Effect of Protein Glutaminase on the Interface Properties of Zein
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摘要: 为提高玉米醇溶蛋白在食品工业中的应用，本文通过测定溶解度、蛋白质结构、表面疏水性、起泡性、乳化性、表面张力、表面膨胀模量等指标，探究了蛋白质谷氨酰胺酶（Protein Glutaminase，PG）不同添加量（0、10、20、30、40、50 U/g）对玉米醇溶蛋白界面性质的影响。结果表明，随着PG添加量的增加，玉米醇溶蛋白的脱酰胺度逐渐升高，酶添加量为40 U/g时溶解度与对照组相比提升了504.38%。二级结构结果表明，PG使β-折叠相对含量减少，β-转角相对含量增加。内源荧光强度和表面疏水性先减小后增加，其微观结构由块状变成了片状，形成了规则的三维网状结构。拉曼光谱分析结果表明酪氨酸残基峰强比（I850/I830）增强，色氨酸残基峰强比（I760/I1004）先降低后升高。此外，PG降低了玉米醇溶蛋白在气-液界面的表面张力，增强了其表面膨胀模量，显著（P<0.05）提升了其乳化与起泡活性。综上所述，本研究表明PG处理可以改变玉米醇溶蛋白的结构，改善其界面性质，提高功能特性，有利于玉米醇溶蛋白在食品工业中更好的应用。Abstract: To improve the application of zein in the food industry, the present study explored the effect of adding different amounts (0, 10, 20, 30, 40, and 50 U/g) of protein glutaminase (PG) on the interfacial properties of zein by measuring solubility, protein structure, surface hydrophobicity, foaming, emulsification, surface tension, surface expansion modulus, and other indicators. As the amount of PG added was increased, the degree of zein deamidation gradually increased. When the amount of enzyme added was 40 U/g, the solubility increased by 504.38% compared with that of the control group. The secondary structure results showed that PG reduced the relative content of β-sheet and increased the relative content of β-turn. The endogenous fluorescence intensity and surface hydrophobicity first decreased and then increased, and the microstructure changed from blocks to flakes, forming a regular three-dimensional (3D) network structure. Raman spectral analysis showed that the peak intensity ratio of tyrosine residues (I850/I830) was enhanced, whereas the peak intensity ratio of tryptophan residues (I760/I1004) first decreased and then increased. In addition, PG reduced the surface tension of zein at the air-liquid interface, enhanced its surface expansion modulus, and significantly (P<0.05) improved its emulsification and foaming properties. In summary, the present study showed that PG treatment can change the structure of zein, improve its interfacial properties, and enhance its functional properties, which enables the improved use of zein in the food industry.
