.0 mL。采用DNS法测定[10]还原糖含量，取样液1.0 mL，加入DNS试剂1.5 mL，摇匀，沸水浴5 min，立即取出，冷却后加蒸馏水定容至25.0 mL，摇匀，在520 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖做标准曲线（y=16.51x-0.06，R2=0.9967）。
1.2.3.2 消化前后多糖分子量变化
利用凝胶色谱仪（GPC）测定消化后分子量，参考Zhang等[11]的方法，分别取消化后口腔消化液、胃消化液、肠消化液，过0.22 µm微孔滤膜后进样20 μL测定。去离子水作为流动相，以1.0 mg/min速率通过Sepax SRT SEC-100（7.8 mm×300 mm）凝胶柱，检测器RX，柱温为40 ℃。通过一系列不同分子量（708、344、107、47 kDa、5908 Da）标准聚钠盐（苯乙烯磺酸钠）校准，根据保留时间计算待测多糖的分子量。
1.2.3.3 酵解过程中总糖消耗量
在反应0、6、12、18、24、36 h时取不同组的发酵液1.0 mL，采用苯酚硫酸法[12]测定总糖含量。
1.2.3.4 酵解过程中菌液pH
在反应0、6、12、18、24、36 h时取不同组的上清液测定pH。
1.2.3.5 酵解过程中短链脂肪酸的测定
每隔一段时间取不同组的发酵液，放入冰水终止发酵，随后转移发酵液至无菌离心管，5000 r/min离心10 min，上清液用于SCFAs的检测。取2 mL上清液，加入0.2 mL50%的硫酸和2 mL无水乙醚，充分涡旋后于4 ℃静置30 min，之后取出乙醚相上清液，0.45 μL微膜过滤，并转入1.5 mL棕色瓶保存，之后用装备DB-FFAP色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）的Agilent7890气相色谱仪对短链脂肪酸定量分析。
色谱条件：以高纯度氮为载气，初始温度为40 ℃、以10 ℃/min的升温速度，升温15 min，维持3 min，检测器温度设置为240 ℃，检测信号，进样量2 μL，每个样品检测约35 min。
配制不同梯度浓度的乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异丁酸、异戊酸、标准品，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行色谱分析，绘制标准曲线。
1.2.4 羊肚菌多糖对肠道微生物生长影响
参考曾钰鹏等[13]的方法并稍作修改。以未加葡萄糖的GAM培养基为基础培养基，配制成含有不同剂量羊肚菌多糖，且质量分数为0%（Control）、0.1%（MEP-1）、0.5%（MEP-2）的液体培养基。以KGM为阳性对照；配制选择培养基从粪便发酵液中分离出双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌：首先将人体粪便发酵液进行梯度稀释，涂布于不同鉴别培养基培养，从中挑选出符合特征的菌落继续分离与纯化，染色后镜检直至获得纯菌株为止。后续提取DNA并PCR扩增，对检测合格的PCR扩增产物双向测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析。取10 mL培养基分别接入100 μL双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌菌液，于厌氧摇床37 ℃培养48 h，每隔一段时间取样，测定其600 nm波长下的吸光值。
1.2.5 泡腾片制作工艺
泡腾片制作主要采用酸碱两相制粒法。称取碱源与酸源分别放于制粒模具，加入10%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，充分混匀，置干燥箱60 ℃干燥1 h。干燥后放在研钵研碎，加入羊肚菌多糖、甜味剂、填充剂，过0.25 mm直径筛，将聚乙二醇6000（PEG 6000）于烧杯80 ℃水浴锅加热溶解，迅速加入过筛粉末，快速搅拌至混匀，倒入模具，冷却后压片，得到泡腾片。
1.2.6 泡腾片原料选择
以感官评价为指标，确定酸源（1 g苹果酸、柠檬酸分别溶于200 mL纯水比较口感）、碱源（1 g碳酸钠、碳酸氢钠分别溶于200 mL纯水比较口感）、甜味剂（分别称1 g三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷溶于200 mL纯水，再按照酸碱比加入酸和碱后搅拌均匀比较口感）、填充剂（分别将麦芽糊精、甘露醇、两者质量比1:1混合压片，观察泡腾片成型情况，再溶于50 mL纯水中，比较不同填充剂的添加对溶液的口感的影响。）。以泡腾片发泡量和pH为指标确定酸碱比（1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1）。
1.2.7 单因素实验
以泡腾片总重量为基准，固定羊肚菌多糖添加量7.5%，甜味剂添加量1%，润滑剂0.5%，崩解剂添加量65%，考察羊肚菌多糖（2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%）、甜味剂（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、崩解剂（50%、55%、60%、65%、70%）、润滑剂（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）添加量对泡腾片感官品质的影响[14]。
