Expression and Characterization of Xyloglucanase from Paenibacillus borealis and Its Application in the Production of Xylogluco-oligosaccharides from Apple Pomace
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摘要: 苹果渣含有丰富的木葡聚糖，是制备具有多种功能活性的木葡寡糖的优良原料，利用新型木葡聚糖酶水解苹果渣有望实现其高值利用。本研究将北风类芽孢杆菌来源的GH74家族木葡聚糖酶基因（PbXEG74B）在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达，对其酶学性质进行表征，进而利用该酶水解苹果渣制备木葡寡糖。结果表明：木葡聚糖酶（PbXEG74B）在大肠杆菌中的表达量为18.0 U/mL。该酶最适pH为5.5，最适温度为55 ℃，在pH4.5~8.5和40 ℃以下具有良好的稳定性。该酶水解木葡聚糖主要产生聚合度2~9的寡糖。在最适条件下，利用PbXEG74B水解低共熔溶剂预处理的苹果渣能够制得聚合度2~9的木葡寡糖，得率为2.79 g/100 g苹果渣，其中聚合度2~4、5~6和7~9的寡糖占比分别为67.0%、11.5%和21.5%。木葡聚糖酶（PbXEG74B）的酶学性质和水解特性优异，在木葡寡糖制备中具有良好的应用潜力，为苹果渣的高值化利用提供了理论基础和实践依据。Abstract: Apple pomace (AP) is rich in xyloglucan, serves as a substrate to produce xylogluco-oligosaccharides with various functional activities. The hydrolysis of AP by novel xyloglucanases is conducive to the high-value utilization of AP. In this study, a novel GH74 xyloglucanase gene (PbXEG74B) from Paenibacillus borealis was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The enzyme was characterized and further used to hydrolyze AP for xylogluco-oligosaccharides production. It was expressed in E. coli with an expression level of 18.0 U/mL. The optimal conditions of PbXEG74B were pH5.5 and 55 ℃. It showed good stability in the pH range of 4.5~8.5 and temperatures up to 40 ℃. The enzyme hydrolyzed xyloglucan to produce xylogluco-oligosaccharides with degrees of polymerization (DP) of 2~9. AP was pretreated with deep eutectic solvents (DESs) and hydrolyzed by PbXEG74B to produce xylogluco-oligosaccharides. Under optimal conditions, the yield of xylogluco-oligosaccharides with DP 2~9 was 2.79 g/100 g AP, containing 67.0%, 11.5%, and 21.5% of xylogluco-oligosaccharides with DP 2~4, 5~6, and 7~9, respectively. PbXEG74B with good enzymatic and hydrolytic properties shows great potential in the high value utilization of AP.