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Keywords:
- protein glutaminase /
- zein /
- interface properties /
- air-liquid interface
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2022年我国玉米产量达到27720.3万吨，玉米醇溶蛋白是玉米中的主要蛋白，是玉米生产加工过程中的主要副产物之一，具有丰富的原料来源[1]。此外，玉米醇溶蛋白具有生物相容性，是一种公认的可食用且安全的蛋白质[2]。它对环境友好、可生物降解且无毒，是一种有潜力的食品原料[3]。但是玉米醇溶蛋白的疏水性氨基酸占据了其总氨基酸的四分之三[4]，一方面，玉米醇溶蛋白的疏水性使其已被广泛应用于耐水的食用膜[5]，而另一方面，高疏水性导致其在纯水中几乎难以溶解，使玉米醇溶蛋白在各种食品中的应用受到了限制。研究人员在尝试提高玉米醇溶蛋白溶解度和扩大其在食品中的应用时发现，玉米醇溶蛋白起泡性、乳化性和凝胶性等功能特性的改善使其在提升食品结构、替代动物蛋白、制作乳液蛋白凝胶等方面具有巨大的应用潜力[4]。有研究表明，通过改变蛋白质的界面性质、控制界面膜的形成可以实现对食品起泡性、乳化性等功能特性的调控[6]。
目前研究者通常使用物理、化学或酶法处理玉米醇溶蛋白提高其在食品中的应用。Li等[7]研究发现，冷等离子体处理玉米醇溶蛋白之后提高了其悬浮液的分散稳定性和亲水性，但是物理改性通常受限于仪器设备，并且具有严苛的反应条件要求。Li等[8]使用单宁酸对玉米醇溶蛋白进行改性发现，显著改善了其乳化性能和界面性质，大幅度降低了其表面疏水性。Li等[9]通过NaOH对玉米醇溶蛋白进行脱酰胺处理发现增强了其在食品应用中的功能特性。但是化学改性可能会引入新的官能团，工艺相对复杂，化学试剂及其反应产物带来的安全性问题也不容忽视[10]。与物理和化学改性相比，酶法改性效果显著，条件温和，但是传统的酶法改性也会产生过度水解以及不良风味等问题。Leulmi等[11]研究发现使用蛋白酶酶解酪蛋白时容易发生过度水解现象，并且使奶酪的味道变苦。而蛋白质谷氨酰胺酶（PG）只作用于植物蛋白质中谷氨酰胺残基的胺酰基，不会对其它以及游离的氨基酸产生作用导致蛋白质营养价值变低、产生不良风味等巨大的副作用。GB 2760-2024中正式规定来源于解朊金黄杆菌的PG可以作为食品添加剂的新品种[12]。已有研究证明，PG可以显著改善椰子蛋白和月见草蛋白的溶解度、乳化稳定性和发泡能力[13−14]，提升豌豆分离蛋白的溶解度和分散性等[15]。蛋白质界面性质变化与其起泡性、乳化性等功能特性存在极大的相关性[16]，蛋白质分子结构与其界面性质之间的关系复杂，目前PG对植物蛋白界面性质的影响还鲜有报道。
因此，本实验旨在探究PG添加量对玉米醇溶蛋白结构与功能特性以及界面性质的影响并揭示其结构、功能特性和界面性质之间的关系。以期通过PG改性玉米醇溶蛋白，改善其界面性质，从而增强其功能特性，拓宽玉米醇溶蛋白在饮料、无麸质发酵制品、冰淇淋等食品加工中的应用。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
玉米醇溶蛋白（95%） 上海麦克林生化科技股份有限公司；蛋白质谷氨酰胺酶（660 U/g） 天野酶制品株式会社；苯酚、亚硝基铁氰化钠、硫酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；其余试剂均为分析纯。
LGJ-50 FD冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公公司；UV-1100紫外分光光度计 上海美普达仪器有限公司；HH-6水浴锅 新瑞仪器厂；Nano-ZS 90激光纳米粒度仪 英国MaLvern；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；Vertex 70傅里叶变红外光谱仪 德国Bruker公司；DSC Q 20差示扫描量热仪 美国TA公司；Invia拉曼光谱仪 德国Brabender公司；IKA高速剪切均质机 德国弗鲁克流体机械制造有限公司；JEM-6490 LV场发射扫描电子显微镜 日本JEOL公司；Tracker S全自动界面流变仪 法国Teclis。
