Optimization in High-pressure Microfluidics Preparation of Black Pepper Essential Oil Nanoemulsion by Response Surface Methodology and Its Component Analysis
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摘要: 为改善黑胡椒精油（Black Pepper Essential Oil，BPEO）在食品保鲜方面应用时存在的刺激性气味和稳定性问题，以BPEO为油相，吐温80（Tween 80）为乳化剂，并使用单因素试验结合Box-Behnken响应面法优化了高压微射流均质技术制备纳米乳液的工艺参数。通过红外光谱法和气相色谱-质谱联用技术（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）对BPEO纳米乳液的成分进行分析。结果表明，最佳工艺参数为均质压力175 Mpa、均质2次以及Tween 80浓度1.5%。在此条件下制备的BPEO纳米乳液粒径为126.64 nm，聚合物分散系数（Polymer dispersity index，PDI）为0.238。BPEO纳米乳液中存在Tween 80和纯精油的大部分官能团，其特征吸收峰的波数变化较为微小，证明BPEO被成功地包裹在液滴中。BPEO纳米乳液的挥发性成分主要包含β-石竹烯（29.32%）、D-柠檬烯（14.05%）、β-蒎烯（13.17%）、桧烯（8.69%）、α-蒎烯（2.89%）、石竹素（1.61%）、芳樟醇（0.27%）、4-松油醇（0.62%）和γ-松油烯（0.21%）等化合物，多数活性成分在BPEO中检测到。说明高压微射流均质技术并没有破坏BPEO生物活性成分，所制备的BPEO纳米乳液有望保持与BPEO相同的生物活性和良好的稳定性，可用于食品防腐保鲜。
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关键词:
- 黑胡椒精油(BPEO) /
- 高压微射流 /
- 响应面法 /
- 纳米乳液
Abstract: In order to improve the irritating odor and stability problems existing in the application of black pepper essential oil (BPEO) in food preservation, BPEO was used as oil phase and Tween 80 was used as emulsifier. The single factor test and Box-Behnken response surface method were utilized to optimize the process parameters of nanoemulsions prepared by high-pressure microjet homogenization technology. The composition of BPEO nanoemulsions was analyzed by infrared spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results demonstrated that the ideal process parameters were the homogenization pressure of 175 Mpa, homogenization cycles were 2, and Tween 80 concentration of 1.5%. The particle size of BPEO nanoemulsion prepared under these conditions was 126.64 nm and the polymer dispersity index (PDI) was 0.238. Most of the functional groups of Tween 80 and BPEO exist in the BPEO nanoemulsion, and the wavenumber changes of the characteristic absorption peaks were slightly small, which proved that BPEO was successfully wrapped in the droplet. The composition of BPEO nanoemulsion mainly contained caryophyllene (29.32%), D-limonene (14.05%), β-pinene (13.17%), bicyclo[3.1.0]hexane, 4-methylene-1-(1-methylethyl) (8.69%), copaene (2.89%), caryophyllene oxide (1.61%), linalool (0.27%), terpinen-4-ol (0.62%) and γ-terpinene (0.21%). Most of the active ingredients were detected in BPEO. The results indicated that the high pressure microjet homogenization technology did not destroy the bioactive ingredients of BPEO, the prepared BPEO nanoemulsion was expected to maintain the same bioactivity and good stability as BPEO, and could be used for food preservation. -
