Inhibitory Effects of Flavonoids from Citrus reticulata 'Chachi' Peel on the Formation of Advanced Glycation End-products
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摘要: 本研究采用牛血清白蛋白-葡萄糖（bovine serum albumin-glucose, BSA-Glu）模拟体系，研究不同生长期的茶枝柑果皮提取物及主要类黄酮化合物川陈皮素、橘皮素和橙皮苷对荧光性AGEs的抑制效果，同时，借助多光谱技术和计算机分子对接研究类黄酮与BSA的相互作用，探究其抑制AGEs的作用机制。结果表明，4个不同生长期的茶枝柑果皮提取物均对AGEs的生成具有显著抑制作用，12月茶枝柑果皮提取物（2.5 mg/mL）对荧光性AGEs以及蛋白糖氧化产物二酪氨酸、犬尿氨酸和N’-甲酰基犬尿氨酸的最大抑制率分别为76.33%、71.78%、62.73%和66.07%。荧光光谱表明，川陈皮素、橘皮素和橙皮苷能静态猝灭BSA的内源性荧光。同步荧光光谱表明，川陈皮素、橘皮素和橙皮苷能轻微改变BSA的构象以及色氨酸（TRP）残基和酪氨酸（TYR）残基的微环境。分子对接表明，川陈皮素、橘皮素和橙皮苷可结合到BSA的TRP-213残基附近的疏水性口袋并与BSA形成复合物，同时与BSA的多个氨基酸残基之间存在氢键和疏水相互作用，阻碍BSA糖基化位点与葡萄糖结合。由此可见，茶枝柑果皮类黄酮通过减少精氨酸、赖氨酸残基与还原糖的结合的方式抑制AGEs的生成，可用于AGEs天然抑制剂用的开发。Abstract: This study investigated the inhibitory effects of extracts from Citrus reticulata 'Chachi' peels at different growth stages and the primary flavonoid components (nobiletin, hesperetin, and hesperidin) on fluorescent AGEs using the bovine serum albumin-glucose (BSA-Glu) model. To elucidate the underlying mechanisms, the interactions between flavonoids and BSA were analyzed using multi-spectral techniques and computer molecular docking. Results showed that extracts from Citrus reticulata 'Chachi' peels at four growth stages significantly inhibited AGE formation. The extracts obtained in December (2.5 mg/mL) showed maximum inhibition rates of 76.33% for fluorescent AGEs and 71.78%, 62.73%, and 66.07% for the protein glycoxidation products dityrosine, kynurenine, and N’-formylkynurenine, respectively. Fluorescence spectroscopy revealed that the fluorescence quenching mechanism of BSA by nobiletin, hesperetin, and hesperidin was via a static quenching procedure. Synchronous fluorescence spectroscopy revealed that these flavonoids slightly altered the conformation of BSA and the microenvironment of tryptophan (TRP) and tyrosine (TYR) residues. Molecular docking studies showed that the flavonoids bound to a hydrophobic pocket near the TRP-213 residue of BSA, forming a complex and disrupting glucose binding to glycation sites on BSA through hydrogen bonds and hydrophobic interactions. In conclusion, flavonoids derived from Citrus reticulata 'Chachi' peels effectively inhibited the formation of AGE by reducing the combination of arginine and lysine residues with reducing sugars, and had potential for use in developing natural AGE inhibitors.
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茶枝柑（Citrus reticulata ‘Chachi’，CRC）主产于广东新会，又称新会柑，为芸香科（Rutacae）柑橘属（Citrus）植物，茶枝柑果皮经干燥和陈化后即可制作成广陈皮（新会陈皮）。广陈皮是传统道地中药材[1−2]，被称为“广东三宝”、“广东十大中药”，也是国家卫健委批准的药食同源品类之一，具有良好的药用和食疗价值[3]。相比普通陈皮，新会广陈皮在原产地环境、品质和临床疗效等方面更为优越[4]。新会茶枝柑每年7月开始分批采摘，其果皮经过加工后可以制成不同种类的产品，其中青皮柑呈青黑色，皮薄质硬不显皱缩，适合制成柑普茶；二红柑外表见褐黄色且皮质稍软，初显皱褶，大红柑皮色泽棕红，质软皮厚，皱缩明显，两者可制作成药理功效相似的新会陈皮[5−6]。有关茶枝柑及广陈皮中次生代谢产物的药用价值和生物活性越来越受关注，其中类黄酮化合物是当下研究的热点。
