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中国精品科技期刊2020

霍山石斛多糖硒化工艺的优化及对α-淀粉酶的抑制作用

曹皖雪, 李姣, 陶强, 范璇璇, 陆继婷, 陈乃富, 陈乃东

曹皖雪,李姣,陶强,等. 霍山石斛多糖硒化工艺的优化及对α-淀粉酶的抑制作用[J]. 食品工业科技,2025,46(9):206−214. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024060247.
引用本文: 曹皖雪,李姣,陶强,等. 霍山石斛多糖硒化工艺的优化及对α-淀粉酶的抑制作用[J]. 食品工业科技,2025,46(9):206−214. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024060247.
CAO Wanxue, LI Jiao, TAO Qiang, et al. Selenization Optimization of Preparation Process of Polysaccharide from Dendrobium huoshanense and Its Inhibitory Effect on α-Amylase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(9): 206−214. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024060247.
Citation: CAO Wanxue, LI Jiao, TAO Qiang, et al. Selenization Optimization of Preparation Process of Polysaccharide from Dendrobium huoshanense and Its Inhibitory Effect on α-Amylase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(9): 206−214. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024060247.

霍山石斛多糖硒化工艺的优化及对α-淀粉酶的抑制作用

基金项目: 安徽省中药质量评价与品质提升科研创新团队(2022AH010090);安徽省高校协同创新中心项目(GXXT-2022-079);安徽省高等学校科学研究项目(2024AH051998)。
详细信息
    作者简介:

    曹皖雪(1997−),女,硕士研究生,研究方向:中药资源开发与利用,E-mail:2210775609@qq.com

    通讯作者:

    陈乃富(1962−),男,本科,教授,研究方向:中药生物技术研究、中药资源与质量研究,E-mail:cnf505@126.com

    陈乃东(1972−),男,博士,教授,研究方向:中药质量评价与品质提升研究,E-mail:2004cnd@163.com

  • 中图分类号: TS201.1

Selenization Optimization of Preparation Process of Polysaccharide from Dendrobium huoshanense and Its Inhibitory Effect on α-Amylase