黑胡椒精油（Black Pepper Essential Oil，BPEO）是由黑胡椒果实蒸馏萃取所得的含有柠檬烯、桧烯、α-蒎烯及石竹烯等生物活性物质的一种天然产物。其具有较强的抗氧化活性及广谱抑菌能力，是一种良好的生物防腐剂，目前已被广泛应用于食品及保健品中[1−2]。作为植物源天然抑菌剂，BPEO基本无毒，绿色环保，对环境污染小，根据美国食品和药物管理局（FDA）的规定，BPEO被归类为“一般公认为安全”（GRAS）物质[3]。然而，当精油用于采后果蔬保鲜并达到有效的抗菌剂量时，其风味可能会影响消费者的感官接受度[4]，且BPEO是高度亲脂性的，在水中溶解性和稳定性差，这些因素限制了精油的应用。而将精油制备成食品级纳米乳液，可以确保精油的疏水成分均匀分布在亲水基质中，提高溶解性及稳定性，控制其释放[5]；另一方面，有效提高了精油的生物活性，减少精油对食品感官品质的影响，更易为消费者接受[6]。纳米乳液作为一种非平衡体系，难以自发形成[7]。因此，找到一种高效可行的方法制备纳米乳液至关重要。
高压微射流均质技术（High-Pressure Microfluidics，HPM）利用高速冲击、高频振动、合力-张力剪切和超高压对物料进行强烈的剪切，液滴高度破碎，具有更好的粒径分布效果，是一种新兴的动态高压均质乳化技术[8]。虽然有关高压微射流均质技术制备纳米乳液的研究相对较少，但一些研究表明，其制备的纳米乳液具有以下优点：纳米乳液极度细化（20~200 nm），具有更低的乳液粒径、聚合物分散性指数（PDI）和良好的缓释性能，有效抑制了乳液酸价和过氧化值的增加，提高了乳液稳定性和生物利用率[9−10]。类似地，高压微射流均质技术制备水飞蓟籽油纳米乳液的研究结果中显示，高压微射流均质技术制备的纳米乳液的粒径、酸价和过氧化值均较小，具有较好的稳定性[11]。
精油纳米乳液因其粒径小，稳定性、可接受度和生物利用率高成为精油应用的热点研究方向[12−14]。不同条件制备所得的精油纳米乳液差异较大，因此本研究通过单因素实验考察高压微射流均质技术中均质压力、均质次数和Tween 80浓度对BPEO纳米乳液滴粒径和PDI的影响，并结合响应面实验以求制备稳定性和生物活性良好的BPEO纳米乳液，以期为扩大BPEO纳米乳液使用范围提供理论参考和科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
BPEO 浓度≥98%，花无边生物科技（上海）有限公司；Tween 80 食品级，美国Roll Into One Emulsifier有限公司。
NanoGenizer30k高压微射流均质机 中国苏州微流纳米公司；纳米粒度及Zeta电位仪 Zetasizer Nano ZSE 英国马尔文公司；MYP11-2A磁力搅拌器 中国上海梅颖浦仪器仪表制造有效公司；T27傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司；7890B/7000B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。
1.2 实验方法
1.2.1 BPEO纳米乳液的制备
BPEO纳米乳液是由BPEO、Tween 80和蒸馏水三种成分利用高压微射流均质而成。首先使用磁力搅拌器以500 r/min转速将蒸馏水与Tween 80混合3 min，然后将BPEO逐滴加入，以500 r/min转速混合5 min以制备BPEO粗乳液，使BPEO最终体积含量为5%。随后，用高压微射流均质机对粗乳液进行均质得到BPEO纳米乳液（图1）[15]。
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图 1 高压微射流均质技术制备BPEO纳米乳液工艺流程Figure 1. Technological processes of preparation of BPEO nanoemulsions by high-pressure microfluidic homogenization1.2.2 BPEO纳米乳液粒径和PDI的测定
吸取1 mL BPEO纳米乳液，用蒸馏水稀释50倍，用纳米粒度及Zeta电位仪测量BPEO纳米乳液粒径和PDI。
1.2.3 BPEO纳米乳液制备条件研究
1.2.3.1 单因素实验
以均质压力（100、125、150、175和200 MPa）、均质次数（0、1、2、3和4）、Tween 80浓度（1%、2%、3%、4%和5%）为影响因素，分别考察各因素对BPEO纳米乳液粒径和PDI的影响。
选取均质压力（100、125、150、175和200 MPa），Tween 80浓度3%，均质次数为2，BPEO浓度为5%，确定最佳均质压力。
选取均质次数（0、1、2、3和4次），Tween 80浓度3%，均质压力150 MPa，BPEO浓度5%，确定最佳均质次数。
选取Tween 80浓度（1%、2%、3%、4%和5%），均质压力150 MPa，均质次数为2，BPEO浓度5%，确定最佳Tween 80浓度。
1.2.3.2 响应面优化试验
基于单因素实验结果，以乳液粒径和PDI为响应值，以均质压力（A）、均质次数（B）和Tween 80浓度（C）为自变量因素，根据Box-Behnken设计响应面试验，确定BPEO纳米乳液的最佳制备参数。
表 1 响应面试验设计因素和水平Table 1. Response surface experimental design factors and levels因素 水平 −1 0 1 A均质压力（MPa） 150 175 200 B均质次数 1 2 3 C Tween 80浓度（%） 1 2 3 1.2.4 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
利用傅里叶变换红外光谱法[16]测定红外吸收光谱。采用氯化钾（KBr）压片法对Tween 80、BPEO及BPEO纳米乳液进行压片，频率范围为4000~400 cm−1。
1.2.5 BPEO及BPEO纳米乳液成分分析
采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）[17]对BPEO及BPEO纳米乳液进行成分分析。气相色谱条件：色谱柱：DB-225；分流比为250:1；进样量1.00 μL；柱初始温度为50 ℃，时间为1 min，以4 ℃/min升温至130 ℃，时间为10 min，再以6 ℃/min升温至200 ℃。质谱条件：EI源；电离电压：70 eV；离子源温度为200 ℃；传输线温度为280 ℃；试验所用的载气为氦气，柱流速为1.0 mL/min；进样口温度为260 ℃。