1.2.8 正交试验设计
在单因素基础上，以羊肚菌多糖添加量（A）、崩解剂添加量（B）、甜味剂添加量（C），润滑剂添加量（D）为研究因素，以泡腾片的模糊感官评分为考核指标，设计四因素三水平的L9（34）正交试验方案。
表 1 泡腾片配方正交试验的因素与水平Table 1. Factors and levels of orthogonal test on the formula of effervescent tablets水平 因素 A羊肚菌多糖
添加量（%）B崩解剂
添加量（%）C甜味剂
添加量（%）D润滑剂
（%）1 5 60 1 0.4 2 7.5 65 1.5 0.5 3 10 70 2 0.6 1.2.9 感官评价
分别取泡腾片溶于50 mL纯水，充分溶解后由10名经过培训的感官品评人员（年龄为20~30岁，男女各5人）组成评价小组，按规定的评判标准对产品的感官品质进行评价[15]，评价标准如表2所示。
表 2 感官评价标准Table 2. Sensory assessment criteria项目 评分标准 分值（分） 口感 甜度适中 9~10 微酸或微甜 6~8 较酸或较甜 3~5 过酸或过甜 0~2 外观 片剂完整，颜色均匀，光滑 9~10 片剂完整，颜色较均一，较光滑 6~8 片剂较完整，轻微吸潮 3~5 片剂粗糙不均匀，吸潮 0~2 气味 浓郁的羊肚菌香味 9~10 较浓的羊肚菌香味 6~8 淡淡的羊肚菌香味 3~5 无味 0~2 溶液状态 羊肚菌固有的淡黄色，液体澄清，无沉淀 9~10 羊肚菌固有的淡黄色，液体较澄清 6~8 液体无色，少量浑浊 3~5 液体浑浊，较多沉淀 0~2 1.2.10 建立模糊数学综合评价模型
1.2.10.1 评价因素
评价因素集U是指产品感官质量构成因素的集合[16]，根据上述4项指标，形成泡腾片的评价因素集：U=（u1，u2，u3，u4），其中，u1～u4分别代表本研究中口感、外观、气味、溶液状态4个指标。建立评价评语集合，泡腾片的评价评语集合为V=（v1，v2，v3，v4）=（80，60，40，20），其中，优（v1）、良（v2）、中（v3）、差（v4）作为评价评语。
1.2.10.2 评价权重
权重集A是指产品感官质量构成因素分别占权重大小的合集，根据表中指标，由10名专业评价员对权重集合打分，采用二元对比法确定各指标权重，将结果进行归一化，形成泡腾片评价项目权重集：A=（a1，a2，a3，a4），各评价指标所占权重比例为（0.45，0.25，0.13，0.17）。
1.2.10.3 模糊矩阵的建立
根据正交试验表L9（34）中组合进行制粒，10名品评人员根据评语集V对每一个产品逐一评价[17]。
根据感官评价得分结果，得到Ri的模糊矩阵。依据模糊变换原理：B=A×R，则对第i号样品的综合评价结果为Bi=A·Ri，即可得到分析结果矩阵B。将分析结果集中各个量分别乘以其对应的分数，并进行加和，最后得到评价总分C，Ci=Bi×V（i=1，2，3，4，5，6，7，8，9）。
1.2.11 泡腾片基本指标测定
1.2.11.1 水分
采用水分测定仪测定。
1.2.11.2 硬度
采用硬度仪检测泡腾片的硬度。将片剂放置于两压板之间，沿直径方向缓缓施压，记录片剂刚破碎时的力即为该片的硬度。
1.2.11.3 片厚
用游标卡尺测量片剂最厚处，每个片剂测量3次，取平均值。
1.2.11.4 发泡量
取25 mL具塞刻度试管3支，将泡腾片放入，完全溶解后，插入10 mL注射器，观察注射器回推数值，平行测定三次，计算发泡量，结果取平均值。
1.2.11.5 崩解时限
参考查晓彤等[18]的方法，准确量取200 mL纯水，机抽取1片泡腾片放入水中，立即开始计时，直到无气泡产生溶解完全后停止计时。测量三次，结果取平均值。
1.2.11.6 pH
参考王京龙等[19]的方法，使用pH计测定。
1.3 数据处理
所有试验均重复三次，结果表示为平均值±标准差，使用SPSS 25通过Tukey检验分析结果，差异显著性为P<0.05。采用Origin Pro 2018软件绘制图表。
2. 结果与分析
2.1 模拟体外消化及酵解分析
2.1.1 模拟体外消化对MEP还原糖含量影响
本实验在模拟口腔消化前，测定了四名志愿者收集到的唾液α-淀粉酶活性，其唾液pH为6.68±0.21，唾液中α-淀粉酶的平均活力为98±5 U/mL，均在正常范围之内[20]。
如表3所示，在消化0 h时消化液中检测到少量还原糖（0.365 mg/mL），这可能是唾液中本身存在。经过口腔消化后，还原糖含量无显著性提高（P>0.05），表明唾液淀粉酶对MEP没有显著性影响。景永帅等[21]对玉竹多糖的体外模拟唾液消化试验，经唾液消化后，发现还原糖吸光度及多糖分子质量分布并未发生变化，说明没有产生还原糖。