1.2 实验方法
1.2.1 脱酰胺玉米醇溶蛋白的制备
根据Yong等[17]的方法略有改动，配制含有11.7%的乙醇的磷酸盐缓冲溶液（50 mmol/L，pH8），分别加入0、10、20、30、40、50 U/g的PG（以加入的玉米醇溶蛋白的质量计），然后将玉米醇溶蛋白分散在配制好的溶液中形成1%的分散悬浮液。样品在40 ℃水浴反应12 h，反应结束后立即对样品进行冰水浴处理以抑制PG的活性。将所得样品冻干，并研磨过100目筛于室温下保存在密封袋中，留作进一步分析使用。
1.2.2 玉米醇溶蛋白脱酰胺度（DD）的测定
本实验使用苯酚-次氯酸盐法测定玉米醇溶蛋白的脱酰胺程度[18]，以硫酸铵标准溶液绘制标准曲线（y=32.9470x−0.7868，R²=0.9980），y为游离氨浓度（μg/μL），x为吸光度值的平均值。
样品游离氨含量的测定：使用5 mL移液枪准确移取5.0 mL苯酚-亚硝基铁氰化钠溶液于试管中，再加入20 μL 1%的样品溶液混合均匀，然后再准确加入5.0 mL碱性次氯酸盐溶液充分混合均匀后立即放入37 ℃水浴锅显色20 min，用紫外分光光度计在625 nm处测定溶液的吸光度值，根据上述的标准曲线计算出样品中游离氨含量。
样品中总酰胺含量的测定：在1%玉米醇溶蛋白悬浊液中加入等体积的2 mol/L硫酸，100 ℃金属浴4 h，反应结束后，将溶液调到中性，取20 μL样品溶液和5.0 mL的苯酚-亚硝基铁氰化钠溶液充分振荡混合均匀，再加入5.0 mL碱性次氯酸盐溶液混合均匀迅速转移至37 ℃的水浴锅中显色20 min，测定溶液在625 nm波长下的吸光值，根据上述的标准曲线计算出样品中总酰胺含量。
脱酰胺度（DD）计算公式为：
(1) 1.2.3 脱酰胺玉米醇溶蛋白溶解度的测定
参考Bai等[19]的方法并作部分改动，称取20 mg脱酰胺玉米醇溶蛋白样品分散在10 mL PBS缓冲溶液中（pH7），将配制好的溶液于25 ℃水浴下振荡1 h，然后在4 ℃以12000 r/min离心15 min，离心后上清液中脱酰胺玉米醇溶蛋白溶液中的蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清蛋白做标准曲线（y=1.1575x−0.0068, R²=0.9983），y为蛋白质质量浓度（mg/mL），x为吸光度值的平均值，每组样品做三个平行。
1.2.4 脱酰胺玉米醇溶蛋白二级结构的测定
参考Tian等[20]的方法并稍作改动，按照1：50的比例分别称取5 mg脱酰胺玉米醇溶蛋白和250 mg的KBr研磨均匀后进行压片，使用傅里叶红外光谱仪在4000~500 cm−1的波段范围内扫描样品64次。
1.2.5 脱酰胺玉米醇溶蛋白内源性荧光光谱的测定
参考Wang等[21]的方法并稍作改动，使用PBS缓冲溶液（pH7）配制1 mg/mL的脱酰胺玉米醇溶蛋白样品溶液，并在295 nm的激发波长下记录脱酰胺玉米醇溶蛋白样品在300~420 nm范围内的内源性荧光强度。
1.2.6 脱酰胺玉米醇溶蛋白拉曼光谱分析
使用激光共聚焦显微镜拉曼光谱仪测定样品的拉曼光谱。将蛋白质样品平铺在载玻片上，在785 nm的波长下，使用50%的能量进行激发，在2000~400 cm−1范围内收集拉曼光谱，数据采集时间为20 s[22]。
1.2.7 脱酰胺玉米醇溶蛋白微观结构的观察
将脱酰胺玉米醇溶蛋白样品粉末放置在有导电硅胶带的载物台上，对样品进行喷金处理之后，于20 kV下使用场发射扫描电子显微镜观察样品微观形态。
1.2.8 界面特性的测定
1.2.8.1 脱酰胺玉米醇溶蛋白表面疏水性的测定
采用溴酚蓝结合法测定脱酰胺玉米醇溶蛋白样品的表面疏水性[23]。蛋白质样品使用PBS缓冲溶液（pH7）稀释至5 mg/mL，再加入200 μL 1 mg/mL的溴酚蓝指示剂，充分混匀之后在4 ℃，6000 r/min的条件下离心15 min，取上清液并且将其稀释10倍后在595 nm处测定其吸光度值（A样），空白组为缓冲溶液（A空）。表面疏水性以溴酚蓝结合量（μg）表示，通过以下公式计算：
(2) 1.2.8.2 脱酰胺玉米醇溶蛋白乳化特性的测定