定性方法：通过与NIST 20.L标准谱库进行数据对比，仅保留相似度>80%的成分。
定量方法：化合物的相对百分含量按峰面积归一法进行计算。
1.3 数据处理
所有指标测定重复三次，结果以平均值±标准误表示。响应面试验设计及数据分析采用Design-expert 13软件进行，采用Origin 2023（Northampton，MA，USA）和Figdraw进行绘图，采用IBM SPSS Statistics 22（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）软件进行数据处理和统计分析。
2. 结果与分析
2.1 高压微射流均质技术制备BPEO纳米乳液
2.1.1 均质压力、均质次数及Tween 80浓度对BPEO纳米乳液粒径及PDI的影响
如图2A和2B所示，随着均质次数和均质压力的增加，BPEO纳米乳液的粒径及PDI随之减小。在175 MPa的压力下，乳液粒径及聚合物分散性指数（PDI）最小，分别为132 nm和0.29；当压力增大至200 MPa时，PDI增大。类似的结果在高压均质法制备肉桂精油纳米乳液中也有报道，这与均质循环过程中系统温度的逐渐升高，液滴聚集有关[18−19]。适当浓度的表面活性剂可以与油滴充分接触，防止液滴聚集，以形成稳定均匀的纳米乳体系[20]。当Tween 80从1%增加到5%时，BPEO纳米乳液粒径显著上升（P<0.05），而乳液的PDI呈先下降后上升最后下降趋势，Tween 80浓度为2%时，乳液PDI最小（图2C）。这可能是因为在较低浓度的Tween 80下，不能充分覆盖精油颗粒，导致颗粒之间聚集较少，使乳液的粒径较小。然而，由于这种乳液体系稳定性较弱，导致乳液分布较广且不均匀，PDI相对较高。随着Tween 80浓度的增加，乳液体系变得更加完整和稳定，Tween 80能够更有效地包裹BPEO，减少了颗粒的聚集，从而降低了PDI值[20]。综上所述，均质压力为175 MPa，均质次数为2次，Tween 80浓度2%时所制备的BPEO纳米乳液的稳定性较好。
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图 2 高压微射流均质条件对BPEO纳米乳液的粒径及PDI的影响注：A：均质压力；B：均质次数；C：Tween 80浓度（B图左纵坐标为对数刻度）。Figure 2. Effect of high-pressure microfluidic homogenization conditions on particle size and PDI of BPEO nanoemulsions2.1.2 BPEO纳米乳液制备条件响应面优化研究
2.1.2.1 BPEO纳米乳液制备条件响应面优化试验方案及结果
根据单因素实验结果，采用三因素三水平响应面对BPEO纳米乳液制备条件进行优化。选择均质压力（150、175和200 MPa），均质次数（1、2和3次），Tween 80浓度（1%、2%和3%），BPEO浓度5%，设计了17组试验，包括5次重复，以BPEO纳米乳液粒径及PDI为响应变量，确定最优化制备工艺并验证（表2）。
表 2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2. Box-Behnken trial design and results试验号 A均质压力
（MPa）B均质次数 C Tween 80
浓度（%）Y1粒径
（nm）Y2 PDI 1 200 2 3 124.90 0.39 2 175 2 2 123.27 0.25 3 150 1 2 141.87 0.32 4 200 2 1 100.33 0.43 5 175 2 2 124.67 0.25 6 175 2 2 125.53 0.25 7 150 3 2 124.37 0.29 8 175 2 2 127.27 0.25 9 175 3 1 106.60 0.37 10 200 3 2 124.93 0.39 11 175 1 3 124.33 0.33 12 150 2 1 116.53 0.40 13 175 1 1 114.57 0.40 14 200 1 2 123.60 0.39 15 150 2 3 126.37 0.29 16 175 2 2 122.3 0.27 17 175 3 3 120.53 0.35 2.1.2.2 BPEO纳米乳液制备条件的回归模型建立及方差分析
通过对表2数据进行多元二次回归拟合，建立BPEO纳米乳液制备工艺参数回归模型。BPEO纳米乳液粒径和PDI与各因素之间的二次多元回归方程式如下：
粒径：Y1=124.608−4.4225A−3.4925B+7.2625C+4.7075AB+3.6825AC+1.0425BC+2.30475A2+1.77975B2−9.88025C2
PDI：Y2=0.254+0.0375A−0.005B−0.03C+0.0075AB+0.0175AC+0.0125BC+0.05425A2+0.03925B2+0.06925C2
对上述模型进行方差分析，结果如表3所示。制备的BPEO纳米乳液粒径及PDI两个模型不同处理间均呈极显著差异（P<0.0001），而失拟项差异均不显著，说明残差均由随机误差引起。两个模型的拟合度R2分别为0.9753和0.9843，说明响应值粒径及PDI的变化分别有97.53%和98.43%来源于所选变量，模型拟合度较好，使用该模型对BPEO纳米乳液的粒径和PDI进行预测是可靠的。