  • 摘要: 目的:优化霍山石斛多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharide,DHP)硒化工艺并探讨DHP硒化前后对α-淀粉酶活性的抑制作用及机制。方法:通过单因素实验探究亚硒酸钠与DHP质量比、反应时间、硝酸浓度、反应温度对霍山石斛硒化多糖(Selenium-containing Dendrobium huoshanense polysaccharide,Se-DHP)中硒含量的影响。以硒含量为响应值,响应面优化Se-DHP的制备工艺。对比DHP和Se-DHP对α-淀粉酶的活性抑制率,并通过荧光猝灭实验探究其抑制机理。结果:DHP的最佳硒化工艺为:反应温度70 ℃、反应时间460 min、亚硒酸钠与DHP的质量比1:1、硝酸浓度为0.5%。在此条件下进行重复实验,得到Se-DHP硒含量为9223.51 μg/g,与预测值9280.59 μg/g接近。相较于DHP,Se-DHP对α-淀粉酶的抑制作用明显增强。荧光猝灭实验结果显示,DHP和Se-DHP对α-淀粉酶内源性荧光的猝灭作用均为静态猝灭。结论:本研究为制备高硒含量的Se-DHP提供一定的理论基础,为霍山石斛硒化多糖作为一种新的补硒制剂在药食领域的进一步应用提供参考。
    Abstract: Objectives: This study aimed to optimize the selenization process of polysaccharides derived from Dendrobium huoshanense (DHP) and to investigate the inhibitory effects and mechanisms of both DHP and selenium-enriched DHP (Se-DHP) on α-amylase activity. Methods: To investigate the impact of factors such as the mass ratio of sodium selenite to DHP, reaction time, nitric acid concentration, and reaction temperature on the selenium content in Se-DHP, a single factor experiment was conducted. Optimization of the Se-DHP preparation conditions was achieved using response surface methodology, with selenium content as the response variable. Additionally, the inhibitory effects of DHP and Se-DHP on α-amylase activity were compared, and their inhibition mechanisms were examined through fluorescence quenching experiments. Results: The optimal conditions for selenization were identified as follows: reaction temperature of 70 ℃, reaction time of 460 minutes, a mass ratio of sodium selenite to DHP of 1:1, and a nitric acid concentration of 0.5%. Under these conditions, the selenium content in Se-DHP was 9223.51 μg/g, closely matching the predicted value of 9280.59 μg/g. Compared to DHP, Se-DHP demonstrated a significantly enhanced inhibitory effect on α-amylase. Fluorescence spectroscopy revealed that both DHP and Se-DHP exhibited static quenching mode for α-amylase. Conclusions: The findings provide a theoretical framework for the preparation of Se-DHP with high-selenium content and offer a reference for the potential use of selenium polysaccharides from DHP as a new selenium supplement in medicinal and nutritional applications.
  • 硒(Se)是人类和许多生命形式必需的微量营养元素,也是许多硒依赖性酶的必需成分[1],人体无法合成,只能通过食物获取,在延缓衰老、预防肿瘤和改善机体免疫力等方面发挥极其重要的作用。硒摄入量不足会导致动物和人体重要器官机能的失调并导致各种硒缺乏相关疾病,如克山病、冠心病、脑血管疾病,同时还会增加癌症、糖尿病等风险。因此,补硒剂受到越来越多的关注。硒多糖是一种无毒的有机硒化合物,包括从植物中提取的硒多糖和人工修饰合成的硒多糖,具有抗糖尿病、抗肿瘤、增强免疫、护肝等多种生物活性,被认为是一种具有广泛应用前景的成分。天然硒多糖通常存在于植物或微生物中[2],然而即使在富硒地区,天然硒多糖中的硒含量也很低,不能满足人类和动物的补硒需求[3]。因此,亟需建立一种高效制备硒多糖的方法。近年来,人们发现人工硒化合成制备硒多糖是一种较好的方法。多糖中功能活性基团如羟基、醛基等,可与硒化试剂中含硒化合物结合,使含硒基团链接到多糖分子中[4]。目前国内外研究已报道了一些硒化修饰的方法,如硝酸-亚硒酸钠(NA-SS)法,冰醋酸-亚硒酸(GA-SA)法,冰醋酸-亚硒酸钠(GA-SS)法和二氯氧硒(SOC)法[5],NA-SS法具有过程简单、操作性强、环境污染小、反应快速、含硒量高等优点,可作为一种理想的硒多糖合成制备方法。采用NA-SS法对多糖进行硒化修饰时,硒化反应的温度、反应时间、亚硒酸钠用量、硝酸浓度等因素通常对硒多糖得率有显著影响,因此,研究通常采用正交法、响应面法等对硒化条件进行优化,其中响应面法可以减少实验次数和提高实验效率,缩短优化时间和降低成本,同时,响应面法能连续地对实验各水平进行分析,优化的结果比正交试验更加合理、精确[6]

    霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng),俗称“米斛”,是兰科石斛属多年生草本植物,为安徽霍山特产的珍稀名贵中药材[78]。历代本草均对其有明确记载,因品质上乘而作为石斛属中极品,备受医者推崇[9]。现代药理研究表明,霍山石斛中富含多糖、游离氨基酸、生物碱、联苄和各种微量元素[10],其中霍山石斛多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharide,DHP)作为其重要成分因具有抗炎、提高免疫力及抗肿瘤等多种生物活性而备受关注[11]。然而,现有的霍山石斛多糖资源有限,若将霍山石斛多糖与硒结合,与单一多糖相比,其可能具有更优良的性能。在以往的研究中,国内外学者采用NA-SS法已合成出不同种类的硒多糖,如硒化黄芪多糖[12]、硒化平菇多糖[13]、硒化绿茶多糖[14]、硒化枸杞多糖[15]、硒化马尾藻多糖[16]等,均表明硒化后的多糖比原始多糖具有更高的生物活性和生物利用度。然而,通过硒化修饰的方法,制备获得生物活性更高的霍山石斛多糖,目前还处于研究领域的空白。

    糖尿病是一种代谢紊乱症,严重影响着人类的日常生活[17],管理糖尿病的主要策略是减少糖的摄入[18],抑制碳水化合物的水解。α-淀粉酶是影响碳水化合物消化和吸收的关键酶,抑制α-淀粉酶活性可降低碳水化合物的消化率,起到控制血糖水平的作用[19]。研究表明天然的霍山石斛多糖具有降糖效果,在本团队的初步研究中,也发现霍山石斛多糖对α-淀粉酶具有一定的抑制作用,然而其抑制活性相比临床常用的α-淀粉酶抑制剂还有待提高。