表 3 模拟体外消化对MEP还原糖含量的影响Table 3. Effect of simulated in vitro digestion on the content of reducing sugar in MEP消化过程 时间（h） 还原糖含量（mg/mL） 口腔 0 0.365±0.002a 0.25 0.362±0.007a 0.5 0.364±0.003a 1 0.362±0.005a 胃 0 0.384±0.002a 0.5 0.392±0.005ab 1 0.397±0.008b 2 0.402±0.009b 4 0.405±0.002b 肠 0 0.405±0.008b 0.5 0.413±0.005b 1 0.404±0.005b 2 0.405±0.002b 4 0.406±0.007b 注：同一指标的不同小写字母代表组内有显著性差异（P<0.05）。 模拟胃消化液0 h时同样检测出还原糖，含量0.384±0.002 mg/mL；消化4 h后，还原糖含量增加至0.405±0.002 mg/mL，经分析发现消化过程中各时间点的还原糖含量之间没有显著性差异（P>0.05）；同样，经过4 h肠消化的还原糖含量依然没有显著变化（P>0.05）。Bai等[22]研究了山药多糖在模拟胃肠消化和粪便发酵过程中的特征变化，发现山药多糖的分子量和游离单糖、还原糖含量在胃消化过程中保持不变。安玲艳等[23]探究银耳多糖的体外消化特性发现还原糖、总多糖含量、总糖醛酸含量在消化过程中无显著变化，分子量和表观粘度趋于稳定，说明消化过程中多糖含量无显著变化，与本试验羊肚菌多糖体外消化特性相似。
2.1.2 模拟体外消化对MEP分子量的影响
模拟口腔、肠胃体外消化过程，MEP的GPC图谱如图1所示，可以看到出峰时间以及峰形基本相似。参考前人[6]的工作，未经消化的MEP平均分子量分别为38、89 kDa。从表4可以看出，经唾液、模拟胃液和肠液消化后平均分子量均在38 kDa和90 kDa左右，与未经消化的分子量基本相同，总体看来多糖分子量较稳定。
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图 1 多糖经体外模拟唾液、胃液、肠液后的分子量分布注：a-唾液；b-胃液；c-肠液。Figure 1. Molecular weight distribution of MEP after simulated digestion in vitro表 4 多糖模拟体外消化后分子量分布Table 4. Molecular weight distribution of MEP after simulated in vitro digestion分子量分布 样品 Mn（Da） Mw（Da） Mv（Da） Mp（Da） Mz（Da） 分散性指数 唾液消化 900713 902224 939781 903652 905002 1.001677 377410 383667 342721 390525 397933 1.016578 胃液消化 912735 913394 / 914033 914651 1.000723 372637 385856 435241 389186 382619 1.007112 肠液消化 895387 897137 929867 898786 900340 1.001905 390498 393696 374787 397003 400401 1.008191 注：MN为数均分子量，MW为重均分子量，MV为粘均分子量，MP为最高峰分子量，MZ为平均分子量。 张文易[8]发现绣球菌多糖在消化过程中分子量降解不明显，仅在胃消化阶段略有降解，但降解率不到1%。陈湑慧等[24]研究发现生姜茎叶多糖组分GSLP-3和GSLP-4经口腔、胃和小肠消化，还原糖含量一直处于较低水平，说明二者多糖组分在口腔、胃和小肠中保持稳定，Mw分布没有发生显著性变化。以上发现说明羊肚菌多糖组分在口腔、胃和小肠中保持稳定，不易被降解，可到达大肠内。
2.1.3 模拟体外酵解总糖消耗量变化
由图2可以看出，两组多糖经过36 h酵解，总糖消耗量逐渐增加，总糖含量逐步下降，并且在前12 h发酵过程中消耗最快，在后续发酵过程缓慢升高，稳定后KGM的消耗量为33.66%±2.31%。KGM是一种从魔芋的块茎中提取的天然高分子杂多糖，有预防肿瘤癌变、润肠通便、增强免疫力、降血糖、降脂减肥、抗炎和改善肠道生态等多种保健功能作用[25]，与KGM相比，MEP的总糖消耗量更多，为41.45%±1.5%，这表明MEP更易被肠道菌群降解并利用。
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2.1.4 模拟体外酵解中pH变化
多糖经肠道微生物发酵会产生酸性产物，例如各种SCFAs，这些产物能够影响肠道pH，因此可通过发酵过程中pH的变化情况推测多糖在肠道中的发酵进程[26]。如图3所示，三组发酵液的初始pH相近，随着发酵进行，KGM组和MEP组在各个时间点pH均显著低于Control组（P<0.05）；经过发酵，三组的pH均下降，并且在前12 h两多糖组pH变化幅度较大，说明该时间段产酸较多，与总糖消耗情况吻合；而Control组整体pH变化幅度较小，说明因缺乏碳源，微生物不能酵解产酸。
2.1.5 模拟体外酵解短链脂肪酸变化
短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物群发酵膳食纤维的主要代谢产物，可调节肠道免疫并维持结肠稳态，对肠道健康有重要影响。因此可通过SCFA生成情况推测多糖体外酵解特征和肠道细菌对其利用能力，并且也可根据多糖在发酵前后短链脂肪酸的浓度变化情况[27]，评价其益生活性。