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功能性寡糖的聚合度（degree of polymerization，DP）是影响其功能的重要因素之一，不同聚合度寡糖的作用位置和功能活性往往不同[1]。例如，低聚合度和多支链的果寡糖有利于近端结肠有益菌的快速增殖，而高聚合度的果寡糖能够促进远端结肠有益菌增殖[2]。作为一种新型功能性寡糖，木葡寡糖（xylogluco-oligosaccharides，XyGOs）是木葡聚糖（Xyloglucan，XyG）降解得到的寡糖，具有改善食品特性、调节肠道菌群、降低血糖血脂、提高脂质代谢等功能活性[3−6]。酶解法制备木葡寡糖具有高效可控、绿色环保、操作简单等优点，是木葡寡糖最主要的生产方法。然而，由于木葡聚糖单糖组成丰富，含有较多支链[7]，酶法制备的木葡寡糖主要为高聚合度组分（DP 7~9），而低聚合度组分（DP 2~4）含量很少。因此，开发含有低聚合度组分（DP 2~4）的木葡寡糖能够丰富其功能活性，有助于木葡寡糖的应用与推广。
木葡聚糖酶（EC 3.2.1.151）能够水解由β-葡萄糖残基通过β-1,4糖苷键连接的木葡聚糖主链，是木葡聚糖水解过程中最重要的酶，分属糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）5、9、12、16、44、45和74家族。利用基因工程菌对木葡聚糖酶进行异源表达是当前研究热点之一。日本纤维弧菌、污染叉丝孔菌和土曲霉等多种微生物来源的木葡聚糖酶在大肠杆菌、毕赤酵母、构巢曲霉等异源宿主中成功表达[8−10]。其中，米黑根毛霉来源的木葡聚糖酶RmXEG12A在毕赤酵母中表达水平达25700 U/mL，是目前木葡聚糖酶的最高表达水平[3]。木葡聚糖酶已广泛应用于生物炼制、饲料加工和木葡寡糖生产等领域[11−13]。目前，用于制备木葡寡糖的木葡聚糖酶多数来源于GH12家族，如米黑根毛霉来源的木葡聚糖酶RmXEG12A[3]、意大利青霉菌来源的木葡聚糖酶PiGH12A[14]和雪白曲霉来源的木葡聚糖酶XegA[15]。该家族木葡聚糖酶主要水解未被取代的β-葡萄糖（G）处的糖苷键，得到聚合度为7~9的木葡寡糖。与GH12家族不同，一些GH74家族木葡聚糖酶能够水解含有α-1,6-木糖取代基的β-葡萄糖（X）处的糖苷键，产生聚合度更低（DP 2~4）的寡糖[16]，是更具潜力的木葡寡糖制备酶种。然而，目前关于GH74家族木葡聚糖酶的研究多集中于它们的分子结构和酶学性质，其应用研究尚不充分。
苹果渣是苹果汁生产的主要副产物，全球每年产量超2000万吨[17]。苹果渣中含有丰富的木葡聚糖，是制备木葡寡糖的潜在底物[18]。然而，苹果渣中的木葡聚糖与纤维素和木质素通过氢键和共价键相连形成木质纤维素，难以直接水解[19]，开发合适的预处理和水解方法对水解苹果渣制备木葡寡糖十分重要。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs）可以破坏木质素、纤维素与半纤维素之间的氢键，使生物质组织结构变得疏松[20]，已成为生物质预处理的重要方法之一。利用天然低共熔溶剂（氯化胆碱/甘油、氯化胆碱/乳酸和碳酸钾/甘油）可以有效去除苹果渣中的果胶[21]。目前，利用低共熔溶剂处理苹果渣制备木葡寡糖的文献报道较少。
北风类芽孢杆菌（Paenibacillus borealis）是一种具有固氮作用的革兰氏阳性菌，能产生多种水解酶，分解酪蛋白、羟甲基纤维素、甲壳素、果胶和蛋黄卵磷脂等[22]。本研究将北风类芽孢杆菌（Paenibacillus borealis）来源的GH74家族木葡聚糖酶基因（PbXEG74B）在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中异源表达，对该酶的酶学性质和水解特性进行系统研究，并利用该酶水解DESs预处理的苹果渣制备木葡寡糖，旨在提供一种能够用于制备木葡寡糖的新型木葡聚糖酶，为苹果渣的高值化利用提供良好的理论基础和实践依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大肠杆菌BL21（DE3）感受态 北京全式金生物技术有限公司；木葡聚糖 爱尔兰Megazyme公司；纤维二糖（G2）、纤维三糖（G3）、纤维四糖（G4） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；木葡七糖（XXXG）、木葡九糖（XLLG，在X基础上以β-1,2糖苷键在木糖残基上连接一个D-半乳糖残基为L） 瑞士Biosynth公司；聚合度7~9木葡寡糖（HPLC≥90%） 实验室自制[3]；苹果渣（苹果榨汁后的残渣烘干至恒重，木葡聚糖含量10%，w/w） 中国汇源果汁集团有限公司；其他试剂若无特殊说明均为分析纯。
TU-1901紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器设备有限责任公司；HZQ-X100恒温双层振荡培养箱 江苏太仓实验设备厂；JY92-II超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-20B高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；ÄKTA蛋白纯化系统 美国GE Healthcare公司；LEO 1530 VP型扫描电子显微镜 德国LEO公司；Dionex ICS-5000+型离子色谱仪、Dionex Carbopac PA200 美国Thermo Fisher科技公司；MALDI-TOF、Q-TOF质谱仪（Ultraflextreme） 德国Bruker公司；1260 Infinity型高效液相色谱仪 美国Agilent公司。