    基于此,本研究采用单因素试验结合响应面法,优化霍山石斛硒化修饰工艺,并比较硒化修饰前后霍山石斛多糖对α-淀粉酶活性的抑制作用,为进一步研究霍山石斛硒多糖作为药物和功能性食品提供科学理论基础。

    霍山石斛鲜条 安徽省六安市酒仙尊霍山石斛有限公司仿野生栽培基地;α-淀粉酶 酶活力≥50 U/mg,合肥博美生物科技有限公司;亚硒酸钠 国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 无锡市展望化工试剂有限公司;硝酸、碳酸氢钠 西泷科学股份有限公司;其他试剂和化学品均为分析级。

    FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器公司;PHS-3E pH计 上海佑科仪器仪表有限公司;Perkinelmer EnSight型多功能酶标仪 美国珀金埃尔默有限公司。

    参照Xiao等[16]的方法并略有修改。将适量霍山石斛鲜条于恒温干燥箱中60 ℃烘干48 h,干燥后粉碎,用60目筛过筛,得到细粉。粉末用95%乙醇在70 ℃回流2次,回流3 h,除去脂质、色素和其他脂溶性杂质。过滤,将残渣在50 ℃风干48 h,然后以1:30 g/mL的比例用水在80 ℃下提取2 h,将上清液在55 ℃下减压浓缩,用Sevag法[20]除去浓缩液中游离蛋白质,直到不再产生白色絮凝,加入无水乙醇将溶液调整为76%的乙醇浓度,并在4 ℃下保存过夜。沉淀物经离心(4000 r/min)5 min后冻干后得到DHP。

    参照Zhan等[21]和温启华等[22]的方法,并稍作改动。精确称量DHP,并加入一定浓度的硝酸溶液50 mL于锥形瓶中,常温搅拌30 min至多糖完全溶解,得到10 mg/mL的DHP溶液。将适量亚硒酸钠加入上述锥形瓶中,置于磁力搅拌器中,设置温度并搅拌反应一定时间。反应完成后,待溶液温度降至室温,采用5.6% NaHCO3调节溶液pH至5~6,最后离心(4000 r/min)5 min除去沉淀。用3500 Da透析袋对反应液进行透析,直至抗坏血酸法[23]检测不出亚硒酸钠。将Se-DHP溶液减压浓缩并加入无水乙醇将溶液调整为76%的乙醇浓度,并在4 ℃下保存过夜,最后离心(4000 r/min)5 min将沉淀物冷冻干燥后得到霍山石斛硒化多糖(Selenium-containing Dendrobium huoshanense polysaccharide,Se-DHP)称重,计算硒含量和Se-DHP得率。

    参照涂玲飞等[24]和李丽彩等[25]的方法,并稍作修改。配制50 μg/mL的亚硒酸钠标准溶液,分别在25 mL容量瓶中加入0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL硒标准溶液后定容。取上述溶液于磨口锥形瓶中,分别加入2 mL的10 g/L EDTA-2Na溶液,并用1 mol/L盐酸溶液将上述溶液pH调至接近2,再加入2.5 mL的10 g/mL邻苯二胺溶液,摇匀,置于黑暗处,40 min后吸取10 mL甲苯溶液加入,振荡萃取5 min,静置分层,将上层有机溶液收集。以空白样为参比,在波长334 nm处测定各标准溶液的吸光度。将硒的质量浓度作为横坐标X,吸光度为纵坐标Y绘制标准曲线,所得回归方程:Y=0.217X−0.0003(R2=0.9965)。

    精密称量20 mg Se-DHP于烧杯中,加入2 mL浓硝酸加热消解,冷却后加入5 mL盐酸(6 mol/L),加热蒸发至1 mL左右,将反应液移至25 mL容量瓶后定容。待测样品硒含量检测方法按照硒含量标准曲线的测定方法,根据如下公式(1)和(2)计算硒含量和DHP得率:

    (μg/g)=C×VM
    (1)
    (%)=m2m1×100
    (2)

