Mechanism of the Regulatory Effect of Pediococcus pentosaceus CQFP202437 on Antibiotic-induced Locomotor Dysfunction in Mice
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摘要: 本研究旨在探究戊糖片球菌CQFP202437对抗生素诱导小鼠运动失调的保护作用，探讨益生菌的作用效果和机理。使用无菌处理后的混合抗生素溶液腹腔注射构建小鼠运动失调模型，造模结束后测定各组小鼠跑步和游泳等运动参数的变化以及小鼠血清和脑组织中丙二醛（Malonic Dialdehyde, MDA），超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、还原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione, GSH），小鼠白细胞介素（Interleukin-6，IL-6、Interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）；小鼠盲肠肠道屏障基因occludin-1、zo-1和claudin-1的mRNA相对表达量；小鼠脑组织中CREB、ERK1/2和BDNF基因的mRNA相对表达量。结果显示，与模型组相比，戊糖片球菌CQFP202437显著提升了小鼠游泳和跑步的时间（P<0.01），显著（P<0.05）降低小鼠大脑中炎症因子IL-6、TNF-α的水平，增加小鼠大脑中SOD的表达，减少小鼠大脑和血清中MDA的累积。并且戊糖片球菌CQFP202437能提升小鼠大脑组织中BDNF代谢通路相关基因BDNF、ERK1/2、CREB的表达，增强BDNF的作用，还能上调盲肠组织中Occludin-1基因表达。研究结果表明戊糖片球菌CQFP202437对抗生素诱导小鼠运动机能失调有调节作用，为提升运动机能益生菌制剂的研制和开发提供理论依据。Abstract: To investigate the protective effect of Pediococcus pentosaceus CQFP202437 against antibiotic-induced locomotor disorders in mice, and to explore the effect and mechanism of probiotics. Probiotics are active microorganisms that are beneficial to health when given in sufficient quantities. In order to investigate the protective effect of Pediococcus pentosaceus CQFP202437 against antibiotic-induced locomotor disorders in mice. In this study, a processed antibiotic mixture was used to construct a model of locomotor disorders in mice by intraperitoneal injection. After the modeling period, the changes of locomotor parameters in mice were measured in each group, such as running and swimming, as well as changes in mice serum and cerebrum. The changes of exercise parameters such as running and swimming in each group of mice, and the relative mRNA expression of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), reduced glutathione (GSH), interleukin (IL-6, IL-10) and tumor necrosis factor (TNF-α) in serum and cerebrum of mice. The expression of mRNA of oclaudin-1, zo-1, and claudin-1 of the gut barrier genes of the cecum. The mRNA expression of the CREB, ERK and BDNF genes of the cerebrum in mice. The mRNA expression of the CREB, ERK and BDNF genes of the cerebrum were determined. Results indicate that Pediococcus pentosaceus CQFP202437 significantly increased both swimming and running duration in mice compared to the model group (P<0.01). Additionally, this treatment significantly reduced the levels of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in the cerebrum, enhanced the expression of superoxide dismutase (SOD), and decreased the accumulation of malondialdehyde (MDA) in both the cerebrum and serum of the mice. Furthermore, Pediococcus pentosaceus CQFP202437 improved the expression of BDNF, ERK1/2, CREB, and genes associated with the BDNF metabolic pathway in the cerebrum. It also upregulated the expression of the Occludin-1 gene in the cecum, which is crucial for maintaining intestinal barrier integrity and ensuring normal physiological function. These results suggest that Pediococcus pentosaceus CQFP202437 exerts a modulating effect on antibiotic-induced locomotor dysfunction in mice, providing a theoretical foundation for the development of probiotic formulations aimed at enhancing locomotor function.
