糖基化修饰消减南极磷虾原肌球蛋白致敏性研究

张书琪; 王舒雅; 贾淑琪; 刘柯欣; 孙娜

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2024060427

糖基化修饰消减南极磷虾原肌球蛋白致敏性研究

大连工业大学食品学院，海洋食品加工与安全控制全国重点实验室，国家海洋食品工程技术研究中心，食品工程技术研究中心，辽宁大连 116034

基金项目: 大连市科技人才创新支持计划项目（2022RY04）。

详细信息

作者简介:
张书琪（1999−），女，硕士研究生，研究方向：虾加工与质量安全控制，E-mail：zsq03150126@163.com

通讯作者:
孙娜（1988−），女，博士，教授，研究方向：虾加工与质量安全控制，E-mail：sunna1215@126.com。

中图分类号: TS201.6
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出版历程
- 收稿日期: 2024-06-27
- 网络出版日期: 2025-02-17

Allergenicity Reduction of Antarctic Krill (Euphausia superba) Tropomyosin through Glycosylation Modification

School of Food Science and Technology, SKL of Marine Food Processing & Safety Control, National Engineering Research Center of Seafood, Food Engineering Research Center, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

摘要

摘要: 南极磷虾是优质的蛋白质资源，然而其主要过敏原原肌球蛋白的强致敏性仍是亟待解决的问题。为了消减南极磷虾原肌球蛋白的致敏性，本研究用单糖（核糖、葡萄糖）和低聚糖（低聚甘露糖、低聚半乳糖）对南极磷虾原肌球蛋白进行糖基化处理。结果显示糖基化后原肌球蛋白的分子量增加，自由氨基含量降低，二级结构从α-螺旋转变为β-折叠，同时由于糖基化处理促使原肌球蛋白中的芳香族氨基酸残基暴露在疏水环境中导致荧光强度降低，这表明原肌球蛋白与四种糖发生了糖基化反应；进一步采用液相色谱质谱联用技术探究了原肌球蛋白的糖基化程度及其过敏原表位的修饰情况，结果发现单糖糖基化修饰原肌球蛋白的糖基化程度显著高于低聚糖（P<0.05），同时低聚甘露糖和低聚半乳糖糖基化修饰原肌球蛋白位于其过敏原表位上的糖基化位点数量分别为9、11个，高于核糖（8个）和葡萄糖（8个）的糖基化位点数量；BALB/c小鼠致敏模型结果表明，与受试原肌球蛋白的小鼠相比，受试糖基化原肌球蛋白小鼠的过敏症状减轻，包括较低水平的IgE、IgG1、IL-4、肥大细胞脱颗粒率、组胺以及血管和肠壁通透性，同时受试低聚半乳糖糖基化处理的原肌球蛋白小鼠的症状减轻程度更加明显，可能是由于低聚半乳糖对原肌球蛋白过敏原表位的修饰数量较多。本研究为南极磷虾原肌球蛋白致敏性的消减及其相关低致敏性产品的开发提供了理论基础。
- 南极磷虾 /
- 原肌球蛋白 /
- 致敏性 /
- 糖基化位点 /
- 过敏原表位
Abstract: Antarctic krill (Euphausia superba) was a premium protein resource. However, its strong allergenicity remained a problem that awaited resolution. To reduce the allergenicity of Antarctic krill tropomyosin, monosaccharides (ribose, glucose) and oligosaccharides (mannooligosaccharide, galactooligosaccharide) were used for glycosylation. The results showed that glycosylated tropomyosin underwent a decrease in free amino groups and an increase in molecular weight. Meanwhile, the secondary structure experienced a transition from α-helix to β-sheet, the exposure of aromatic amino acid residues to a hydrophobic environment resulted in decreased fluorescence intensity of glycosylated tropomyosin. These findings demonstrated that four kinds of sugars successfully glycosylation with tropomyosin. The glycosylation degree of tropomyosin and the modification of its allergenic epitopes were further investigated using liquid chromatography−tandem MS. Results revealed that the glycosylation degree of monosaccharide glycosylated tropomyosin significantly higher than that of oligosaccharide glycosylated tropomyosin (P<0.05), and that the number of glycosylation sites on allergenic epitopes of tropomyosin modified by mannooligosaccharide and galactooligosaccharide was 9 and 11, respectively, higher than those of tropomyosin modified by ribose and glucose, which showed 8 and 8, respectively. Results from the BALB/c mice model showed that the mice gavaged with glycosylated tropomyosin exhibited reduced allergic responses compared to those gavaged with tropomyosin, including lower levels of IgE, IgG1, IL-4, mast cell degranulation, histamine, vascular permeability, and intestinal permeability. It was worth noting that the mice gavaged with galactooligosaccharide-glycosylated tropomyosin showed a more pronounced reduction in allergic responses, which was attributed to the fact that galactooligosaccharide modified more allergen epitopes of tropomyosin than ribose, glucose, and mannooligosaccharide. This study provided a theoretical basis for reducing the allergenicity of Antarctic krill tropomyosin and developing hypoallergenic shrimp products.
- Antarctic krill /
- tropomyosin /
- allergenicity reduction /
- glycosylation site /
- allergen epitopes

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食物过敏作为影响人类生活质量的主要健康风险之一，近年来受到越来越多的关注。随着虾类食品的普及以及消费者的青睐，虾类过敏患者的数量逐渐增加^[1]。美国一项人群调查报告显示，约有25%的成人以及20%的儿童被甲壳类食物过敏困扰，其中虾类过敏最为常见，约有3%的成人以及1.3%的儿童受此影响^[2]。在中国大陆52个城市的44156名过敏患者中，虾类过敏人群的患病率高达19.97%^[3]。原肌球蛋白（Tropomyosin, TM）是虾类的主要过敏原^[4]，其过敏机制为：TM的过敏原表位与嗜碱性粒细胞或肥大细胞表面的特异性IgE结合，释放炎症介质，这些介质作用于相应组织和器官，进而引起过敏反应的发生^[5]。早在2008年，Motoyama等^[6]已经证明TM是南极磷虾的主要过敏原。课题组前期研究表明，南极磷虾TM是一种高度保守蛋白，对热、酸碱及胃液消化均具有较强的稳定性，可引起小鼠严重的过敏症状，使小鼠特异性抗体水平升高、肥大细胞脱颗粒率升高、血管通透性增加以及组织病理学改变^[7−8]。然而到目前为止，仍缺乏有效降低南极磷虾致敏性的方法，这将局限南极磷虾加工业的深入发展。

寻找一种绿色高效的技术来降低南极磷虾TM的致敏性至关重要。目前，降低虾类致敏性的方法主要分为四类：化学方法（如：糖基化修饰、酶处理等）、物理方法（如：超声波、热处理等），生物方法（如：发酵、基因工程等）和联合处理方法（如：热压处理等）^[9]。与其他降低致敏性的方法相比，糖基化修饰既不需要复杂的设备，也不需要独特的化学原料。糖基化降低致敏性的主要机制是通过引入糖链来破坏、掩盖或修饰过敏原表位，从而影响食物的致敏性^[10]。Fu等^[11]发现中国对虾TM经还原糖糖基化后致敏性降低了60%。Yang等^[12]观察到，随着糖基化时间的延长，葡萄糖糖基化TM的IgG和IgE结合能力大大降低，BALB/c小鼠的过敏反应减弱。也有研究表明，使用功能性寡糖对秀丽白虾TM进行糖基化可显著降低其致敏性^[13]。然而，很少有关于通过糖基化降低南极磷虾TM致敏性的报道。因此，有必要对其进行进一步的研究。

在本研究中，选用核糖（Ribose，RIB）、葡萄糖（Glucose，GLU）、低聚甘露糖（Mannoseoligosaccharides，MOS）和低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）对南极磷虾TM进行糖基化反应。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、自由氨基含量、二级和三级结构、液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）对TM的糖基化程度、结构变化以及糖链对过敏原表位的修饰情况进行评估。最后通过BALB/c小鼠致敏模型评价糖基化修饰对南极磷虾原肌球蛋白致敏性的影响。本研究为开发低过敏性产品和致敏性消减的研究提供了重要的理论基础。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻南极磷虾糜　大连辽渔海洋食品有限公司；SDS-PAGE试剂盒、二喹啉甲酸（Bicin-choninic Acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、低聚甘露糖（纯度93%）　北京索莱宝科技有限公司；核糖（纯度≥99%）、葡萄糖（纯度≥99.5%）、低聚半乳糖（纯度98%）　上海麦克林生化科技股份有限公司；3～4周龄SPF级雌性BALB/c小鼠（体重20±2 g）　辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001；SteadyPure通用RNA提取试剂盒Ⅱ、EVo M-MLV RT试剂盒（gDNA Clean用于gPCRⅡ）、SYBR Green Premix Pro Tag HS qPCR试剂盒　湖南艾科瑞生物工程有限公司；生物素标记的大鼠抗小鼠IgE、HRP标记的羊抗小鼠的IgG1、HRP标记的羊抗小鼠的IgG2a、链霉亲和素（HRP）、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）　英国abcam公司；小鼠组胺（HIS）ELISA检测试剂盒　上海江莱生物科技有限公司；其他常用化学试剂和药品　天津大茂化学试剂厂。