类黄酮是茶枝柑果皮中的重要次生代谢物，主要分为两类：一类是二氢黄酮苷类，包括橙皮苷、柚皮苷等；另一类是多甲氧基黄酮类，包括川陈皮素、橘皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲基黄酮等[7]。茶枝柑类黄酮具有抗炎[8]、抗氧化[9]、抗肿瘤[10]、降血脂[11]等生物活性。茶枝柑果皮药食同源，在广东地区素有陈皮入膳的传统。陈皮既能赋予食品独特的风味，类黄酮等活性成分还能与食品中的蛋白质、糖、氨基酸、多糖等成分发生反应或者相互作用[12]，影响食品加工中美拉德反应、脂质氧化和蛋白质变性等反应过程[13−14]。
晚期糖基化终产物（Advanced Glycation End Products，AGEs）是美拉德反应形成的一类化合物总称，现已发现有近40种[15−16]，被认为是一种促进宿主细胞死亡和器官损伤的强毒性分子，会对人体健康产生不利影响[17−20]。食源性AGEs是人体AGEs的主要来源，人体内食源性AGEs的占比高于因葡萄糖代谢异常或脂质过氧化产生的内源性AGEs[21]。高糖高蛋白的热加工食物，例如烤肉、饼干、咖啡等，由于美拉德反应剧烈，容易积累高水平的AGEs。植物提取物中高水平的多酚和黄酮类化合物是安全的天然AGEs抑制剂，能通过清除自由基、捕获高活性羰基化合物、抑制糖自氧化以及封闭氨基酸位点等方式[22−23]抑制食品中AGEs的生成。现有研究表明，纽荷尔脐橙中的类黄酮化合物以及从其他柑橘果皮中分离出的5-去甲基川陈皮素具有抗糖化的作用[24−25]，目前尚未有茶枝柑作为AGEs天然抑制剂的研究。
因此，本文采用牛血清蛋白-葡萄糖（BSA-Glu）体系模拟食品中美拉德反应，研究不同生长期的茶枝柑果皮类黄酮提取物及其主要成分对荧光性AGEs的抑制效果，通过分析类黄酮化合物对乙二醛（GO）和甲基乙二醛（MGO）的捕获能力以及类黄酮化合物与BSA的相互作用，阐明茶枝柑果皮类黄酮抑制AGEs的作用机制，为茶枝柑在食品工业中作为AGEs抑制剂的潜在应用奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
小青柑、青柑、二红柑和大红柑4个生长期的茶枝柑果实分别于2023年7月、9月、11月、12月采摘于广东省江门植保所果园（图1）。鲜果果皮清洗后真空冷冻干燥，粉碎成约60目的粉末，−80 ℃储存。
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图 1 茶枝柑鲜果四个生长期概览图Figure 1. Overview of four growth stages of fresh Citrus reticulata 'Chachi'川陈皮素（nobiletin，NOB）、橘皮素（tangeretin，TAN）、橙皮苷（hesperidin，HES）、甜橙黄酮（sinensetin）、5-去甲基川陈皮素（demethylnobiletin）、4’,5,6,7-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮 纯度>98%，上海源叶生物技术有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、葡萄糖（glucose，Glu）、氨基胍（aminoguanidine，AG）、L-赖氨酸（L-Lysine，Lys）、乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO） 美国Sigma-Aldrich公司；液相和质谱所用乙腈、甲酸 美国Thermo Scientific公司；乙醇、石油醚、二氯甲烷、邻苯二胺等均为分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司。
电子分析天平SQP 德国赛多利斯科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机LGJ-25C 北京四环福瑞科仪科技有限公司；真空旋转蒸发仪RV 3 德国IKA公司；多功能酶标仪Spark 瑞士TECAN公司；荧光分光光度计LS-55 美国PerkinElmer公司；超高效液相色谱仪1290 InfinityⅡ、液质联用仪TOF/QTOF 6500 美国安捷伦公司。
1.2 实验方法
1.2.1 茶枝柑果皮类黄酮的提取和富集
茶枝柑果皮类黄酮的提取和富集参考Zheng等[26]的方法并稍加修改。称取50 g冻干茶枝柑果皮粉末，按料液比1∶20加入90%乙醇（w/w）溶液，45 ℃下超声提取30 min，重复提取3次后收集合并提取液，旋转蒸发回收溶剂，得到茶枝柑果皮类黄酮粗提液。将类黄酮粗提液用水稀释一倍后依次用等体积的石油醚和二氯甲烷进行连续萃取，收集二氯甲烷萃取液，旋转蒸发回收溶剂后真空冷冻干燥，得到茶枝柑果皮类黄酮提取物，置于−20 ℃保存。
1.2.2 茶枝柑果皮类黄酮提取物成分的质谱定性分析
取4个生长期的茶枝柑果皮类黄酮提取物混合，用50%甲醇水溶解配制成300 μg/mL待测样品。川陈皮素、橘皮素、橙皮苷、甜橙黄酮、5-去甲基川陈皮素、4’,5,6,7-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮等标准品用50%甲醇水溶液配制成50 μg/mL的标准液用于定性分析。采用Agilent TOF/Q-TOF 6500液质联用仪，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm）。色谱条件：A相为0.1%的甲酸水，B相为含0.1%甲酸的乙腈；柱温40 ℃，流速为0.4 mL/min，进样量为2 μL；梯度洗脱程序为0 min，90% A；2 min，90% A；12 min，20% A；14 min，20% A；16 min，0% A；18 min，0% A。质谱条件：采用电喷雾离子化方式，正离子模式；质谱采集质量-电荷比（m/z）范围为100~3000；离子化电压3500 V，气帘气35 psi，温度350 ℃[27]。
1.2.3 茶枝柑果皮类黄酮提取物的液相色谱定量分析
称取4个生长期的茶枝柑果皮类黄酮提取物5 mg，用50%甲醇水溶解配制成20 mL待测样品。川陈皮素、橘皮素、橙皮苷标准品配制成浓度梯度6.25~100 μg/mL的标准液，甜橙黄酮、5-去甲基川陈皮素标准品配制成浓度梯度0.3125~5 μg/mL的标准液。采用安捷伦1290 InfinityⅡ超高效液相色谱仪，Hypersil GOLD C4柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm；Thermo SCIENTIFIC，USA）。液相色谱条件[28]：柱温为30 ℃；进样量为2 μL；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱条件：0 min，90% A；2 min，90% A；10 min，70% A；15 min，50% A；20 min，10% A；流速为0.3 mL/min；橙皮苷的检测波长为280 nm，川陈皮素、橘皮素、甜橙黄酮和去甲基川陈皮素的检测波长为330 nm。以标品溶液质量浓度（µg/mL）为横坐标、对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，测定4个生长期的茶枝柑果皮类黄酮提取物中川陈皮素、橘皮素、橙皮苷、甜橙黄酮和5-去甲基川陈皮素含量。