1.2 实验方法
1.2.1 木葡聚糖酶（PbXEG74B）序列和结构分析
在GenBank数据库中发掘了一个北风类芽孢杆菌来源的假想蛋白（No.OMD45931.1），预测为木葡聚糖酶，命名为PbXEG74B。利用在线软件ExPASy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）预测蛋白质的分子量和等电点，利用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列同源性比对，使用DNAMAN进行多序列比对分析并绘图。使用AlphaFold2预测PbXEG74B结构[23]，PbXEG74B蛋白与Paenibacillus odorifer来源木葡聚糖酶PoGH74（PDB:6MGL）的催化模块进行结构比对，模型使用PyMOL 2.3.1（https://pymol.org/）进行可视化。
1.2.2 木葡聚糖酶（PbXEG74B）的表达
将GenBank数据库中来源于北风类芽孢杆菌的木葡聚糖酶基因（GenBank：No.MPTB01000023.1 96400~99684）序列委托擎科公司合成至pET-28a（+）载体，得到重组质粒pET-28a-PbXEG74B，热激转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，平板涂布（含50 μg/mL卡那霉素），挑取正常生长的阳性转化子，测序无误后获得重组菌株。将重组菌株接种于10 mL LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，于37 ℃、200 r/min培养12 h左右，作为种子液。将种子液以体积分数1%接种量转接至200 mL LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，于37 ℃、200 r/min培养，当培养液OD600达0.6~0.8左右时，添加终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于16 ℃培养16 h。离心（10000 r/min、10 min）收集菌体，并用缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含有500 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑）重悬菌体。置于冰水浴中超声破碎，离心（10000 r/min、10 min、4 ℃）收集上清液（即粗酶液）。
1.2.3 木葡聚糖酶（PbXEG74B）的纯化
利用Ni-NTA亲和层析柱（1.0 cm×10.0 cm）对木葡聚糖酶进行纯化。用缓冲液A平衡亲和层析柱，粗酶液以0.5 mL/min的流速上样，分别用缓冲液A和B（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含有500 mmol/L NaCl和50 mmol/L咪唑）洗脱未结合蛋白与杂蛋白，再用缓冲液C（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含有500 mmol/L NaCl和200 mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白。洗脱过程在ÄKTA蛋白纯化系统上进行，流速为1.0 mL/min。收集有酶活组分于20 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中4 ℃透析（截留分子量12000 Da）过夜，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯度。
1.2.4 木葡聚糖酶PbXEG74B的酶活力和蛋白含量测定
木葡聚糖酶酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法[24]：在150 µL 0.3%（w/v）的木葡聚糖溶液（50 mmol/L乙酸缓冲液，pH5.5）中加入50 µL适当稀释的酶液，55 ℃反应10 min后，加入200 µL DNS溶液，沸水浴15 min后加入200 µL饱和酒石酸钾钠，冷却至室温后于OD540测定吸光度值，以葡萄糖作为标准品计算所产生的还原糖量。木葡聚糖酶酶活力定义：在以上反应条件下每分钟生成1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。蛋白含量测定：蛋白含量测定参照Classics等[25]的方法，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白质（y=2.67x−0.16，R2=0.9992，x为740 nm处吸光度，y为蛋白浓度mg/mL）。