    式中,V为待测样溶液体积,mL;C为根据吸光度计算得到的硒质量浓度,μg/mL;M为待测样品质量,g;m1为DHP质量,g;m2为Se-DHP质量,g。

    按照1.2.2的方法制备Se-DHP,分别考察反应温度、反应时间、硝酸浓度和亚硒酸钠与DHP的质量比对Se-DHP中硒含量的影响。固定反应温度50 ℃,反应时间8 h,硝酸浓度0.5%,改变亚硒酸钠与DHP的质量比分别为0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1,考察其对硒含量和得率的影响;固定反应时间8 h,反应温度50 ℃,亚硒酸钠与DHP的质量比1:1,改变硝酸浓度分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%,考察硝酸浓度对硒含量及其得率的影响;固定反应温度50 ℃,亚硒酸钠与DHP的质量比1:1,硝酸浓度0.5%,对4、6、8、10、12 h的反应时间进行研究,考察反应时间对硒含量及得率的影响;固定亚硒酸钠与DHP的质量比1:1,反应时间8 h,硝酸浓度0.5%,以50、60、70、80、90 ℃为实验条件,考察在不同温度条件下硒含量及得率的变化。

    基于单因素实验,固定亚硒酸钠与霍山石斛多糖的质量比为1:1,以Se-DHP的硒含量为响应值,进一步优化反应温度(℃)、反应时间(h)、硝酸浓度(%)对Se-DHP硒含量的影响。本试验利用Design-Expert 13.0软件,Box-Behnken进行响应面设计,对DHP的硒化工艺进行优化,见表1

    表  1  Box-Benhnken设计因素水平及编码值
    Table  1.  Design factor level and code value of Box-Benhnken
    水平 因素
    A反应温度(℃) B反应时间(h) C硝酸浓度(%)
    −1 60 6 0.3
    0 70 8 0.5
    1 80 10 0.7
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    根据Xu等[26]的方法,稍作修改。用0.1 mol/L、pH为6.8的磷酸缓冲液分别溶解多糖溶液(2.5~12.5 mg/mL)、可溶性淀粉溶液(1%,w/v)和氯化钠溶液(6 mmol/L)。将不同浓度的多糖溶液(50 μL)、α-淀粉酶溶液(50 μL)和可溶性淀粉(50 μL)分别混合,在37 ℃下反应10 min,孵育5 min后,快速加入DNS(100 μL),在沸水中加热10 min,在540 nm处对样品进行测量。按照如下公式计算α-淀粉酶抑制率:

    (%)=A2(AxA3)A2A1×100
    (3)

    式中,A2、Ax、A3及A1分别为只加酶的吸光度、待测样品(含该酶)的吸光度、空白样品(不含该酶)的吸光度、只加磷酸缓冲液(不含该酶)的吸光度。

    参照Wang等[19]方法,稍作修改。α-淀粉酶、DHP、Se-DHP均用磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH6.8)配制。在荧光激发波长(λex)为280 nm的条件下,将3 mL 0.26 mg/mL的α-淀粉酶溶液分别与300 μL不同质量浓度的DHP、Se-DHP溶液(0、2.5、5、7.5、10、12.5 mg/mL)混匀,置于不同温度(303.15、310.15 K)下孵育10 min,记录荧光光谱。设置发射波长(λem)为300~400 nm,狭缝宽度为5 nm。并通过如下公式(4)和(5),计算Stern-Vlomer方程确定DHP、Se-DHP对α-淀粉酶的荧光猝灭类型:

    F0F=1+Ksv[C]
    (4)
    lgF0FF=lgKa+nlg[C]
    (5)

    式中,F为加入猝灭剂(DHP或Se-DHP)的α-淀粉酶的荧光强度;Ksv为猝灭常数,L/g;[C]表示DHP或Se-DHP的质量浓度,mg/mL;n为猝灭剂与α-淀粉酶结合位点数;F0表示无猝灭剂(DHP或Se-DHP)的α-淀粉酶荧光强度;Ka为猝灭剂与α-淀粉酶结合常数,L/g。

    根据热力学参数[27],对DHP和Se-DHP与α-淀粉酶之间的主要结合力类型进行研究[28]。通过van’t Hoff方程确定自由能变化(△G0)、熵变(△S0)和焓变(△H0):

    lgKa=ΔH02.303RT+ΔS02.303R
    (6)
    ΔG0=ΔH0TΔS0=2.303RlgKa
    (7)

    式中,R为气体常数,8.314 J/(mol·K);△H0、△G0和△S0分别为焓变,kJ/g、自由能变化,kJ/g和熵变,J/(g·K);T为温度,K。

    实验数据均以平均值±标准差表示,使用SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析,在P<0.05时认为差异有统计学意义,其他数据绘图由Origin 2019软件绘制。