表 3 回归模型方差分析Table 3. Variance analysis of regression model来源 Y1粒径（nm） PDI（Y2） 均值 F值 P值 显著性 均值 F值 P值 显著性 模型 139.50 30.67 <0.0001 ** 0.0071 48.86 <0.0001 ** A 156.47 34.40 0.0006 ** 0.0112 77.21 <0.0001 ** B 97.58 21.45 0.0024 ** 0.0002 1.37 0.2797 C 421.95 92.76 <0.0001 ** 0.0072 49.41 0.0002 ** AB 88.64 19.49 0.0031 ** 0.0002 1.54 0.2540 AC 54.24 11.92 0.0106 * 0.0012 8.41 0.0230 * BC 4.35 0.9557 0.3608 0.0006 4.29 0.0771 A2 22.37 4.92 0.0621 0.0124 85.04 <0.0001 ** B2 13.34 2.93 0.1306 0.0065 44.52 0.0003 ** C2 411.03 90.36 <0.0001 ** 0.0202 138.57 <0.0001 ** 失拟项 5.60 1.49 0.3458 0.0002 2.92 0.1639 决定系数（R²） 0.9753 0.9843 校正系数（Radj²） 0.9435 0.9642 精密度（Adeq） 0.7731 0.8203 在BPEO纳米乳液粒径模型中，一次项系数对粒径影响表现为极显著（P<0.01），交互项均质压力和均质次数（A×B）对粒径影响表现为极显著（P<0.01）、均质压力和Tween 80浓度（A×C）对粒径影响表现为显著（P<0.05），二次项Tween 80浓度（C2）对粒径影响表现为极显著（P<0.01）。而在PDI模型中，一次项系数均质压力（A）、Tween 80浓度（C）对PDI影响极显著（P<0.01），交互项均质压力和Tween 80浓度（A×C）对PDI影响表现为显著（P<0.05），二次项对PDI影响均表现为极显著（P<0.01）。F值可以反应各因素影响BPEO纳米乳液粒径的显著性，三个因素对BPEO纳米乳液粒径的影响顺序为：Tween 80浓度>均质压力>均质次数；对PDI的影响顺序为：均质压力>Tween 80浓度>均质次数。
2.1.2.3 响应面各因素交互作用分析
响应曲面和等高线图能够直观地展示均质压力、均质次数以及Tween 80浓度之间的两两交互作用对乳液粒径和PDI响应值的影响关系。响应曲面的坡面越陡，等高线越密集，影响越显著，而等高线越接近椭圆，两因素的交互作用越强。如图3所示，均质压力（A）和均质次数（B）的交互图曲面坡度相对陡峭，表明二者间交互作用较强，对BPEO纳米乳液粒径影响显著。均质压力（A）和Tween 80浓度（C）的交互图曲面坡度次之，而均质次数（B）和Tween 80浓度（C）的坡度相对平缓，表明二者间的交互作用对BPEO纳米乳液粒径的影响最小。高压微射流均质所产生的高剪切力使乳液的粒径减小到纳米级，但是乳液作为一种热不稳定的各向同性体系，在能量足够打破原有相平衡条件下，表面活性剂浓度成为控制纳米乳液体系主要因素，对纳米乳液粒径影响较大[21−23]。本研究中，当均质压力和次数接近最优值时，Tween 80浓度对BPEO纳米乳液粒径的影响大于均质压力和均质次数，如图3b和c所示，随着Tween 80浓度的升高，BPEO纳米乳液粒径增大，响应面图中反而出现极大值。类似地，在柑橘精油-果胶纳米乳液性质的研究中发现，乳液粒径随Tween 80浓度的增加而显著增加[24]。而BPEO纳米乳液PDI的响应面与等高线分析表明，响应曲面陡峭程度为均质压力（A）和Tween 80浓度（C）>均质次数（B）和Tween 80浓度（C）>均质压力（A）和均质次数（B）（如图4），说明均质压力和Tween 80浓度的交互作用对BPEO纳米乳液PDI的影响更显著，上述分析与表3的方差分析结果一致。
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图 3 BPEO纳米乳液粒径的响应面与等高线分析图Figure 3. Response surface and contour analysis diagram of BPEO nanoemulsion particle size![]()
图 4 BPEO纳米乳液PDI的响应面与等高线分析图Figure 4. Response surface and contour analysis diagram of BPEO nanoemulsion PDI2.1.3 BPEO纳米乳液最佳制备工艺条件及验证
通过Design-Expert 13，按照优化目标，将BPEO纳米乳液粒径和PDI设置为“minimize”，对模型方程最小化分析，得出制备BPEO纳米乳液的最佳工艺条件为均质压力174.153 MPa，均质次数2.360次，Tween 80浓度1.459%。在此条件下，可获得粒径最小、PDI最小的BPEO纳米乳液，其粒径和PDI的理论预测值分别为116.72 nm和0.290。考虑到实际情况，将制备BPEO纳米乳液的最佳条件修正为：均质压力175 MPa，均质次数2，Tween 80浓度1.5%。如图5所示，在上述条件下制备的BPEO纳米乳液，其粒径和PDI分别为126.64 nm和0.238，与理论预测值的吻合度分别达到92.17%和82.07%。这表明实验结果与方程预测值具有较好的一致性。此外，通过响应面方法优化微射流参数后制备的丁香精油纳米乳液同样显示出优良的颗粒聚集性和相分离稳定性[25]，进一步支持了本研究优化方法的有效性。
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图 5 最佳制备工艺条件所制备的BPEO纳米乳液粒径和PDI注：条形柱的高度代表乳液在此粒径大小下的相对频率，曲线为乳液粒径的拟合曲线。Figure 5. Particle size and PDI of BPEO nanoemulsion prepared under optimal preparation process conditions2.2 BPEO纳米乳液傅里叶变换红外光谱
Tween 80、BPEO和BPEO纳米乳液的红外光谱如图6所示。Tween 80的红外光谱峰位及振动模式（表4）中，3493.82 cm−1为O-H邻氢拉伸产生的宽峰，2857.10 cm−1为饱和脂肪烃的-C-H伸缩振动，1735.07 cm−1为共轭酮、醛和酯的C=O振动[26]，1458.78、1349.81 cm−1为CH3弯曲振动峰，1296.29 cm−1为C-N伸缩振动峰，1247.93 cm−1为C-O-C的伸缩振动，1093.50 cm−1为C-O的伸缩振动峰，946.18 cm−1为C-H弯曲振动振动峰，846.38 cm−1为三取代烷基氧基（C-O）的特征峰，513.34 cm−1为六取代芳环（C-C）的振动峰[26]。BPEO的红外光谱峰位及振动模式（表4）中，3071.26 cm−1为芳香烃和烯烃的C-H伸缩振动，2922.02、2867.20 cm−1处是饱和脂肪烃的C-H伸缩振动，1642.78 cm−1处是共轭酮、醛和酯的C=O振动，1446.62、1379.10 cm−1是CH3的伸缩振动，1104.60 cm−1为C-O的伸缩振动峰，523.75 cm−1是C-H的弯曲振动峰。