表5展示了酵解过程中SCFA的生成情况。与Control组相比，在培养基中添加KGM或MEP可明显增加总SCFA浓度。经酵解3组都有乙酸、丙酸、丁酸产生，只有KGM和MEP组有异丁酸和正戊酸生成，且每组之间浓度有显著差异（P<0.05）；在整个发酵过程所有组均未检出异戊酸。随着发酵进行，SCFA浓度增加，在各个时间点，KGM组和MEP组的乙酸、丙酸、正丁酸及总SCFA浓度均显著高于Control组，且MEP组略高于KGM组。Bai等[22]将山药多糖在人粪便中体外发酵24 h，丰富了大球菌和双歧杆菌的相对丰度，并增加了发酵液中乙酸、乳酸、丙酸和丁酸的浓度，被认定为一种潜在益生元。乙酸可以使肠道保持在适当的酸性pH水平，还可以与肠道中的一些受体结合，以控制食欲和调节脂肪储存。丙酸具有降低胆固醇、减少脂肪储存功能，丁酸具有良好的抗氧化和抗癌特性[28]。由此可看出MEP具有一定益生活性，可作为益生元的潜在来源。
表 5 体外酵解后短链脂肪酸的变化Table 5. Changes of SCFAs after in vitro fermentation样品 酵解时间（h） 短链脂肪酸（mmol/L） 乙酸 丙酸 正丁酸 正戊酸 异丁酸 异戊酸 总SCFAs Control 0 / / / / / / / 6 2.39±0.03a / / / / / 2.39±0.35a 12 4.21±0.10b 0.56±0.30a / / / / 4.77±0.82b 18 6.47±0.24c 0.82±0.10a 0.17±0.02a / / / 7.46±0.53c 24 7.38±0.59c 1.27±0.26b 0.24±0.22a / / / 8.89±0.55d 36 8.13±0.33c 1.44±0.21b 0.30±0.10a / / / 9.87±0.43e KGM 0 / / / / / / / 6 3.83±0.21a 0.41±0.01a 0.94±0.22a / / / 5.18±0.29a 12 12.08±1.22b 3.89±0.05b 1.38±0.74ab / / / 17.35±1.36b 18 18.72±0.04c 7.64±0.41c 1.84±0.05b 0.47±0.02a 0.17±0.01a / 28.84±1.09c 24 24.11±1.22d 9.21±0.21d 2.54±0.21c 1.06±0.02b 0.25±0.00a / 37.17±1.46d 36 28.34±0.07e 10.10±0.33d 3.06±0.43c 1.43±0.01c 0.29±0.01a / 43.22±1.21d MEP 0 / / / / / / / 6 8.43±0.13a 0.37±0.12a 0.93±0.59a / / / 9.73±0.41a 12 11.69±0.76b 4.17±0.04b 1.67±0.18b / / / 17.53±0.87b 18 19.76±0.83c 8.59±0.56c 2.21±0.17c 0.46±0.18a 0.06±0.00a / 31.08±1.58c 24 25.41±0.26d 9.49±0.12d 2.81±0.24d 1.52±0.32b 0.82±0.03b / 40.46±2.17d 36 29.51±0.66e 11.32±0.41e 3.11±0.11d 2.01±0.30c 1.30±0.01c / 47.52±2.55e 注：图中“/”表示未检出，同一指标的不同小写字母代表同组内有显著性差异（P<0.05）。 2.2 羊肚菌多糖泡腾片对肠道微生物的影响及其泡腾片的研制
2.2.1 羊肚菌多糖对肠道微生物的影响
OD值与益生菌生长呈正比，可以反映益生菌生长状况，因此可以通过测定600 nm波长下的OD值推测益生菌的生长情况[29]。不同浓度MEP对双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和大肠杆菌生长的促进作用如图4。总体来看，MEP能够促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长且浓度越高促进效果越明显，KGM也能促进两种益生菌生长，效果与MEP-1相近；对大肠杆菌没有明显的促进或抑制作用。MEP-2从6 h开始对双歧杆菌与嗜酸乳杆菌浓度的影响与Control组相比显著升高（P<0.05），12 h时开始显著高于低浓度组（P<0.05）；KGM组在24 h后对乳酸菌浓度的影响显著高于MEP-1组（P<0.05），说明MEP-1对乳酸菌的益生作用略弱于KGM，但两者益生作用都低于MEP-2，说明在一定范围内，高浓度的多糖促生长作用更优。李国光[30]比较了不同浓度银耳多糖的益生元效应，发现中等浓度的银耳多糖对所选益生菌促进效果最显著。
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图 4 不同浓度羊肚菌多糖对微生物生长情况影响注：图中不同字母表示不同组间差异显著（P<0.05）。Figure 4. Effect of different concentrations of MEP on microbial growth综上所述，MEP能促进益生菌的生长繁殖，但对大肠杆菌的生长无明显影响，有一定的益生活性。