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长时间的高强度运动会引起身体各个系统的耐受力下降，系统功能受到影响，机体的抗氧化系统遭到破坏，体内产生脂质过氧化，自由基也大量增加，机体因此会产生保护性抑制，运动员身体机能和运动能力会严重下降，恢复能力也大大延长[1]。高强度运动后中枢系统会产生疲劳，进而导致反应力缓慢、注意力集中困难、疲惫无力、心情极度糟糕等[2]。机体运动时，机体内不但发生一系列物质代谢和能量代谢的变化，还与外界环境持续进行着物质交换。保证机体运的动力在于不断产生ATP，促进与阻抑机体运动能力的关键在于促进与阻抑机体ATP的产生[3]。运动时，机体会出现一些物质代谢的变化如糖类贮存的排空、血糖浓度降低、肌肉和血液乳酸浓度升高、pH降低，伴随着外周骨骼肌细胞乳酸堆积并释放进入血液循环，这些变化与运动时疲劳的发生有相当密切的关系[4]。另外，急性运动可能会诱导氧化应激的产生，进而造成蛋白质、脂质、核酸等物质的氧化损伤[5]。
研究表明，大脑在执行高水平认知活动时，神经元主要依靠乳酸（而非葡萄糖）作为能量底物产生ATP，维持突触活动；在高强度运动情况下，脑葡萄糖摄取随着运动强度的增加而降低，提示大脑可能利用乳酸补偿在高强度运动期间维持神经元活动所需的能量[6]。耐力运动会造成神经外周和脑炎症水平的升高，因而降低运动引起的神经外周血、神经以及肝脏的炎症水平均可延缓运动疲劳发生[7]。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子（Neurotropins）家族的重要成员，它们主要在脑和神经组织表达，对神经细胞的分化和神经元的存活具有重要作用。BDNF与TrκB结合后，激活下游丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，然后ERK激酶和ERK相继被激活，最终导致CREB的磷酸化，增强学习和记忆功能，有助于运动能力提升[8]。具有抗氧化或抗炎特性的活性物质，如多酚提取物能够作为营养补充剂起到调节运动状态和抗疲劳的效果[9]。因而，寻求更为天然的可降低神经炎症的抗氧化剂对运动机能的提升有一定的辅助作用。
乳酸菌是一类以乳酸为主要发酵终产物的革兰氏阳性菌，在自然界分布广泛，具有调节人体肠道微生物群、调节免疫力、降低血糖和延缓衰老等多种益生特性[10]。益生菌是调节肠道菌群组成和功能的有效手段。这促进了微生物多样性，增加了繁殖，并有助于促进健康物种的生长。有研究显示适当剂量的植物乳植杆菌补充剂可以改善疲劳相关症状，减轻运动疲劳，加速肌肉损伤的恢复[11]。戊糖片球菌属于乳酸菌科（Lactobacillaceae）、片球菌属（Pediococcus），具有调节肠道免疫功能、提高营养物质的合成代谢以及降低胆固醇含量等多种生理活性，是一株有较多益生潜能的菌株[12]。前期戊糖片球菌相关的研究多集中于发酵性能以及抗氧化能力，针对其运动机能的益生性能研究较为缺乏。
本研究以一株分离自腊肉中的戊糖片球菌为研究对象，采用混合抗生素腹腔注射构建小鼠运动失调模型，以小鼠跑台实验和负重游泳实验为参数，探讨戊糖片球菌对抗生素诱导小鼠运动机能的调节作用，旨在为提升运动机能益生菌制剂的研制和开发提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
戊糖片球菌CQFP202437菌种 保藏于中国微生物菌种保藏中心（保藏编号为29614）。
30只6-8周龄的雄性SPF级C57BL/6J小鼠及小鼠饲料 湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号： SCXK（湘）2019-0004。
新霉素、万古霉素、两性霉素、氨苄、甲硝唑和咖啡酸 上海源叶生物科技有限公司；异丙醇 天津市富宇精细化工有限公司；DEPC 索莱宝生物科技有限公司；氯仿 天津市富宇精细化工有限公司；以上试剂均为分析纯。小鼠白细胞介素（IL）-6、白细胞介素（IL）-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α的酶联免疫吸附测定试剂盒 上海酶联科技有限公司；丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平检测试剂盒 南京建成生物工程研究所（南京，中国）； 反转录试剂盒、 高特异性qPCR试剂（TB Green Premix Ex TaqTM II） 美国赛默飞科技有限公司。