EASY-nLC 1000 UPLC系统、Q Exactive Plus MS仪　美国赛默飞世尔科技公司；CR22N高速冷冻离心机、F-2700荧光分光光度计　日本Hitachi公司；MF-ChemiBIS 2.0凝胶成像系统　以色列DNR公司；Infinite M200多功能酶标仪　瑞士Tecan公司；J-1500圆二色光谱仪　日本Jasco公司；T100 Thermal Cycler PCR自动系列化分析仪　北京楚齐仪表有限责任公司；NanoDrop One超微量分光光度计　济南爱来宝仪器设备有限公司；qTOWER2.2荧光定量PCR仪　耶拿分析仪器（北京）有限公司；PB-10 pH计　赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糖基化TM的制备

参考Wang等^[7]的方法进行南极磷虾TM的提取纯化，所有提取纯化步骤均在4 ℃下进行。首先将南极磷虾肉按1:10的质量体积比与0.02 mol/L磷酸盐缓冲液混合匀浆，混合物以8000×g的转速离心10 min，将此步骤重复4次。其次将沉淀按1:2的质量体积比与50%丙酮混合，搅拌4 h后，将混合物以10000×g的转速离心15 min，将此步骤重复2次。自然风干24 h后获得丙酮粉。按照1:10的质量体积比加入0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5，含1 mol/L KCl、10 mmol/L β-巯基乙醇）抽提过夜，抽提液以20000×g的速度离心20 min。将上清液的pH调至4.5，使用1 mol/L HCl溶液进行等电沉淀，然后以10000×g的速度离心15 min。将沉淀溶解于适量的0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中，向溶液中缓慢添加41%~60%硫酸铵进行分段盐析，静置4 h后以10000×g的速度离心15 min。将沉淀复溶于适量0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中，然后在沸水浴中加热10 min，待冷却至室温后以20000×g的速度离心10 min。最后，收集上清液进行冻干，并存放于−80 ℃保存备用。参考Bai等^[14]的研究方法进行糖基化TM的制备。将冻干TM溶解在20 mmol/L PBS（pH7.5）中，然后将TM溶液与RIB、GLU、MOS以及GOS混合，分别命名为TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS，调整TM和糖液浓度分别为5×10⁻³ mmol/L和4 mmol/L，将糖液和TM的混合物在100 ℃下反应60 min后，立即冰浴结束反应，并使用超纯水透析48 h（10 kDa）以除去多余的糖。而后冷冻干燥，于−20 ℃保存。

1.2.2 SDS-PAGE实验

实验选用12%分离胶以及4%浓缩胶。将混合物浓度调整到1 mg/mL，分别与上样缓冲液按4:1（V/V）混合均匀，并于100 ℃加热5 min。Marker上样5 μL，其余各样品均上样10 μL，浓缩胶在80 V电压下持续30 min，分离胶在100 V电压下持续180 min，结束后取出凝胶，用R-250染色2 h后，使用脱色液洗脱至各电泳条带清晰为止，最后利用凝胶成像系统扫描拍照。

1.2.3 自由氨基含量的测定

配制邻苯二甲醛（OPA）溶液和L-赖氨酸标准溶液，将L-赖氨酸标准溶液进行梯度稀释，使用酶标仪测定波长340 nm处的吸光度，并绘制标准曲线。然后将20 μL上述得到的TM及糖基化TM样品（1 mg/mL）和200 μL OPA溶液（0.8 mg/mL）混合后，使用酶标仪测定波长340 nm处的吸光值。将TM值设为100%自由氨基含量，计算各糖基化TM样品的自由氨基含量。

1.2.4 圆二色光谱（Circular Dichroism Spectroscopy，CD）分析

使用圆二色光谱仪对TM以及糖基化TM的二级结构进行测定。扫描波长为190~240 nm，带宽1 nm，扫描速度为50 nm/min，响应时间为2 s。实验在室温下进行。连续测定3次。使用Yang方程计算TM的二级结构含量^[15]。

1.2.5 荧光光谱分析

使用荧光分光光度计测定TM及糖基化TM样品的荧光强度。将样品溶于超纯水中，调整浓度到0.05 mg/mL，激发波长285 nm，激发发射狭缝宽度为5 nm，扫描速度为1500 nm/min。采集250~400 nm的发射光谱。

1.2.6 液相色谱质谱联用鉴定

TM及糖基化TM样品通过LC-MS/MS与在线nanaport离子源进行分析。通过Orbitrap Exploris 480质谱仪与EASY nanoLC 1200系统串联进行检测，结果由PEAKS Studio 10.6版本评估。样品预处理及其他的实验步骤均按照Xin等^[16]的方法完成。在TM原始序列的基础上，通过SWISS-MODEL对三维结构进行了同源建模（https://swissmodel.expasy.org/）。通过PyMOL软件（San Carlos，California）将过敏原表位和位于过敏原表位上的糖基化位点映射到TM的3D结构上。为了对每个位点的糖基化程度进行更全面的比较，使用以下公式计算每个位点的糖基化程度（Degree of Site-specific Glycosylation，DSP）^[17]：

$\rm \text{DSP}=\frac{{{\sum }_{i=1}^{n}\text{I}}_{\text{i}}}{{{\sum }_{i=1}^{n}\text{I}}_{\text{i}}+{{\sum }_{k=1}^{n}\text{I}}_{\text{k}}}$

(1)

式中，I_i是含有一定糖基化位点的糖基化肽的强度；I_k是包含相应氨基酸位点的未糖基化肽的强度；i和k分别是含有相应氨基酸位点的糖基化和未糖化肽的数目。

1.2.7 动物实验方案

基于课题组前期研究^[7]，BALB/c小鼠致敏模型实验方案设计如图1所示。将小鼠随机分为6组，每组10只，在适应饲养一周后，分别在第7、14、21、28和35 d对阴性对照组（CON）小鼠灌胃200 μL生理盐水，对阳性对照组小鼠灌胃200 μg TM（溶于200 μL生理盐水），实验组小鼠分别灌胃200 μg相应蛋白（溶于200 μL生理盐水），分别命名为TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS以及TM-GOS组。第49 d，对小鼠进行眼内眦静脉采血，于4 ℃和1000×g下离心20 min取上层血清。在第50 d，经口灌胃800 μg相应蛋白进行大剂量刺激，测量耳温并评估小鼠的过敏症状^[18]。大剂量刺激20 min后眼内眦静脉采血并置于含有EDTA-K₂抗凝剂的离心管中，以5000×g、4 ℃离心10 min获得血浆，并保存在−80 ℃备用，并将小鼠的脏器保存于−80 ℃进行后续实验。动物实验灌胃剂量及灌胃周期均根据课题组前期研究确定。动物实验由大连工业大学实验动物伦理委员会批准（方案编号：DLPU2022015）。动物实验方案中的图形均使用BioRender（www.BioRender.com）绘制。BALB/c小鼠致敏模型实验方案见图1.