1.2.5 木葡聚糖酶（PbXEG74B）的酶学性质
最适pH的测定：用不同pH的缓冲液（50 mmol/L）在55 ℃条件下按照1.2.4中方法测定酶活力，以最大值为100%，分别计算各pH下的相对酶活力。所用的缓冲液体系及其pH范围为：柠檬酸（Citrate）（pH3.0~4.5）、乙酸（Acetate）（pH4.0~6.0）、2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（pH5.0~6.5）、3-吗啉丙磺酸（MOPS）（pH 6.0~8.0）、三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（pH7.0~9.0）和2-（环己胺基）乙磺酸（CHES）（pH8.0~10.0）。
pH稳定性的测定：分别用不同pH的缓冲液（50 mmol/L）稀释酶液（稀释后蛋白浓度大于1 mg/mL），于35 ℃下保温30 min，立即冰水浴冷却30 min，按照1.2.4中方法测定酶活力，以未经处理的酶液为100%，分别计算各pH处理后的相对酶活力。
最适温度的测定：在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）下按照1.2.4中方法测定木葡聚糖酶酶活力，以最高酶活力为100%。
温度稳定性的测定：将酶液用乙酸缓冲液（50 mmol/L，pH5.5）稀释（稀释后蛋白浓度大于1 mg/mL），于不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）中保温30 min，立即冰水浴冷却30 min，按照1.2.4中方法测定酶活力，以未经处理的酶液为100%，分别计算各温度处理后的相对酶活力。
底物特异性的测定：以不同种类的多糖为底物，按照标准方法测定木葡聚糖酶酶活力，以PbXEG74B对木葡聚糖的酶活力为100%，分别计算木葡聚糖酶对各种底物的比酶活力。底物包括木葡聚糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、普鲁兰多糖、微晶纤维素、壳聚糖、桦树木聚糖、槐豆胶、可溶性淀粉等。
1.2.6 木葡聚糖酶（PbXEG74B）的水解特性
用乙酸缓冲液（50 mmol/L，pH5.5）配制1%（w/v）的木葡聚糖溶液，添加5 U/mL的PbXEG74B，在35 ℃下水解12 h，于不同时间点（0、15、30 min、1、2、4、8、12 h）取样，样品于沸水浴中灭酶5 min。用乙酸缓冲液（50 mmol/L，pH5.5）配制1%（w/v）的木葡七糖（XXXG）和木葡九糖（XLLG）溶液，添加5 U/mL的PbXEG74B，在35 ℃下水解8 h，样品于沸水浴中灭酶5 min。薄层层析（TLC）检测条件：样品于10000×g离心3 min，吸取上清液点样于硅胶板上，硅胶板置于展层剂中展层两次，用显色剂完全浸润硅胶板后吹干，烘烤至显色。展层剂为正丁醇:乙酸:水=2:1:1，显色剂为甲醇:硫酸=95:5。标品为葡萄糖、G2、G3、G4和聚合度7~9木葡寡糖。
1.2.7 DESs预处理苹果渣与扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）分析
氯化胆碱与甘油摩尔比1:4混合，于80 ℃水浴搅拌至透明的均相溶液，得到DESs。苹果渣与DESs质量比1:7混合，80 ℃水浴搅拌24 h后，水洗离心（4 ℃、10000 r/min、15 min）重复三次，收集沉淀60 ℃烘干，过40目筛，得到DESs预处理的苹果渣（处理组）。以纯水处理的苹果渣为对照组。使用SEM观察对照组和处理组的苹果渣显微结构。利用双面胶将样品固定在圆形铝板上，使用喷涂镀膜仪在样品表面镀金，测定时加速电压为5.00 kV。
1.2.8 木葡聚糖酶（PbXEG74B）水解苹果渣生产木葡寡糖
反应体系为500 mL，底物（对照组和处理组）浓度为10%（w/v），缓冲体系为乙酸缓冲液（50 mmol/L、pH5.5），PbXEG74B添加量为200 U/g底物，在35 ℃、150 r/min条件下水解12 h，水解过程中于不同时间点（0、0.5、1、2、4、8、12 h）取样，沸水浴灭酶5 min，水解液经10000×g离心5 min，上清液冷冻干燥后得到苹果渣木葡寡糖，室温贮存用于后续分析。
1.2.9 苹果渣木葡寡糖的组成分析