UPH-II-20T优普系列超纯水器 四川优普超纯科技有限公司；Bioprep-24生物样品均质仪 杭州奥盛仪器有限公司；LDZM-60KCS高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械公司；CX33显微镜 日本Olympus 公司；ZH-PT/5S动物实验跑台 北京众实科技有限公司；MK3Multiskan全自动酶标仪 美国 Thermo 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种准备
将于−80 ℃保藏的菌落接种到5 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h复苏后进行传代培养。取1 mL含菌培养基置于无菌离心管中，4000 r/min离心10 min，丢弃上层。将菌体沉淀并重新悬浮在无菌生理盐水中，记为菌液，留待灌胃使用；另外取1 mL含菌培养基于无菌离心管中100 ℃水浴30 min，4000 r/min离心10 min，弃去上层清液，将菌体沉淀并重新悬浮在无菌生理盐水中，记为热灭活菌液，留待灌胃使用。
1.2.2 动物模型
将30只雄性C57BL小鼠喂养于重庆第二师范学院儿童营养与协同创新中心，动物实验伦理许可证号：2023092702B。环境温度设定在25±1 ℃，湿度设定在60%，光暗循环周期设定为12 h，正式试验开始前适应性喂养7 d，适应性喂养及试验过程中均提供无菌处理后的SPF级小鼠维持饲料和自由饮水。 适应性喂养结束后，将其随机分为5组，每组6只，分别为：正常组（Normal）、模型组（Model）、咖啡酸组（CA：Caffeic acid）、菌液组（Lived）、热灭活的菌液组（HK：heat-killed）。各组处理具体措施如下：Normal组不处理；Model组隔天腹腔注射无菌处理的混合抗生素溶液；CA组隔天腹腔注射无菌处理的混合抗生素溶液，同时灌胃咖啡酸（10mg/kg）[13]； Lived组隔天腹腔注射无菌处理的混合抗生素溶液，同时灌胃菌液（浓度为1×109 CFU/mL）；HK组隔天腹腔注射无菌处理的混合抗生素溶液，同时灌胃热灭活菌液。正常组和模型组灌胃相同剂量的生理盐水，灌胃及注射均持续14d。灌胃和注射剂量均为0.1mL/10g。混合抗生素溶液：5 mg/mL新霉素，25 mg/mL万古霉素、0.1 mg/mL两性霉素、10 mg/mL氨苄及5 mg/mL甲硝唑溶于0.9%的生理盐水[14]。
1.2.3 小鼠负重游泳和跑台力竭实验
参照文献[6]的方法，对各组小鼠均进行负重游泳和跑台力竭实验。最后一次造模结束前（试验第13 d），将小鼠置于25±3 ℃的水中游泳至力竭。力竭的判断标准为：小鼠沉入水中超过10 s，且放在平面时无法完成翻正反射。游泳力竭后的小鼠迅速采用吹风机烘干，放回笼架中。使用高80 cm、直径50 cm的玻璃水缸为容器，每次游泳实验加水深度为40 cm，小鼠正式测试前进行预适应。预适应时不在尾部捆绑铅皮卷，自由游泳 3~5 min。正式实验时在小鼠尾根部捆绑 5% 体重的铅块，完全打湿毛发后进行测试。小鼠保持平衡漂浮不动时采用玻璃棒轻推驱赶。当小鼠没于水面以下时间超过8 s且无法继续维持游泳运动时判定小鼠力竭疲劳，同时记录每只小鼠负重游泳时间。
最后一次造模后（试验第15 d），进行小鼠跑台力竭实验，实验前将小鼠置跑道内自由探索1~3 min熟悉环境。跑台程序设置如下：运动30 min，休息1 min，电强度3.0 mA，加速度4 m/s2，坡度20度，跑台速度程序最高速度为20 m/min。当小鼠无法在跑台通道上继续维持跑步，长时间被遗留在在跑道末端或伏地式前进，且跑台电击与人为驱赶也无法使其跑至跑道前端时判定为小鼠力竭疲劳，同时记录跑步持续时间和距离。
1.2.4 小鼠血清的收集
试验结束时，将禁食12 h的小鼠麻醉剪去胡须后迅速摘取眼球，收集血液于无内毒素的小管中。分组标记后，血清样品在37 ℃静置30 min，在4 ℃，3000 r/min条件下离心10 min，取上清液冻存于−80 ℃供后续检测使用，避免反复冻融。
1.2.5 小鼠脏器组织的收集