2.2.2 羊肚菌多糖泡腾片的研制
2.2.2.1 原料选择结果
由表6可知，使用柠檬酸得分较高，苹果酸略有苦味感，柠檬酸稍带甜味和清凉的酸味，入口后能迅速察觉到很柔和的酸味，因此使用柠檬酸口感好；碳酸钠涩味比碳酸氢钠略重，可能是由于碳酸钠碱性更强；甜菊糖带有植物的涩味，阿斯巴甜具有清爽、类似蔗糖的甜感，三氯蔗糖甜度高、味纯正，与蔗糖的味感最为接近，因此选择三氯蔗糖作为甜味剂；甘露醇可压性好、不容易吸湿、流动性好且易溶于水，麦芽糊精溶解性能良好，吸湿性较低，不易结团，将两者均匀混合后使用效果更好。因此最终选择柠檬酸、碳酸氢钠作为酸源和碱源，三氯蔗糖作为甜味剂，麦芽糊精和甘露醇1:1混合作为填充剂。
表 6 原料选择结果Table 6. Raw material selection results成分 酸源 碱源 甜味剂 填充剂 原料 苹果
酸柠檬
酸碳酸
钠碳酸
氢钠三氯
蔗糖阿斯
巴甜甜菊
糖苷麦芽
糊精甘露
醇混合 得分 6.20±
0.77b6.80±
0.64a5.75±
0.09b6.40±
0.71a6.20±
0.58a5.60±
0.36b4.80±
0.35c6.40±
0.78a5.40±
0.41b7.40±
0.14c注：同行不同字母表示同组间差异显著（P<0.05）。 2.2.2.2 酸碱比选择
如图5，可以看出酸碱比对泡腾片发泡量和pH有显著影响（P<0.05），随着酸碱比增加，发泡量先增加后减少，1.5:1时发泡量最大，之后显著下降（P<0.05），考虑到消费者的感官体验，一般要求发泡量高且溶解时间短[17]；为使碱源完全反应，酸的实际用量略多于理论用量[31]，因此最终选择发泡量最大的酸碱比；pH则随着酸比重的增大显著下降（P<0.05），综合考虑部分消费者的体验及发泡量分析结果，确定1.5:1为最佳酸碱比。
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图 5 发泡量和pH随酸碱比变化注：横坐标1为酸碱比1:1；2为1.25:1；3为1.5:1；4为1.75:1；5为2:1。Figure 5. Gas production and pH change with acid-base ratio2.2.2.3 单因素实验结果
如图6，随着MEP添加量增大，泡腾片的口感和风味也发生变化：在添加量低时，香气持久性差、回味性不好，随添加量增加羊肚菌特有风味增加，但添加量过高导致其味道过重，感官评分下降，并且考虑到成本以及人体每日适宜摄入量，选择5%、7.5%、10%三个梯度进行后续试验。
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图 6 各因素添加量单因素实验结果Figure 6. Single factor experiment results of the amount of each factor added从图6中可以看出，当甜味剂添加量较少时，感官评分不高，这可能是因为添加量少导致口味不佳，酸味较重，但添加过多又会影响羊肚菌风味，并且不同消费者之间口味存在差异，甜味过重也会导致感官评分下降。从图中可以看出甜味剂添加量在1.5%时感官评分最高。因此选择1%、1.5%、2%三个梯度进行后续试验。
从图6中可以看出感官评分随崩解剂添加量增加而升高，65%时达到最大。崩解剂增加会导致发泡量提高，崩解时限缩短，能够增加泡腾片特有风味和口感，但是添加量过多会加重酸味，导致感官评分降低。因此选择60%、65%、70%三个梯度进行后续试验。
从图6中可看出，随着润滑剂添加量增加，感官评分先升高后降低，在添加量为0.5%时达到最大。润滑剂的作用主要是在压片过程中帮助药粉做粘合，但是所选润滑剂PEG6000本身具有一点臭味，过多添加会影响风味，所以选择0.4%、0.5%、0.6%三个梯度进行后续试验。
2.2.2.4 感官评分结果
由10位评价人员对正交实验中9个样品进行评价，将评价小组得出的评价结果收集汇总后进行统计并分析，结果如表7所示：
表 7 感官评分结果Table 7. Sensory score results序号 口感 外观 气味 溶液状态 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 1 7 2 1 0 6 3 1 0 5 3 2 0 4 5 1 0 2 8 1 1 0 7 2 1 0 6 4 0 0 6 1 2 1 3 4 3 2 1 3 5 2 0 6 3 1 0 6 3 1 0 4 6 2 1 1 8 1 1 0 3 5 2 0 7 2 1 0 5 4 5 1 0 5 5 0 0 8 1 1 0 4 3 2 1 6 9 1 0 0 5 3 2 0 5 4 1 0 5 3 2 0 7 4 4 2 0 1 6 2 1 7 2 1 0 8 1 1 0 8 5 3 2 0 6 2 2 0 4 4 2 0 7 3 0 0 9 8 2 0 0 4 4 2 0 2 4 3 1 2 4 4 0 2.2.2.5 模糊矩阵建立结果
以样品1为例，将评分结果转化为评价矩阵后为：