参考Hu等[24]的方法并作部分修改，将质量浓度为10 mg/mL的脱酰胺玉米醇溶蛋白样品溶液15 mL与5 mL大豆油混合，在10000 r/min的转速下高速剪切乳化2 min。在乳化完成后立即取100 μL底部乳液，在乳化完成的10 min后同样取100 μL底部乳液，并且立即与0.1%的十二烷基硫酸钠溶液混合均匀，涡旋1 min后使用紫外分光光度计于500 nm处测定样品的吸光度值。乳化活性指数（emulsification activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsification stability index，ESI）的计算公式如下：
(3) (4) 式中：A0，乳液在0 min时的吸光度；A10，乳液在10 min时的吸光度；N，稀释因子；φ，油相体积分数；C，样品浓度，g/mL。
1.2.8.3 脱酰胺玉米醇溶蛋白起泡性和起泡稳定性的测定
参考Li等[25]的方法并稍作修改。配制2 mg/mL的脱酰胺玉米醇溶蛋白样品溶液，使用高速剪切机在10000 r/min的转速下均质2 min，立即将溶液倒入量筒中测量体积V1，静置15 min后记录体积V2。起泡性（FC）和起泡稳定性（FS）的计算公式如下：
(5) (6) 式中：V0表示样品初始体积，mL。
1.2.8.4 表面张力的测定
通过分析脱酰胺玉米醇溶蛋白在界面吸附过程中表面张力的变化来分析其界面吸附行为。配制质量浓度为1 mg/mL的脱酰胺玉米醇溶蛋白样品，选取全自动界面流变仪的悬滴模式测定样品在空气-水界面上的吸附情况。使用直针吸取样品溶液，通过程序控制形成10 μL的样品溶液液滴。在室温下进行该实验，测试时间为5400 s。
1.2.8.5 表面膨胀模量分析
通过分析脱酰胺玉米醇溶蛋白在界面吸附过程中表面膨胀模量的变化来分析其界面流变行为。采用全自动界面张力仪对脱酰胺玉米醇溶蛋白的空气-水界面膨胀模量进行测定，测试时间为5400 s，测试振幅为10%。
1.3 数据处理
本实验所有数据均进行三次平行测定，数据以平均值±标准差表示。使用SPSS软件对数据进行显著性分析，P<0.05表示数据之间存在显著性差异。采用Origin软件对原始数据进行整理和绘图。
2. 结果与分析
2.1 脱酰胺对玉米醇溶蛋白脱酰胺度的影响
PG对蛋白质的结构及功能特性的影响通常依赖于蛋白质的脱酰胺程度。如图1所示，PG催化玉米醇溶蛋白脱酰胺的程度呈现酶剂量依赖性增加的现象，当加酶量达到50 U/g时DD达到了54.17%，与PG脱酰胺椰子蛋白[13]和月见草中可食用蛋白[26]中的研究结果一致。PG酶具有较高的特异性，DD主要取决于蛋白质本身的结构以及谷氨酰胺残基含量的多少[27]，所以当加酶量超过30 U/g时，随着加酶量的增加DD的增加量相对减小，因为酶与底物的结合位点接近饱和。并且脱酰胺玉米醇溶蛋白的DD值（54.17%）高于椰子蛋白（36.1%）[13] 和肌原纤维蛋白（6.8%）[28]，这可能是因为玉米醇溶蛋白含有较多的谷氨酰胺残基并且在处理过程中蛋白质结构展开程度较高[28]。
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2.2 脱酰胺对玉米醇溶蛋白溶解度的影响
未处理和脱酰胺玉米醇溶蛋白样品的溶解度如图2所示。PG处理过的玉米醇溶蛋白溶解度均高于未处理的，总体上随着加酶量的添加溶解度呈现先增加后减小的趋势，溶解度得到了显著改善（P<0.05）。当加酶量达到40 U/g时，与对照组相比脱酰胺玉米醇溶蛋白的溶解度提升了504.38%。可能是因为蛋白质净电荷和结构灵活性变化的共同作用[15]。玉米醇溶蛋白经过PG脱酰胺后其谷氨酰胺残基中的酰胺基被转化为羧基，使蛋白质分子的电荷发生改变，分子之间静电斥力增强，减弱了蛋白质分子之间的聚集能力，从而使蛋白质的溶解度得到了显著的提升[29−30]。当加酶量达到50 U/g时，溶解度有一定程度的下降，这可能是因为过量的PG与玉米醇溶蛋白产生了较大的聚集体，形成了空间位阻[31]。此外，也有可能是脱酰胺达到一定程度时，蛋白质分子之间又会重新富集形成聚集体[15]。
2.3 脱酰胺对玉米醇溶蛋白二级结构的影响