1.2.4 茶枝柑果皮类黄酮提取物对AGEs的抑制
牛血清蛋白-葡萄糖体系（BSA-Glu体系）在参考前人的方法基础上稍加修改[29−30]。20 mg/mL BSA、1 mol/L葡萄糖溶解于磷酸盐缓冲溶液PBS（50 mmol/L，pH7.4）。川陈皮素、橘皮素、橙皮苷标准品以及4个时期茶枝柑果皮黄酮提取物用DMSO配制成母液，加入到上述体系中达到最终浓度为0、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL，并确保DMSO小于1%（V/V），同时，以相同浓度的AG为阳性对照。100 ℃水浴反应75 min后，测定其对荧光性AGEs和蛋白质氧化产物的抑制作用。方法参考Zhao等[31]，在370/440、330/415、365/480和325/434 nm激发/发射波长处分别测定荧光性AGEs及蛋白糖氧化产物二酪氨酸、犬尿氨酸和N'-甲酰基犬尿氨酸的荧光强度[32]。茶枝柑果皮类黄酮提取物对AGEs的抑制率（%）为：
抑制率(%)=A0−A1A0×100 (1) 式中，A0为对照组（仅BSA-Glu体系）的荧光强度，A1为实验组（添加不同浓度提取物或类黄酮化合物标准品）的荧光强度。
1.2.5 类黄酮化合物对MGO和GO捕集能力的测定
由于食品中二羰基化合物乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）自身并不稳定且在200~400 nm波长下没有紫外吸收，所以对二羰基化合物进行衍生化，稳定形成的喹喔啉衍生物进行检测[33−34]。
方法如下：MGO/GO（4 mmol/L）与不同浓度（0、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL）的类黄酮化合物（NOB、TAN、HES）在50 mmol/L磷酸盐缓冲液PBS（pH7.0）37 ℃孵育6 h，取0.5 mL衍生化试剂OPD（10 mmol/L）与0.5 mL上述孵育样品37 ℃反应0.5 h，过0.22 μm膜后用HPLC-DAD检测生成的MGO/GO衍生物。Hypersil GOLD C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；Thermo SCIENTIFIC，USA）色谱柱，进样量为10 μL，流量比为1 mL/min，柱温30 ℃，流动性为0.1%的乙酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度程序为：0~20 min，30%~70% B。检测波长为315 nm。MGO/GO捕获率（%）的计算公式为:
MGO/GO捕获率(%)=F0−F1F0×100 (2) 式中，F0为对照组（仅BSA-Glu体系）的MGO/GO浓度，F1为实验组（添加不同浓度类黄酮化合物标准品）的MGO/GO浓度。
1.2.6 荧光光谱测定
在25 ℃下，将BSA溶液与不同浓度的类黄酮化合物（NOB、TAN、HES）混合，最终混合液中BSA浓度均为2×10−6 mol/L。用比色皿（10×10 mm）测量，荧光分光光度计扫描，测定荧光淬灭曲线。光谱条件：激发波长为280 nm，发射波长为310~500 nm，电压400 V，扫描速度1200 nm/min，狭缝宽度5 nm[35]。根据经典Stern-Volmer方程确定NOB、TAN、HES与BSA之间的猝灭常数：
F0/F = 1+Kqτ 0 [Q] = 1+Ksv [Q] (3) log[F0− F/F] = logKa + n log[Q] (4) 式中，F0和F分别为无类黄酮和有类黄酮时BSA的荧光强度，[Q]为类黄酮的浓度，Kq和Ksv分别为双分子猝灭速率常数和Stern-Volmer猝灭常数，τ0为荧光分子的平均寿命（约10−8 s），Ka和n分别为结合常数和结合位点数[36]。
1.2.7 同步荧光光谱测定
样品制备同1.2.6，在260~340 nm（Δλ=15 nm）和220~360 nm（Δλ=60 nm）范围内记录含类黄酮化合物和不含类黄酮化合物的BSA的同步荧光光谱。激发和发射狭缝宽度均设为5.0 nm，扫描速率设为1200 nm·min−1。
1.2.8 分子对接分析
BSA的晶体结构来自蛋白质数据库（PDB id: 4F5S）[37]，为了获得稳定的蛋白质和受体，使用PyMOL软件去除BSA的B链和所有水分子与配体以产生单体结构。使用ChemDraw（v.19.0）软件描绘并优化NOB、TAN、HES的2D和3D立体化学结构。然后，使用AutoDock Tools（1.5.7版本）向受体BSA和类黄酮配体添加极性氢，每个配体中的所有可旋转键都保持自由，而受体保持刚性，并分配氢原子和Gasteiger电荷，确保以最低能量的结合姿势进行分析。对接盒子的中心坐标为x=−3.615，y=23.022，z=107.822，大小为60×60×60，网格空间为0.375 Å。对接采用全盲对接，对接时采用AutoDock Vina力场，搜索前20个得分最高的构象。用PLIP在线工具分析茶枝柑类黄酮化合物与BSA结合位点的疏水相互作用和形成的氢键。最后，在PyMOL软件中绘制BSA蛋白分子的表面结构图，并展示茶枝柑类黄酮化合物与其结合的情况。
1.3 数据处理
所有实验进行三次重复，结果数据采用Excel 2010处理，以平均值±标准差（SD）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后使用IBM SPSS Statistics 16.0软件进行数据统计分析，采用Duncan检验，P<0.05。采用Origin 2021软件作图。
2. 结果与分析
2.1 茶枝柑果皮类黄酮提取物成分鉴定