R1=|0.70.20.100.60.30.100.50.30.200.40.50.10| 依据模糊变换原理：B=A×R，则1号样品的综合评价结果为B1=A：R1，即可得到分析结果矩阵:
B1=(0.45,0.25,0.13,0.17)×|0.70.20.100.60.30.100.50.30.200.40.50.10|=(0.598，0.289，0.113，0) 按照相同计算步骤，余下样品的分析结果为B1=（0.598，0.289，0.113，0），B2=（0.715，0.164，0.104，0.017），B3=（0.435，0.35，0.17，0.045），B4=（0.628，0.214，0.113，0.045），B5=（0.477，0.414，0.092，0.017），B6=（0.68，0.223，0.097，0），B7=（0.432，0.373，0.17，0.025），B8=（0.546，0.288，0.166，0），B9=（0.52，0.31，0.157，0.013）。
2.2.2.6 感官评定结果 以样品1为例，将B1与V进行相乘赋值，得到V1=0.598×80+0.289×60+0.113×40+0×20=69.7，按照相同步骤计算各样品感官评定结果，见表8所示：
表 8 正交试验结果Table 8. Orthogonal experiment results编号 多糖添加量 崩解剂 甜味剂 润滑剂 感官评分（分） 1
21
11
21
21
269.70
71.543 1 3 3 3 63.50 4 2 1 2 3 68.50 5 2 2 3 1 67.02 6 2 3 1 2 71.66 7
8
93 1 3 2 64.24 3
32
31
23
167.60
66.74均值1 68.25 67.48 69.65 67.82 均值2 69.06 68.72 68.93 69.15 均值3 66.19 67.30 64.92 66.53 极差 2.867 1.420 4.733 2.614 因素主次 C>A>D>B 最优组合 A2B2C1D2 通过比较各因素极差数可得，羊肚菌多糖泡腾片各因素主次关系为C>A>D>B，即最优组合为A2B2C1D2，即羊肚菌多糖添加量7.5%、崩解剂添加量65%、甜味剂添加量1.5%、润滑剂添加量0.5%。
2.2.2.6 验证试验
根据正交优化结果，进行3次平行试验，得到羊肚菌泡腾片的综合评分为75.14，因此该配方合理。
2.2.2.7 泡腾片质量指标
对泡腾片各项指标进行质量检查，泡腾片的基本指标见表10。2015版《中国药典》中规定泡腾片崩解时限应不超过5 min，片重大于等于0.3 g的泡腾片片重差异应在5%以内。制得泡腾片外观为淡黄色，表面光滑、无杂质，冲泡后有羊肚菌特有香气、味微甜，检测得到水分含量2.68%±0.03%，片重1.00±0.05 g，片厚0.48±0.01 cm，崩解时限平均38.0±0.8 s，发泡量0.14±0.01 mL，硬度21.87±0.9 N，pH5.63±0.03，均符合规定。
表 9 泡腾片质量评价结果Table 9. Quality evaluation results of effervescent tablets水分
（%）片重
（g）片厚
（cm）硬度
（N）发泡
量（mL）崩解
时限（s）pH 2.68±0.03 1.00±0.05 0.48±0.01 21.87±0.9 0.14±0.01 38.0±0.80 5.63±0.03 3. 结论
本试验对MEP的体外消化及酵解特性进行了研究，并通过富集培养评估其对双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的益生作用。研究结果表明，MEP在唾液、胃和小肠液中稳定性较好，相比KGM更易被肠道菌群降解并吸收利用，并具有一定益生活性。微生物实验表明MEP能够促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长且浓度越高促进效果越明显。通过模糊数学感官评价法制作羊肚菌多糖泡腾片，选取三氯蔗糖作为甜味剂；碳酸氢钠和柠檬酸为崩解剂，酸碱比1.5:1；麦芽糊精和甘露醇1:1混合作为填充剂。通过正交试验，确定最佳配方为：羊肚菌多糖10%、崩解剂65%、甜味剂1.5%、润滑剂0.5%，并进行基本质量指标检测，均符合《国家药典》标准。泡腾片成品有羊肚菌特有风味，口味微甜，同时崩解迅速，便于人体吸收，使羊肚菌的健康保健功能得到发挥。该试验研究结果证实了MEP的益生能力，能为羊肚菌多糖泡腾片开发提供一定理论依据，为羊肚菌资源利用提供新思路。
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图 1 多糖经体外模拟唾液、胃液、肠液后的分子量分布
注：a-唾液；b-胃液；c-肠液。
Figure 1. Molecular weight distribution of MEP after simulated digestion in vitro
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图 4 不同浓度羊肚菌多糖对微生物生长情况影响
注：图中不同字母表示不同组间差异显著（P<0.05）。