    不同亚硒酸钠与DHP的质量比对DHP硒化修饰的影响如图1A所示。随着亚硒酸钠(Na2SeO3)质量的增加,硒含量表现为显著增加趋势(P<0.05),当亚硒酸钠与DHP的质量一致时,硒含量与得率均达到峰值,硒含量为3882.91±105.64 μg/g,得率为54.81%±0.35%;当质量比大于1:1时,得率和硒含量均呈下降趋势,这可能与饱和结合位点引起的非特异性摄取有关[29]。故选择Na2SeO3与DHP的质量比为1:1。

    图  1  各因素对Se-DHP硒含量的影响
    注:图中不同小写字母代表不同条件下硒含量、得率之间的显著性差异,P<0.05。
    Figure  1.  Effect of various factors on Se content of Se-DHP

    随着硝酸浓度的增加,硒含量表现出先上升后下降的趋势。硝酸浓度为0.5%时,硒含量和得率均达到峰值(见图1B),即0.5%为最佳硝酸浓度。这可能是因为酸水解使多糖中相应的活性基团暴露并与硒结合,起到较好的催化作用。硝酸浓度过低,硒与多糖不能充分结合导致硒含量较低。当硝酸浓度大于0.5%时,硒含量下降,可能是由于硒化体系酸度过高,多糖结构被破坏,影响硒化反应的进行。故选择硝酸浓度为0.5%。

    硒含量和得率均随反应时间的延长而增加,并在8 h达到峰值,超过8 h后,硒含量与得率均呈下降趋势(见图1C)。在高温和酸性条件下,时间不足导致反应不充分,时间过长多糖会发生降解,影响与硒的结合,进而影响反应的进行。故选择反应时间为8 h。

    在50~60 ℃的温度范围内,随着反应温度的升高,硒含量与得率也随之增高,60 ℃时,得率达到峰值,为56.80%±1.31%。当温度继续升高至70 ℃时,硒含量达到峰值为9274.68±189.67 μg/g,后随着温度的上升,硒含量与得率显著下降(P<0.05)(见图1D)。这可能是因为较高温度使硒结合位点被激活,硒化被促进,当温度继续升高时,多糖分解导致其与硒的解离速度大于结合速度,阻碍硒化反应的进行。故选择反应温度为70 ℃。

    按照表1的设计进行响应面试验,结果见表2。以硒含量为响应值,通过Design-Expert 13.0,将实验数据(表2)进行回归拟合,所得二元多次回归方程:Y=9223.51−3.91A−693.53B−20.46C−1084.64AB−498.54AC−256.20BC−2421.18A2−2222.97B2−2080.34C2。为检验此方程的有效性,对此设计的模型进行方差分析(表3)。响应面回归模型极显著(P<0.0001),说明此模型有意义。模型失拟项P值为0.3943,大于0.05,表明模型失拟项不显著,信噪比21.9602>4,说明该模型可预测试验结果,模型决定系数R2=0.9876,校正后决定系数R2adj=0.9716,模型的拟合度良好,能预测97.16%的响应值,R2pred=0.8926与R2adj的差值小于0.2,说明该响应面设计合理。由回归模型的显著性可知,一次项B,二次项A2、B2、C2及交互项AB的P值均小于0.01,表明影响极显著,交互项AC的影响显著(P<0.05),由F值可知,各因素对硒含量的影响程度为:B(反应时间)>C(硝酸浓度)>A(反应温度)。综上所述,该回归模型对响应值的拟合程度较高,方程能够较好地反映响应值与自变量的关系。