使用高效阴离子交换色谱-安培检测器（high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）分析水解苹果渣产生木葡寡糖的含量。流动相A相：蒸馏水，流动相B相：1 mol/L NaOH，流动相C相：1 mol/L乙酸钠。洗脱梯度：0~5 min，10% B+3.5% C；5~12 mim，10% B+3.5%~30% C线性增加；12~12.1 min，50% B+50% C；12.1~13 min：B与C线性恢复至10% B+3.5% C；13~17 min，10% B+3.5% C；流速为1 mL/min，柱温为30 ℃。以葡萄糖、G2、G3、G4、XXXG、XLLG为标准品（在X基础上以β-1,2糖苷键在木糖残基上连接一个D-半乳糖残基为L）。根据标准品的出峰时间对样品的聚合度进行定性分析，根据峰面积-浓度标准曲线对样品中的木葡寡糖进行定量分析。木葡寡糖得率计算公式为：
木葡寡糖得率(%)=A1A2×100 式中：A1为100 g苹果渣经预处理和酶解后得到的木葡寡糖质量，A2为100 g苹果渣。
苹果渣中木葡聚糖水解率计算公式为：
木葡聚糖水解率(%)=B1B2×100 式中：B1、B2分别为木葡寡糖和木葡聚糖的含量。
使用电喷雾电离质谱法（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF）分析水解8 h时样品组成。ESI-MS方法：气体温度450 ℃，干燥气100 kPa，雾化气1.5 L/min，ESI+模式，电压4000 V。MALDI-TOF方法：取1 μL 8 h的水解样品点在MALDI靶上，并立即与1 μL浓度为20 mg/mL 2,5-二羟基苯甲酸（溶剂为50%（v/v）乙腈）混合，待液滴干燥后用激光轰击。质谱扫描范围：100~2500 m/z；采用正离子模式，电压29 kV。结合前期实验和质荷比对样品中的主要组分进行定性分析[18]。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次。数据间显著性分析通过IBM SPSS Statistics 26.0软件采用单因素方差分析，P<0.05表示数据具有显著差异。
2. 结果与分析
2.1 PbXEG74B的序列与结构分析
PbXEG74B基因全长为3285 bp，编码1094个氨基酸。ExPASy分析表明该酶预测分子量和等电点分别为114.7 kDa和5.0。将PbXEG74B的氨基酸序列与已报道GH74家族木葡聚糖酶进行比对（图1），该酶与Paenibacillus odorifer来源的木葡聚糖酶（GenBank：AIQ73809.1）的相似度为88.5%，与类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）（GenBank：BAE44527.1）、日本纤维弧菌（Cellvibrio japonicus）（GenBank：ACE84745.1）和黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris）（GenBank：AAM41043.1）来源的木葡聚糖酶序列相似度分别为64.9%、57.0%和36.2%。因此，该酶是一个新型GH74家族木葡聚糖酶。利用AlphaFold2对该酶分子结构进行预测，PbXEG74B中含有两个7叶β螺旋结构域，两者形成一个大催化凹槽可以容纳底物，催化残基Asp38和Asp445位于催化凹槽的中心，为典型的GH74家族木葡聚糖酶结构（图2）。
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图 1 木葡聚糖酶PbXEG74B与其他来源木葡聚糖酶序列比对注：相同的残基在红色背景上显示为白色，保守残基在白色背景上显示为红色，两个保守的催化残基用红色五角星标记。Figure 1. Multiple sequences alignment of PbXEG74B and other xyloglucanases![]()
图 2 PbXEG74B与PoGH74结构比对注：催化残基用红色标注；PbXEG74B与PoGH74催化模块（CD）用蓝色和粉色标注；碳水化合物结合模块X2和CBM3分别用紫色和黄色标注。Figure 2. Structural comparison between PbXEG74B and PoGH742.2 PbXEG74B的纯化与酶学性质
PbXEG74B成功在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达，目的蛋白分泌在胞内，表达量为18.0 U/mL，粗酶液经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化得到电泳级纯酶，分子量为115 kDa，与预测分子量一致（图3），酶活力回收率为51.4%，纯化倍数为2.2。PbXEG74B的最适pH为5.5（图4a），在pH4.5~8.5范围内保持稳定（图4b）；该酶的最适温度为55 ℃（图4c），40 ℃处理30 min仍保留80%以上的酶活力（图4d）。PbXEG74B对木葡聚糖的比酶活力最高，为68.4 U/mg，对其他底物均没有表现出活力。