Figure 4. Effect of different concentrations of MEP on microbial growth
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图 5 发泡量和pH随酸碱比变化
注：横坐标1为酸碱比1:1；2为1.25:1；3为1.5:1；4为1.75:1；5为2:1。
Figure 5. Gas production and pH change with acid-base ratio
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图 6 各因素添加量单因素实验结果
Figure 6. Single factor experiment results of the amount of each factor added
表 1 泡腾片配方正交试验的因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test on the formula of effervescent tablets
水平 因素 A羊肚菌多糖
添加量（%）B崩解剂
添加量（%）C甜味剂
添加量（%）D润滑剂
（%）1 5 60 1 0.4 2 7.5 65 1.5 0.5 3 10 70 2 0.6 
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表 2 感官评价标准
Table 2 Sensory assessment criteria
项目 评分标准 分值（分） 口感 甜度适中 9~10 微酸或微甜 6~8 较酸或较甜 3~5 过酸或过甜 0~2 外观 片剂完整，颜色均匀，光滑 9~10 片剂完整，颜色较均一，较光滑 6~8 片剂较完整，轻微吸潮 3~5 片剂粗糙不均匀，吸潮 0~2 气味 浓郁的羊肚菌香味 9~10 较浓的羊肚菌香味 6~8 淡淡的羊肚菌香味 3~5 无味 0~2 溶液状态 羊肚菌固有的淡黄色，液体澄清，无沉淀 9~10 羊肚菌固有的淡黄色，液体较澄清 6~8 液体无色，少量浑浊 3~5 液体浑浊，较多沉淀 0~2
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表 3 模拟体外消化对MEP还原糖含量的影响
Table 3 Effect of simulated in vitro digestion on the content of reducing sugar in MEP
消化过程 时间（h） 还原糖含量（mg/mL） 口腔 0 0.365±0.002a 0.25 0.362±0.007a 0.5 0.364±0.003a 1 0.362±0.005a 胃 0 0.384±0.002a 0.5 0.392±0.005ab 1 0.397±0.008b 2 0.402±0.009b 4 0.405±0.002b 肠 0 0.405±0.008b 0.5 0.413±0.005b 1 0.404±0.005b 2 0.405±0.002b 4 0.406±0.007b 注：同一指标的不同小写字母代表组内有显著性差异（P<0.05）。
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表 4 多糖模拟体外消化后分子量分布
Table 4 Molecular weight distribution of MEP after simulated in vitro digestion
分子量分布 样品 Mn（Da） Mw（Da） Mv（Da） Mp（Da） Mz（Da） 分散性指数 唾液消化 900713 902224 939781 903652 905002 1.001677 377410 383667 342721 390525 397933 1.016578 胃液消化 912735 913394 / 914033 914651 1.000723 372637 385856 435241 389186 382619 1.007112 肠液消化 895387 897137 929867 898786 900340 1.001905 390498 393696 374787 397003 400401 1.008191 注：MN为数均分子量，MW为重均分子量，MV为粘均分子量，MP为最高峰分子量，MZ为平均分子量。
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表 5 体外酵解后短链脂肪酸的变化
Table 5 Changes of SCFAs after in vitro fermentation