蛋白质二级结构变化在一定程度上决定了蛋白质的加工性能，脱酰胺玉米醇溶蛋白红外光谱如图3A所示，在1600~1700 cm−1波段内具有吸收峰，是蛋白质主链中最敏感的振动带，其变化反映了蛋白质二级结构相对含量的变化。如图3B所示，随着PG添加量的增加（0~50 U/g），脱酰胺玉米醇溶蛋白样品β-折叠相对含量逐渐减少，从29%减少到了12%。与对照组相比，随着PG添加量的增加，α-螺旋的相对含量依次增加了17.86%、7.14%、10.71%、17.86%、21.43%。Jiang等[30]和Yong等[32]的研究也都发现经过PG脱酰胺作用之后，蛋白质的β-折叠相对含量减少，α-螺旋的相对含量增加。这可能是因为当进行PG脱酰胺时，改变了蛋白质间的电荷条件，增强了β-折叠构象之间的静电斥力，导致它们分离，从而使β-折叠含量的减少和被称为“环”的无界移动区域的形成[32]。β-折叠结构属于比较稳定有序的结构，而α-螺旋相对来说更具有柔性和更加灵活[27]。β-转角结构和无规则卷曲结构则相对来说较为松散无序，与对照组相比，这种相对无序结构（β-转角结构和无规则卷曲结构之和）依次增加了20.93%、30.23%、30.23%、27.90%、25.58%。这表明合适添加量的PG使玉米醇溶蛋白无序结构增加，蛋白柔性和可溶性提高[27]。
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图 3 脱酰胺对玉米醇溶蛋白二级结构的影响注：A .红外光谱；B.二级结构相对含量。Figure 3. Effect of deamidation on the secondary structure of zein2.4 脱酰胺玉米醇溶蛋白对内源性荧光光谱的影响
蛋白质固有的荧光主要是由氨基酸残基色氨酸（Tryptophan）、酪氨酸（Tyrosine）和苯丙氨酸（Phenylalanine）引起的，其光谱可以反映出蛋白质的构象变化。如图4所示，随着加酶量的增加，脱酰胺玉米醇溶蛋白的荧光强度呈现出下降的趋势。荧光强度受多方面的因素影响，这可能是因为脱酰胺作用将疏水性的胺基转换为了羧基，色氨酸所处的极性环境改变；其次可能是随着加酶量的增大空间位阻作用也越来越大，荧光发色基团的信号被屏蔽削弱了蛋白质的三级结构或者脱酰胺作用引起了静电斥力的增加。同时由图4可知，玉米醇溶蛋白脱酰胺后的最大发射波长总体来说发生了红移（361 nm→370 nm），说明经过PG酶解后玉米醇溶蛋白的三级结构发生了变化，结构展开变得松散，疏水性氨基酸周围微环境发生变化处在更加亲水的环境中[33]。
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图 4 脱酰胺对玉米醇溶蛋白内源性荧光光谱的影响Figure 4. Effect of deamidation on the endogenous fluorescence spectrum of zein2.5 脱酰胺玉米醇溶蛋白侧链构象分析
拉曼光谱可以通过芳香族氨基酸的侧链（酪氨酸和色氨酸等）的特征条带获得有关蛋白质三级结构变化的信息[34]。脱酰胺对玉米醇溶蛋白拉曼光谱的影响如图5A所示，酪氨酸双峰的比例（830 和 850 cm−1附近）可以反映出酪氨酸残基周围微环境的变化[35]。如图5B所示，随着加酶量的增加玉米醇溶蛋白的I850/I830比值显著上升（P<0.05），当加酶量大于40 U/g时其比值大于1，这说明酪氨酸残基暴露，并且与氢键结合，从而有利于与水分子的相互作用[36]。表明经过PG处理后，脱酰胺玉米醇溶蛋白的酪氨酸残基逐渐从蛋白质内部暴露出来。由色氨酸残基吲哚环振动引起的拉曼光谱谱带可以反映出其周围微环境的变化，并且色氨酸残基越暴露其强度越低[37]。由图5C可知，经过PG改性后玉米醇溶蛋白的色氨酸谱带强度出现先逐渐降低再升高的趋势，这说明脱酰胺使色氨酸残基逐渐暴露出来，而后又趋于包埋态。这可能是因为脱酰胺使蛋白质结构展开，而后色氨酸残基的包埋可能与过度脱酰胺后聚集体的形成有关[15]。
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图 5 脱酰胺对玉米醇溶蛋白氨基酸侧链的影响注：A.拉曼光谱；B.I850/I830；C. I760/I1004。Figure 5. Effect of deamidation on zein amino acid side chains2.6 脱酰胺对玉米醇溶蛋白微观结构的影响
通过图6可以发现，对照组蛋白呈现不规则的块状，表面较为平滑没有不规则的孔洞。PG添加量为10~30 U/g时，随着加酶量的增加，蛋白质颗粒逐渐由块状展开为片状，并且表面的孔洞逐渐增多。在添加量为30 U/g时蛋白质表面形成了规则的三维网状结构，同样证明了PG可以使玉米醇溶蛋白结构变得更加灵活、松散，这与蛋白质二级结构的变化是一致的（图3）。但是随着PG添加量的进一步增加，蛋白质表面孔洞变大且分布不规则，在加酶量达到50 U/g时甚至发生塌陷且三维网状结构被破坏，这可能是过量的PG导致玉米醇溶蛋白上的结合位点饱和，产生了负面影响，艾洪湖等[31]研究不同谷氨酰胺转氨酶添加量对香菇蛋白的微观结构的影响时也得到了类似的结果。