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图 3 木葡聚糖酶PbXEG74B纯化电泳图注：M：高分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：纯酶液。Figure 3. SDS-PAGE analysis of PbXEG74B before and after purification![]()
图 4 PbXEG74B的最适pH（a）、pH稳定性（b）、最适温度（c）和温度稳定性（d）Figure 4. Optimal pH (a), pH stability (b), optimal temperature (c) and temperature stability (d) of PbXEG74BPbXEG74B的分子量与大丽轮枝菌（110 kDa）和里氏木霉（105 kDa）来源的GH74家族木葡聚糖酶较为相近[26−27]，高于米黑根毛霉（21.9 kDa）和鹿皮曲霉（24.5 kDa）来源的GH12家族木葡聚糖酶[3,28]。这主要是由于GH74家族木葡聚糖酶含有碳水化合物结合模块（Carbohydrate binding module，CBM）导致分子量偏大。PbXEG74B的最适pH低于大部分GH74家族的木葡聚糖酶，如高温单孢菌（pH7.0）[29]、琼斯氏菌（pH7.5~9.0）[30]和类芽孢杆菌（pH6.0~6.5）[31]来源的木葡聚糖酶，但高于Caldicellulosiruptor kronotskyensis来源的木葡聚糖酶（pH4.5）[32]。PbXEG74B具有良好的pH稳定性，优于米黑根毛霉来源的RmXEG12B（pH5.0~6.5）和阿维链霉菌来源的SaGH74B（pH6.0~6.5）[33−34]。PbXEG74B的最适温度高于土曲霉来源的Xeg5A（45 ℃）[35]，温度稳定性与Paenibacillus odorifer来源的PoGH74相似[36]。PbXEG74B的比酶活力高于大部分GH74家族木葡聚糖酶，如嗜热毁丝菌（22.6 U/mg）和烟曲霉（11.9 U/mg）来源的木葡聚糖酶[37−38]。PbXEG74B良好的酶学性质使其具有一定的工业适应性，有利于从生物质中水解得到木葡寡糖。
2.3 PbXEG74B的水解特性
PbXEG74B水解木葡聚糖过程如图5所示，水解初期产物以聚合度8以上的组分为主，产生少量三糖和四糖。随着水解时间的延长，聚合度高于9的组分逐渐减少，聚合度为2~4和9的寡糖浓度逐渐增加（图5a）。以木葡七糖为底物时，XXXG完全被水解为X和XG（图5b）。以木葡九糖为底物时，XLLG无法被水解（图5c）。
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图 5 木葡聚糖（a）、木葡七糖（b）和木葡九糖（c）水解产物TLC分析Figure 5. TLC analysis of XyG (a) , XXXG (b) and XLLG (c) hydrolyzed by PbXEG7PbXEG74B在水解初期就产生了低聚合度的木葡寡糖，属于过程性内切酶。PbXEG74B不仅能够水解木葡聚糖产生XXXG、XXLG/XLXG（木葡八糖）和XLLG等高聚合度木葡寡糖，还能将XXXG进一步水解产生聚合度更低的寡糖。目前已报道的GH12家族木葡聚糖酶仅能在G处水解得到XXXG型的木葡寡糖，无法进一步产生聚合度2~4的木葡寡糖[39]。前期研究表明，木葡聚糖酶−1亚位点是影响酶水解特性的关键位点[16]。PbXEG74B的−1亚位点有Gly444残基，能有效地识别X和G，因此该酶能够水解XXXG产生更低聚合度的寡糖。但PbXEG74B无法水解XLLG，这可能是由于双半乳糖基化阻碍了底物与酶结合[36]。
2.4 水解苹果渣制备木葡寡糖
DESs预处理前后苹果渣的微观结构如图6所示。未经处理的苹果渣颗粒表面较为平整，DESs处理后的苹果渣表面变得粗糙、多孔。疏松多孔的结构增加了PbXEG74B与苹果渣中木葡聚糖的接触面积。在最适水解条件（10%底物浓度，200 U/g加酶量）下，PbXEG74B水解苹果渣产木葡寡糖的含量随水解时间的延长逐渐增加，其中聚合度2~4、7~9和>9的组分含量增加最明显（图7）。水解8 h后，聚合度2~9木葡寡糖得率为2.79 g/100 g苹果渣，苹果渣中木葡聚糖的水解率达27.9%。其中，聚合度2~4、5~6和7~9的木葡寡糖的得率分别为1.86、0.32和0.60 g/100 g，占比分别为67.0%、11.5%和21.5%。未预处理的苹果渣（对照组）水解8 h后，聚合度2~9的木葡寡糖得率为1.53 g/100g苹果渣，仅为预处理苹果渣的55%。
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图 6 未处理（a）和预处理（b）苹果渣的微观结构（2000×）Figure 6. Microstructure of untreated(a) and pretreated (b) AP (2000×)![]()