    表  2  响应面试验设计与结果
    Table  2.  Design and results of response surface method test
    试验号 因素 硒含量(μg/g)
    A(℃) B(h) C(%)
    1 60 6 0.5 3877.07
    2 80 6 0.5 6507.67
    3 60 10 0.5 4820.33
    4 80 10 0.5 3112.38
    5 60 8 0.3 4513
    6 80 8 0.3 5033.1
    7 60 8 0.7 5407.95
    8 80 8 0.7 3933.9
    9 70 6 0.3 5427.91
    10 70 10 0.3 4392.22
    11 70 6 0.7 5960.59
    12 70 10 0.7 3900.08
    13 70 8 0.5 8732.86
    14 70 8 0.5 9559.77
    15 70 8 0.5 9235.92
    16 70 8 0.5 9573.27
    17 70 8 0.5 9015.74
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    表  3  方差分析结果
    Table  3.  Result of variance analysis
    项目平方和自由度均方FP显著性
    模型项8.098E+0798.998E+0661.81<0.0001极显著
    A122.461122.460.00080.9777
    B3.848E+0613.848E+0626.430.0013**
    C3350.3313350.330.02300.8837
    AB4.706E+0614.706E+0632.330.0007**
    AC9.942E+0519.942E+056.830.0347*
    BC2.626E+0512.626E+051.800.2212
    A22.468E+0712.468E+07169.55<0.0001**
    B22.081E+0712.081E+07142.93<0.0001**
    C21.822E+0711.822E+07125.18<0.0001**
    残差1.019E+0671.456E+05
    失拟项4.996E+0531.665E+051.280.3943不显著
    纯误差5.195E+0541.299E+05
    总和8.200E+0716
    注:**P<0.01,差异极显著;*P<0.05,差异显著。
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    根据回归方程绘制出的响应面见图2。各个因素之间的交互作用对硒含量存在相互影响,其影响程度可以通过响应面中的陡峭角度和等高线呈现的形状以及等高线的疏密、颜色变化反映出来[30]。由图2a可知,当硝酸浓度为0.5%时,随着反应温度和反应时间水平的增加,硒含量值先上升后下降,其对应的等高线分布密集,呈椭圆状,因此判断反应温度与反应时间交互作用显著。由图2b知,当反应时间为8 h时,随着反应温度和硝酸浓度水平的增加,硒含量先升高后降低,其对应的响应面图较为陡峭,等高线呈椭圆状,说明反应温度和硝酸浓度交互作用显著。图2c中,当硒化温度为70 ℃,随着反应时间和硝酸浓度水平的增加,硒含量先升高后降低,其对应的等高线显示圆形,说明反应时间和硝酸浓度交互作用不显著。上述结果与方差分析结果相吻合。

    图  2  各因素交互作用对硒含量影响的响应曲面
    Figure  2.  Response surface of the interaction of various factors on Se content

    用Design-Expert 13.0软件计算,得到制备Se-DHP的最佳工艺参数为:反应时间460.2 min、硒化温度70.36 ℃、硝酸浓度0.5%,该条件下预测的硒含量值为9280.59 μg/g。鉴于实际情况,各条件改为硒化时间460 min、硒化温度70 ℃、硝酸浓度为0.5%,重复3次实验,得到的硒含量平均值为9223.51 μg/g,与预测值接近,表明所建立模型很好地预测了Se-DHP硒含量,优化工艺条件合理、可靠。

    DHP和Se-DHP对α-淀粉酶抑制活性结果如图3所示。在2.5~12.5 mg/mL浓度范围内,DHP和Se-DHP对α-淀粉酶抑制作用均随着浓度增加而增强。DHP的IC50值为12.08 mg/mL,而Se-DHP的IC50值为8.59 mg/mL,结果表明Se-DHP对α-淀粉酶抑制作用明显强于DHP,硒化修饰增强了对α-淀粉酶的抑制作用。王峙力等[31]报道的甜玉米芯硒多糖和姚琳琳等[32]报道的连翘多糖纳米硒与本文研究结果均具有相似的α-淀粉酶抑制效果,表明硒化处理显著增强了多糖对α-淀粉酶活性的抑制能力,并且产生剂量依赖作用。

    图  3  DHP和Se-DHP对α-淀粉酶抑制作用
    Figure  3.  Inhibitory effect of DHP and Se-DHP on α-amylase

    荧光猝灭实验可用于研究DHP及Se-DHP与α-淀粉酶的相互作用[33]。色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等芳香族氨基酸在特定激发波长下可以发射荧光,即α-淀粉酶具有内源性荧光,其发光特性与其周围的微环境息息相关[34]。结果见图4,当发射波长为339 nm时,随着DHP、Se-DHP浓度的增加,荧光发射峰强度明显下降,表明DHP和 Se-DHP对α-淀粉酶的荧光具有浓度依赖的猝灭作用。同浓度下,Se-DHP对α-淀粉酶的荧光猝灭程度高于DHP,这与活性抑制率结果一致。且最大发射波长(λmax)发生了轻微的红移,当DHP及Se-DHP浓度增大到12.5 mg/mL时,最大发射波长分别由339 nm红移到343 nm以及341 nm,这说明DHP及Se-DHP均能够通过与酶的相互作用,舒展酶的结构,强烈地猝灭α-淀粉酶的固有荧光,并使荧光团所处的微环境发生改变。