样品 酵解时间（h） 短链脂肪酸（mmol/L） 乙酸 丙酸 正丁酸 正戊酸 异丁酸 异戊酸 总SCFAs Control 0 / / / / / / / 6 2.39±0.03a / / / / / 2.39±0.35a 12 4.21±0.10b 0.56±0.30a / / / / 4.77±0.82b 18 6.47±0.24c 0.82±0.10a 0.17±0.02a / / / 7.46±0.53c 24 7.38±0.59c 1.27±0.26b 0.24±0.22a / / / 8.89±0.55d 36 8.13±0.33c 1.44±0.21b 0.30±0.10a / / / 9.87±0.43e KGM 0 / / / / / / / 6 3.83±0.21a 0.41±0.01a 0.94±0.22a / / / 5.18±0.29a 12 12.08±1.22b 3.89±0.05b 1.38±0.74ab / / / 17.35±1.36b 18 18.72±0.04c 7.64±0.41c 1.84±0.05b 0.47±0.02a 0.17±0.01a / 28.84±1.09c 24 24.11±1.22d 9.21±0.21d 2.54±0.21c 1.06±0.02b 0.25±0.00a / 37.17±1.46d 36 28.34±0.07e 10.10±0.33d 3.06±0.43c 1.43±0.01c 0.29±0.01a / 43.22±1.21d MEP 0 / / / / / / / 6 8.43±0.13a 0.37±0.12a 0.93±0.59a / / / 9.73±0.41a 12 11.69±0.76b 4.17±0.04b 1.67±0.18b / / / 17.53±0.87b 18 19.76±0.83c 8.59±0.56c 2.21±0.17c 0.46±0.18a 0.06±0.00a / 31.08±1.58c 24 25.41±0.26d 9.49±0.12d 2.81±0.24d 1.52±0.32b 0.82±0.03b / 40.46±2.17d 36 29.51±0.66e 11.32±0.41e 3.11±0.11d 2.01±0.30c 1.30±0.01c / 47.52±2.55e 注：图中“/”表示未检出，同一指标的不同小写字母代表同组内有显著性差异（P<0.05）。
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表 6 原料选择结果
Table 6 Raw material selection results
成分 酸源 碱源 甜味剂 填充剂 原料 苹果
酸柠檬
酸碳酸
钠碳酸
氢钠三氯
蔗糖阿斯
巴甜甜菊
糖苷麦芽
糊精甘露
醇混合 得分 6.20±
0.77b6.80±
0.64a5.75±
0.09b6.40±
0.71a6.20±
0.58a5.60±
0.36b4.80±
0.35c6.40±
0.78a5.40±
0.41b7.40±
0.14c注：同行不同字母表示同组间差异显著（P<0.05）。
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表 7 感官评分结果
Table 7 Sensory score results
序号 口感 外观 气味 溶液状态 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 1 7 2 1 0 6 3 1 0 5 3 2 0 4 5 1 0 2 8 1 1 0 7 2 1 0 6 4 0 0 6 1 2 1 3 4 3 2 1 3 5 2 0 6 3 1 0 6 3 1 0 4 6 2 1 1 8 1 1 0 3 5 2 0 7 2 1 0 5 4 5 1 0 5 5 0 0 8 1 1 0 4 3 2 1 6 9 1 0 0 5 3 2 0 5 4 1 0 5 3 2 0 7 4 4 2 0 1 6 2 1 7 2 1 0 8 1 1 0 8 5 3 2 0 6 2 2 0 4 4 2 0 7 3 0 0 9 8 2 0 0 4 4 2 0 2 4 3 1 2 4 4 0
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表 8 正交试验结果
Table 8 Orthogonal experiment results
编号 多糖添加量 崩解剂 甜味剂 润滑剂 感官评分（分） 1
21
11
21
21
269.70
71.543 1 3 3 3 63.50 4 2 1 2 3 68.50 5 2 2 3 1 67.02 6 2 3 1 2 71.66 7
8
93 1 3 2 64.24 3
32
31
23
167.60
66.74均值1 68.25 67.48 69.65 67.82 均值2 69.06 68.72 68.93 69.15 均值3 66.19 67.30 64.92 66.53 极差 2.867 1.420 4.733 2.614 因素主次 C>A>D>B 最优组合 A2B2C1D2
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表 9 泡腾片质量评价结果
Table 9 Quality evaluation results of effervescent tablets
水分
（%）片重
（g）片厚
（cm）硬度
（N）发泡
量（mL）崩解
时限（s）pH 2.68±0.03 1.00±0.05 0.48±0.01 21.87±0.9 0.14±0.01 38.0±0.80 5.63±0.03
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