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图 6 Tween 80、BPEO及BPEO纳米乳液的红外光谱图Figure 6. FT-IR spectra of Tween 80, BPEO and BPEO nanoemulsion表 4 Tween 80、BPEO及BPEO纳米乳液的红外光谱峰位及其振动模式Table 4. Peak positions and vibration modes of IR spectrum of Tween 80, BPEO and BPEO nanoemulsionBPEO纳米乳液 BPEO Tween 80 振动模式 3471.38 3493.82 -O-H的邻-氢拉伸[26] 3071.26 芳香烃和烯烃的-C-H伸缩振动[26] 2921.50 2922.02 饱和脂肪烃的-C-H伸缩振动 2858.14 2867.20 2857.10 饱和脂肪烃的-C-H伸缩振动[26] 1735.32 1735.07 共轭酮、醛和酯的C=O振动[26] 1644.18 1642.78 共轭酮、醛和酯的C=O振动[26] 1457.94 1446.62 1458.78 CH3弯曲振动[26] 1350.07 1379.10 1349.81 CH3弯曲振动[26] 1296.31 1296.29 C-N伸缩振动[26] 1248.29 1247.93 C-O-C伸缩振动[26] 1092.82 1104.60 1093.50 C-O伸缩振动[26] 946.54 946.18 C-H弯曲振动[27,28] 844.57 846.38 三取代烷基氧基（C-O）的振动[27,28] 517.56 513.34 六取代芳环（C-C）的振动[27,28] 523.75 C-H键的弯曲振动[27,28] BPEO纳米乳液的红外光谱图与Tween 80和BPEO光谱图相比，只是部分特征峰发生位移、峰强减弱或消失（表4），并没有新的特征峰出现，说明BPEO被成功地包裹在纳米乳液液滴中，BPEO纳米乳液中Tween 80和BPEO分子之间的相互作用为物理作用。在对高压均质法制备姜精油纳米乳液的红外光谱图中也表现出相同的结果[29]。其中BPEO与Tween 80乳化形成BPEO纳米乳液后，BPEO纳米乳液中BPEO芳香烃和烯烃的C-H伸缩振动峰及C-H键的弯曲振动峰明显减弱甚至消失，其他研究中也报道了类似现象。例如由相转变温度法（PIT）和相转化乳化法（EPI）制备的BPEO纳米乳液中3071.59 cm−1处芳香烃和烯烃的碳氢拉伸振动峰几乎消失，出现这种情况是因为BPEO被Tween 80包裹后与Tween 80紧密结合，基团所处微环境发生变化，分子振动受到限制而不能完全显现原有红外特征，红外特征峰被Tween 80掩盖[26,30]。
2.3 BPEO及BPEO纳米乳液GC-MS成分分析
采用GC-MS分析高压微射流均质技术制备的BPEO纳米乳液，并与BPEO进行比较，其主要化合物保留时间及相对含量如图7和表5所示。BPEO的挥发性成分主要包括β-石竹烯（28.59%）、D-柠檬烯（14.04%）、β-蒎烯（13.69%）、桧烯（9.44%）、α-蒎烯（2.81%）、石竹素（1.20%）、芳樟醇（0.24%）、4-松油醇（0.24%）和γ-松油烯（0.13%），这些成分与Hien等[26]研究的BPEO主要成分一致。精油中丰富的萜烯类、醇类和酮类化合物可通过清除细胞内活性氧发挥抗氧化作用，还具有广谱抑菌能力，能抑制多种微生物如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长繁殖[31]。BPEO纳米乳液中同样富含β-石竹烯、D-柠檬烯、β-蒎烯、桧烯、α-蒎烯、石竹素、芳樟醇、4-松油醇和γ-松油烯等化合物，占总成分的70.83%，与纯精油相似。其中D-柠檬烯和芳樟醇[32]、4-松油醇[33]、γ-松油烯[33]和石竹素[34]等均具有较强的抑菌活性，这些化合物在BPEO纳米乳液中的含量均高于BPEO。这表明通过高压微射流均质技术制备的BPEO纳米乳液保留了BPEO的大部分生物活性，适合用于食品防腐保鲜。
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图 7 BPEO和BPEO纳米乳液挥发性成分总离子流图Figure 7. Total ion current chromatogram of volatile components in BPEO and BPEO nanoemulsion表 5 BPEO及其纳米乳液挥发性成分定性分析结果Table 5. Qualitative analysis results of volatile components in BPEO and BPEO nanoemulsion主要化合物 BPEO保留时间（min） 相对含量
（%）BPEO纳米乳保留时间（min） 相对含量