为明确茶枝柑果皮类黄酮提取物的化学组成，采用UPLCMS/MS对其主要化学成分进行鉴定，其总离子流图如图2所示。质谱峰1、7、8、9、10、11、12通过与标准物质比对保留时间、准分子离子和二级离子碎片质荷比分别确定为橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、4’,5,6,7-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-去甲基川陈皮素。多甲氧基黄酮质谱裂解规律主要是连续丢失CH3·，失去C环中的羰基、CO2、中性水分子H2O，偶见黄酮母核发生C环逆狄尔斯-阿尔德（RDA）裂解[38]。质谱峰2准分子离子峰为329.1021 [M+H]+，推测其化学式为C18H16O6，二级质谱的特征片段离子包括m/z 314.0777（[M+H-CH3]+）、m/z 299.0543（[M+H-2CH3]+），结合文献[38]中广陈皮化学成分的质谱信息推断其为7-H-5,3’,4’-三甲基黄酮。质谱峰3其准分子离子峰为359.1122 [M+H]+，二级质谱的特征片段离子包括m/z 344.0872（[M+H-CH3]+）、m/z 326.0771（[M+H-CH3-H2O]+）、m/z 315.0878（[M+H-CO2]+），结合文献[38−39]推断其为5-H-3’,4’,7,8-四甲氧基黄酮。相似的，质谱峰5、13推测为2’,3’,4’,5,7-五甲氧基黄酮和2-（3,4-Dimethoxyphenyl）-5-hydroxy-6,7-dimethoxy-4H-chromen-4-one。质谱峰4、6的准分子离子为389.12 [M+H]+，推测其分子式为C20H20O8，并且二级碎片离子符合羟基-五甲氧基黄酮的断裂方式，应为两个同分异构体，根据文献[38−40]中保留时间先后，分别推测为5-H-3,6,7,8,4’-五甲氧基黄酮、5-H-3,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮。以上13种类黄酮化合物的质谱信息见表1。
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图 2 茶枝柑果皮提取物的总离子流图Figure 2. Total Ion current chromatogram of Citrus reticulata 'Chachi' peel extract表 1 茶枝柑果皮提取物的主要化学成分Table 1. Main chemical components of Citrus reticulata 'Chachi' peel extract峰 保留时间（min） 鉴定化合物 分子式 [M+H]+ 误差（ppm） MS/MS碎片 鉴定依据 1 5.26 橙皮苷（Hesperidin） C28H34O15 611.1962 −1.54 449.1397；303.0857；153.0174 标准品 2 6.57 7-H-5,3’,4’-三甲基黄酮（7-Hydroxy-5,3',4'-trimethoxyflavone） C18H16O6 329.1021 0.07 314.0777；299.0543；268.0726 [38] 3 6.90 5-H-3’,4’,7,8-四甲氧基黄酮（5-Hydroxy-3',4',7,8-tetramethoxyflavone） C19H18O7 359.1122 −1.2 344.0872；326.0771；315.0878 [38−39] 4 7.23 5-H-3,6,7,8,4’-五甲氧基黄酮（5'-Hydroxy-3,6,7,8,4'-pentamethoxyflavone） C20H20O8 389.1240 1.69 374.0988；359.0756；341.0644；197.0078 [38,40] 5 7.35 2’,3’,4’,5,7-五甲氧基黄酮（2',3',4',5,7-Pentamethoxyflavone） C20H20O7 373.1296 3.09 358.1043；343.0816 [38] 6 7.52 5-H-3,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮
（5-Hydroxy-3,7,8,3',4'-pentamethoxyflavone）C20H20O8 389.1230 −0.05 374.0986；359.0757；341.0646 [38] 7 7.84 甜橙黄酮（Sinensetin） C20H20O7 373.1291 2.1 358.1042；344.0840；329.1017；312.0988 标准品 8 8.38 川陈皮素（Nobiletin） C21H22O8 403.1459 −4.1 388.1158；373.0956；355.0818；342.1096 标准品 9 8.48 4’,5,6,7-四甲氧基黄酮（4',5,6,7-Tetramethoxyflavone） C19H18O6 343.118 3.22 328.0935；313.0706；282.0884 标准品 10 8.76 3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮
（3,5,6,7,8,3',4'-Heptamethoxyflavone）C22H24O9 433.1506 2.74 418.1262；403.1030；385.0917 标准品 11 9.01 橘皮素（tangeritin） C20H20O7 373.1307 13.5 358.1055；343.0830；325.0712 标准品 12 9.52 5-去甲基川陈皮素
（5-Demethylnobiletin）C20H20O8 389.1240 2.11 359.0761；341.0651 标准品 13 10.16 2-（3,4-Dimethoxyphenyl）-5-
hydroxy-6,7-dimethoxy-4H-chromen-
4-oneC19H18O7 359.1129 0.76 344.0895；329.0652；311.0540 [38] 2.2 茶枝柑果皮提取物类黄酮含量动态变化
采用高效液相色谱法对不同生长期的茶枝柑果皮提取物中橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-去甲基川陈皮素共5种主要类黄酮化合物进行定量分析，4’,5,6,7-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮等其他类黄酮成分含量较低，未达定量检出限。以上化合物随生长时期的动态变化如图3。
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图 3 四个生长期茶枝柑果皮提取物中5种类黄酮化合物含量注：小写字母表示化合物在不同生长期含量具有显著差异（P<0.05）。Figure 3. Contents of five flavonoids in Citrus reticulata 'Chachi' peel extract at four growth stages茶枝柑果皮提取物中川陈皮素的含量最高，其次是橘皮素。橙皮苷含量随生长发育呈显著上升趋势，从0.156 μg/g增加至1.012 μg/g。川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素和甜橙黄酮大致呈下降趋势，但在12月成熟期时，多甲氧基黄酮类化合物含量较未成熟期（9月、11月）略高（P<0.05）。由此可见，茶枝柑生长发育过程中，小青柑时期（7月）多甲氧基黄酮在果皮中大量积累，在二红柑时期前（9月）出现明显下降（图3）。以上结果与前人研究结果相似，Liang等[9]通过检测发现7~12月份茶枝柑果皮中类黄酮化合物含量呈现动态变化，橙皮苷在成熟期高于未成熟期，而多甲氧基黄酮在未成熟期高于成熟期。