采集血清后，迅速解剖，将小鼠的全脑、肝脏和盲肠取出，置于预冷的生理盐水中漂洗，以去除粘附在其上的血清和黏膜，并用滤纸迅速吸干表面水分。将肝组织称重后冻存于−80 ℃为后续检测用。将全脑组织切成块，分成三部分，一部分浸泡在20倍体积的4%（v/v）多聚甲醛（PBS中制备）溶液中，为组织观察用；另一部分加入9倍预冷的0.9%生理盐水置于电动匀浆器中快速研磨，在4 ℃，8000 r/min条件下离心15 min，取上清液冻存于−80 ℃，为ELISA（酶联免疫吸附法）试剂盒检测用，避免反复冻融；第三部分在锡纸中于液氮速冻，并迅速转移至无菌1.5 mL ep管中冻存于−80 ℃，为荧光定量检测用。将盲肠组织包在锡纸中于液氮速冻，并迅速转移至无菌1.5 mL ep管中冻存于−80 ℃，为荧光定量检测用。
小鼠肝脏脏器指数=小鼠肝脏重量（g）/小鼠体重（g）×100%。
1.2.6 小鼠大脑组织形态学观察
将经组织固定液固定后的脑组织以冠状法取材 4 mm 厚，再分别使用70%、80%、95%、100%的酒精进行梯度脱水，每个脱水过程各持续30 min，脱水后分别使用二甲苯浸泡各20 min，随后石蜡浸蜡30 min进行组织包埋，使用切片机将其切成 4 μm 的组织薄片。将组织薄片轻贴于载玻片并放入烘箱烘干后，使用苏木精-伊红（HE）进行染色。染色后，在光学显微镜下观察分析组织学特征。
1.2.7 小鼠血清及脑组织氧化应激水平和炎症水平的检测
取保存的血清和大脑组织匀浆，使用丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD）和还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒进行氧化应激水平的检测，同时采用ELISA试剂盒测定大脑组织匀浆中的IL-6、IL-10和TNF-α含量，试验步骤参照试剂盒说明书进行。
1.2.8 小鼠脑组织中CREB、ERK1/2、BDNF 以及盲肠中肠道屏障基因zo-1、occludin-1 和claudin-1 mRNA相对表达量的检测
使用Trizol法从冻存于−80 ℃的脑组织和盲肠组织中提取RNA，检测纯度后冻存于−80 ℃备用；使用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix试剂盒，按说明书在冰上低温操作，在65 ℃（5 min）→42 ℃（60 min）→70 ℃（5min）→4 ℃（hold）条件下分别对提取的RNA进行逆转录，获得相应组织的cDNA；使用TOYOBO SYBR® Green Realtime PCR Master Mix试剂盒，按照试剂盒说明书混合模板cDNA和引物并加入荧光染料和高保真酶，变性条件为95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；退火至60 ℃，40 s；72 ℃延伸，1 min；40个循环条件下进行PCR扩增。以β-actin为内参基因进行实时荧光定量PCR分析试验。引物序列见表1。计算方法采用比较CT值法（2−ΔΔCT）。
表 1 RT-qPCR中的引物及其序列Table 1. Sequences of primers in RT-qPCRGene forward primer （5’-3’） reverse primer （5’-3’） CREB AGCAGCTCATGCAACATCATC AGTCCTTACAGGAAGACTGAACT ERK TCCGCCATGAGAATGTTATAGGC GGTGGTGTTGATAAGCAGATTGG BDNF TTACCTGGATGCCGCAAACAT TGACCCACTCGCTAATACTGTC ZO-1 GCTTTAGCGAACAGAAGGAGC TTCATTTTTCCGAGACTTCACCA Occludin-1 TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG Claudin-1 GGGGACAACATCGTGACCG AGGAGTCGAAGACTTTGCACT β-actin GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 1.3 数据处理
通过Turkey检验使用单因素方差分析法（ANOVA）对数据进行分析，当P<0.05时，认为差异显著；并使用GraphPad Prism 8.0软件（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）绘图。
2. 结果
2.1 小鼠肝脏脏器系数