图 7 苹果渣木葡寡糖的组分分析注：CK：未预处理的苹果渣水解8 h；G：葡萄糖；G2：纤维二糖；G3：纤维三糖、G4：纤维四糖；XXXG：木葡七糖；XLLG：木葡九糖。Figure 7. Composition of AP XyGOs表 1 PbXEG74B水解苹果渣制备木葡寡糖得率Table 1. Yield of XyGOs in enzymatic hydrolysis of pretreated AP by PbXEG74B水解时间（h） 不同聚合度寡糖得率（g/100 g苹果渣） 木葡寡糖总得率
（g/100 g苹果渣）DP 2~4 DP 5~6 DP 7~9 CK 0.94±0.02c 0.11±0.01d 0.48±0.06cd 1.53±0.09c 0.5 0.56±0.02e 0.07±0.01e 0.27±0.00f 0.90±0.00e 1 0.70±0.03d 0.13±0.02cd 0.37±0.03e 1.20±0.01d 2 0.95±0.01c 0.15±0.01c 0.44±0.02de 1.55±0.00c 4 1.26±0.02b 0.24±0.04b 0.54±0.02bc 2.05±0.02b 8 1.86±0.11a 0.32±0.02a 0.60±0.08ab 2.79±0.08a 12 1.86±0.04a 0.32±0.03a 0.66±0.03a 2.85±0.10a 注：同列字母不同表示差异显著（P<0.05）。 氯化胆碱/甘油体系是常用的DESs，广泛应用于半纤维素和木质素的提取、分离或去除。经DESs处理后，苹果渣的微观结构发生改变，致密的纤维结构变得松动，生物质抗降解屏障受到破坏，暴露出的木葡聚糖更易与PbXEG74B结合并被降解。预处理后，苹果渣木葡寡糖得率为2.79 g/100 g苹果渣，是对照组寡糖得率的1.8倍，表明DESs处理效果显著。经PbXEG74B水解后苹果渣中木葡聚糖水解率为27.9%，效果优于已报道的大部分木葡聚糖酶。Wang等[40]利用太瑞斯梭孢壳霉来源的GH74家族木葡聚糖酶水解DESs预处理苹果渣，还原糖产量仅为1.4 g/100g苹果渣。Grishutin等[27]用三种不同来源GH74家族木葡聚糖酶水解木葡聚糖，水解率均低于27.9%。Shi等[41]利用米黑根毛霉来源的RmXEG12A水解苹果渣，木葡聚糖水解率仅为23.3%。利用PbXEG74B水解苹果渣制备的木葡寡糖中，聚合度2~4木葡寡糖含量明显高于聚合度7~9的木葡寡糖含量，这是由于木葡聚糖被PbXEG74B水解为高聚合度木葡寡糖后，部分高聚合度木葡寡糖继续被水解为低聚合度的木葡寡糖。而米黑根毛霉来源的GH12家族木葡聚糖酶RmXEG12B仅能将木葡聚糖水解为聚合度7~10的高聚合度木葡寡糖[33]。
2.5 木葡寡糖成分分析
根据ESI-MS（图8a）和MALDI-TOF（图8b）质谱结果，并结合Chen等[18]的实验结果，分析质荷比300~1700范围的木葡寡糖。木葡寡糖中低聚合度寡糖有[X+Na]+（m/z 335.0）、[XG+Na]+（m/z 497.0）、[XX+Na]+（m/z 629.0）、[LG+K]+（m/z 659.1）、[XXG/LX+Na]+（m/z 791.0）和[FG+Na]+（m/z 805.2），高聚合度寡糖有[XXGG/LL/LXG+Na]+（m/z 953.6）、[XFG+Na]+（m/z 1099.3）、[XLXG/XXLG+K]+（m/z 1263.4）。此外，部分寡糖以乙酰化的形式存在，如[FG+Ac+Na]+（m/z 847.2）、[XFG+Ac+Na]+ （m/z 1141.3）、[LFG+Ac+Na]+（m/z 1303.3）、[XFXG/XXFG+Ac+Na]+（m/z 1435.4）、[XLLG+Ac+Na/XXFG+Ac+K]+（m/z 1451.5）和[XFXG/XXFG+2Ac+Na]+（m/z 1477.5）（在L基础上以α-1,2糖苷键在半乳糖残基上连接一个L-岩藻糖残基为F）。可见，利用PbXEG74B制备得到的木葡寡糖中至少含有15种木葡寡糖，而RmXEG12B水解苹果渣所得寡糖仅有XXXG、XXLG/XLXG、XXFG/XFXG和XLFG[33]。
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图 8 苹果渣木葡寡糖的ESI（a）和MALDI-TOF（b）分析Figure 8. ESI (a) and MALDI-TOF (b) analysis of AP XyGOs3. 结论
本研究发掘了一个新型GH74家族木葡聚糖酶PbXEG74B，该酶在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达。PbXEG74B具有良好的酶学性质和水解特性，水解木葡聚糖能够产生聚合度为2~9的木葡寡糖。进一步将其应用于水解DESs预处理后的苹果渣制备苹果渣木葡寡糖，产物中聚合度2~4的木葡寡糖占比达67.0%，实现了低聚合度木葡寡糖的酶法制备。综上，利用PbXEG74B水解耦合DESs预处理可以实现苹果渣中木葡聚糖的酶法降解，将其转化为高附加值的木葡寡糖，为苹果渣的高值化利用和低聚合度木葡寡糖的制备提供了理论基础和实践依据。