2.3 茶枝柑类黄酮对荧光性AGEs形成的影响
茶枝柑果皮提取物中含有类黄酮化合物，不同生长期茶枝柑类黄酮提取物对荧光性AGEs形成的抑制作用如图4所示。同一浓度（2.5 mg/mL）下对比4个生长期的结果，12月采摘的大红柑果皮提取物对BSA-Glu体系中荧光性AGEs生成的抑制率最高达76.33%，显著优于阳性对照AG（P<0.05）。说明不同生长期的茶枝柑对荧光性AGEs的抑制效果存在差异，12月大红柑最适宜用作糖基化抑制剂产品的开发。Zhang等[24]发现从纽荷尔脐橙分离出的17种黄酮类化合物中甜橙黄酮可作为效果最佳的糖基化抑制剂；Upadhyay等[25]从其他柑橘果皮中分离出的5-O-去甲氧基-川陈皮素也具有抗糖化的作用。但甜橙黄酮和5-去甲基川陈皮素在茶枝柑中含量较低，说明虽然不同柑橘品种的果皮都具有抗糖化作用，但其发挥作用的主要活性成分可能并不一致。
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图 4 四个生长期茶枝柑类黄酮提取物对BSA-Glu体系中荧光性AGEs的抑制效果注：不同小写字母表示同一生长期茶枝柑在不同浓度下抑制率具有显著性差异（P<0.05）。Figure 4. Inhibitory effects of Citrus reticulata 'Chachi' peel extracts at four growth stages on fluorescent AGEs in BSA-Glu model为明确茶枝柑类黄酮提取物中发挥抗糖化作用的主要活性成分，对其含量最高的三种类黄酮化合物（NOB、TAN、HES）抑制BSA-Glu体系中AGEs生成的效果进行研究，其结果如图5所示。类黄酮化合物和AG的加入显著降低了荧光性AGEs的形成，且与浓度呈正相关。阳性对照AG对荧光性AGEs形成的抑制效果显著强于三种类黄酮化合物（P<0.05），同一浓度（2.5 mg/mL）下，AG可抑制体系中65.02%的荧光性AGEs生成，而NOB、TAN和HES对荧光性AGEs抑制率分别为51.11%、41.94%和28.81%。由此表明，三种类黄酮化合物的抑制效果为NOB>TAN>HES。但三种类黄酮化合物在相同浓度下对荧光性AGEs的抑制效果都不及12月份茶枝柑类黄酮提取物，由此推测，茶枝柑类黄酮提取物中不同类黄酮化合物在抑制AGEs的过程中可能存在协同作用。
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图 5 三种类黄酮化合物对BSA-Glu体系中荧光性AGEs的抑制效果注：不同小写字母表示同一化合物在不同浓度下抑制率具有显著性差异（P<0.05）。Figure 5. Inhibitory effect of three flavonoids on fluorescent AGEs in BSA-Glu model2.4 茶枝柑果皮类黄酮化合物对蛋白糖氧化产物形成的影响
蛋白在糖基化过程中同时会发生氧化反应，二酪氨酸、N'-甲酰基犬尿氨酸和犬尿氨酸等蛋白糖氧化产物也可以反映蛋白质糖基化的程度[41]。色氨酸残基被修饰为二酪氨酸和N-甲酰基犬尿氨酸，而酪氨酸残基被转化为犬尿氨酸。由图6可知，4个时期的茶枝柑果皮提取物中，当浓度为2.5 mg/mL时，12月大红柑果皮对二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰基犬尿氨酸的抑制效果最佳，其最大抑制率分别为71.78%、62.73%和66.07%；3种类黄酮化合物中，NOB对犬尿氨酸的抑制效果最佳，达到66.85%，TAN对二酪氨酸和N-甲酰基犬尿氨酸的抑制效果最佳，其最大抑制率分别是84.90%和78.47%。糖氧化是一种非酶促反应，还原糖与蛋白质的氨基酸残基反应，导致蛋白质结构和功能的改变[35]。BSA有两个色氨酸和21个酪氨酸残基，并且酪氨酸残基更容易被糖氧化为犬尿氨酸，导致BSA糖氧化产物中犬尿氨酸水平相对较高。因此，茶枝柑类黄酮化合物和AG对犬尿氨酸形成的抑制作用可能弱于二酪氨酸[42−43]。总之，结果表明茶枝柑类黄酮化合物可以抑制BSA中氨基酸残基的糖氧化。
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图 6 类黄酮化合物与茶枝柑提取物对BSA-Glu体系中蛋白糖氧化产物生成的抑制作用注：A、C、E分别为类黄酮化合物对BSA-Glu体系中二酪氨酸、犬尿氨酸、N’-甲酰基犬尿氨酸生成的抑制作用；B、D、F分别为茶枝柑提取物对BSA-Glu体系中二酪氨酸、犬尿氨酸、N’-甲酰基犬尿氨酸生成的抑制作用。不同小写字母表示类黄酮化合物或同一时期茶枝柑提取物在不同浓度下抑制率具有显著性差异（P<0.05）。Figure 6. Inhibitory effects of flavonoids and Citrus reticulata 'Chachi' extract on protein glyoxidation products in BSA-Glu model2.5 类黄酮化合物对MGO和GO的影响
由图7可知，与MGO和GO孵育后TAN、HES和NOB对MGO和GO的捕获率几乎不变，而AG对MGO和GO捕获率显著上升，在浓度为2.0 mg/mL时MGO和GO的捕获率达90%以上。类黄酮化合物A环上的羟基在捕获MGO和GO中起重要作用，但本研究中所用的三种类黄酮化合物缺乏游离羟基，无法与MGO、GO形成加合物[44]。说明TAN、HES和NOB这三种茶枝柑中主要类黄酮化合物无法通过捕获MGO与GO这一途径抑制AGEs的生成。
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图 7 三种茶枝柑类黄酮化合物的MGO/GO捕获能力注：不同小写字母表示类黄酮化合物在不同浓度下捕获率有显著性差异（P<0.05）。Figure 7. MGO/GO capturing capacity of three flavonoids from Citrus reticulata 'Chachi'2.6 茶枝柑果皮中类黄酮化合物与BSA相互作用机理
类黄酮与蛋白分子间的相互作用可改变蛋白的构象，减少蛋白的糖基化位点，是类黄酮抑制AGEs生成的重要途径[42]。为进一步探究三种茶枝柑主要类黄酮化合物抑制BSA糖基化的分子机制，本研究通过荧光猝灭光谱研究NOB、TAN和HES与BSA的相互作用。蛋白质的荧光猝灭可分为静态猝灭、动态猝灭和静态联合动态猝灭[45]。动态猝灭过程中，蛋白质吸收峰波长不发生改变，而静态猝灭则会导致吸收峰波长改变[46]。