（%）萜烯类 2-甲基-5-（1-甲基乙基）-双环[3.1.0]己二烯，（2-Methyl-5-（1-methylethyl）-bicyclo[3.1.0]hex-2-ene） 3.705 0.61 3.705 0.64 β-蒎烯（.beta.-Pinene） 5.232 13.69 5.191 13.17 桧烯（Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-（1-methylethyl）-） 5.381 9.44 5.347 8.69 α-水芹烯（.alpha.-Phellandrene） 6.033 0.99 6.013 0.74 松油烯（1,3-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-（1-methylethyl）-） 6.386 0.11 6.372 0.13 23.378 0.05 D-柠檬烯（D-Limonene） 6.637 14.04 6.576 14.05 γ-松油烯（γ-Terpinene） 7.662 0.13 7.649 0.21 柠檬烯（Cyclohexene,1-methyl-4-（1-methylethylidene）- ） 8.457 0.27 8.443 0.24 23.371 0.02 萜品油烯（Cyclohexene, 3-methyl-6-（1-methylethylidene）-） 9.341 0.08 8.328 0.08 α-蒎烯（Copaene） 15.809 2.81 15.788 2.89 β-红没药烯（.beta.-Bisabolene） 20.927 0.91 20.914 0.92 α-古芸烯（1H-Cycloprop[e]azulene, 1a,2,3,4,4a,5,6,7b-octahydro-1,1,4,7-tetramethyl-, [1aR-（1a.alpha.,4.alpha.,4a.beta.,7b.alpha.）]-） 16.868 0.09 16.854 0.09 20.792 0.11 20.778 0.08 β-石竹烯（Caryophyllene） 17.927 0.09 18.925 28.50 18.857 29.32 木犀烯（γ-Muurolene） 20.215 0.05 20.208 0.05 Δ-杜松烯（Naphthalene, 1,2,3,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-（1-methylethyl）-, （1S-cis）- ） 21.674 0.80 21.654 0.80 大牛儿烯D（Germacrene D） 18.517 0.14 21.294 0.16 21.28 0.15 25.381 0.07 27.505 0.07 去氢白菖烯（Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1,6-dimethyl-4-（1-methylethyl）-, （1S-cis）- ） 22.367 0.03 24.036 0.08 石竹素（Caryophyllene oxide） 30.187 0.04 31.823 0.23 31.089 0.23 32.027 0.93 32.020 1.38 酮类 4,7,7-三甲基双环[4.1.0]庚-3-烯-2-酮（4,7,7-Trimethylbicyclo[4.1.0]hept-3-en-2-one） 27.071 0.02 27.085 0.04 醇类 桉油精（Eucalyptol） 7.866 0.08 7.852 0.09 芳樟醇（Linalool） 13.188 0.24 13.175 0.27 4-松油醇（Terpinen-4-ol） 15.632 0.24 15.625 0.62 2-（4-甲基苯基）丙-2-醇
（Benzenemethanol, .alpha.,.alpha.,4-trimethyl-）19.624 0.04 19.610 0.05 桉油烯醇（Isospathulenol） 33.996 0.19 33.995 0.23 其他 1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯
（Benzene, 1-methyl-4-（1-methylethenyl）- ）11.389 0.01 11.369 0.01 Cyclohexene, 4-ethenyl-4-methyl-3-（1-methylethenyl）-1-（1-methylethyl）-, （3R-trans）- 14.824 1.99 14.811 1.98 1,4,7,-Cycloundecatriene, 1,5,9,9-tetramethyl-, Z,Z,Z- 20.323 1.10 20.310 1.13 纳米乳化后化合物的含量间接地反映了乳液的包封效率，包封效率越高，化合物的定量含量越低，而微流化条件是影响化合物的包封效率主要因素[35]。研究表明，微流化过程中均质压力和均质次数的交互作用轻微影响精油中主要化合物的含量，但不影响其抑菌活性。另一方面，某些化合物含量的降低可能与均质过程中的能量增加、温度升高导致化合物降解和化学反应有关[35]。总之，高压微射流制备的BPEO纳米乳液具有较好的包封效率，虽然对精油主要化合物的含量有轻微影响，但仍不影响其抑菌效果。
3. 结论
以BPEO为油相，Tween 80为乳化剂，采用单因素结合响应面试验确定了高压微射流均质技术制备BPEO纳米乳液的最佳工艺参数为均质压力175 MPa，均质次数2次，表面活性剂浓度1.5%。利用GC-MS对BPEO纳米乳液成分进行分析，其中β-石竹烯、D-柠檬烯、β-蒎烯、桧烯、α-蒎烯、石竹素、芳樟醇、4-松油醇和γ-松油烯等占总成分的70.83%。结合GC-MS和FTIR分析，可以确认BPEO纳米乳液与BPEO中的主要成分及含量相似，高压微射流均质技术并未破坏BPEO中的主要成分。因此，制备的BPEO纳米乳液显示出良好的稳定性，有望保留与BPEO相同的生物活性，适用于食品的防腐和保鲜。
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图 1 高压微射流均质技术制备BPEO纳米乳液工艺流程
Figure 1. Technological processes of preparation of BPEO nanoemulsions by high-pressure microfluidic homogenization
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图 2 高压微射流均质条件对BPEO纳米乳液的粒径及PDI的影响
注：A：均质压力；B：均质次数；C：Tween 80浓度（B图左纵坐标为对数刻度）。
Figure 2. Effect of high-pressure microfluidic homogenization conditions on particle size and PDI of BPEO nanoemulsions