图 1 BALB/c小鼠致敏模型实验方案

Figure 1. Scheme of BALB/c mice model

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1.2.8 致敏性评估

1.2.8.1 过敏症状评分和体温测定

测量大刺激前以及大刺激20 min后的体温变化，并按照如下细则评价过敏症状，0分：无症状；1分：鼻子、嘴巴和头部附近反复抓挠；2分：眼睛和嘴巴周围肿胀，伴有毛发竖立、活动减少和呼吸频率增加；3分：喘息，呼吸困难，嘴巴周围颜色发绀；4分：失去意识，震颤或痉挛；5分：抽搐至休克、死亡。

1.2.8.2 特异性抗体水平测定

在致敏阶段第49 d，从CON、TM、TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS以及TM-GOS组小鼠眼眦采集血液样本，并在5000 r/min条件下离心并收集血清。通过间接ELISA法测定小鼠血清中特异性IgE、IgG1和IgG2a水平。参照张自业^[15]的方法进行测试。不同的是，在特异性IgG1、IgG2a水平的检测中，本文选用HRP标记的羊抗小鼠IgG1/IgG2a二抗的稀释比例为1:2000/1:8000；在特异性IgE水平的检测中，本文选用的生物素标记的大鼠抗小鼠IgE稀释比例为1:1000，HRP标记的链霉亲和素稀释比例为1:2000。

1.2.8.3 肥大细胞脱颗粒率测定

将每组小鼠的脾脏组织固定在4%多聚甲醛中，然后进行石蜡切片处理。脱蜡后，通过甲苯胺蓝染色法观察脾脏肥大细胞的形态学变化，肥大细胞脱颗粒率计算如下：

$\text{肥大细胞脱颗粒率}\text{(\%)}=\frac{{\text{D}}_{\text{0}}}{{\text{D}}_{\text{1}}}\times 100$

(2)

其中D₀表示脱颗粒的肥大细胞的数量，D₁表示每个切片中肥大细胞的总数。

1.2.8.4 血浆组胺测定

采用ELISA法测定小鼠血浆组胺含量。将小鼠血浆稀释3倍，根据小鼠组胺（HIS）酶联免疫吸附测定试剂盒进行组胺的检测，测试过程均按照试剂盒说明书进行。

1.2.8.5 血管通透性测定

根据Kumar等^[19]的方法，通过测量小鼠腹腔白蛋白水平来评估血管通透性。具体操作如下：大剂量刺激40 min后，向小鼠腹腔内注射3 mL含有10 mmol/L EDTA的PBS溶液，按摩腹部1 min，并吸取腹膜液。将腹膜液在4 ℃、600×g的条件下离心6 min，吸取上清液。上清液中的白蛋白含量通过BCA蛋白浓度测定试剂盒进行检测。根据BSA标准曲线计算每个样品的白蛋白浓度。

1.2.8.6 细胞因子的测定

小鼠脾脏细胞因子的检测分为RNA提取、逆转录以及qPCR反应三部分，操作步骤分别遵循SteadyPure通用型RNA提取试剂盒II、Evo M-MLV反转录试剂盒II以及SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒说明书的步骤。其中β-actin的正向引物序列为CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC（5’到3’，下同），反向引物序列为ATGGAGCCACCGATCCACA；IL-4的正向引物序列为ACGGAGATGGATGTGCCAAAC，反向引物序列为AGCACCTTGGAAGCCCTACAGA；IFN-γ的正向引物序列为CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA，反向引物序列为GTTGCTGATGGCCTGATTGTC。

1.2.8.7 肠壁通透性测定

小鼠肠壁通透性参考Zaki等^[20]的方法，操作如下：大刺激后，每组随机选择三只小鼠禁食4 h，之后对其灌胃60 mg/kg的FITC-葡聚糖。4 h后对小鼠进行眼内眦静脉采血，收集血浆，并将小鼠安乐死。使用Infinite M200多功能酶标仪测定吸光度（激发波长485 nm、发射波长535 nm）。用磷酸盐缓冲液将FITC-葡聚糖标准品进行梯度稀释，测定吸光度并绘制标准曲线，据此计算血清中FITC-葡聚糖的含量。

1.2.8.8 组织病理学分析

按照1.2.8.3的方法将小鼠脾脏和空肠组织进行固定、切片，脱蜡后，通过阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色法（Alcian blue periodic acid schiff，AB-PAS）检测杯状细胞的数量，通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining，H&E）观察脾脏巨核细胞以及空肠的形态。

1.3 数据处理

每组实验至少重复3次，通过GraphPad Prism（8.3.0版，GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）软件绘制图形，采用SPSS Statistics 19软件对实验结果进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2. 结果与分析

2.1 糖基化TM结构的表征

通过SDS-PAGE对糖基化后TM的分子量变化进行检测，如图2a所示。经不同糖糖基化后，TM的蛋白条带均向上出现了不同程度的偏移：偏移程度为TM-GOS>TM-MOS>TM-GLU>TM-RIB，且两种低聚糖的分子量偏移明显大于两种单糖。蛋白质中自由氨基的来源主要包括赖氨酸残基、精氨酸残基以及N-末端的游离氨基，在糖基化过程中，原肌球蛋白上的ε-氨基与糖类的羰基会发生反应，导致糖基化后自由氨基含量下降^[21]。自由氨基含量如图2b所示，TM经GLU、RIB、GOS以及MOS糖基化后，自由氨基含量分别下降了83.79%、85.27%、62.38%以及63.33%，其趋势与图2a的结果一致。低聚糖糖基化TM的自由氨基含量降低较少，可能是由于在一定的分子量范围内，分子量小的糖分子受到的空间阻力较小，更容易与TM发生糖基化反应，而分子量越大的糖分子受到的空间阻力较大，更难与TM发生糖基化反应^[22]。

图 2 糖基化程度分析

注：a：SDS-PAGE分析；b：自由氨基含量；不同字母表示差异显著（P<0.05），图5~图8同。

Figure 2. Glycosylation degree analysis

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通过圆二色光谱仪对TM及糖基化TM样品的二级结构进行表征，如图3a~图3b所示。TM在209 nm和223 nm处呈现两个负峰，在193 nm处呈现最大正峰，与α-螺旋的CD光谱一致，这表明TM中存在α-螺旋。根据特征峰的变化趋势，发现经糖基化后α-螺旋的含量随着峰值的变化下降了25%以上，而β-折叠的含量增加，TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS、TM-GOS的β-折叠含量分别从原来的2.23%增加到了18.10%、15.67%、25.17%、32.10%。这些结果表明糖基化反应是通过拉伸α-螺旋并解开螺旋结构，使其转换为β-折叠，从而引起了TM二级结构的改变。

图 3 糖基化后TM二级、三级结构分析

Figure 3. Secondary and tertiary structure analysis of TM after glycosylation

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荧光光谱主要是靠蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸吸收能量并发射荧光进行检测^[23]。这些氨基酸残基的微环境能明显改变其荧光强度。通过荧光光谱对TM及糖基化TM样品的三级结构进行分析，如图3c所示。与TM相比，糖基化处理降低了TM的荧光强度，其中TM-RIB的荧光强度从TM的9603降低到了2703，TM-GLU降低到了5067，这可能是因为糖基化反应改变了TM的构象，使TM荧光发色团暴露在极性环境，与极性溶剂发生了荧光猝灭，导致荧光强度降低^[24]。而TM-MOS以及TM-GOS的荧光强度降低较少，这表明低聚糖糖基化修饰对TM芳香族氨基酸微环境的影响较小。

2.2 糖基化修饰位点分析

通过以上研究我们初步确定了TM与糖类的结合引起了TM分子量、二级以及三级结构的改变。为了进一步的验证，使用LC-MS/MS对样品的糖基化程度以及糖基化位点进行了分析。每个位点的糖基化程度（Degree of Site-specific Glycosylation，DSP）是分析蛋白质样品糖基化程度的一个重要指标^[17]，通过糖基化位点所在肽段的强度之和与相应氨基酸所在肽段强度之和的比值确定。DSP值越高，糖基化肽段的比例越大^[25]。在前面的研究中，已经通过自由氨基含量证明了不同样品的糖基化程度，在此进一步对糖基化位点的DSP进行分析。从表1中可以看到，糖基化位点K128、K5在TM-RIB中的反应活性较高，DSP值分别为62.12%、44.32%，同时可以看出K128、K205是TM-GLU中反应活性较高的两个糖基化位点，DSP值分别为61.57%、29.87%。从整体上来看，TM-MOS以及TM-GOS糖基化位点的DSP值都低于TM-RIB和TM-GLU。例如TM-MOS中反应活性最高的糖基化位点DSP值为28.5%，而TM-GOS中活性最高糖基化位点的DSP值仅为12.23%。这些结果表明，不同糖基化位点的糖基化程度都有一定的差异性，且糖的类型会显著的影响糖基化位点的糖基化程度^[26]。在四个样品中，K30都发生了糖基化修饰，但其DSP值各不相同，表现出TM-RIB>TM-GLU>TM-MOS>TM-GOS的趋势。同样，在位点K112、K161上也发现了相似的结果。总体而言，TM-RIB中糖基化位点的反应活性高于TM-GLU，其次是TM-MOS、TM-GOS。这与图2分子量变化以及自由氨基含量表现出相似的结果。

表 1 糖基化TM 中鉴定出的糖化肽段和相关的质谱信息

Table 1. Identified glycated peptides in glycated TM and related mass information