如图8所示，BSA在353 nm处有特征荧光峰，随着NOB、TAN以及HES的浓度升高，BSA的荧光强度逐渐降低并且出现红移，表明NOB、TAN和HES均与BSA发生相互作用，并且诱导BSA的构象改变，推测是类黄酮化合物中的芳香环与BSA中的色氨酸、酪氨酸残基等荧光基团结合，导致荧光强度下降。因此，初步判断NOB、TAN和HES对BSA的淬灭过程为静态淬灭。
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图 8 不同浓度茶枝柑类黄酮化合物与BSA的荧光光谱注：A、D、G为NOB、TAN、HES对BSA荧光光谱的影响，B、E、H分别为NOB、TAN、HES与BSA相互作用的Stern-Volmer方程曲线图，C、F、I分别为NOB、TAN、HES与BSA相互作用的双对数曲线；a~g：c（BSA）=1.0 μmol/L，c（NOB）=0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.7（×10−5 mol/L），c（TAN）=0、0.27、0.54、1.1、1.6、2.1、2.7（×10−5 mol/L），c（HES）=0、0.32、0.65、1.0、1.3、1.6、2.5（×10−5 mol/L）。Figure 8. Fluorescence Spectra of BSA with different concentrations of Citrus reticulata 'Chachi' flavonoids不同浓度NOB、TAN和HES与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线呈线性关系（图8），结果显示三种类黄酮化合物对BSA的双分子猝灭速率常数（Kq）远高于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散猝灭常数（2.0×1010 L·mol−1·s−1），表明类黄酮和BSA的结合涉及单一猝灭机制，且静态猝灭可能是主要的猝灭方式[45]。结合常数Ka和结合位点数n也是研究小分子和蛋白质相互作用中常用的定量依据，结果如表2所示。TAN与HES与BSA的结合位点数n接近于1，表明BSA对这两种类黄酮有一类结合位点，而NOB得到的n接近2，BSA对川陈皮素可能存在两类结合位点。Ka是评价蛋白质和配体分子间结合亲合力的重要参数，BSA对不同类黄酮化合物的结合亲和力不同。BSA-NOB/TAN/HES的Ka范围在105~107（L·mol−1），表明蛋白与配体小分子之间存在较强的结合力[47]。
表 2 BSA与类黄酮相互作用的猝灭常数、结合常数及结合位点数Table 2. Quenching constants, binding constants and number of binding sites of BSA interaction with flavonoidsKsv
（×105L·mol−1）Kq
（×1013L·mol−1·s−1）n Ka
（×105L·mol−1）BSA+NOB 0.185 0.185 1.8359 933.25 BSA+TAN 0.432 0.432 1.2195 4.6773 BSA+HES 0.306 0.306 1.1221 1.0715 2.7 类黄酮化合物对BSA构象的影响
BSA中含有的芳香族氨基酸使其具有内源性荧光，当波长为285±5.0 nm时，BSA中的酪氨酸（TYR）和色氨酸（TRP）残基贡献出大部分的荧光发射，其中TRP残基的贡献大约是TYR残基的10倍以上[48]。同步荧光光谱可反映出配体对蛋白质构象的影响，提供分子微环境信息[49]。当波长间隔（Δλ）为15 nm和60 nm时，分别可以得到TYR和TRP残基的特征信息，最大发射波长的变化揭示TYR或TRP残基周围极性微环境的变化[50]。由图9可知，NOB、TAN和HES使BSA的TYR和TRP残基均发生荧光淬灭，并且最大特征荧光峰呈现轻微蓝移，表明类黄酮化合物的加入改变了BSA上的TYR和TRP残基周围极性微环境。比较BSA和三种类黄酮在不同扫描间隔（Δλ）下的同步荧光特性后发现，随着类黄酮化合物浓度的增加，BSA的荧光强度有规律地降低。
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图 9 不同浓度茶枝柑类黄酮化合物与BSA的同步荧光光谱注：A.NOB，D.HES，G.TAN，Δλ=15 nm；B.NOB，E.HES，H.TAN，Δλ=60 nm； a→j：c(NOB/HES/TAN)=0、2、4、6、8、10、15、20、25、30 μg/mL。Figure 9. Synchronous Fluorescence Spectra of BSA with different concentrations of Citrus reticulata 'Chachi' flavonoids通过比较三种类黄酮化合物对蛋白的同步荧光猝灭比，揭示不同类黄酮化合物对TRP和TYR残基的影响。随着NOB浓度的增加，TRP残基的荧光强度下降40.93%，比TYR残基的荧光强度下降（27.94%）更为显著；同样浓度的TAN则降低了TRP残基（63.59%）和TYR残基（47.83%）的荧光强度；HES降低了TRP残基（24.71%）和TYR残基（19.80%）的荧光强度，表明TRP残基对相互作用的贡献大于TYR残基，推测TRP残基应比TYR残基更靠近结合位点，而三种类黄酮化合物具有相似的荧光猝灭，说明茶枝柑类黄酮化合物可通过与BSA的TRP残基和TYR残基结合而影响其构象。
2.8 分子对接分析类黄酮化合物与BSA相互作用机理
三种类黄酮化合物均可与BSA相互作用，表明其可能通过竞争糖基化位点和改变蛋白质构象抑制AGEs生成。因此，通过计算机分子对接更直观地识别和可视化类黄酮化合物与BSA的结合位点和相互作用方式[51]。三种类黄酮化合物与BSA的的结合位点和作用方式如图10所示，三种类黄酮化合物与BSA的相互作用位点位于蛋白质分子亚结构域ⅡA与ⅢA之间的疏水空腔内。NOB能与BSA的ARG-194、TRP-213、ARG-217、LYS-294、SER-343和SER-453残基形成氢键，与BSA的ALA-341、VAL-342和ASP-450残基存在疏水相互作用。TAN能与TRP-213、ARG-217、LYS-294、VAL-342和ARG-198残基形成氢键，也与TRP-213、VAL-342和ASP-450残基之间存在疏水相互作用。同样，HES与BSA的SER-453、ARG-217、ARG-198、ARG-194和VAL-342残基形成氢键，与BSA的TRP-213和VAL-342残基存在疏水相互，并且ARG-194、ARG-198和ARG-217与HES分子之间形成盐桥。