    图  4  DHP和Se-DHP对α-淀粉酶荧光特性的影响
    注:图a为DHP荧光光谱图,图b为Se-DHP荧光光谱图。
    Figure  4.  Effect of DHP and Se-DHP on the fluorescence properties of α-amylase

    荧光猝灭机制分为静态猝灭、动态猝灭以及两者的结合。静态猝灭涉及猝灭剂和荧光分子之间形成复合物。因此,由于复合物在较高温度下稳定性降低,随着温度升高静态猝灭常数减小。而动态猝灭则是猝灭剂与荧光团扩散和碰撞的结果。由于扩散和碰撞事件的加剧,随着温度的升高动态猝灭常数增大[35]。由图5可以看出,在不同温度(303.15、310.15 K)下,DHP及Se-DHP浓度与F0F显示良好的线性关系,表明只发生一种猝灭类型,静态或动态。由表4可知,DHP和Se-DHP的猝灭速率常数Ksv均随着温度的上升而逐渐下降,分别由0.0674 L/g减少至0.0636 L/g,由 0.0758 L/g减少至0.0411 L/g,表明DHP和Se-DHP均通过静态猝灭的方式猝灭α-淀粉酶的荧光。

    图  5  DHP对α-淀粉酶的荧光猝灭作用
    注:a、c为DHP、Se-DHP的F0/F-[C]曲线;b、d为DHP、Se-DHP的lg((F0-F)/F)-lg[C]曲线。
    Figure  5.  Fluorescence quenching of α-amylase by DHP

    为了深入研究DHP及Se-DHP与α-淀粉酶的作用机理,得到DHP或Se-DHP与α-淀粉酶结合常数Ka和结合位点数(n)。根据表4,随着温度的增加,DHP与α-淀粉酶的结合常数Ka由0.0461 L/g减小至0.0044 L/g,Se-DHP与α-淀粉酶的结合常数Ka由0.0494 L/g减少至0.0421 L/g,说明温度越低越有利于复合物结构的稳定性,即该反应属于放热反应,不受熵驱动。将由Stern-Vlomer方程得到的Ka代入van’t Hoff方程。绘制logKa与1/T的关系图,得到熵变(ΔS0)和焓变(ΔH0),并通过公式变换计算自由能变化(ΔG0)。研究发现,酶与配体之间的结合主要驱动力有范德华力和氢键(ΔH0和ΔS0均为负)、疏水相互作用(ΔH0和ΔS0均为正)和静电相互作用(ΔH0几乎为零,ΔS0为正)[36]。如表4所示,DHP及Se-DHP的自由能变化ΔG0为正,ΔH0和ΔS0为负,说明相互作用过程不是自发的,主要驱动力是氢键和范德华力。

    表  4  热力学参数
    Table  4.  Thermodynamic parameters
    样品 T
    (K)
    Ksv
    (L/g)
    Ka
    (L/g)
    n ΔH0
    (kJ/g)
    ΔG0
    (kJ/g)
    ΔS0
    (J/(g·K))
    DHP
    303.15 0.0674 0.0461 1.13414 −262.7842
    7.7547 −892.4259
    310.15 0.06361 0.0044 2.02702 14.0016
    Se-DHP 303.15 0.07575 0.0494 1.18852 −17.8430 7.5833 −83.8737
    310.15 0.04107 0.0421 0.9627 8.1704
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    糖尿病是一种普遍的慢性疾病,控制患者血糖水平、预防并发症是治疗糖尿病的关键。研究表明缺硒会增加糖尿病的风险。以天然霍山石斛多糖为原料,制备更高活性的硒多糖既能补充硒元素,同时能预防糖尿病。本研究以霍山石斛多糖为原料,亚硒酸钠为硒化试剂,进行霍山石斛硒多糖的合成,以硒含量为指标,通过单因素结合响应面法得到DHP的最佳硒化条件:硒化时间460 min、硒化温度70 ℃、硝酸浓度为0.5%。在此条件下制备的Se-DHP硒含量平均值为9223.51 μg/g,与预测值9280.59 μg/g接近,表明建立的响应面模型可靠。本研究初步对比了硒化前后霍山石斛多糖对α-淀粉酶的抑制作用及荧光光谱的差异性,结果显示,硒化修饰后的霍山石斛多糖对α-淀粉酶活性的抑制作用明显增强,DHP和Se-DHP均通过静态猝灭的方式猝灭α-淀粉酶的荧光。总而言之,霍山石斛多糖经硒化修饰后,提高了对α-淀粉酶活性的抑制能力,从而大大延缓了糖类的消化速度,这对于改善人体的血糖水平以及控制餐后高血糖都有非常重要的意义。