原始肽段	Δppm	位置	序列	糖基化肽段	DSP （%）	糖基化位点
TM-RIB
182.615⁺²	0.5	1-7	MDAIKKK.M	527.2799⁺²	44.32	K5
266.3788⁺²	1	12-21	M.KMEKDSAMDR.A	694.8075⁺²	2.08	K12
211.1044⁺³	2.8	16-35	K.DSAMDRADALEAQNKETNAK.A	795.3632⁺³	27.50	K30
112.9972⁺⁴	8.1	31-48	K.ETNAKAEKADDEVHNLQK.R	584.0288⁺⁴	5.15	K35
104.8829⁺⁴	9.7	46-66	N.LQKRLQTLENDLDQVSEALLK.A	743.6416⁺⁴	6.67	K48
155.1536⁺⁴	−3.4	50-76	R.LQTLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	812.6743⁺⁴	2.60	K66
861.4561⁺³	−0.5	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	969.4928⁺³	3.54	K74
867.7931⁺³	8	69-90	N.TQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	911.8064⁺³	13.26	K76
143.5285⁺³	6	77-91	K.ALQNAEGEVAALNRR.I	592.6354⁺³	5.29	R90
313.1854⁺²	5.4	91-101	R.RIQLLEEDLER.S	788.4208⁺²	2.09	R91
107.8716⁺⁴	−8.1	91-105	R.RIQLLEEDLERSEER.L	623.5463⁺⁴	2.14	R101
244.5716⁺³	0.9	104-125	E.ERLNTATTKLAEASQAADESER.M	925.7748⁺³	20.18	K112
165.0868⁺³	−0.2	113-128	K.LAEASQAADESERMRK.V	657.3105⁺³	4.03	R125
149.3535⁺²	−0.1	128-133	R.KVLENR.S	460.757⁺²	62.12	K128
157.0946⁺³	4.9	133-149	N.RSLLDEERMDALENQLK.E	795.3937⁺³	3.02	R133
217.1165⁺³	2.7	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	813.3994⁺³	11.54	K149
404.2191⁺²	2.1	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	970.4882⁺²	23.30	K161
125.5221⁺³	4.2	168-182	R.KLAMVEADLERAEER.A	700.6764⁺³	3.07	K168
237.5695⁺³	−2.9	179-198	R.AEERAEAGENKIVELEEELR.V	874.7585⁺³	1.07	R182
689.8742⁺⁴	3.2	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.3867⁺⁴	1.08	R198
832.4419⁺²	3	199-213	R.VVGNNLKSLEVSEEK.A	904.4669⁺²	20.12	K205
250.8907⁺²	−0.7	239-244	R.AEFAER.S	663.8314⁺²	11.28	R244
TM-GLU
182.615⁺²	0.5	45298	MDAIKKK.M	527.2799⁺²	24.32	K5
266.3788⁺²	1	45647	M.KMEKDSAMDR.A	694.8075⁺²	3.60	K12
211.1044⁺³	2.8	16-35	K.DSAMDRADALEAQNKETNAK.A	795.3632⁺³	26.84	K30
193.9922⁺³	1.2	31-48	K.ETNAKAEKADDEVHNLQK.R	744.0267⁺³	1.13	K35
117.3258⁺⁴	6.1	45-66	H.NLQKRLQTLENDLDQVSEALLK.A	793.4133⁺⁴	0.69	K48
195.8925⁺³	−3.9	49-66	K.RLQTLENDLDQVSEALLK.A	749.7274⁺³	7.99	R49
752.6395⁺⁴	1.6	52-76	Q.TLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	800.6545⁺⁴	1.43	K66
764.9107⁺⁴	5.4	50-76	R.LQTLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	845.9382⁺⁴	11.82	K74
605.3301⁺²	0.4	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	1372.7102⁺²	12.52	K76
143.5285⁺³	6	77-91	K.ALQNAEGEVAALNRR.I	592.6354⁺³	8.11	R90
313.1854⁺²	5.3	91-101	R.RIQLLEEDLER.S	788.4208⁺²	1.03	R91
630.5574⁺²	2.8	103-125	S.EERLNTATTKLAEASQAADESER.M	1453.1748⁺²	4.01	R105
244.5716⁺³	0.9	104-125	E.ERLNTATTKLAEASQAADESER.M	925.7748⁺³	18.22	K112
165.0868⁺³	−0.2	113-128	K.LAEASQAADESERMRK.V	657.3105⁺³	3.23	R125
149.3535⁺²	−0.1	128-133	R.KVLENR.S	460.757⁺²	61.57	K128
157.0946⁺³	4.8	133-149	N.RSLLDEERMDALENQLK.E	795.3937⁺³	2.02	R133
217.1165⁺³	2.7	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	813.3994⁺³	6.52	K149
404.2191⁺²	2.1	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	970.4882⁺²	21.59	K161
125.5221⁺³	4.2	168-182	R.KLAMVEADLERAEER.A	700.6764⁺³	1.51	K168
71.6105⁺⁴	7.3	181-198	E.ERAEAGENKIVELEEELR.V	610.5518⁺⁴	0.55	R182
689.8774⁺⁴	7.5	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.3899⁺⁴	1.05	R198
848.4417⁺³	−6.7	192-213	V.ELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	902.4584⁺³	29.87	K205
250.8907⁺²	−0.7	239-248	R.AEFAERSVQK.L	663.8314⁺²	2.23	R244
TM-MOS
469.4693⁺²	0.2	13-30	K.MEKDSAMDRADALEAQNK.E	1100.9886⁺²	1.13	K15
211.1026⁺³	−1.9	16-35	K.DSAMDRADALEAQNKETNAK.A	795.3577⁺³	3.14	K30
546.5503⁺²	6.2	48-66	Q.KRLQTLENDLDQVSEALLK.A	1285.1605⁺²	1.51	K48
155.1531⁺⁴	−3.6	50-76	R.LQTLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	812.6723⁺⁴	3.94	K66
861.4575⁺³	3.1	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	969.4942⁺³	0.47	K74
843.7838⁺³	7.9	69-90	N.TQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	897.8005⁺³	12.32	K76
143.3081⁺³	−0.4	77-91	K.ALQNAEGEVAALNRR.I	591.9742⁺³	6.23	R90
313.1845⁺²	5.3	91-101	R.RIQLLEEDLER.S	788.4189⁺²	3.01	R91
622.8331⁺⁴	7.2	92-112	R.IQLLEEDLERSEERLNTATTK.L	663.3456⁺⁴	1.15	R101
309.8150⁺³	1.3	104-125	E.ERLNTATTKLAEASQAADESER.M	929.4451⁺³	1.07	R105
293.3614⁺³	−2.5	102-125	R.SEERLNTATTKLAEASQAADESER.M	1012.1243⁺³	5.43	K112
149.0778⁺³	6.7	113-127	K.LAEASQAADESERMR.K	609.2833⁺³	1.03	R125
149.3526⁺²	−2	128-133	R.KVLENR.S	460.7551⁺²	20.39	K128
232.4556⁺³	8.8	133-149	N.RSLLDEERMDALENQLK.E	859.4167⁺³	1.40	R133
215.4482⁺³	3.6	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	808.3946⁺³	0.42	K149
145.7494⁺³	−0.6	140-152	E.RMDALENQLKEAR.L	569.2883⁺³	4.49	R140
80.9237⁺⁴	−2.1	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	485.7446⁺⁴	9.68	K161
95.3089⁺⁴	3.5	179-198	R.AEERAEAGENKIVELEEELR.V	645.3157⁺⁴	0.37	R182、K189
689.6251⁺⁴	1.2	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.1376⁺⁴	0.4	R198
697.8742⁺⁴	9.9	191-213	I.VELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.8842⁺⁴	4.47	K205
370.689⁺²	7.7	206-217	K.SLEVSEEKASSR.E	873.4179⁺²	28.50	R217
250.8903⁺²	0.3	239-248	R.AEFAERSVQK.L	663.8306⁺²	2.11	R244
TM-GOS
262.3788⁺²	−2.5	45647	M.KMEKDSAMDR.S	686.8076⁺²	1.33	K12
230.3559⁺²	0.1	13-21	K.MEKDSAMDR.S	622.7618⁺²	3.17	K15
209.769⁺³	−0.5	16-35	K.DSAMDRSDALEAQNKETNAK.A	791.3569⁺³	2.54	K30
339.42575⁺²	−0.2	22-35	R.SDALEAQNKETNAK.A	840.9015⁺²	12.23	K35
110.2903⁺³	−0.6	36-49	K.ADKADDEVHNLQKR.L	654.981⁺³	1.27	K38
203.4608⁺³	7.2	48-66	Q.KRLQTLENDLDQVSEALLK.A	964.4925⁺³	0.11	K48
95.1232⁺⁴	8.5	61-76	V.SEALLKANTQLVEKDK.A	572.5529⁺⁴	3.32	K66
107.0915⁺³	1	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	969.4944⁺³	3.32	K74、K76
115.5715⁺⁴	9.7	85-101	E.VAALNRRIQLLEEDLER.S	654.3459⁺⁴	5.07	R91
235.9003⁺³	1	102-125	R.SEERLNTATTKLAEASQAADESER.M	1031.8108⁺³	3.43	K112
375.6806⁺²	−6.8	113-127	K.LAEASQAADESERMR.K	913.4111⁺²	0.49	R125
108.8373⁺²	1.6	128-133	R.KVLENR.S	541.7845⁺²	10.04	K128
215.339⁺³	2	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	808.0671⁺³	1.68	K149
80.9242⁺⁴	0	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	485.7467⁺⁴	7.15	R160
179.8537⁺²	0.1	161-167	R.KYDEVAR.K	521.7574⁺²	8.11	K161
241.8909⁺²	−3.1	168-178	R.KLAMVEADLER.A	807.8918⁺²	0.27	K168
919.8301⁺³	8.9	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	973.8468⁺³	0.08	R198
548.9661⁺³	−1.8	199-213	R.VVGNNLKSLEVSEEK.A	602.9828⁺³	2.21	K205
307.1659⁺²	1.9	206-217	K.SLEVSEEKANQR.E	776.3817⁺²	1.08	K213
142.7491⁺³	1	214-226	K.ANQREEAYKEQIK.H	590.2972⁺³	7.79	K222
398.2254⁺²	7.2	218-231	R.EEAYKEQIKHLTHK.L	958.5007⁺²	8.22	K226
130.2993⁺³	9.3	237-248	E.ARAEFAERSVQK.L	582.958⁺³	3.11	R238
448.9975⁺²	0.6	249-264	K.LQKEVDRLEDELVNEK.E	1060.0449⁺²	9.14	K251
169.205⁺³	−0.4	252-266	K.EVDRLEDELVNEKEK.Y	669.6649⁺³	6.70	K264
注：标有灰色阴影的为位于过敏原表位上的糖基化位点。