脏器指数代表了器官在恒定环境下的运动和生理功能，是对小鼠进行毒理学评价的一个重要指标。脏器指数偏高可能是由于器官充血和水肿，而脏器指数偏低可能是由于肌肉萎缩或对身体的毒性影响[15]。本研究通过称量小鼠肝脏的重量，进行脏器指数的计算，结果如图1所示。模型组小鼠的肝脏脏器指数极显著高于正常组（P<0.01），说明抗生素的处理导致小鼠肝脏充血和水肿，机体出现异常状况，可能影响机体的正常生理功能；咖啡酸的处理使得脏器指数低于模型组，但差异并不显著（P>0.05），可能是由于机体摄入咖啡酸引起肝脏代谢造成的，但仍极显著高于正常组（P<0.01）；菌液组与灭活菌液组的肝脏脏器系数均显著低于模型组（P<0.01），并与正常组差异不显著（P>0.05），菌液主要成分为有活性的戊糖片球菌CQFP202437及其代谢产物，热灭活菌液主要成分为菌体代谢产物，说明戊糖片球菌CQFP202437菌体及其代谢产物均有助于调节抗生素导致的小鼠肝脏充血和水肿，恢复机体正常生理功能。
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图 1 小鼠肝脏脏器指数注：与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。Figure 1. Organ indices of liver in mice2.2 小鼠脑组织病理学观察
如图2所示，正常组大脑组织结构完整，细胞排列致密。模型组的大脑表面观测到2个炎症病灶，且病灶附近的神经元与周围组织间隙增大，说明抗生素导致大脑组织发生水肿变化。整体来看，组织中神经细胞浓染，胞核不清晰，说明抗生素导致了大脑组织细胞发生固缩，影响其正常生理形态。菌液处理组小鼠大脑皮层部分神经元细胞变性但未见明显炎症细胞浸润；热灭活菌液处理组有大量神经元细胞水肿，细胞肿胀，胞质呈空泡状。由此可见，戊糖片球菌对抗生素诱导小鼠脑组织有一定的保护作用。
2.3 小鼠运动参数的变化
分别对各组小鼠进行游泳力竭和跑台力竭实验，结果如表2所示。由表可知，模型组小鼠的游泳和跑步时间均极显著低于正常组（P<0.01），说明抗生素的处理可能导致小鼠运游泳和跑步时长的降低。各组游泳与跑步时间均显著低于正常组（P<0.01），但菌液与灭活菌液分别处理后，均在不同程度延长小鼠运动时间，说明戊糖片球菌CQFP202437可以改善抗生素诱导的运动失调。并且整体来看，菌液处理组的改善作用更显著。
表 2 小鼠游泳及跑步时间的变化Table 2. Changes of swimming and running time in mice分组 游泳时间（s） 跑步时间（min） Normal 2225.83±81.59a 195.67±6.03 a Model 133.67±59.60 e 91.67±21.36 e CA 359.33±59.48 cd 155.00±4.58 b Lived 520.00±7.81 b 145.67±7.02 bc HK 443.33±66.15 bc 139.00±19.08 bcd 注：同一列数值相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（p<0.01）。 2.4 小鼠机体氧化应激水平的变化
各组小鼠脑组织和血清中GSH、MDA和SOD水平如图3所示。由图可知，抗生素处理会导致小鼠血清和大脑中GSH和MDA都极显著低于正常组（P<0.01），说明抗生素会导致机体处于氧化应激状态，影响机体的正常生理功能。菌液处理组脑组织GSH含量水平显著高于模型组（P<0.05），经过戊糖片球菌CQFP202437处理后，机体氧化应激水平有一定的回升，均能高于模型组。
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图 3 小鼠机体氧化应激水平注：3（a）脑组织GSH，3（b）脑组织MDA，3（3）脑组织SOD，3（d）血清GSH，3（e）血清MDA；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。Figure 3. Oxidative stress levels in mice2.5 小鼠大脑炎症水平的变化