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图 3 BPEO纳米乳液粒径的响应面与等高线分析图
Figure 3. Response surface and contour analysis diagram of BPEO nanoemulsion particle size
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图 4 BPEO纳米乳液PDI的响应面与等高线分析图
Figure 4. Response surface and contour analysis diagram of BPEO nanoemulsion PDI
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图 5 最佳制备工艺条件所制备的BPEO纳米乳液粒径和PDI
注：条形柱的高度代表乳液在此粒径大小下的相对频率，曲线为乳液粒径的拟合曲线。
Figure 5. Particle size and PDI of BPEO nanoemulsion prepared under optimal preparation process conditions
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图 6 Tween 80、BPEO及BPEO纳米乳液的红外光谱图
Figure 6. FT-IR spectra of Tween 80, BPEO and BPEO nanoemulsion
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图 7 BPEO和BPEO纳米乳液挥发性成分总离子流图
Figure 7. Total ion current chromatogram of volatile components in BPEO and BPEO nanoemulsion
表 1 响应面试验设计因素和水平
Table 1 Response surface experimental design factors and levels
因素 水平 −1 0 1 A均质压力（MPa） 150 175 200 B均质次数 1 2 3 C Tween 80浓度（%） 1 2 3 
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表 2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Box-Behnken trial design and results
试验号 A均质压力
（MPa）B均质次数 C Tween 80
浓度（%）Y1粒径
（nm）Y2 PDI 1 200 2 3 124.90 0.39 2 175 2 2 123.27 0.25 3 150 1 2 141.87 0.32 4 200 2 1 100.33 0.43 5 175 2 2 124.67 0.25 6 175 2 2 125.53 0.25 7 150 3 2 124.37 0.29 8 175 2 2 127.27 0.25 9 175 3 1 106.60 0.37 10 200 3 2 124.93 0.39 11 175 1 3 124.33 0.33 12 150 2 1 116.53 0.40 13 175 1 1 114.57 0.40 14 200 1 2 123.60 0.39 15 150 2 3 126.37 0.29 16 175 2 2 122.3 0.27 17 175 3 3 120.53 0.35
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表 3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
来源 Y1粒径（nm） PDI（Y2） 均值 F值 P值 显著性 均值 F值 P值 显著性 模型 139.50 30.67 <0.0001 ** 0.0071 48.86 <0.0001 ** A 156.47 34.40 0.0006 ** 0.0112 77.21 <0.0001 ** B 97.58 21.45 0.0024 ** 0.0002 1.37 0.2797 C 421.95 92.76 <0.0001 ** 0.0072 49.41 0.0002 ** AB 88.64 19.49 0.0031 ** 0.0002 1.54 0.2540 AC 54.24 11.92 0.0106 * 0.0012 8.41 0.0230 * BC 4.35 0.9557 0.3608 0.0006 4.29 0.0771 A2 22.37 4.92 0.0621 0.0124 85.04 <0.0001 ** B2 13.34 2.93 0.1306 0.0065 44.52 0.0003 ** C2 411.03 90.36 <0.0001 ** 0.0202 138.57 <0.0001 ** 失拟项 5.60 1.49 0.3458 0.0002 2.92 0.1639 决定系数（R²） 0.9753 0.9843 校正系数（Radj²） 0.9435 0.9642 精密度（Adeq） 0.7731 0.8203
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表 4 Tween 80、BPEO及BPEO纳米乳液的红外光谱峰位及其振动模式
Table 4 Peak positions and vibration modes of IR spectrum of Tween 80, BPEO and BPEO nanoemulsion