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表位是过敏原的结构片段，决定了免疫系统对过敏原的识别能力^[27]。课题组前期研究得到了8条南极磷虾TM潜在的过敏表位肽段^[7]，分别为aa24-44（EAQNKETNAKADKADDEVH）、aa98-107（DLERSEERLN）、aa111-125（TKLAEASQAADESER）、aa157-164（EADRKYDE）、aa177-186（ERAEERAEAG）、aa209-225（VSEEKANQREEAYKEQI）、aa244-255（RSVQKLQKEVDR）以及aa261-270（VNEKEKYKGI）。糖基化反应通过修饰过敏原表位引起致敏性降低，而这种修饰效果受不同种类糖的影响^[28]。将TM的抗原表位与四种糖基化产物（TM-RIB，TM-GLU，TM-MOS，TM-GOS）的糖基化位点联合分析，得出了位于过敏原表位的糖基化位点，其三维图如图4所示。发现赖氨酸的数量远大于精氨酸的数量，这说明赖氨酸是南极磷虾TM的主要糖基化位点，这与Zhang等^[29]的研究结果一致。TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS以及TM-GOS位于过敏原表位上的糖基化位点分别为8、8、9和11个。TM-GOS位于过敏原表位的糖基化位点数量最多，占总糖基化位点的40%以上，其次是TM-MOS，占总糖基化位点的37%。Yang等^[30]采用质谱技术研究了脉冲电场结合糖基化处理β-乳球蛋白的糖基化位点，发现其糖基化位点与其IgE、IgG结合能力之间存在着一定的联系。本研究初步推测糖链对TM过敏原表位的修饰可降低TM的致敏性。为了验证此观点，本文通过动物实验对其进行进一步的探究。

图 4 修饰过敏原表位的三维图谱

注：黄色阴影为预测的线性表位结果，粉色标记为位于过敏原表位上的糖基化位点。a：TM-RIB；b：TM-GLU；c：TM-MOS；d：TM-GOS。

Figure 4. Modified linear epitope based on 3D structures

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2.3 小鼠过敏症状分析

过敏反应和体温变化通常与身体的免疫反应有关，食物过敏反应主要有抓耳挠头、呼吸困难、腹泻、肌肉痉挛、休克、甚至死亡等症状^[31]。第50 d大剂量刺激后小鼠的体温变化如图5a所示，CON组小鼠的体温处于正常水平。与CON组小鼠相比，TM组小鼠的体温显著降低（P<0.05），平均降低了1.11 ℃。与TM组小鼠相比，糖基化TM组小鼠体温降幅明显减小（P<0.05）。TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS组小鼠的体温平均降低了0.65、0.46、0.30和0.21 ℃。小鼠的过敏症状评分如图5b所示，CON组小鼠没有明显的过敏症状。与CON组小鼠相比，TM组的大多数小鼠都出现口腔周围发绀、呼吸困难、身体震颤和抽搐等症状。与TM组小鼠相比，受试糖基化TM能够显著减轻小鼠的过敏症状。此外，受试低聚糖糖基化TM的小鼠仅表现出活力下降、眼睛和嘴巴周围浮肿等过敏症状。从小鼠体温变化以及症状评分初步看出，糖基化TM能够降低小鼠因过敏引起的症状以及体温降低现象。

图 5 小鼠过敏症状分析

Figure 5. Analysis of allergic symptoms in mice

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2.4 特异性IgE、IgG1和IgG2a的测定

当小鼠暴露于过敏原蛋白时，过敏原蛋白经消化后被吸收，通过血液输送到免疫器官，引起抗体的分泌^[32]。IgE和IgG1是Th2型细胞介导的特异性抗体^[7]。大多数食物过敏反应是由IgE介导的，其增加是发生过敏反应的一个明显特征^[33]。IgG1是人体免疫系统中最常见的IgG亚型之一^[34]。血清中特异性IgE和IgG1水平的升高是指示过敏的重要标志^[18]。IgG2a由Th1型细胞介导的免疫反应产生^[7]，Th1型细胞可以调节Th2型细胞的活性，而Th2型细胞会抑制Th1型细胞的活性，造成Th2/Th1失衡，提示过敏反应的发生^[35]。如图6a~图6c所示，CON组小鼠的特异性抗体水平始终保持在较低水平。与CON组小鼠相比，TM组和糖基化TM组小鼠的特异性抗体水平显著升高（P<0.05）。与TM组小鼠相比，受试糖基化TM的小鼠血清中特异性IgE和IgG1水平显著降低（P<0.05），而IgG2a水平显著升高（P<0.05）。受试低聚糖糖基化TM小鼠的特异性IgE和IgG1水平显著低于受试单糖糖基化TM的小鼠，而特异性IgG2a水平显著高于受试单糖糖基化TM的小鼠（P<0.05）。这些结果表明，受试糖基化TM能够降低小鼠血清中特异性IgE和IgG1的含量，并促进了特异性IgG2a的产生，导致Th2型反应减弱。而低聚糖糖基化TM在降低致敏性方面有较好的效果，这与上述糖基化原肌球蛋白被修饰的过敏原表位数量结果呈现了一致的趋势。以往的研究发现，在一定的分子量范围内，分子量较大的糖一旦与过敏原蛋白发生反应，糖蛋白的糖链可通过分子运动遮蔽抗原表位，起到降低致敏性的作用^[15]。在一项对葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖三糖、麦芽糖戊二糖和麦芽糖七糖糖基化虾TM致敏性变化的研究中，发现分子量较大的糖（麦芽七糖）可显著破坏或屏蔽TM表位，具有更明显的抑制致敏性作用^[36]。