各组小鼠大脑炎症水平如图4所示。由图可知，抗生素处理会导致小鼠大脑中IL-6、IL-10以及TNF-α水平都极显著高于正常组（P<0.01），说明抗生素会导致机体炎症因子水平显著提升，进而引起机体的炎症反应，影响机体的正常生理功能。菌液组IL-10水平显著低于模型组（P<0.01），降低了12.5%；灭活菌液组IL-6以及TNF-α水平显著低于模型组（P<0.01，P<0.05），分别降低了11.5%和8.3%；说明经戊糖片球菌CQFP202437处理后，机体炎症因子水平下调，低于模型组。
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图 4 小鼠大脑炎症因子注：4（a）大脑IL-6，4（b）大脑IL-10，4（c）大脑TNF-α；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。Figure 4. Inflammatory factors of cerebrum in mice2.6 小鼠大脑BDNF代谢通路基因相对表达量的变化
各组小鼠大脑BDNF代谢通路基因相对表达量的变化如图5所示。由图可知，抗生素处理会导致小鼠大脑中BDNF代谢通路上关键基因BDNF和ERK1/2的相对表达量都显著低于正常组（P<0.05，P<0.01），说明抗生素会导致大脑中BDNF代谢通路相关基因表达量下降，进而导致神经递质失衡，影响小鼠神经系统正常功能的维系。咖啡酸处理后，关键基因的表达量极显著高于模型组（P<0.01）；经戊糖片球菌CQFP202437处理后，三个关键基因的相对表达量都大幅度提升，均极显著高于模型组（P<0.01）。并且综合来看，菌液处理组对小鼠大脑中BDNF代谢通路的表达影响更显著。
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图 5 小鼠大脑BDNF代谢通路基因的相对表达量注：5（a） BDNF基因的相对表达量，5（b） ERK1/2基因的相对表达量，5（c） CREB基因的相对表达量；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。Figure 5. Relative expression of BDNF metabolic pathway genes of cerebrum in mice2.7 小鼠盲肠肠道屏障基因相对表达量的变化
各组小鼠盲肠肠道屏障基因相对表达量的变化如图6所示。由图可知，抗生素处理会下调小鼠盲肠中肠道屏障基因的表达，进而破坏肠道屏障，进而导致机体生理功能失衡。咖啡酸处理后，occludin-1与claudin-1mRNA的相对表达量显著高于模型组（P<0.01，P<0.05）。经过戊糖片球菌CQFP202437处理后，三个屏障基因mRNA的相对表达量都大幅度提升，均显著高于模型组（P<0.05），说明戊糖片球菌CQFP202437可以缓解抗生素对肠道屏障的破坏作用，并且综合来看，菌液处理组的保护作用更显著。
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图 6 小鼠盲肠肠道屏障基因的相对表达量注：6（a） Claudin-1基因的相对表达量，6（b） ZO-1基因的相对表达量，6（c） Occludin-1基因的相对表达量；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。Figure 6. Relative expression of intestinal barrier genes of cecum in mice3. 讨论
运动可以使体内产生增加活性氧，从而诱发细胞产生氧化应激。适量的活性氧对细胞是一种适应性刺激，但是过量的会对机体造成运动损伤及引起多种疾病的发生[5]。氧化应激是指氧化剂的产生和抗氧化防御之间的失衡，这可能会导致生物系统受损[16]，是一种生理学中的氧化还原信号[17]。氧化应激已被证明参与到动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病、阿尔茨海默病和癌症等多种疾病的病程当中，这一发现揭示了氧化剂导致细胞损伤的多种机制[18]。氧化剂，特别是细胞在生理刺激下产生的H2O2，可以充当第二信使[15]。在氧化应激中，H2O2的非生理性产生会导致氧化还原信号失常。有研究表明，氧化应激可能是疾病和毒性的主要因素，主要是因为在氧化应激可以通过修饰蛋白质、促进炎症、诱导细胞凋亡、放松自噬、损害线粒体功能和许多其他机制，扰乱各种信号通路并影响多种生物过程[19−21] 。超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）能有效清除体内多余的自由基，可以直接反应机体清除自由基的能力，间接体现机体的抗氧化活性[22]。本研究中戊糖片球菌CQFP202437处理后小鼠的大脑SOD和GSH水平均显著高于模型组（P<0.05），说明该菌株可以调节被抗生素诱导的机体氧化水平异常。