  • 图  1   各因素对Se-DHP硒含量的影响

    注:图中不同小写字母代表不同条件下硒含量、得率之间的显著性差异,P<0.05。

    Figure  1.   Effect of various factors on Se content of Se-DHP

    图  2   各因素交互作用对硒含量影响的响应曲面

    Figure  2.   Response surface of the interaction of various factors on Se content

    图  3   DHP和Se-DHP对α-淀粉酶抑制作用

    Figure  3.   Inhibitory effect of DHP and Se-DHP on α-amylase

    图  4   DHP和Se-DHP对α-淀粉酶荧光特性的影响

    注:图a为DHP荧光光谱图,图b为Se-DHP荧光光谱图。

    Figure  4.   Effect of DHP and Se-DHP on the fluorescence properties of α-amylase

    图  5   DHP对α-淀粉酶的荧光猝灭作用

    注:a、c为DHP、Se-DHP的F0/F-[C]曲线;b、d为DHP、Se-DHP的lg((F0-F)/F)-lg[C]曲线。

    Figure  5.   Fluorescence quenching of α-amylase by DHP

    表  1   Box-Benhnken设计因素水平及编码值

    Table  1   Design factor level and code value of Box-Benhnken

    水平 因素
    A反应温度(℃) B反应时间(h) C硝酸浓度(%)
    −1 60 6 0.3
    0 70 8 0.5
    1 80 10 0.7
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    表  2   响应面试验设计与结果

    Table  2   Design and results of response surface method test

    试验号 因素 硒含量(μg/g)
    A(℃) B(h) C(%)
    1 60 6 0.5 3877.07
    2 80 6 0.5 6507.67
    3 60 10 0.5 4820.33
    4 80 10 0.5 3112.38
    5 60 8 0.3 4513
    6 80 8 0.3 5033.1
    7 60 8 0.7 5407.95
    8 80 8 0.7 3933.9
    9 70 6 0.3 5427.91
    10 70 10 0.3 4392.22
    11 70 6 0.7 5960.59
    12 70 10 0.7 3900.08
    13 70 8 0.5 8732.86
    14 70 8 0.5 9559.77
    15 70 8 0.5 9235.92
    16 70 8 0.5 9573.27
    17 70 8 0.5 9015.74
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    表  3   方差分析结果

    Table  3   Result of variance analysis

    项目平方和自由度均方FP显著性
    模型项8.098E+0798.998E+0661.81<0.0001极显著
    A122.461122.460.00080.9777
    B3.848E+0613.848E+0626.430.0013**
    C3350.3313350.330.02300.8837
    AB4.706E+0614.706E+0632.330.0007**
    AC9.942E+0519.942E+056.830.0347*
    BC2.626E+0512.626E+051.800.2212
    A22.468E+0712.468E+07169.55<0.0001**
    B22.081E+0712.081E+07142.93<0.0001**
    C21.822E+0711.822E+07125.18<0.0001**
    残差1.019E+0671.456E+05
    失拟项4.996E+0531.665E+051.280.3943不显著
    纯误差5.195E+0541.299E+05
    总和8.200E+0716
    注:**P<0.01,差异极显著;*P<0.05,差异显著。
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    表  4   热力学参数

    Table  4   Thermodynamic parameters

    样品 T
    (K)
    Ksv
    (L/g)
    Ka
    (L/g)
    n ΔH0
    (kJ/g)
    ΔG0
    (kJ/g)
    ΔS0
    (J/(g·K))
    DHP
    303.15 0.0674 0.0461 1.13414 −262.7842
    7.7547 −892.4259
    310.15 0.06361 0.0044 2.02702 14.0016
    Se-DHP 303.15 0.07575 0.0494 1.18852 −17.8430 7.5833 −83.8737
    310.15 0.04107 0.0421 0.9627 8.1704
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-06-16
  • 网络出版日期:  2025-03-05
  • 刊出日期:  2025-04-30

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