图 6 小鼠血清中特异性抗体水平

Figure 6. Levels of serum specific antibodies in mice

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2.5 肥大细胞脱颗粒率以及炎症介质的释放

过敏原诱导IgE的产生并与抗体交叉结合，导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放化学介质^[33]，其中组胺是一种关键的过敏介质^[37]。机体内肥大细胞释放组胺通常是引起食物过敏的直接原因^[38−40]。用光学显微镜观察6组小鼠脾脏肥大细胞脱颗粒情况，如图7a所示。CON组小鼠脾脏肥大细胞形态完整，而TM组小鼠脾脏中绝大多数肥大细胞的细胞膜破裂，周围散布着大量细胞介质，表明肥大细胞发生了脱颗粒。与TM组小鼠相比，受试糖基化TM后，小鼠脾脏肥大细胞脱颗粒现象明显减轻，TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS组小鼠的肥大细胞脱颗粒率分别降低了23.52%、28.91%、50.20%和51.66%（P<0.05，图7b）。值得注意的是，受试低聚糖糖基化TM小鼠的肥大细胞脱颗粒率显著低于受试单糖糖基化TM的小鼠（P<0.05）。通过采集小鼠血浆对其组胺含量进行测定，CON组小鼠的组胺水平较低（图7c）。与CON组小鼠相比，TM组小鼠的组胺水平显著升高（P<0.05）。与TM组小鼠相比，TM-RIB和TM-GLU组小鼠的血浆组胺水平分别显著降低了23.53%、24.25%（P<0.05），受试低聚糖糖基化TM后，小鼠组胺水平下降更为显著，TM-MOS和TM-GOS组小鼠的血浆组胺水平分别显著降低了45.01%和48.33%（P<0.0001）。这与肥大细胞脱颗粒水平得到了同样的结果。表明糖基化TM可以降低肥大细胞的脱颗粒率和炎症因子的释放，为糖基化修饰能够消减TM致敏性提供了进一步的依据。

图 7 肥大细胞脱颗粒以及炎症介质的检测

注：红色箭头表示脱颗粒肥大细胞，黑色箭头表示非脱颗粒肥大细胞。A：肥大细胞脱颗粒形态（40×），比例尺：50 μm；B：肥大细胞脱颗粒的形态计量学分析；C：血浆组胺水平；D：腹腔白蛋白水平；E：IL-4的mRNA的表达水平；F：IFN-γ的mRNA的表达水平。

Figure 7. Degranulation of mast cells and release of inflammatory mediators

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由于全身性过敏反应是由血管通透性增加引起的，因此可以通过测定大剂量刺激后小鼠的血管通透性来评估小鼠的全身性过敏症状^[7]。如图7d所示，CON组小鼠的腹腔白蛋白保持在较低水平。与CON组小鼠相比，TM组小鼠的腹腔白蛋白水平显著升高（P<0.05）。与TM组小鼠相比，TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS组小鼠的腹腔白蛋白水平分别下降了9.27%、20.33%、34.64%和36.27%，明显低于TM组小鼠（P<0.05）。而低聚糖糖基化TM组小鼠的腹腔白蛋白水平显著低于单糖糖基化TM组小鼠（P<0.05）。因此，我们初步认为，糖基化TM可以减少TM引起的小鼠严重全身过敏反应，并减轻血管通透性的增加，低聚糖糖基化TM在这一方面具有更显著的效果。张自业^[15]也在研究中发现，受试不同类型糖糖基化的TM后，小鼠的血管通透性均有不同程度的减弱，而受试分子量相对较大的糖糖基化TM的小鼠减弱效果最明显。

脾脏是免疫系统中最大的器官，检测小鼠脾脏mRNA细胞因子的相对表达量可以揭示全身过敏反应对机体的影响^[41]。IL-4和IFN-γ是重要的Th2和Th1型细胞因子^[42]，可以用来反映食物过敏中的Th2/Th1细胞亚群免疫应答的失衡。小鼠脾脏中mRNA的IL-4相对表达量如图7e所示。与CON组小鼠相比，TM组小鼠IL-4的相对表达水平显著升高（P<0.05）。与TM组小鼠相比，TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS组小鼠的IL-4相对表达水平分别显著降低了13.15%、23.44%、41.22%和44.45%（P<0.05）。值得注意的是，与受试单糖糖基化TM的小鼠相比，受试低聚糖糖基化TM的小鼠脾脏中的IL-4水平显著降低（P<0.05）。IFN-γ的相对表达水平如图7f所示。与CON组小鼠相比，TM组小鼠IFN-γ的相对表达显著增加（P<0.05）。与TM组小鼠相比，TM-RIB、TM-GLU和TM-MOS组小鼠脾脏分泌的IFN-γ水平增加，但差异不显著（P>0.05），而TM-GOS组小鼠与TM组小鼠之间的IFN-γ相对表达水平有显著性差异（P<0.05）。这些结果表明，糖基化TM可以通过抑制Th2型细胞因子和促进Th1型细胞因子的表达来减少过敏反应，而低聚糖糖基化TM则表现出更明显的效果。这种现象可能是由于低聚糖的分子量较大，糖基化后附着在TM上较长的糖链，进而导致过敏原表位被修饰。Zhang等^[43]用多种寡糖与秀丽白虾TM发生糖基化反应，发现经糖链较长的麦芽五糖糖基化TM后，受试小鼠过敏反应明显降低，原因是麦芽五糖较长的糖链会占据更多的TM表面空间，从而实现对TM过敏原表位的修饰。

2.6 肠壁通透性分析

过敏原会诱导肠壁通透性增加，使其穿透肠道屏障，刺激粘膜下的免疫系统，引发过敏反应或自身免疫性疾病的发生^[44]。杯状细胞是一种特殊的肠上皮细胞，其主要功能是分泌粘液，保护肠黏膜免受外界的刺激和损伤^[45]。本研究用AB-PAS染色法分析空肠杯状细胞数量。如图8a~图8b所示，CON组小鼠的杯状细胞数量较多，且均匀分布在肠绒毛上。TM组小鼠的杯状细胞数量明显减少（P<0.05）。与TM组小鼠相比，受试糖基化TM后，小鼠空肠杯状细胞数量显著增加。TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS组小鼠的杯状细胞数量分别增加了86.52%（P<0.05）、97.87%（P<0.05）、182.98%（P<0.001）和195.04%（P<0.001），这可能是因为低聚糖对肠道屏障有一定的保护作用。Valentina等^[46]和Dev等^[47]发现MOS可以改变肠道微生物群的组成，提高肠道屏障的完整性，GOS可以促进肠道微生物群中双歧杆菌的增殖，促进肠道短链脂肪酸的合成。因此，低聚糖可能通过多种方式保护了肠道屏障，减轻了过敏原对肠道屏障造成的损伤。

图 8 糖基化修饰对小鼠肠道屏障的影响

注：A：小鼠空肠AB-PAS染色（20×），比例尺：100 μm；B：杯状细胞数量分析；C：FITC-葡聚糖水平变化。

Figure 8. Effects of glycosylation modification on intestinal barrier

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肠壁通透性的增加会导致肠腔中的微生物抗原和食物抗原穿过肠道屏障，直接损害肠道黏膜下层细胞，甚至进入体循环，引发全身性炎症反应^[48]。本研究通过测定FITC-葡聚糖的含量来反映小鼠的肠壁通透性^[49]。如图8c所示，CON组小鼠的FITC-葡聚糖含量保持在较低水平。与CON组小鼠相比，TM组小鼠的FITC-葡聚糖水平显著高于CON组小鼠（P<0.05）。与TM组小鼠相比，TM-RIB、TM-GLU、TM-MOS和TM-GOS组小鼠的FITC-葡聚糖水平显著降低（P<0.05），分别降低了18.81%、35.51%、54.56%和56.44%。值得注意的是，TM-MOS以及TM-GOS组小鼠与CON组小鼠相比没有显著性差异（P>0.05），这表明受试低聚糖糖基化TM后小鼠的肠壁通透性得到了更好的改善。肠壁通透性的降低阻碍了过敏原进入系统循环，从而缓解了过敏反应。

2.7 空肠和脾脏的组织病理学研究

食物过敏不仅会引起各种临床症状，还会引起空肠、脾等器官的组织病理学改变^[50]。本研究对小鼠空肠和脾脏进行H&E染色，并在显微镜下观察组织病理学变化。如图9所示，CON组小鼠脾脏内未见巨核细胞，空肠绒毛结构完整且排列有序。与CON组小鼠相比，TM组小鼠脾脏内有大量巨核细胞出现，这可能是由T淋巴细胞分化和增殖引起的，表明淋巴器官存在慢性炎症^[51-52]。空肠表现出明显的损伤，空肠绒毛萎缩并出现脱落现象。这表明肥大细胞活化导致细胞因子和蛋白酶的大量释放，显著增加了肠壁通透性，破坏了肠粘膜的生理功能^[53]。与TM组小鼠相比，糖基化TM组小鼠的脾脏巨核细胞减少，空肠绒毛损伤减轻。与单糖糖基化TM组小鼠相比，低聚糖糖基化TM组小鼠的组织病理学情况有所改善。