2.7 脱酰胺对玉米醇溶蛋白界面性质的影响
2.7.1 脱酰胺对玉米醇溶蛋白表面疏水性的影响
表面疏水性可以反映出蛋白质表面疏水面积的大小，同时也可以表征蛋白质分子经过改性后的结构变化[38]。如图7所示，随着PG添加量的增大，脱酰胺玉米醇溶蛋白的表面疏水性显著下降（P<0.05），说明PG酶解使蛋白质结构展开暴露出了更多的亲水基团，同时PG酶解使蛋白质中的疏水性氨基转化为了亲水性的羧基，从而导致了其表面疏水性的下降[39]。还有可能是因为经过PG处理后，蛋白质内疏水相互作用和静电斥力导致其结构展开，使亲水性基团和疏水性基团重新分布，蛋白质的表面疏水性下降[32−33]。通常表面疏水性的降低会增加蛋白质的溶解度，这与溶解度的变化趋势相一致（图2）。
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图 7 脱酰胺对玉米醇溶蛋白表面疏水性的影响Figure 7. Effect of deamidation on surface hydrophobicity of zein2.7.2 乳化活性和乳化稳定性
乳化活性表征蛋白质在界面上的吸附能力，而乳化稳定性是衡量一段时间内乳化液保持乳化的能力[40]。如图8所示，随着加酶量的增加，乳化活性呈现出先增大后减小的趋势，在加酶量为30 U/g时蛋白质乳化活性由对照组的20.16 m2/g提升到了78.73 m2/g。这可能是因为随着脱酰胺程度的增加，蛋白质结构展开，分子柔性增加，导致油水界面张力降低提高了乳化活性[41]。随着PG添加量的继续增大，可能是由于形成了较大的聚集体影响了界面攀爬的速度，从而使乳化活性降低[39]。与对照组相比，添加PG后蛋白质的乳化稳定性出现了显著性的下降（P<0.05），但不同加酶量对其影响不显著（P>0.05）。这可能是因为静电斥力的增大，使其在界面难以稳定吸附，并且表面疏水性的下降也使蛋白质分子之间的相互作用减弱，从而导致乳化稳定性下降[42]。
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图 8 脱酰胺对玉米醇溶蛋白乳化性质的影响Figure 8. Effect of deamidation on emulsifying properties of zein2.7.3 起泡性和起泡稳定性
图9显示了不同PG添加量对玉米醇溶蛋白起泡性和起泡稳定性的影响。随着PG添加量的增加，玉米醇溶蛋白的起泡性和起泡稳定性都呈现出先增大后减小的趋势。在加酶量为30 U/g时，玉米醇溶蛋白的起泡性和起泡稳定性都达到了一个相对较高的状态，分别是59.31%和38.94%。这是因为脱酰胺处理增加了蛋白质的分子柔性，降低了蛋白质的表面张力，从而改善了其起泡性质[43]。随着PG添加量的继续增大，蛋白质暴露出来更多的疏水性基团又形成了较多的聚集体，削弱了蛋白质在气-水界面形成液膜的能力[39]，从而导致了其起泡性质的显著下降（P<0.05）。
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图 9 脱酰胺对玉米醇溶蛋白起泡性质的影响Figure 9. Effect of deamidation on the foaming properties of zein2.7.4 表面张力
如图10所示，蛋白质动态表面张力的下降速率总体上呈现先上升后下降的趋势，平衡后的表面张力值呈现先下降后上升的趋势。当加酶量达到30 U/g时蛋白质的表面张力达到了最低，这是因为适度的脱酰胺增加了蛋白质的分子柔性，结构展开暴露出来更多的疏/亲水基团，更加有利于蛋白质在气-水界面的吸附，从而使蛋白质的表面张力降低[1]。随着加酶量的增加，又形成了较大的聚集体，以及表面疏水性的降低也不利于蛋白质在界面上的吸附，从而导致表面张力的增加。蛋白质在气-水界面的表面张力对其起泡性质有着很大的影响，然而表面张力与起泡性质的总体变化趋势相似却并不完全一致，这说明表面张力并不是决定蛋白质起泡性质的唯一因素。任中阳等[44]发现鲢鱼肌浆蛋白的起泡性与溶解度有直接关系；Johnson等[45]研究发现蛋白质水解物聚集体的大小也会对其起泡性产生直接影响。
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图 10 脱酰胺对玉米醇溶蛋白气-水动态表面张力的影响Figure 10. Effect of deamidation on the air-water dynamic surface tension of zein2.7.5 表面膨胀模量