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图 1 木葡聚糖酶PbXEG74B与其他来源木葡聚糖酶序列比对
注：相同的残基在红色背景上显示为白色，保守残基在白色背景上显示为红色，两个保守的催化残基用红色五角星标记。
Figure 1. Multiple sequences alignment of PbXEG74B and other xyloglucanases
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图 2 PbXEG74B与PoGH74结构比对
注：催化残基用红色标注；PbXEG74B与PoGH74催化模块（CD）用蓝色和粉色标注；碳水化合物结合模块X2和CBM3分别用紫色和黄色标注。
Figure 2. Structural comparison between PbXEG74B and PoGH74
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图 3 木葡聚糖酶PbXEG74B纯化电泳图
注：M：高分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：纯酶液。
Figure 3. SDS-PAGE analysis of PbXEG74B before and after purification
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图 4 PbXEG74B的最适pH（a）、pH稳定性（b）、最适温度（c）和温度稳定性（d）
Figure 4. Optimal pH (a), pH stability (b), optimal temperature (c) and temperature stability (d) of PbXEG74B
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图 5 木葡聚糖（a）、木葡七糖（b）和木葡九糖（c）水解产物TLC分析
Figure 5. TLC analysis of XyG (a) , XXXG (b) and XLLG (c) hydrolyzed by PbXEG7
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图 6 未处理（a）和预处理（b）苹果渣的微观结构（2000×）
Figure 6. Microstructure of untreated(a) and pretreated (b) AP (2000×)
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图 7 苹果渣木葡寡糖的组分分析
注：CK：未预处理的苹果渣水解8 h；G：葡萄糖；G2：纤维二糖；G3：纤维三糖、G4：纤维四糖；XXXG：木葡七糖；XLLG：木葡九糖。
Figure 7. Composition of AP XyGOs
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图 8 苹果渣木葡寡糖的ESI（a）和MALDI-TOF（b）分析
Figure 8. ESI (a) and MALDI-TOF (b) analysis of AP XyGOs
表 1 PbXEG74B水解苹果渣制备木葡寡糖得率
Table 1 Yield of XyGOs in enzymatic hydrolysis of pretreated AP by PbXEG74B
水解时间（h） 不同聚合度寡糖得率（g/100 g苹果渣） 木葡寡糖总得率
（g/100 g苹果渣）DP 2~4 DP 5~6 DP 7~9 CK 0.94±0.02c 0.11±0.01d 0.48±0.06cd 1.53±0.09c 0.5 0.56±0.02e 0.07±0.01e 0.27±0.00f 0.90±0.00e 1 0.70±0.03d 0.13±0.02cd 0.37±0.03e 1.20±0.01d 2 0.95±0.01c 0.15±0.01c 0.44±0.02de 1.55±0.00c 4 1.26±0.02b 0.24±0.04b 0.54±0.02bc 2.05±0.02b 8 1.86±0.11a 0.32±0.02a 0.60±0.08ab 2.79±0.08a 12 1.86±0.04a 0.32±0.03a 0.66±0.03a 2.85±0.10a 注：同列字母不同表示差异显著（P<0.05）。 
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