图 9 空肠和脾脏的组织病理学分析

注：黄色箭头表示巨核细胞，蓝色圈表示肠绒毛断裂；脾脏放大倍数为40×，比例尺为50 μm；空肠放大倍数为20×，比例尺为100 μm。

Figure 9. Histopathological analysis in jejunums and spleens

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3. 结论

本研究利用核糖（RIB）、葡萄糖（GLU）、低聚甘露糖（MOS）和低聚半乳糖（GOS）对南极磷虾TM进行糖基化处理，糖基化后TM的分子量升高，自由氨基含量降低，二级结构发生了从α-螺旋到β-折叠的转变，同时由于糖基化过程中芳香族氨基酸残基暴露在疏水环境中导致荧光强度降低。这些结果表明TM与四种糖发生了糖基化反应。通过LC-MS/MS对样品的糖基化程度以及过敏原表位的修饰情况进行了分析得到单糖糖基化TM的糖基化程度高于低聚糖糖基化TM的糖基化程度。然而，TM-MOS和TM-GOS分别修饰了9个和11个过敏原表位，而TM-RIB和TM-GLU均修饰了8个过敏原表位。通过BALB/c小鼠致敏模型对糖基化调控TM致敏性进行验证，发现与受试TM的小鼠相比，受试糖基化TM小鼠的过敏症状减轻，包括较低的IgE、IgG1、IL-4水平、肥大细胞脱颗粒率、组胺水平、血管通透性和肠壁通透性，以及较高的IgG2a、IFN-γ水平。值得注意的是，受试TM-GOS小鼠的症状减轻更加明显，这与TM-GOS修饰了更多TM的过敏原表位有关。因此，通过糖基化修饰消减南极磷虾TM致敏性是一种有效的方法，为低致敏性虾类产品的开发提供了理论基础。