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图 10 BSA与NOB（A）、TAN（B）及HES（C）的分子对接图Figure 10. Molecular docking simulation diagrams of BSA with NOB (A), TAN (B), and HES (C)氢键加强了类黄酮小分子化合物与BSA之间的非共价作用力，疏水相互作用可减少结合过程中水的介入，均有助于两者结合为稳定的复合物。三种类黄酮化合物均可与BSA上的TRP 213存在一种作用力，证明了2.7中提到的BSA中TRP残基更靠近结合位点并形成稳固的结合，因此降低了TRP残基的荧光强度。研究表明，赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸残基具有较高的亲核活性，是蛋白质糖化的主要位点[52]。Sobhy等发现[41]黑芥子苷、亚麻酸和异香草酸可通过与BSA的ARG 194、ARG 185、ARG 198、ARG 217、LYS 190、LYS 434和LYS 350残基结合抑制AGEs的形成。而三种类黄酮化合物在与BSA相互作用过程中均存在不同程度地封闭精氨酸（ARG）与赖氨酸（LYS）并阻断葡萄糖与这些活性位点发生反应，故能在一定程度抑制AGEs生成。
3. 结论
考虑到陈皮在制作和陈化过程中，自身会积累一定的AGEs，可能干扰体系中AGEs的测定，因此本研究选用茶枝柑鲜果为材料。结果表明，茶枝柑果皮提取物及其主要成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素能明显抑制BSA-Glu体系中荧光性AGEs和蛋白糖氧化产物的形成。茶枝柑类黄酮可以与BSA相互作用并静态猝灭BSA的内源荧光，两者的结合导致BSA轻微的构象和微环境变化。分子对接分析显示，类黄酮化合物可结合到BSA的疏水空腔并与BSA的ARG-194、TRP-213、ARG-217、LYS-294、VAL-342和ARG-198等残基相互作用。总之，茶枝柑果皮中川陈皮素、橘皮素、橙皮苷可以通过减少精氨酸、赖氨酸残基与还原糖的结合，阻断部分糖基化位点来保护BSA免受糖基化。
茶枝柑果皮药食同源，在广东地区也常用作食品调味剂，但目前有关茶枝柑类黄酮功能活性和药理作用的研究较为深入，在食品加工中的应用研究较少。本研究揭示了茶枝柑类黄酮抑制AGEs的作用机制，为陈皮入膳提供科学依据，为茶枝柑类黄酮AGEs抑制剂的开发奠定了理论基础。但本研究采用BSA-Glu化学体系，无法还原真实食品加工过程中的复杂变化，后续可进一步在食品体系中研究茶枝柑对AGEs的抑制作用，并揭示其对于食品香气、风味和质构的影响，开发出用于食品加工的茶枝柑抗糖化产品。
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图 1 茶枝柑鲜果四个生长期概览图
Figure 1. Overview of four growth stages of fresh Citrus reticulata 'Chachi'
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图 2 茶枝柑果皮提取物的总离子流图
Figure 2. Total Ion current chromatogram of Citrus reticulata 'Chachi' peel extract
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图 3 四个生长期茶枝柑果皮提取物中5种类黄酮化合物含量
注：小写字母表示化合物在不同生长期含量具有显著差异（P<0.05）。
Figure 3. Contents of five flavonoids in Citrus reticulata 'Chachi' peel extract at four growth stages
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图 4 四个生长期茶枝柑类黄酮提取物对BSA-Glu体系中荧光性AGEs的抑制效果
注：不同小写字母表示同一生长期茶枝柑在不同浓度下抑制率具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 4. Inhibitory effects of Citrus reticulata 'Chachi' peel extracts at four growth stages on fluorescent AGEs in BSA-Glu model
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图 5 三种类黄酮化合物对BSA-Glu体系中荧光性AGEs的抑制效果
注：不同小写字母表示同一化合物在不同浓度下抑制率具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 5. Inhibitory effect of three flavonoids on fluorescent AGEs in BSA-Glu model
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图 6 类黄酮化合物与茶枝柑提取物对BSA-Glu体系中蛋白糖氧化产物生成的抑制作用
注：A、C、E分别为类黄酮化合物对BSA-Glu体系中二酪氨酸、犬尿氨酸、N’-甲酰基犬尿氨酸生成的抑制作用；B、D、F分别为茶枝柑提取物对BSA-Glu体系中二酪氨酸、犬尿氨酸、N’-甲酰基犬尿氨酸生成的抑制作用。不同小写字母表示类黄酮化合物或同一时期茶枝柑提取物在不同浓度下抑制率具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 6. Inhibitory effects of flavonoids and Citrus reticulata 'Chachi' extract on protein glyoxidation products in BSA-Glu model
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图 7 三种茶枝柑类黄酮化合物的MGO/GO捕获能力
注：不同小写字母表示类黄酮化合物在不同浓度下捕获率有显著性差异（P<0.05）。
Figure 7. MGO/GO capturing capacity of three flavonoids from Citrus reticulata 'Chachi'