此外，在生物体内，自由基会作用于脂质发生过氧化，氧化的最终产物丙二醛（MDA）会对细胞的新陈代谢和基本功能产生重大影响，其水平反映了机体的氧化应激水平[23]。戊糖片球菌处理组小鼠大脑MDA水平极显著高于模型组（P<0.01），表明戊糖片球菌CQFP202437可以调节因抗生素诱导而异常的机体氧化应激因子水平，缓解机体的氧化应激状态，诱发机体各项机能恢复到正常状态。
TNF不仅通过诱导炎症介质的表达，而且通过诱导细胞死亡、刺激炎症免疫反应和疾病发展间接驱动炎症反应[24]。同时细胞因子IL-6 和 TNF-α水平在机体炎症过程中都会急剧升高，因此作为评判机体炎症的指标。本研究中模型组的IL-6和IL-10水平极显著高于正常组（P<0.01），戊糖片球菌处理处理后部分炎症因子水平仍然高于正常组，但已显著低于模型组（P<0.01），说明抗生素处理后，小鼠机体炎症因子水平上升，可能导致机体产生炎症，影响正常的生理生化状态，但戊糖片球菌CQFP202437的干预会减缓炎症因子水平的上升，缓解机体的炎症反应。
神经营养因子（BDNF）是中枢神经系统中研究最多，特征最为明确的神经营养因子之一。在大脑中，BDNF由谷氨酸能神经元[25]、胶质细胞和小胶质细胞[26]表达。此外，BDNF可以促进神经肌肉突触的发育，这表明BDNF在肌肉疾病中作为治疗靶点具有潜在作用[27]。本实验结果表明抗生素处理会导致小鼠大脑中BDNF代谢通路上关键基因BDNF和ERK1/2的相对表达量都显著低于正常组（P<0.05，P<0.01），经过戊糖片球菌CQFP202437处理后，三个关键基因的相对表达量都大幅度提升，均极显著高于模型组（P<0.01）。说明戊糖片球菌能有效缓解抗生素造成的神经递质表达量降低，维持神经系统的稳态，从而调控机体各项正常生理功能。
肠上皮屏障由粘液层、上皮糖蛋白和上皮细胞组成，在防止病原体入侵方面发挥着关键作用[28]。作为肠上皮屏障的重要组成部分，细胞间连接包括紧密连接、间隙连接、粘附连接和桥粒都形成多种功能复合物[26]。紧密连接作为最重要的细胞间连接，决定了肠上皮通透性，并维持了肠屏障的生理功能[27]。Zonula occludens-1（zo-1）、occludin-1和claudin-1是三种最重要的紧密连接蛋白，在维持肠道细胞极性和肠上皮屏障完整性等方面都显示出不可或缺的作用[28−30]。研究表明，紧密连接蛋白在修复肠上皮损伤中至关重要，因为肠道微生物组参与肠道上皮细胞信号传导，并影响肠道屏障功能[31]。肠道微生物通过维持紧密连接蛋白表达和分布来调节肠道屏障功能，这对肠道屏障完整性至关重要。肠道微生物通过维持紧密连接蛋白表达和分布来调节肠道屏障功能，这对肠道屏障完整性至关重要。本研究中模型组occludin-1的mRNA相对表达量均显著低于正常组（P<0.05），菌液处理组小鼠盲肠occludin-1的mRNA相对表达量极显著高于模型组（P<0.01），说明戊糖片球菌CQFP202437的处理可以缓解抗生素对小鼠肠道屏障的破坏，恢复机体部分正常生理机能。
4. 结论
本研究采用腹腔注射混合抗生素溶液诱导小鼠运动机能失调模型，戊糖片球菌CQFP202437能有效延长小鼠游泳和跑步的时长，减少炎症因子IL-6、TNF-α的水平。还能增加小鼠的抗氧化水平，减少MDA的累积，增加SOD的水平。通过RT-qPCR的检测发现，该菌株能通过提升肠道屏障基因的表达修复肠道屏障，维护肠道稳态，还能大幅提升神经递质代谢相关通路基因的表达，维持神经系统的稳态，从而调控机体运动机能。综上所述，戊糖片球菌CQFP202437能够缓解机体炎症，调节机体的氧化应激状态，能通过影响神经递质的表达，进而调节机体的运动机能，为提升运动机能益生菌制剂的研制和开发提供理论依据。
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图 1 小鼠肝脏脏器指数
注：与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。
Figure 1. Organ indices of liver in mice