图 1 BALB/c小鼠致敏模型实验方案

Figure 1. Scheme of BALB/c mice model

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图 2 糖基化程度分析

注：a：SDS-PAGE分析；b：自由氨基含量；不同字母表示差异显著（P<0.05），图5~图8同。

Figure 2. Glycosylation degree analysis

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图 3 糖基化后TM二级、三级结构分析

Figure 3. Secondary and tertiary structure analysis of TM after glycosylation

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图 4 修饰过敏原表位的三维图谱

注：黄色阴影为预测的线性表位结果，粉色标记为位于过敏原表位上的糖基化位点。a：TM-RIB；b：TM-GLU；c：TM-MOS；d：TM-GOS。

Figure 4. Modified linear epitope based on 3D structures

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图 5 小鼠过敏症状分析

Figure 5. Analysis of allergic symptoms in mice

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图 6 小鼠血清中特异性抗体水平

Figure 6. Levels of serum specific antibodies in mice

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图 7 肥大细胞脱颗粒以及炎症介质的检测

Figure 7. Degranulation of mast cells and release of inflammatory mediators

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图 8 糖基化修饰对小鼠肠道屏障的影响

注：A：小鼠空肠AB-PAS染色（20×），比例尺：100 μm；B：杯状细胞数量分析；C：FITC-葡聚糖水平变化。

Figure 8. Effects of glycosylation modification on intestinal barrier

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图 9 空肠和脾脏的组织病理学分析

注：黄色箭头表示巨核细胞，蓝色圈表示肠绒毛断裂；脾脏放大倍数为40×，比例尺为50 μm；空肠放大倍数为20×，比例尺为100 μm。

Figure 9. Histopathological analysis in jejunums and spleens

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表 1 糖基化TM 中鉴定出的糖化肽段和相关的质谱信息

Table 1 Identified glycated peptides in glycated TM and related mass information

原始肽段	Δppm	位置	序列	糖基化肽段	DSP （%）	糖基化位点
TM-RIB
182.615⁺²	0.5	1-7	MDAIKKK.M	527.2799⁺²	44.32	K5
266.3788⁺²	1	12-21	M.KMEKDSAMDR.A	694.8075⁺²	2.08	K12
211.1044⁺³	2.8	16-35	K.DSAMDRADALEAQNKETNAK.A	795.3632⁺³	27.50	K30
112.9972⁺⁴	8.1	31-48	K.ETNAKAEKADDEVHNLQK.R	584.0288⁺⁴	5.15	K35
104.8829⁺⁴	9.7	46-66	N.LQKRLQTLENDLDQVSEALLK.A	743.6416⁺⁴	6.67	K48
155.1536⁺⁴	−3.4	50-76	R.LQTLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	812.6743⁺⁴	2.60	K66
861.4561⁺³	−0.5	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	969.4928⁺³	3.54	K74
867.7931⁺³	8	69-90	N.TQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	911.8064⁺³	13.26	K76
143.5285⁺³	6	77-91	K.ALQNAEGEVAALNRR.I	592.6354⁺³	5.29	R90
313.1854⁺²	5.4	91-101	R.RIQLLEEDLER.S	788.4208⁺²	2.09	R91
107.8716⁺⁴	−8.1	91-105	R.RIQLLEEDLERSEER.L	623.5463⁺⁴	2.14	R101
244.5716⁺³	0.9	104-125	E.ERLNTATTKLAEASQAADESER.M	925.7748⁺³	20.18	K112
165.0868⁺³	−0.2	113-128	K.LAEASQAADESERMRK.V	657.3105⁺³	4.03	R125
149.3535⁺²	−0.1	128-133	R.KVLENR.S	460.757⁺²	62.12	K128
157.0946⁺³	4.9	133-149	N.RSLLDEERMDALENQLK.E	795.3937⁺³	3.02	R133
217.1165⁺³	2.7	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	813.3994⁺³	11.54	K149
404.2191⁺²	2.1	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	970.4882⁺²	23.30	K161
125.5221⁺³	4.2	168-182	R.KLAMVEADLERAEER.A	700.6764⁺³	3.07	K168
237.5695⁺³	−2.9	179-198	R.AEERAEAGENKIVELEEELR.V	874.7585⁺³	1.07	R182
689.8742⁺⁴	3.2	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.3867⁺⁴	1.08	R198
832.4419⁺²	3	199-213	R.VVGNNLKSLEVSEEK.A	904.4669⁺²	20.12	K205
250.8907⁺²	−0.7	239-244	R.AEFAER.S	663.8314⁺²	11.28	R244
TM-GLU
182.615⁺²	0.5	45298	MDAIKKK.M	527.2799⁺²	24.32	K5
266.3788⁺²	1	45647	M.KMEKDSAMDR.A	694.8075⁺²	3.60	K12
211.1044⁺³	2.8	16-35	K.DSAMDRADALEAQNKETNAK.A	795.3632⁺³	26.84	K30
193.9922⁺³	1.2	31-48	K.ETNAKAEKADDEVHNLQK.R	744.0267⁺³	1.13	K35
117.3258⁺⁴	6.1	45-66	H.NLQKRLQTLENDLDQVSEALLK.A	793.4133⁺⁴	0.69	K48
195.8925⁺³	−3.9	49-66	K.RLQTLENDLDQVSEALLK.A	749.7274⁺³	7.99	R49
752.6395⁺⁴	1.6	52-76	Q.TLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	800.6545⁺⁴	1.43	K66
764.9107⁺⁴	5.4	50-76	R.LQTLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	845.9382⁺⁴	11.82	K74
605.3301⁺²	0.4	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	1372.7102⁺²	12.52	K76
143.5285⁺³	6	77-91	K.ALQNAEGEVAALNRR.I	592.6354⁺³	8.11	R90
313.1854⁺²	5.3	91-101	R.RIQLLEEDLER.S	788.4208⁺²	1.03	R91
630.5574⁺²	2.8	103-125	S.EERLNTATTKLAEASQAADESER.M	1453.1748⁺²	4.01	R105
244.5716⁺³	0.9	104-125	E.ERLNTATTKLAEASQAADESER.M	925.7748⁺³	18.22	K112
165.0868⁺³	−0.2	113-128	K.LAEASQAADESERMRK.V	657.3105⁺³	3.23	R125
149.3535⁺²	−0.1	128-133	R.KVLENR.S	460.757⁺²	61.57	K128
157.0946⁺³	4.8	133-149	N.RSLLDEERMDALENQLK.E	795.3937⁺³	2.02	R133
217.1165⁺³	2.7	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	813.3994⁺³	6.52	K149
404.2191⁺²	2.1	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	970.4882⁺²	21.59	K161
125.5221⁺³	4.2	168-182	R.KLAMVEADLERAEER.A	700.6764⁺³	1.51	K168
71.6105⁺⁴	7.3	181-198	E.ERAEAGENKIVELEEELR.V	610.5518⁺⁴	0.55	R182
689.8774⁺⁴	7.5	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.3899⁺⁴	1.05	R198
848.4417⁺³	−6.7	192-213	V.ELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	902.4584⁺³	29.87	K205
250.8907⁺²	−0.7	239-248	R.AEFAERSVQK.L	663.8314⁺²	2.23	R244
TM-MOS
469.4693⁺²	0.2	13-30	K.MEKDSAMDRADALEAQNK.E	1100.9886⁺²	1.13	K15
211.1026⁺³	−1.9	16-35	K.DSAMDRADALEAQNKETNAK.A	795.3577⁺³	3.14	K30
546.5503⁺²	6.2	48-66	Q.KRLQTLENDLDQVSEALLK.A	1285.1605⁺²	1.51	K48
155.1531⁺⁴	−3.6	50-76	R.LQTLENDLDQVSEALLKANTQLVEKDK.A	812.6723⁺⁴	3.94	K66
861.4575⁺³	3.1	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	969.4942⁺³	0.47	K74
843.7838⁺³	7.9	69-90	N.TQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	897.8005⁺³	12.32	K76
143.3081⁺³	−0.4	77-91	K.ALQNAEGEVAALNRR.I	591.9742⁺³	6.23	R90
313.1845⁺²	5.3	91-101	R.RIQLLEEDLER.S	788.4189⁺²	3.01	R91
622.8331⁺⁴	7.2	92-112	R.IQLLEEDLERSEERLNTATTK.L	663.3456⁺⁴	1.15	R101
309.8150⁺³	1.3	104-125	E.ERLNTATTKLAEASQAADESER.M	929.4451⁺³	1.07	R105
293.3614⁺³	−2.5	102-125	R.SEERLNTATTKLAEASQAADESER.M	1012.1243⁺³	5.43	K112
149.0778⁺³	6.7	113-127	K.LAEASQAADESERMR.K	609.2833⁺³	1.03	R125
149.3526⁺²	−2	128-133	R.KVLENR.S	460.7551⁺²	20.39	K128
232.4556⁺³	8.8	133-149	N.RSLLDEERMDALENQLK.E	859.4167⁺³	1.40	R133
215.4482⁺³	3.6	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	808.3946⁺³	0.42	K149
145.7494⁺³	−0.6	140-152	E.RMDALENQLKEAR.L	569.2883⁺³	4.49	R140
80.9237⁺⁴	−2.1	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	485.7446⁺⁴	9.68	K161
95.3089⁺⁴	3.5	179-198	R.AEERAEAGENKIVELEEELR.V	645.3157⁺⁴	0.37	R182、K189
689.6251⁺⁴	1.2	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.1376⁺⁴	0.4	R198
697.8742⁺⁴	9.9	191-213	I.VELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	730.8842⁺⁴	4.47	K205
370.689⁺²	7.7	206-217	K.SLEVSEEKASSR.E	873.4179⁺²	28.50	R217
250.8903⁺²	0.3	239-248	R.AEFAERSVQK.L	663.8306⁺²	2.11	R244
TM-GOS
262.3788⁺²	−2.5	45647	M.KMEKDSAMDR.S	686.8076⁺²	1.33	K12
230.3559⁺²	0.1	13-21	K.MEKDSAMDR.S	622.7618⁺²	3.17	K15
209.769⁺³	−0.5	16-35	K.DSAMDRSDALEAQNKETNAK.A	791.3569⁺³	2.54	K30
339.42575⁺²	−0.2	22-35	R.SDALEAQNKETNAK.A	840.9015⁺²	12.23	K35
110.2903⁺³	−0.6	36-49	K.ADKADDEVHNLQKR.L	654.981⁺³	1.27	K38
203.4608⁺³	7.2	48-66	Q.KRLQTLENDLDQVSEALLK.A	964.4925⁺³	0.11	K48
95.1232⁺⁴	8.5	61-76	V.SEALLKANTQLVEKDK.A	572.5529⁺⁴	3.32	K66
107.0915⁺³	1	67-90	K.ANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNR.R	969.4944⁺³	3.32	K74、K76
115.5715⁺⁴	9.7	85-101	E.VAALNRRIQLLEEDLER.S	654.3459⁺⁴	5.07	R91
235.9003⁺³	1	102-125	R.SEERLNTATTKLAEASQAADESER.M	1031.8108⁺³	3.43	K112
375.6806⁺²	−6.8	113-127	K.LAEASQAADESERMR.K	913.4111⁺²	0.49	R125
108.8373⁺²	1.6	128-133	R.KVLENR.S	541.7845⁺²	10.04	K128
215.339⁺³	2	134-152	R.SLLDEERMDALENQLKEAR.L	808.0671⁺³	1.68	K149
80.9242⁺⁴	0	153-167	R.LLAEEADRKYDEVAR.K	485.7467⁺⁴	7.15	R160
179.8537⁺²	0.1	161-167	R.KYDEVAR.K	521.7574⁺²	8.11	K161
241.8909⁺²	−3.1	168-178	R.KLAMVEADLER.A	807.8918⁺²	0.27	K168
919.8301⁺³	8.9	190-213	K.IVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEK.A	973.8468⁺³	0.08	R198
548.9661⁺³	−1.8	199-213	R.VVGNNLKSLEVSEEK.A	602.9828⁺³	2.21	K205
307.1659⁺²	1.9	206-217	K.SLEVSEEKANQR.E	776.3817⁺²	1.08	K213
142.7491⁺³	1	214-226	K.ANQREEAYKEQIK.H	590.2972⁺³	7.79	K222
398.2254⁺²	7.2	218-231	R.EEAYKEQIKHLTHK.L	958.5007⁺²	8.22	K226
130.2993⁺³	9.3	237-248	E.ARAEFAERSVQK.L	582.958⁺³	3.11	R238
448.9975⁺²	0.6	249-264	K.LQKEVDRLEDELVNEK.E	1060.0449⁺²	9.14	K251
169.205⁺³	−0.4	252-266	K.EVDRLEDELVNEKEK.Y	669.6649⁺³	6.70	K264
注：标有灰色阴影的为位于过敏原表位上的糖基化位点。

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图(9) / 表(1)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 糖基化TM的制备
1.2.2 SDS-PAGE实验
1.2.3 自由氨基含量的测定
1.2.4 圆二色光谱（Circular Dichroism Spectroscopy，CD）分析
1.2.5 荧光光谱分析
1.2.6 液相色谱质谱联用鉴定
1.2.7 动物实验方案
1.2.8 致敏性评估
1.2.8.1 过敏症状评分和体温测定
1.2.8.2 特异性抗体水平测定
1.2.8.3 肥大细胞脱颗粒率测定
1.2.8.4 血浆组胺测定
1.2.8.5 血管通透性测定
1.2.8.6 细胞因子的测定
1.2.8.7 肠壁通透性测定
1.2.8.8 组织病理学分析
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 糖基化TM结构的表征
2.2 糖基化修饰位点分析
2.3 小鼠过敏症状分析
2.4 特异性IgE、IgG1和IgG2a的测定
2.5 肥大细胞脱颗粒率以及炎症介质的释放
2.6 肠壁通透性分析
2.7 空肠和脾脏的组织病理学研究
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 糖基化TM的制备
1.2.2 SDS-PAGE实验
1.2.3 自由氨基含量的测定
1.2.4 圆二色光谱（Circular Dichroism Spectroscopy，CD）分析
1.2.5 荧光光谱分析
1.2.6 液相色谱质谱联用鉴定
1.2.7 动物实验方案
1.2.8 致敏性评估
1.2.8.1 过敏症状评分和体温测定
1.2.8.2 特异性抗体水平测定
1.2.8.3 肥大细胞脱颗粒率测定
1.2.8.4 血浆组胺测定
1.2.8.5 血管通透性测定
1.2.8.6 细胞因子的测定
1.2.8.7 肠壁通透性测定
1.2.8.8 组织病理学分析
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 糖基化TM结构的表征
2.2 糖基化修饰位点分析
2.3 小鼠过敏症状分析
2.4 特异性IgE、IgG1和IgG2a的测定
2.5 肥大细胞脱颗粒率以及炎症介质的释放
2.6 肠壁通透性分析
2.7 空肠和脾脏的组织病理学研究
3. 结论

参考文献(53)

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糖基化修饰消减南极磷虾原肌球蛋白致敏性研究

作者简介: 张书琪（1999−），女，硕士研究生，研究方向：虾加工与质量安全控制，E-mail：zsq03150126@163.com

通讯作者: 孙娜（1988−），女，博士，教授，研究方向：虾加工与质量安全控制，E-mail：sunna1215@126.com。

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