表面膨胀流变学是一个重要的表征，通过其可以确定吸附在气-水界面的蛋白质的相互作用[46]。如图11所示，随着PG添加量的增大，脱酰胺玉米醇溶蛋白的表面膨胀模量呈现先增大后减小的趋势。当加酶量达到30 U/g时蛋白质的表面膨胀模量达到了最大40.74 mN/m。这可能是因为适度的脱酰胺，增强了蛋白质分子柔性，形成了致密的三维网状结构，疏水性基团暴露，蛋白质分子之间的相互作用加强，从而增强了蛋白质在吸附层薄膜的稳定性。当PG量继续增加时，蛋白质网络结构塌陷，重新形成了聚集体，疏水相互作用减弱使蛋白质界面膜的稳定性变差。
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图 11 脱酰胺对玉米醇溶蛋白表面膨胀模量的影响Figure 11. Effect of deamidation on surface expansion modulus of zein3. 结论
本文研究了PG添加量对玉米醇溶蛋白界面性质的影响。结果表明：PG脱酰胺会显著影响蛋白质的结构与功能特性以及界面性质。当加酶量为30 U/g时玉米醇溶蛋白形成了规则的三维网状结构，乳化性最高达到了78.73 m2/g，溶解度为0.29 mg/mL，起泡性和起泡稳定分别是59.31%和38.94%。适度的脱酰胺一方面提高了蛋白质的溶解度，降低了其表面张力，增加了其表面膨胀模量；另一方面使玉米醇溶蛋白β-折叠相对含量减少、无序结构增加，柔性和可溶性提高、进而使疏水性氨基酸残基暴露，从而增强了蛋白质在界面吸附层薄膜的稳定性。本研究为改善玉米醇溶蛋白的溶解度和界面性质提供了一定的理论依据，可以为拓宽其在食品工业中的应用提供参考。然而由于玉米醇溶蛋白自身的结构特性，使得反应初期酶不易于作用于玉米醇溶蛋白，大大降低了反应速率，今后可探究新的反应体系有效提升其反应速率。
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图 3 脱酰胺对玉米醇溶蛋白二级结构的影响
注：A .红外光谱；B.二级结构相对含量。
Figure 3. Effect of deamidation on the secondary structure of zein
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图 4 脱酰胺对玉米醇溶蛋白内源性荧光光谱的影响
Figure 4. Effect of deamidation on the endogenous fluorescence spectrum of zein
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图 5 脱酰胺对玉米醇溶蛋白氨基酸侧链的影响
注：A.拉曼光谱；B.I850/I830；C. I760/I1004。
Figure 5. Effect of deamidation on zein amino acid side chains
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图 7 脱酰胺对玉米醇溶蛋白表面疏水性的影响
Figure 7. Effect of deamidation on surface hydrophobicity of zein
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图 8 脱酰胺对玉米醇溶蛋白乳化性质的影响
Figure 8. Effect of deamidation on emulsifying properties of zein
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图 9 脱酰胺对玉米醇溶蛋白起泡性质的影响
Figure 9. Effect of deamidation on the foaming properties of zein
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图 10 脱酰胺对玉米醇溶蛋白气-水动态表面张力的影响
Figure 10. Effect of deamidation on the air-water dynamic surface tension of zein
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