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图 8 不同浓度茶枝柑类黄酮化合物与BSA的荧光光谱
注：A、D、G为NOB、TAN、HES对BSA荧光光谱的影响，B、E、H分别为NOB、TAN、HES与BSA相互作用的Stern-Volmer方程曲线图，C、F、I分别为NOB、TAN、HES与BSA相互作用的双对数曲线；a~g：c（BSA）=1.0 μmol/L，c（NOB）=0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.7（×10−5 mol/L），c（TAN）=0、0.27、0.54、1.1、1.6、2.1、2.7（×10−5 mol/L），c（HES）=0、0.32、0.65、1.0、1.3、1.6、2.5（×10−5 mol/L）。
Figure 8. Fluorescence Spectra of BSA with different concentrations of Citrus reticulata 'Chachi' flavonoids
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图 9 不同浓度茶枝柑类黄酮化合物与BSA的同步荧光光谱
注：A.NOB，D.HES，G.TAN，Δλ=15 nm；B.NOB，E.HES，H.TAN，Δλ=60 nm； a→j：c(NOB/HES/TAN)=0、2、4、6、8、10、15、20、25、30 μg/mL。
Figure 9. Synchronous Fluorescence Spectra of BSA with different concentrations of Citrus reticulata 'Chachi' flavonoids
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图 10 BSA与NOB（A）、TAN（B）及HES（C）的分子对接图
Figure 10. Molecular docking simulation diagrams of BSA with NOB (A), TAN (B), and HES (C)
表 1 茶枝柑果皮提取物的主要化学成分
Table 1 Main chemical components of Citrus reticulata 'Chachi' peel extract
峰 保留时间（min） 鉴定化合物 分子式 [M+H]+ 误差（ppm） MS/MS碎片 鉴定依据 1 5.26 橙皮苷（Hesperidin） C28H34O15 611.1962 −1.54 449.1397；303.0857；153.0174 标准品 2 6.57 7-H-5,3’,4’-三甲基黄酮（7-Hydroxy-5,3',4'-trimethoxyflavone） C18H16O6 329.1021 0.07 314.0777；299.0543；268.0726 [38] 3 6.90 5-H-3’,4’,7,8-四甲氧基黄酮（5-Hydroxy-3',4',7,8-tetramethoxyflavone） C19H18O7 359.1122 −1.2 344.0872；326.0771；315.0878 [38−39] 4 7.23 5-H-3,6,7,8,4’-五甲氧基黄酮（5'-Hydroxy-3,6,7,8,4'-pentamethoxyflavone） C20H20O8 389.1240 1.69 374.0988；359.0756；341.0644；197.0078 [38,40] 5 7.35 2’,3’,4’,5,7-五甲氧基黄酮（2',3',4',5,7-Pentamethoxyflavone） C20H20O7 373.1296 3.09 358.1043；343.0816 [38] 6 7.52 5-H-3,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮
（5-Hydroxy-3,7,8,3',4'-pentamethoxyflavone）C20H20O8 389.1230 −0.05 374.0986；359.0757；341.0646 [38] 7 7.84 甜橙黄酮（Sinensetin） C20H20O7 373.1291 2.1 358.1042；344.0840；329.1017；312.0988 标准品 8 8.38 川陈皮素（Nobiletin） C21H22O8 403.1459 −4.1 388.1158；373.0956；355.0818；342.1096 标准品 9 8.48 4’,5,6,7-四甲氧基黄酮（4',5,6,7-Tetramethoxyflavone） C19H18O6 343.118 3.22 328.0935；313.0706；282.0884 标准品 10 8.76 3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮
（3,5,6,7,8,3',4'-Heptamethoxyflavone）C22H24O9 433.1506 2.74 418.1262；403.1030；385.0917 标准品 11 9.01 橘皮素（tangeritin） C20H20O7 373.1307 13.5 358.1055；343.0830；325.0712 标准品 12 9.52 5-去甲基川陈皮素
（5-Demethylnobiletin）C20H20O8 389.1240 2.11 359.0761；341.0651 标准品 13 10.16 2-（3,4-Dimethoxyphenyl）-5-
hydroxy-6,7-dimethoxy-4H-chromen-
4-oneC19H18O7 359.1129 0.76 344.0895；329.0652；311.0540 [38] 
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表 2 BSA与类黄酮相互作用的猝灭常数、结合常数及结合位点数
Table 2 Quenching constants, binding constants and number of binding sites of BSA interaction with flavonoids
Ksv
（×105L·mol−1）Kq
（×1013L·mol−1·s−1）n Ka
（×105L·mol−1）BSA+NOB 0.185 0.185 1.8359 933.25 BSA+TAN 0.432 0.432 1.2195 4.6773 BSA+HES 0.306 0.306 1.1221 1.0715
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