BPEO纳米乳液 BPEO Tween 80 振动模式 3471.38 3493.82 -O-H的邻-氢拉伸[26] 3071.26 芳香烃和烯烃的-C-H伸缩振动[26] 2921.50 2922.02 饱和脂肪烃的-C-H伸缩振动 2858.14 2867.20 2857.10 饱和脂肪烃的-C-H伸缩振动[26] 1735.32 1735.07 共轭酮、醛和酯的C=O振动[26] 1644.18 1642.78 共轭酮、醛和酯的C=O振动[26] 1457.94 1446.62 1458.78 CH3弯曲振动[26] 1350.07 1379.10 1349.81 CH3弯曲振动[26] 1296.31 1296.29 C-N伸缩振动[26] 1248.29 1247.93 C-O-C伸缩振动[26] 1092.82 1104.60 1093.50 C-O伸缩振动[26] 946.54 946.18 C-H弯曲振动[27,28] 844.57 846.38 三取代烷基氧基（C-O）的振动[27,28] 517.56 513.34 六取代芳环（C-C）的振动[27,28] 523.75 C-H键的弯曲振动[27,28]
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表 5 BPEO及其纳米乳液挥发性成分定性分析结果
Table 5 Qualitative analysis results of volatile components in BPEO and BPEO nanoemulsion
主要化合物 BPEO保留时间（min） 相对含量
（%）BPEO纳米乳保留时间（min） 相对含量
（%）萜烯类 2-甲基-5-（1-甲基乙基）-双环[3.1.0]己二烯，（2-Methyl-5-（1-methylethyl）-bicyclo[3.1.0]hex-2-ene） 3.705 0.61 3.705 0.64 β-蒎烯（.beta.-Pinene） 5.232 13.69 5.191 13.17 桧烯（Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-（1-methylethyl）-） 5.381 9.44 5.347 8.69 α-水芹烯（.alpha.-Phellandrene） 6.033 0.99 6.013 0.74 松油烯（1,3-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-（1-methylethyl）-） 6.386 0.11 6.372 0.13 23.378 0.05 D-柠檬烯（D-Limonene） 6.637 14.04 6.576 14.05 γ-松油烯（γ-Terpinene） 7.662 0.13 7.649 0.21 柠檬烯（Cyclohexene,1-methyl-4-（1-methylethylidene）- ） 8.457 0.27 8.443 0.24 23.371 0.02 萜品油烯（Cyclohexene, 3-methyl-6-（1-methylethylidene）-） 9.341 0.08 8.328 0.08 α-蒎烯（Copaene） 15.809 2.81 15.788 2.89 β-红没药烯（.beta.-Bisabolene） 20.927 0.91 20.914 0.92 α-古芸烯（1H-Cycloprop[e]azulene, 1a,2,3,4,4a,5,6,7b-octahydro-1,1,4,7-tetramethyl-, [1aR-（1a.alpha.,4.alpha.,4a.beta.,7b.alpha.）]-） 16.868 0.09 16.854 0.09 20.792 0.11 20.778 0.08 β-石竹烯（Caryophyllene） 17.927 0.09 18.925 28.50 18.857 29.32 木犀烯（γ-Muurolene） 20.215 0.05 20.208 0.05 Δ-杜松烯（Naphthalene, 1,2,3,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-（1-methylethyl）-, （1S-cis）- ） 21.674 0.80 21.654 0.80 大牛儿烯D（Germacrene D） 18.517 0.14 21.294 0.16 21.28 0.15 25.381 0.07 27.505 0.07 去氢白菖烯（Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1,6-dimethyl-4-（1-methylethyl）-, （1S-cis）- ） 22.367 0.03 24.036 0.08 石竹素（Caryophyllene oxide） 30.187 0.04 31.823 0.23 31.089 0.23 32.027 0.93 32.020 1.38 酮类 4,7,7-三甲基双环[4.1.0]庚-3-烯-2-酮（4,7,7-Trimethylbicyclo[4.1.0]hept-3-en-2-one） 27.071 0.02 27.085 0.04 醇类 桉油精（Eucalyptol） 7.866 0.08 7.852 0.09 芳樟醇（Linalool） 13.188 0.24 13.175 0.27 4-松油醇（Terpinen-4-ol） 15.632 0.24 15.625 0.62 2-（4-甲基苯基）丙-2-醇
（Benzenemethanol, .alpha.,.alpha.,4-trimethyl-）19.624 0.04 19.610 0.05 桉油烯醇（Isospathulenol） 33.996 0.19 33.995 0.23 其他 1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯
（Benzene, 1-methyl-4-（1-methylethenyl）- ）11.389 0.01 11.369 0.01 Cyclohexene, 4-ethenyl-4-methyl-3-（1-methylethenyl）-1-（1-methylethyl）-, （3R-trans）- 14.824 1.99 14.811 1.98 1,4,7,-Cycloundecatriene, 1,5,9,9-tetramethyl-, Z,Z,Z- 20.323 1.10 20.310 1.13
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