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图 3 小鼠机体氧化应激水平
注：3（a）脑组织GSH，3（b）脑组织MDA，3（3）脑组织SOD，3（d）血清GSH，3（e）血清MDA；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。
Figure 3. Oxidative stress levels in mice
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图 4 小鼠大脑炎症因子
注：4（a）大脑IL-6，4（b）大脑IL-10，4（c）大脑TNF-α；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。
Figure 4. Inflammatory factors of cerebrum in mice
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图 5 小鼠大脑BDNF代谢通路基因的相对表达量
注：5（a） BDNF基因的相对表达量，5（b） ERK1/2基因的相对表达量，5（c） CREB基因的相对表达量；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。
Figure 5. Relative expression of BDNF metabolic pathway genes of cerebrum in mice
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图 6 小鼠盲肠肠道屏障基因的相对表达量
注：6（a） Claudin-1基因的相对表达量，6（b） ZO-1基因的相对表达量，6（c） Occludin-1基因的相对表达量；与Normal组相比， *表示P<0.05， **表示P<0.01；与Model组比较， #表示P<0.05， ##表示P<0.01。
Figure 6. Relative expression of intestinal barrier genes of cecum in mice
表 1 RT-qPCR中的引物及其序列
Table 1 Sequences of primers in RT-qPCR
Gene forward primer （5’-3’） reverse primer （5’-3’） CREB AGCAGCTCATGCAACATCATC AGTCCTTACAGGAAGACTGAACT ERK TCCGCCATGAGAATGTTATAGGC GGTGGTGTTGATAAGCAGATTGG BDNF TTACCTGGATGCCGCAAACAT TGACCCACTCGCTAATACTGTC ZO-1 GCTTTAGCGAACAGAAGGAGC TTCATTTTTCCGAGACTTCACCA Occludin-1 TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG Claudin-1 GGGGACAACATCGTGACCG AGGAGTCGAAGACTTTGCACT β-actin GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 
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表 2 小鼠游泳及跑步时间的变化
Table 2 Changes of swimming and running time in mice
分组 游泳时间（s） 跑步时间（min） Normal 2225.83±81.59a 195.67±6.03 a Model 133.67±59.60 e 91.67±21.36 e CA 359.33±59.48 cd 155.00±4.58 b Lived 520.00±7.81 b 145.67±7.02 bc HK 443.33±66.15 bc 139.00±19.08 bcd 注：同一列数值相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（p<0.01）。
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